組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

Summary

本プロトコールは、キトサン−ゲニピンミクロゲルの作製のための非エマルジョンベースの方法を記載する。これらのミクロゲルのサイズは正確に制御することができ、pH依存性の腫脹を示し、 インビボで分解し、持続的に経時的に放出する治療分子を装填することができ、組織工学用途に非常に関連性が高い。

Abstract

キトサンミクロゲルは、その幅広い用途、低コスト、および免疫原性のために、組織工学において大きな関心事である。しかしながら、キトサンミクロゲルは、一般に、環境に有毒で有害である有機溶媒リンスを必要とするエマルジョン法を用いて製造される。本プロトコールは、有機溶媒リンスを必要とせずにキトサン - ゲニピンミクロゲルを製造するための迅速で非細胞毒性の非エマルジョンベースの方法を提示する。本明細書に記載のミクロゲルは、正確なサイズ制御を用いて作製することができる。生体分子の徐放性を示し、組織工学、生体材料、再生医療との関連性が高い。キトサンはゲニピンで架橋されてヒドロゲルネットワークを形成し、次いでシリンジフィルターを通過してミクロゲルを生成する。ミクロゲルは、様々なサイズを作り出すために濾過することができ、pH依存性の膨潤を示し、酵素的に経時的に分解する。これらのミクロゲルは、ラット成長プレート傷害モデルにおいて採用されており、軟骨組織修復の増加を促進し、 インビボで28日目に完全な分解を示すことが実証された。低コスト、高い利便性、および細胞適合性材料による製造の容易さのために、これらのキトサンミクロゲルは、組織工学においてエキサイティングでユニークな技術を提示する。

Introduction

成長プレートは、フィジーとしても知られており、子供の成長を媒介する長骨の端に位置する軟骨構造です。成長プレートが損傷すると、「ボーンバー」として知られる修復組織が形成され、正常な成長が中断され、成長欠陥または角度変形を引き起こす可能性がある。疫学的データは、すべての小児骨格損傷の15%〜30%が成長プレートに関連していることを示している。骨棒形成は、これらの傷害の最大30%で起こり、成長プレート損傷およびそれに関連する治療を重大な臨床症状の問題にする1,2,3,4。骨棒の形成が起こるとき、最も一般的な治療手段は、骨棒を切除し、シリコンまたは脂肪組織⁵などの介在材料を挿入することを含む。しかし、骨棒切除手術を受けた患者は、損傷した成長プレート^を完全に修復できる治療法が現在存在しないため、完全な回復のための予後不良を有することが多い^6,7,8。これらの欠点に照らして、骨棒の形成を予防し、健康なフィシール軟骨組織を再生するの両方において、成長プレート傷害を治療するための効果的な戦略が決定的に必要とされている。

ヒドロゲル微粒子、またはミクロゲルは、治療薬の徐放性を提供することができる注射用足場として最近関心を集めている⁹。その高い同調性と生体適合性のために、ミクロゲルは生理活性因子または細胞カプセル化にも適している。ミクロゲルは、ポリエチレングリコール(PEG)などの合成ポリマーから、アルギン酸塩やキトサン^10、11、12などの天然ポリマーまで、さまざまな材料で作ることができます。キトサンは、グラム陰性菌の外膜を不安定化させる能力など、組織工学にいくつかの有益な効果を有することが示されており、それによって固有の抗菌活性を提供する^1〜3、14。さらに、キトサンは費用対効果が高く、細胞がインタラクティブで、アミン含有構造を使用して容易に修飾できます。キトサンベースのミクロゲルは、細菌感染を予防しながら組織再生を促進することができる薬物送達および材料シグナル伝達のための生体材料戦略を約束する。しかしながら、キトサンミクロゲルは、しばしば、特別な装置、エマルジョン技術、または細胞傷害性溶媒リンスを必要とする広範囲の技術を用いて製造される。例えば、いくつかの研究では、エマルジョンベースの方法でキトサンミクロゲルを作製しているが、これらのプロトコルは溶媒リンスおよび細胞傷害性架橋剤を必要とし、臨床現場への翻訳を否定する可能性がある^15,16。他の研究では、マイクロフルイディクスまたはエレクトロスプレーアプローチを使用してキトサンミクロゲルを製造しており、これには特別な装置、調製、およびトレーニングが必要です^17,18。キトサンミクロゲルはまた、一般に、キトサン溶液に架橋剤を滴下するプロセスで製造される。しかしながら、この方法は、溶液粘度、ポリマー濃度、および流速に大きく依存し、ミクロゲル¹⁹、²⁰のサイズおよび分散性を制御することを困難にする。逆に、本明細書に記載されるミクロゲル作製方法は、専門的な装置または溶媒すすぎを必要とせず、これらのミクロゲルを、ほぼすべての実験室または設定における製造に実行可能にする。したがって、これらのミクロゲルは、多くの用途において、迅速で費用対効果が高く、製造が容易な薬物送達ビヒクルのための、関連性の高い生体材料を表す。

ミクロゲルの組成と材料特性を調節することにより、研究者は細胞微小環境を正確に制御し、材料依存的に細胞挙動を導くことができます。ミクロゲルは、単独で使用することも、バルク生体材料系と組み合わせて、生理活性因子の延長放出や、天然または外因性細胞に対する正確な特別なシグナル伝達などの特定の機能性を付与することもできます。生体材料およびミクロゲルは、成長プレート損傷の魅力的な治療手段として浮上してきた。成長プレート損傷^21、22、²³、^24、25を治療するためのアルギン酸およびキトサンベースの生体材料の開発に多大な努力が捧げられてきた。成長板の骨化と骨の伸長の動的時間的性質のために、骨棒形成のメカニズムは完全には理解されていない。したがって、ラット、ウサギ、およびヒツジなどにおける軟骨骨化および骨棒形成のメカニズムをよりよく解明するために、いくつかの動物モデルが開発されている26、^27、28。そのようなモデルの1つは、ラット成長プレート傷害モデルであり、ラット脛骨のドリルホール欠陥を使用して、予測可能かつ再現可能な方法で骨バーを生成し、成長プレート^29、30の3つのゾーンすべてにわたってヒト傷害を模倣する。成長プレートの損傷を治療するためのいくつかの生体材料ベースの戦略が、このモデルを使用してテストされている。さらに、キトサンミクロゲルを作製するための2つの異なる方法が開発されており、これは、治療薬を持続的に放出する注射可能な生体材料系として使用することができる^10、31。これらのミクロゲルはラットフィシール傷害モデルに採用されており、SDF−1aおよびTGF−b3を放出すると軟骨再生³¹の改善を示した。このプロトコールで提供される技術は、これらのキトサンミクロゲルを製造するために開発された方法を記述し、その後、多種多様な組織工学用途に採用することができる。例えば、最近の研究では、制御された腫瘍学的薬物送達用途のために、温度またはマゼント応答性キトサンミクロゲルが使用されている^32,33。

Protocol

すべての動物処置は、コロラド大学デンバー校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。6週齢の雄性スプレイグ・ドーリーラットを本研究に使用した。ラット成長プレート傷害モデルは、以前に発表された報告³⁰に従って作成された。

キトサンポリマーの調製

1. 市販の供給源から精製および凍結乾燥された低分子量(LMW)キトサンを得る( 材料表を参照のこと)。
2. 495 mL の二重蒸留水 (ddH₂O) と撹拌子を 1 L ビーカーに加えます。キトサン5gを加え(ステップ1.1)、よく混ぜる。
   注:キトサンは生理学的pHでは水溶液に難溶性であるため、この段階ではキトサンは容易に溶解しません。
3. 上記調製したキトサン溶液に5mLの氷酢酸を加える。
4. 50°Cに保持した水浴にセットしたビーカーで覆いを300rpmで18時間攪拌する。
5. ビュッヒナーフラスコと漏斗を使用して、キトサン溶液を、22 μm、8 μm、および2.7 μmの縮小したろ紙を通してろ過します( 材料表を参照)。
6. 濾過したキトサン溶液をセルロース透析チューブ(材料表参照)に加え、ddH2Oを毎日変化させながら、室温でddH2O中で4日間透析する。
   注: 最後の変更には、超高純度の ddH₂O 水を使用してください。
7. 透析したキトサン溶液をビーカーに移し、1 M NaOHを用いてpHを8.0に調整した。
8. キトサンを遠沈管にアリコートし、4000 x g で室温で5分間遠心分離する。
9. 上清を廃液流にデカントし、キトサンを_ddH2Oに再懸濁させ、2回繰り返す。
10. キトサンペレットを凍結し、凍結乾燥する。
    1. 毎日、凍結乾燥物を取り出し、質量を記録する。
       注:凍結乾燥製品の質量がもはや変化しなくなったら、製品は完全に乾燥され、使用準備が整うまで-20°Cで保存することができます。

2. キトサンハイドロゲルの作製

1. 2 mLの6%酢酸および120mgの精製キトサン(ステップ1)を10mLのルアーロックシリンジに加え、6%w/vキトサン溶液を形成する。
2. メス - ルアーロックコネクタを使用してルアーロックシリンジを別の同一のシリンジに接続し、30秒間、またはキトサンが酢酸に完全に溶解するまで溶液を前後に混合する。
3. 架橋する前に、任意の治療剤または生理活性剤をキトサン溶液に(必要に応じて)加える。本研究のために、200ngのSDF−1aおよびTGF−b3( 材料表を参照のこと)をミクロゲルに添加した。
   注:SDF−1aおよびTGF−b3は、成長プレート組織再生に関連する生理活性物質である。SDF-1aは間葉系幹細胞の欠損部位への遊走を促進し、TGF-b3は軟骨形成因子として機能し、これらの幹細胞を軟骨形成系譜³¹に分化誘導する。
   注:治療薬を完全に組み込むために、シリンジの間にキトサンをもう一度混ぜる。
4. 100%エタノール中に100mMのゲニピンのストック架橋剤溶液( 材料表を参照)を調製する。
5. 調製したゲニピン溶液100μL(工程2.4.)をキトサン含有シリンジに加え、再びシリンジ間を30秒間前後に混合する。
6. 混合物をシリンジから35mmシャーレに押し出し、パラフィンフィルムで覆い、加湿雰囲気下で37°Cで一晩インキュベートする。
   注:溶液は濃い青色に変わり、キトサンとゲニピンとの間の架橋反応が起こり、キトサンミクロゲルの形成につながることを示す。
7. 調製したキトサンミクロゲルを以下の手順に従って濾過する。
   1. ヘラを使用してヒドロゲルを静かに小片に割る。
      注:ピースは、直径約1〜2cmの10mLシリンジの背面に移すのに十分な大きさにする必要があります。
   2. 希望のメッシュサイズのフィルターを清潔な10mLシリンジの背面に置きます。
      注:ミクロゲルの典型的なサイズ範囲は50〜200μmです。
   3. 壊れたゲル片をフィルターを取り付けたシリンジに移し、6mLの_ddH2Oを加える。
      注:キトサンゲルは水性媒体中で著しく膨潤するため、ゲル体積に大きな変化が予想される。
   4. ルアーロックコネクタ を介して シリンジを別の清潔な10 mLシリンジに接続します。
   5. ゲル+水混合物をフィルター付きのシリンジに強制的に通し、指定された最大直径のミクロゲルを作成します。
      1. 最初のろ過の後、フィルターを入れたシリンジの背面を開き、混合物をこのシリンジに押し戻します。
      2. シリンジの背面を交換し、混合物を再びフィルターに強制的に通します。
      3. ろ過を5〜6x、またはフィルターを通る抵抗がほとんどなくなるまで繰り返します。
8. ろ過したミクロゲルをすすぎ、精製する。
   1. 濾過したゲル混合物を50mL円錐管に移し、ddH2Oで全体積を_20mLまで持ってきて、次いで混合物を渦巻き、均一な分散を確実にする。
   2. ミクロゲルを室温で100 x g で5分間遠心分離し、上部水相をデカントする。
   3. ミクロゲルを10mLの70%エタノールに再懸濁し、渦を巻き込み、UV光下に1時間置いて滅菌する。
   4. ミクロゲルを室温で1,000 x gで5分間遠心分離し、エタノールを捨て、ddH2Oで3xすすいでください。

3. イン ビトロ または インビボ 用途のためのミクロゲルの調製

注:本研究のために、成長プレート損傷における軟骨再生をラットモデルで研究した。詳しくは、参考文献³¹ を参照してください。

1. ミクロゲルペレットをddH2O中に1:1で再懸濁し、ミクロゲルを4°Cで_ddH2O中に懸濁して最大1ヶ月間保存することができる。 生理活性剤を使用する場合、ミクロゲルは直ちに使用しなければならない。
2. 以前に公開された報告³⁰に続いて動物における傷害部位を作成する。
3. 傷害部位を生理食塩水で洗い流し、動物を未処置のままにするか(対照研究のため)、キトサンミクロゲルのみまたは生理活性物質を装填したミクロゲルを注射する(ステップ3.2)。
4. 動物の創傷を閉じ、術後鎮痛薬³⁰を投与する。
5. 術後7日目または28日目に、_CO2 過剰摂取によりラットを安楽死させ、四肢を切除し、組織学を行い、傷害部位³¹における組織修復を評価する。

Representative Results

キトサンミクロゲルの製造の成功は、ゲニピンとキトサンとの間の架橋反応、特にキトサンポリマー鎖上のアミンを含むことに依存する。他のミクロゲル作製技術とは対照的に、この方法はエマルジョンまたは溶媒すすぎを必要とせず、安価な装置で迅速かつ容易に行うことができる。ミクロゲル製造を成功させるための特徴的な指標は、キトサンとゲニピンが混合された後のオフホワイトからダークブルーへの明確な色の変化です。ゲニピンとキトサンまたは他のタンパク質などのアミン含有化合物との間の架橋反応は、文献³⁴において十分に特徴付けられている。要するに、架橋機構は、キトサンのアミノ基による求核攻撃であると考えられ、そこでは、ゲニピンは、安定な縮合生成物³⁵を有するジアルデヒドとして作用する。安定で凝縮したゲニピンの短鎖は、キトサンポリマー間の架橋架橋として作用する。架橋反応は、溶液を濃い青色に変色させるが、これは、求核攻撃³⁶からの開環反応に続く中間体化合物の酸素ラジカル誘発重合および脱水素に起因する可能性が高い。

ミクロゲルをろ過し、1:1の水希釈液に再懸濁すると、さまざまな生体材料用途に簡単に使用できます。最近、これらのエマルジョンフリーキトサンミクロゲルを使用して、成長プレート傷害における軟骨再生を促進する研究が発表されました。前記ミクロゲルを本明細書に記載のように作製し、空のままにするか、または成長プレート組織再生に関連する生理活性物質であるSDF−1aおよびTGF−b3を負荷し、SDF−1aと共に欠損部位への間葉系幹細胞の遊走を促進し、TGF−b3が軟骨形成系譜下へのこれらの幹細胞の分化を誘導する軟骨形成因子として役立つ^37、38。タンパク質の放出速度をELISAを介してインビトロで定量し、これらの分子の放出を経時的に持続させた³¹。次いで、このミクロゲルをin vivoラットモデルにおける成長プレート傷害に注入し、そして注入されたミクロゲルは、インビボ31における早期骨棒形成を予防した。これらの注射可能で、費用対効果が高く、製造が簡単なキトサンミクロゲルは、多くの生体材料用途に容易に採用することができる。

ミクロゲル製造のためのこのプロセスは、簡単なセットアップとアプリケーションのために最適化されていますが、研究者が注意すべきいくつかの問題が依然として発生する可能性があります。ポリマーと架橋成分の不十分な混合は、製造中に異なる結果をもたらす可能性が最も高い原因である。固体キトサンはシリンジ間で激しく混合されなければならず、得られたキトサン溶液は、ゲニピン架橋剤が添加される前に完全に均質でなければならない。溶液が均質でない場合、溶液中に残存する固体キトサンチャンクは塊を形成し、不均一な架橋が起こり、効果的な濾過を妨げ、直径が著しく変化する多分散ミクロゲルをもたらす。製造中に考慮すべきもう1つの重要な要素は、架橋期間中の蒸発を避けることであり、これはパラフィンフィルムまたは他の蒸発トラップ技術で防止されなければならない。キトサンヒドロゲルが乾燥すると、水すすぎ中に膨潤せず、シリンジを通して濾過されない。最後に、ミクロゲルは濾過プロセス中に過剰な水に懸濁し、使用していないときは4°Cの水に保存する必要があります。ミクロゲルは、少なくとも1:1の希釈水に懸濁しない限り、押し出し可能または注射可能ではない。

図1は 、ミクロゲル作製プロセスの広範な概要を示す。 同じプロセスを図 2 に再び示し、そのプロセスの写真を示し、テキストだけでは理解しにくいプロトコルの段階を強調しています。たとえば、 図 2D は、金網フィルターを 10 mL シリンジに挿入する方法を示しています。シリンジの上部に完全に装着されると、この金網フィルターは、特殊な装置や溶媒なしでキトサンミクロゲルを迅速かつ便利にろ過することができます。同様に、 図2E は、ミクロゲル作製の基礎であるメッシュフィルターを通る水和キトサンゲルの流れを示す。 図3 は、これらのミクロゲルに関する我々の以前の刊行物から適合されたものであり、それらのpH依存的な膨潤挙動およびメッシュフィルターの孔径に依存するミクロゲルのサイズの違いを示す。異なるメッシュサイズを製造業者に注文することができ、これにより、ミクロゲルのサイズを便利に制御することができる。ミクロゲルサイズに対するこの正確な制御は、明確に定義された治療負荷放出速度を有する薬物送達システムを設計する際に非常に重要です。ミクロゲルに関する以前の研究はまた、それらが2〜4週目にリゾチームの存在下で有意に分解することを示した³¹。最後に、 図4 は、SDF−^1a およびTGF−b3をロードしたキトサンミクロゲルで処置したラット成長プレート傷害モデルにおける組織像画像31を示す。

図1:キトサンミクロゲル作製の概略概要。 図は biorender.com を使用して作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ミクロゲル作製工程の写真。(b)キトサンゲルを35mmのシャーレに押し出す。(c)オフホワイトからダークブルーに変色した架橋後のキトサンゲルの取り出し。(d)シリンジのノズルに嵌め込まれた金網ふるいを示すシリンジ内部の上面下図。(e)キトサンゲルをメッシュフィルターを通してプレスし、ミクロゲルを製造した。(f)ミクロゲルを、円錐管中のddH2Oの1:1希釈で保存した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:(A)pH変化に応答したミクロゲルの膨潤挙動を示すフェレ径の正規分布グラフ。(b)200メッシュ目(上段画像:<75μmサイズのミクロゲル)及び100メッシュ目(下段画像:75~150μmサイズのミクロゲル)を用いて作製したミクロゲルの蛍光画像。図は参考文献³¹の許可を得て転載しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:SDF−1aおよびTGF−b3をロードしたキトサンミクロゲルで処置したラット成長プレート損傷モデルにおける組織像像。 無傷の成長プレート修復組織を示す10x組織像(A)および(E)、未処置(B)および(F)、ミクロゲル処置(C)および(G)、ミクロゲル+SDF−1a処置(D)および(H)、ならびにミクロゲル+TGF−b3処置(I)の手足。7日目に動物をミクロゲル+TGFb3で処理しなかった。ミクロゲルは濃い赤色の繊維状組織として現れる。スケールバー = 500 μm。図は参考文献³¹の許可を得て転載しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ミクロゲルは、薬物送達または細胞封入などの様々な目的への適用性が高いため、近年広く研究されている⁹。マイクロスケールの生体材料構築物の製造の容易さは、研究者が特定のサイズおよび時間スケールでヒドロゲルベースの戦略を開発することを可能にするため、組織工学において有意に関連している。しかしながら、キトサンミクロゲルを製造するためのほとんどの方法は、高価な装置および試薬、エマルジョン、または細胞傷害性溶媒リンスを必要とし、これは臨床使用へのそれらの翻訳を妨げる¹⁵、¹⁶、17、^18、19、20。これらのミクロゲルは、エマルジョン技術または溶媒リンスを必要としない、製造の著しい利便性の点で優れている。さらに、これらのミクロゲルは、pH依存性の腫脹および薬物負荷、調整された分解挙動、および治療薬の持続放出などの組織工学的構築物にとって理想的な特性を保持する。

これらのキトサンミクロゲルを製造する上で最も重要なステップは、シリンジ間の濾過である。これらのミクロゲルはバルクヒドロゲルとして始まり、金網フィルターを使用して特定のサイズ範囲にろ過されます。濾過がなければ、ミクロゲルの適用性、機械的特性、および薬物放出特性は大きく異なるであろう。ろ過工程は、ヒドロゲルのサイズを正確に制御することを可能にし、また、pH依存性の腫脹および治療薬の持続放出を示すミクロゲルのハイスループット製造を可能にする。

このプロセスの制限は、濾過ステップが完全に球状のヒドロゲルをもたらさなかったことであり、これはいくつかの用途のために考慮すべき重要な要素であり得る。このため、ミクロゲルの特徴的な大きさをフェレ径(図3)を用いて説明したが、これは不規則な形状の粒子³⁹の定量に有用である。ミクロゲルの幾何学的形状は完全な球体ではなかったが、粒子の平均サイズはシリンジフィルターのメッシュサイズに基づいて制御することが容易であり、そして、多くの用途において、完全に球状の粒子を有する必要はない。ミクロゲルの多分散度指数(PDI)は、大きな粒子集団(n = 74)から得られた平均フェレ径に対するフェレ径の標準偏差の二乗比を用いて定量化した。PDIは、次の式を使用して0.076として計算されました。

PDI = (S/D)²

ここで、sは平均フェレ径の標準偏差であり、Dは平均フェレ径^40である。このプロセス中に行われたフィルタリングと、不規則な形状の粒子に対するフェレ径の使用のために、これらの粒子の多分散指数は、単分散と見なすことができる程度に、非常に低かった。

将来の研究のために、このプロトコルにいくつかの変更を加えて、与えられた研究ニーズによりよく適合させることができます。例えば、SDF1−aおよびTGF−b3の2つのタンパク質のみが、これらのミクロゲルによるそれらの制御放出について研究されている。以前の研究は、イン ビトロで 〜30日までこれらの生理活性因子の持続放出を示した。しかし、ナノ粒子、RNA干渉(RNAi)分子、他の生物製剤、または低分子薬物などの他の関連治療薬も、このキトサンミクロゲル技術を適用した場合の放出速度および有効性を定量化するために探索することができる。将来調査できる別の変数は、シリンジフィルターのメッシュサイズを変更するだけで行われるミクロゲルのサイズ範囲を変更することです。これはまた、ミクロゲルからの治療薬の放出速度に重大な影響を及ぼし、架橋の化学的性質を変えることなく放出動態を簡便に制御することを可能にする。さらに、このプロトコルは、より大きなシリンジおよびフィルターまたは真空ろ過技術を使用して、大量のキトサンミクロゲルを製造するために容易にスケールアップすることができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh