Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Doku Mühendisliği Uygulamaları için Boyut Kontrollü ve Emülsiyonsuz Kitosan-Genipin Mikrojellerinin İmalatı

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Mevcut protokol, kitosan-genipin mikrojellerinin üretimi için emülsiyon bazlı olmayan bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu mikrojellerin boyutu hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve pH'a bağlı şişlik gösterebilir, in vivo olarak bozulabilir ve zamanla sürekli bir şekilde salınan terapötik moleküllerle yüklenebilir, bu da onları doku mühendisliği uygulamaları için oldukça alakalı hale getirir.

Abstract

Kitosan mikrojelleri, geniş uygulama alanları, düşük maliyetleri ve immünojenisiteleri nedeniyle doku mühendisliğinde önemli bir ilgi görmektedir. Bununla birlikte, kitosan mikrojelleri genellikle toksik ve çevreye zararlı olan organik çözücü durulamaları gerektiren emülsiyon yöntemleri kullanılarak üretilir. Mevcut protokol, organik çözücü durulamalarına ihtiyaç duymadan kitosan-genipin mikrojellerinin üretimi için hızlı, sitotoksik olmayan, emülsiyon bazlı olmayan bir yöntem sunmaktadır. Burada açıklanan mikrojeller hassas boyut kontrolü ile üretilebilir. Biyomoleküllerin sürekli salınımını sergilerler, bu da onları doku mühendisliği, biyomalzemeler ve rejeneratif tıp için oldukça alakalı hale getirir. Kitosan, bir hidrojel ağı oluşturmak için genipin ile çapraz bağlanır, daha sonra mikrojelleri üretmek için bir şırınga filtresinden geçirilir. Mikrojeller bir dizi boyut oluşturmak için filtrelenebilir ve pH'a bağlı şişlik gösterir ve zamanla enzimatik olarak bozulurlar. Bu mikrojeller bir sıçan büyüme plakası yaralanma modelinde kullanılmıştır ve artmış kıkırdak dokusu onarımını teşvik ettiği ve in vivo olarak 28 günde tam bozulma gösterdiği gösterilmiştir. Düşük maliyetleri, yüksek kolaylıkları ve sitouyumlu malzemelerle üretim kolaylığı nedeniyle, bu kitosan mikrojelleri doku mühendisliğinde heyecan verici ve benzersiz bir teknoloji sunmaktadır.

Introduction

Fizik olarak da bilinen büyüme plağı, çocuklarda büyümeye aracılık eden uzun kemiklerin sonunda bulunan kıkırdak yapısıdır. Büyüme plakası yaralanırsa, normal büyümeyi kesintiye uğratan ve büyüme kusurlarına veya açısal deformitelere neden olabilecek "kemikli çubuk" olarak bilinen onarım dokusu oluşabilir. Epidemiyolojik veriler tüm çocukluk çağı iskelet yaralanmalarının %15-30'unun büyüme plağı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Kemikli çubuk oluşumu bu yaralanmaların %30'una kadar meydana gelerek, büyüme plağı yaralanmaları ve bunlara bağlı tedaviler önemli bir klinik bulgu sorunu 1,2,3,4 haline getirmektedir. Kemikli çubuk oluşumu meydana geldiğinde, en yaygın tedavi yolu kemikli çubuğun rezeksiyonunu ve silikon veya yağ dokusu5 gibi ara konumsal bir malzemenin yerleştirilmesini içerir. Bununla birlikte, kemikli çubuk rezeksiyon ameliyatı geçiren hastalar genellikle tam iyileşme için kötü bir prognoza sahiptir, çünkü şu anda yaralı bir büyüme plakası 6,7,8'i tamamen onarabilecek bir tedavi yoktur. Bu eksikliklerin ışığında, hem kemikli bir çubuğun oluşumunu önlemede hem de sağlıklı fizyal kıkırdak dokusunun yenilenmesinde büyüme plağı yaralanmalarının tedavisinde etkili stratejilere kritik bir ihtiyaç vardır.

Hidrojel mikropartikülleri veya mikrojeller, son zamanlarda terapötiklerin sürekli salınımını sağlayabilen enjekte edilebilir iskeleler olarak ilgi kazanmıştır9. Yüksek ayarlanabilirlikleri ve biyouyumlulukları nedeniyle, mikrojeller biyoaktif faktör veya hücre kapsüllemesi için de çok uygundur. Mikrojeller, polietilen glikol (PEG) gibi sentetik polimerlerden, aljinat veya kitosan10,11,12 gibi doğal polimerlere kadar çeşitli malzemelerden yapılabilir. Kitosanın, gram-negatif bakterilerin dış zarını dengesizleştirme kabiliyeti gibi doku mühendisliği için çeşitli yararlı etkilere sahip olduğu gösterilmiştir, böylece doğal antimikrobiyal aktivitesunar 1 3,14. Ek olarak, kitosan uygun maliyetli, hücre etkileşimlidir ve amin içeren yapısı kullanılarak kolayca değiştirilebilir. Kitosan bazlı mikrojeller, bakteriyel enfeksiyonu önlerken doku yenilenmesini teşvik edebilecek ilaç dağıtımı ve materyal sinyalizasyonu için bir biyomateryal stratejisi vaat etmektedir. Bununla birlikte, kitosan mikrojelleri genellikle özel ekipman, emülsiyon teknikleri veya sitotoksik çözücü durulamaları gerektiren çok çeşitli tekniklerle üretilir. Örneğin, bazı çalışmalar emülsiyon bazlı yöntemlerle kitosan mikrojelleri imal etmiştir, ancak bu protokoller solvent durulamaları ve sitotoksik çapraz bağlayıcılar gerektirir ve potansiyel olarak klinik ortamlara çevirilerini reddeder15,16. Diğer çalışmalar, özel ekipman, hazırlık ve eğitim gerektiren kitosan mikrojellerini üretmek için mikroakışkanlar veya elektrosprey yaklaşımları kullanmıştır17,18. Kitosan mikrojelleri ayrıca yaygın olarak kitosan çözeltisine damla çapraz bağlayıcı işlemi ile yapılır; Bununla birlikte, bu yöntem çözelti viskozitesine, polimer konsantrasyonuna ve akış hızına büyük ölçüde bağımlıdır ve mikrojellerin boyutunu ve dispersitesini kontrol etmeyi zorlaştırır19,20. Tersine, burada açıklanan mikrojel üretimi yöntemi, uzman ekipman veya solvent durulama gerektirmez, bu da bu mikrojelleri hemen hemen her laboratuarda veya ortamda üretim için uygun hale getirir. Bu nedenle, bu mikrojeller, birçok uygulama için hızlı, uygun maliyetli ve üretilmesi kolay bir ilaç dağıtım aracı için son derece alakalı biyomalzemeleri temsil eder.

Bir mikrojelin bileşimini ve malzeme özelliklerini modüle ederek, araştırmacılar hücresel mikro çevre üzerinde hassas kontrol elde edebilir, böylece hücre davranışını malzemeye bağımlı bir şekilde yönlendirebilirler. Mikrojeller kendi başlarına kullanılabilir veya biyoaktif faktörlerin genişletilmiş salınımı veya doğal veya eksojen hücreler için hassas özel sinyalizasyon gibi belirli işlevler kazandırmak için toplu biyomalzeme sistemleriyle birleştirilebilir. Biyomalzemeler ve mikrojeller, büyüme plağı yaralanmaları için çekici tedavi yolları olarak ortaya çıkmıştır. Büyüme plakası yaralanmalarını tedavi etmek için aljinat ve kitosan bazlı biyomateryallerin geliştirilmesine önemli çabalar adanmıştır21,22,23,24,25. Büyüme plağı kemikleşmesinin ve kemik uzamasının dinamik zamansal doğası nedeniyle, kemikli çubuk oluşum mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, sıçanlar, tavşanlar ve koyunlar gibi endokondral kemikleşme ve kemikli çubuk oluşumu mekanizmalarını daha iyi aydınlatmak için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir26,27,28. Böyle bir model, öngörülebilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kemikli bir çubuk üretmek için sıçan tibiasında bir matkap deliği kusuru kullanan ve büyüme plakası 29,30'un her üç bölgesinde de insan yaralanmalarını taklit eden bir sıçan büyüme plakası yaralanma modelidir. Büyüme plakası yaralanmalarını tedavi etmek için çeşitli biyomateryal bazlı stratejiler bu model kullanılarak test edilmiştir. Ek olarak, kitosan mikrojellerinin üretimi için iki farklı yöntem geliştirilmiştir, bu da terapötikleri sürekli bir şekilde serbest bırakan enjekte edilebilir bir biyomateryal sistemi olarak kullanılabilir10,31. Bu mikrojeller bir sıçan fizyal yaralanma modelinde kullanılmıştır veSDF-1a ve TGF-b3'ü serbest bırakırken kıkırdak rejenerasyonunun 31 arttığını göstermiştir. Bu protokolde sağlanan teknikler, daha sonra çok çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilecek bu kitosan mikrojellerini üretmek için geliştirilen yöntemleri tanımlamaktadır. Örneğin, son zamanlarda yapılan çalışmalar, kontrollü onkolojik ilaç dağıtım uygulamaları için termo- veya magento-duyarlı kitosan mikrojelleri kullanmıştır32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Colorado Üniversitesi Denver Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 6 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanılmıştır. Sıçan büyüme plakası yaralanma modeli, daha önce yayınlanan bir rapor30'un ardından oluşturulmuştur.

1. Kitosan polimerinin hazırlanması

  1. Ticari olarak temin edilebilen kaynaklardan saflaştırılmış ve liyofilize edilmiş düşük moleküler ağırlıklı (LMW) kitosan elde edin (bakınız Malzeme Tablosu).
  2. 1 L'lik bir beherin içine 495 mL çift damıtılmış su (ddH2O) ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. 5 g kitosan (Adım 1.1.) ekleyin ve iyice karıştırın.
    NOT: Kitosan, fizyolojik pH'ta sulu bir çözelti içinde sadece az miktarda çözünür, bu nedenle kitosan bu adımda kolayca çözünmez.
  3. Yukarıda hazırlanan kitosan çözeltisine 5 mL buzul asetik asit ekleyin.
  4. Beher, 50 ° C'de tutulan bir su banyosuna yerleştirilmiş beher ile 18 saat boyunca 300 rpm'de kaplanır.
  5. Bir Büchner şişesi ve hunisi kullanarak, kitosan çözeltisini azalan filtre kağıdı boyutlarıyla filtreleyin: 22 μm, 8 μm ve 2,7 μm (bkz.
  6. Filtrelenmiş kitosan çözeltisini selüloz diyaliz tüpüne ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ddH 2 O'da oda sıcaklığında 4 günboyunca diyalize izin verin, ddH2O'yu her gün değiştirin.
    NOT: Son değişiklik için ultra saf ddH2O su kullanın.
  7. Diyalize kitosan çözeltisini bir beher'e aktarın ve 1 M NaOH kullanarak pH'ı 8.0'a ayarlayın.
  8. Kitosanı santrifüj tüplerine alıkoyun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj yapın.
  9. Süpernatantı bir atık akışına boşaltın ve kitosan'ı ddH 2 O'da2xtekrarlayarak yeniden askıya alın.
  10. Dondurun ve sonra kitosan peletini liyofilize edin.
    1. Her gün, liyofilize ürünü çıkarın ve kütleyi kaydedin.
      NOT: Liyofilize ürünün kütlesi artık değişmediğinde, ürün tamamen kurutulur ve kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklanabilir.

2. Kitosan hidrojel imalatı

  1. % 6'lık bir kitosan çözeltisi oluşturmak için 10 mL'lik bir Luer-lock şırıngasına 2 mL% 6 asetik asit ve 120 mg saflaştırılmış kitosan (Adım 1) ekleyin.
  2. Luer-lock şırıngasını dişi-dişi Luer-lock konektörü kullanarak başka bir özdeş şırıngaya bağlayın ve çözeltiyi 30 s boyunca veya kitosan asetik asit içinde tamamen çözünene kadar ileri geri karıştırın.
  3. Çapraz bağlamadan önce, kitosan çözeltisine (gerekirse) herhangi bir terapötik veya biyoaktif ajan ekleyin. Bu çalışma için, mikrojellere 200 ng SDF-1a ve TGF-b3 (bakınız Malzeme Tablosu) eklenmiştir.
    NOT: SDF-1a ve TGF-b3, büyüme plakası dokusu rejenerasyonu ile ilgili biyoaktif ajanlardır. SDF-1a, mezenkimal kök hücrelerin defekt bölgesine göçünü teşvik eder ve TGF-b3, bu kök hücrelerin kondrojenik soy31'den farklılaşmasını sağlamak için kondrojenik bir faktör olarak işlev görür.
    NOT: Terapötiği tamamen dahil etmek için kitosanı şırıngalar arasında tekrar karıştırın.
  4. % 100 etanol içinde 100 mM stok çapraz bağlayıcı genipin çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Hazırlanan genipin çözeltisinden 100 μL'yi (Adım 2.4.) kitosan içeren şırıngaya ekleyin ve tekrar 30 s boyunca şırıngalar arasında ileri geri karıştırın.
  6. Karışımı şırıngadan 35 mm'lik bir Petri kabına ekstrüzyon yapın, parafin filmle örtün ve nemlendirilmiş bir atmosferde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Çözelti koyu maviye dönecek ve kitosan ve genipin arasındaki çapraz bağlanma reaksiyonunun meydana geldiğini ve kitosan mikrojelinin oluşumuna yol açtığını gösterecektir.
  7. Hazırlanan kitosan mikrojelini aşağıdaki adımları izleyerek filtreleyin.
    1. Bir spatula kullanarak hidrojeli yavaşça daha küçük parçalara ayırın.
      NOT: Parçalar, ~ 1-2 cm çapında 10 mL'lik bir şırınganın arkasına aktarılacak kadar küçük olmalıdır.
    2. Temiz bir 10 mL şırınganın arkasına istenen ağ boyutunda bir filtre yerleştirin.
      NOT: Mikrojeller için tipik boyut aralığı 50-200 μm arasındadır.
    3. Kırık jel parçalarını filtreyle donatılmış şırıngaya aktarın ve 6 mL ddH2O ekleyin.
      NOT: Kitosan jeli sulu ortamda önemli ölçüde şişecektir, bu nedenle jel hacminde büyük bir değişiklik beklenir.
    4. Şırıngayı bir Luer-lock konektörü aracılığıyla başka bir temiz 10 mL şırıngaya bağlayın.
    5. Belirtilen maksimum çapa sahip mikrojeller oluşturmak için jel + su karışımını filtreyle şırıngadan geçirin.
      1. İlk filtrelemeden sonra, filtreyi içeren şırınganın arkasını açın ve karışımı bu şırıngaya geri ekstrüde edin.
      2. Şırınganın arkasını değiştirin ve karışımı tekrar filtreden geçirin.
      3. Filtrelemeyi 5-6x veya filtreden çok az direnç olana kadar tekrarlayın.
  8. Filtrelenmiş mikrojelleri durulayın ve saflaştırın.
    1. Filtrelenmiş jel karışımını 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın, ddH 2 O ile toplam hacmi20mL'ye çıkarın ve ardından homojen dağılım sağlamak için karışımı vorteksleyin.
    2. Mikrojelleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj edin ve üst sulu fazı boşaltın.
    3. Mikrojelleri% 70 etanol, girdapta 10 mL'lik bir alanda yeniden askıya alın ve sterilize etmek için 1 saat boyunca UV ışığı altında yerleştirin.
    4. Mikrojelleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin, etanol atın ve ddH 2 O ile3xdurulayın.

3. İn vitro veya in vivo uygulamalar için mikrojellerin hazırlanması

NOT: Bu çalışmada, büyüme plağı yaralanmalarında kıkırdak rejenerasyonu bir sıçan modelinde incelenmiştir. Ayrıntılar için referans31'e bakın.

  1. Mikrojel peletlerini ddH 2 O'da 1: 1 oranındayeniden askıya alın Mikrojeller, 4 ° C'de ddH2O'da askıya alınmış 1 aya kadar saklanabilir. Bir biyoaktif madde kullanılıyorsa, mikrojeller derhal kullanılmalıdır.
  2. Daha önce yayınlanmış bir rapor30'u takiben hayvandaki yaralanma bölgesini oluşturun.
  3. Yaralanma bölgesini salin ile yıkayın ve hayvanı tedavi edilmeden tutun (kontrol çalışması için) veya sadece kitosan mikrojellerini veya biyoaktif ajanlarla yüklü mikrojelleri enjekte edin (Adım 3.2.).
  4. Hayvandaki yarayı kapatın ve ameliyat sonrası analjezikler30 uygulayın.
  5. Ameliyat sonrası 7. veya 28. günlerde, sıçanı aşırı dozda CO2 ile ötenazi yapın, uzuvları tüketin ve yaralanma bölgesinde doku onarımını değerlendirmek için histoloji yapın31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kitosan mikrojellerinin başarılı bir şekilde üretilmesi, genipin ve kitosan arasındaki çapraz bağlanma reaksiyonuna dayanır, özellikle kitosan polimer zincirleri üzerindeki aminleri içerir. Diğer mikrojel üretim tekniklerinin aksine, bu yöntem emülsiyonlar veya solvent durulamaları gerektirmez ve ucuz ekipmanlarla hızlı ve kolay bir şekilde gerçekleştirilebilir. Başarılı mikrojel üretimi için ayırt edici bir gösterge, kitosan ve genipin karıştırıldıktan sonra kirli beyazdan koyu maviye farklı renk değişimidir. Kitosan veya diğer proteinler gibi genipin ve amin içeren bileşikler arasındaki çapraz bağlanma reaksiyonu, literatürde iyi karakterize edilmiştir34. Kısacası, çapraz bağlama mekanizması, genipinin kararlı yoğuşma ürünleri35 ile bir dialdehit görevi gördüğü kitosan amino grupları tarafından nükleofilik bir saldırı olarak kabul edilir. Kararlı, yoğunlaştırılmış genipinin kısa zincirleri, kitosan polimerleri arasında çapraz bağlama köprüleri görevi görür. Çapraz bağlanma reaksiyonu, muhtemelen oksijen radikalinin neden olduğu polimerizasyon ve ara bileşiklerin dehidrojenasyonu nedeniyle, nükleofilik atak36'dan halka açma reaksiyonunu takip eden çözeltinin koyu maviye dönmesine neden olur.

Mikrojeller filtrelendikten ve 1: 1 su seyreltmesinde yeniden askıya alındıktan sonra, çeşitli biyomalzeme uygulamalarında kolayca kullanılabilirler. Son zamanlarda, büyüme plakası yaralanmalarında kıkırdak rejenerasyonunu teşvik etmek için bu emülsiyonsuz kitosan mikrojelleri kullanan çalışmalar yayınlanmıştır. Mikrojeller burada tarif edildiği gibi imal edilmiş ve ya boş tutulmuş ya da büyüme plakası doku rejenerasyonu ile ilgili biyoaktif ajanlar olan SDF-1a ve TGF-b3 ile yüklenmiş, SDF-1a mezenkimal kök hücrelerin defekt bölgesine göçünü teşvik etmiş ve TGF-b3 bu kök hücrelerin kondrojenik soydan farklılaşmasını sağlamak için kondrojenik bir faktör olarak hizmet etmiştir37, 38. Proteinlerin salınım hızı ELISA aracılığıyla in vitro olarak ölçüldü ve bu moleküllerin salınımı zaman içinde sürdürüldü31. Daha sonra, mikrojeller in vivo sıçan modelinde bir büyüme plakası yaralanmasına enjekte edildi ve enjekte edilen mikrojeller in vivo31'de erken kemikli çubuk oluşumunu önledi. Bu enjekte edilebilir, uygun maliyetli ve üretimi kolay kitosan mikrojelleri birçok biyomalzeme uygulamasında kolayca kullanılabilir.

Mikrojel üretimi için bu süreç basit kurulum ve uygulamalar için optimize edilmiş olsa da, araştırmacıların dikkat etmesi gereken birkaç sorun ortaya çıkabilir. Polimer ve çapraz bağlama bileşenlerinin yetersiz karıştırılması, imalat sırasında farklı sonuçların en olası nedenidir. Katı kitosan şırıngalar arasında kuvvetlice karıştırılmalı ve elde edilen kitosan çözeltisi, genipin çapraz bağlayıcı eklenmeden önce tamamen homojen olmalıdır. Çözelti homojen değilse, çözeltide kalan katı kitosan parçaları topaklar oluşturacak ve düzensiz çapraz bağlanma meydana gelecek, etkili filtrelemeyi önleyecek ve önemli ölçüde değişen çaplara sahip çok dağınık mikrojellerle sonuçlanacaktır. İmalat sırasında göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli faktör, parafin filmi veya diğer buharlaşma yakalama teknikleriyle önlenmesi gereken çapraz bağlama periyodu sırasında buharlaşmayı önlemektir. Kitosan hidrojel kurursa, su durulamaları sırasında şişmez ve şırıngadan süzülmez. Son olarak, mikrojeller filtrasyon işlemi sırasında fazla suda asılmalı ve kullanılmadığında 4 ° C'de suda saklanmalıdır. Mikrojeller, en az 1: 1 seyreltme suyunda askıya alınmadıkça ekstrüde edilemez veya enjekte edilemez.

Şekil 1, mikrojel üretim sürecine geniş bir genel bakış sunmaktadır. Aynı süreç, sürecin fotoğraflarını gösteren ve yalnızca metinden anlaşılması zor olan protokol aşamalarını vurgulayan Şekil 2'de tekrar tasvir edilmiştir. Örneğin, Şekil 2D, bir tel örgü filtrenin 10 mL şırıngaya nasıl yerleştirildiğini göstermektedir. Şırınganın tepesine tamamen oturtulduktan sonra, bu tel örgü filtre, kitosan mikrojellerinin uzman ekipman veya çözücüler olmadan hızlı ve rahat bir şekilde filtrelenmesini sağlar. Benzer şekilde, Şekil 2E, mikrojel üretiminin temeli olan ağ filtresinden hidratlanmış kitosan jelin akışını göstermektedir. Şekil 3, bu mikrojeller hakkındaki önceki yayınımızdan uyarlanmıştır ve pH'a bağlı şişme davranışlarını ve ağ filtresinin gözenek boyutuna bağlı olarak mikrojellerin boyutlarındaki farklılıkları göstermektedir. Üreticiden, mikrojellerin boyutu üzerinde uygun kontrol sağlayan farklı ağ boyutları sipariş edilebilir. Mikrojel boyutu üzerindeki bu hassas kontrol, iyi tanımlanmış terapötik yük salınım oranlarına sahip ilaç dağıtım sistemleri tasarlanırken son derece önemlidir. Mikrojeller üzerinde yapılan önceki çalışmalar da 2-4 hafta31'de lizozim varlığında önemli ölçüde bozulduklarını göstermiştir. Son olarak, Şekil 4, SDF-1a ve TGF-b3 yüklü kitosan mikrojelleri ile tedavi edilen bir sıçan büyüme plakası yaralanma modelinde histoloji görüntüleri 31'i göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Kitosan mikrojel üretimine şematik genel bakış. Figür biorender.com kullanılarak oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Mikrojel üretim sürecinin fotoğrafları . (A) Luer kilidi kullanılarak bağlanan şırıngalarda kitosan çözeltisi. (B) Kitosan jelin 35 mm'lik bir Petri kabına ekstrüzyonu. (C) Çapraz bağlanma renginden sonra kitosan jelinin alınması, kirli beyazdan koyu maviye dönüşür. (D) Şırınganın içine, şırınganın nozuluna takılan tel örgü eleği gösteren yukarıdan aşağıya görünüm. (E) Kitosan jeli, mikrojeller üretmek için bir ağ filtreden geçirildi. (F) Mikrojeller, ddH2O'nun 1: 1 seyreltilmesinde konik bir tüp içinde depolandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Mikrojellerin pH'a bağlı şişme davranışı . (A) pH değişikliklerine yanıt olarak mikrojellerin şişme davranışını gösteren Feret çapının normal dağılım grafiği. (B) No. 200 mesh (üst resim: <75 μm boyutlu mikrojeller) ve No. 100 ağ (alt resim: 75-150 μm boyutlu mikrojeller) kullanılarak üretilen mikrojellerin floresan görüntüleri. Şekil, referans31'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: SDF-1a ve TGF-b3 yüklü kitosan mikrojelleri ile tedavi edilen bir sıçan büyüme plakası yaralanma modelinde histoloji görüntüleri. bozulmamış (A) ve (E), tedavi edilmemiş (B) ve (F), mikrojel ile muamele edilmiş (C) ve (G), mikrojel + SDF-1a ile tedavi edilmiş (D) ve (H) ve mikrojel + TGF-b3 ile muamele edilmiş (I) büyüme plakası onarım dokusunu gösteren 10x histolojik görüntü ) uzuvlar. Hiçbir gün 7 hayvan mikrojel + TGFb3 ile tedavi edilmedi. Alcian mavi hematoksilin (ABH) kemiği turuncudan kırmızıya, fibröz doku pembesine ve kıkırdak mavisine boyar. Mikrojel koyu kırmızı fibröz benzeri bir doku olarak görünür. Ölçek çubukları = 500 μm. Şekil, referans31'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrojeller, ilaç dağıtımı veya hücrekapsüllemesi 9 gibi çeşitli amaçlar için yüksek düzeyde uygulanabilirlikleri nedeniyle son yıllarda yaygın olarak araştırılmıştır. Mikro ölçekli biyomalzeme yapılarının üretim kolaylığı, araştırmacıların belirli bir boyut ve zaman ölçeğinde hidrojel bazlı stratejiler geliştirmelerine izin verdiği için doku mühendisliğinde önemli bir öneme sahiptir. Bununla birlikte, kitosan mikrojellerinin üretimi için çoğu yöntem, pahalı ekipman ve reaktifler, emülsiyonlar veya sitotoksik çözücü durulamaları gerektirir, bu da klinik kullanıma geçişlerini önler 15,16,17,18,19,20. Bu mikrojeller, emülsiyon teknikleri veya solvent durulamaları gerektirmeyen, önemli üretim kolaylıkları açısından mükemmeldir. Ek olarak, bu mikrojeller, pH'a bağımlı şişlik ve ilaç yükleme, ayarlanmış bozulma davranışı ve terapötiklerin sürekli salınması gibi doku mühendisliği yapılmış bir yapı için ideal özellikleri korur.

Bu kitosan mikrojellerinin üretilmesinde en kritik adım, şırıngalar arasındaki filtrasyondur. Bu mikrojeller dökme hidrojel olarak başlar ve tel örgü filtreler kullanılarak belirli bir boyut aralığına filtrelenir. Filtreleme olmadan, mikrojellerin uygulanabilirliği, mekanik özellikleri ve ilaç salınım özellikleri önemli ölçüde farklı olacaktır. Filtreleme adımı, hidrojellerin boyutu üzerinde hassas kontrol sağlar ve ayrıca pH'a bağlı şişlik ve terapötiklerin sürekli salınımını sergileyen mikrojellerin yüksek verimli üretimine izin verir.

Bu işlemin bir sınırlaması, filtreleme adımının mükemmel küresel bir şekle sahip hidrojellere yol açmamasıdır, bu da bazı uygulamalar için dikkate alınması gereken önemli bir faktör olabilir. Bu nedenle, mikrojellerin karakteristik boyutu, düzensiz şekilli parçacıkları ölçmek için yararlı olan Feret çapı (Şekil 3) kullanılarak tanımlanmıştır39. Mikrojellerin geometrisi mükemmel bir küre olmamasına rağmen, parçacıkların ortalama boyutunun, şırınga filtresinin ağ boyutuna göre kontrol edilmesi kolaydı ve birçok uygulama için mükemmel küresel parçacıklara sahip olmak gerekli değildi. Mikrojellerin polidispersite indeksi (PDI), Feret çapının standart sapmasının büyük bir parçacık popülasyonundan elde edilen ortalama Feret çapına kare oranı kullanılarak ölçülmüştür (n = 74). PDI denklemi kullanılarak 0.076 olarak hesaplanmıştır.

PDI = (s/D)2

burada s, ortalama Feret çapının standart sapmasıdır ve D, ortalama Feret çapı40'tır. Bu işlem sırasında yapılan filtreleme ve düzensiz şekilli parçacıklar için Feret çapının kullanılması nedeniyle, bu parçacıkların polidispersite indeksi, monodispers olarak kabul edilebilecekleri ölçüde oldukça düşüktü.

Gelecekteki araştırmalar için, verilen araştırma ihtiyacına daha iyi uyacak şekilde bu protokolde birkaç değişiklik yapılabilir. Örneğin, sadece iki protein, SDF1-a ve TGF-b3, bu mikrojellerle kontrollü salınımları için incelenmiştir. Önceki çalışmalar, bu biyoaktif faktörlerin in vitro ~ 30 güne kadar sürekli salınımını göstermiştir. Bununla birlikte, nanopartiküller, RNA müdahale eden (RNAi) molekülleri, diğer biyolojikler veya küçük moleküllü ilaçlar gibi diğer ilgili terapötikler, bu kitosan mikrojel teknolojisi ile uygulandığında salınım hızlarını ve etkinliklerini ölçmek için de araştırılabilir. Gelecekte araştırılabilecek bir başka değişken, şırınga filtresinin ağ boyutunu değiştirerek yapılan mikrojellerin boyut aralığını değiştirmektir. Bu aynı zamanda mikrojellerden terapötiklerin salınım hızı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir ve çapraz bağlamanın kimyasını değiştirmeden salınım kinetiği üzerinde uygun kontrol sağlar. Ek olarak, bu protokol, büyük miktarlarda kitosan mikrojelleri üretmek için daha büyük şırıngalar ve filtreler veya vakum filtreleme teknikleri kullanılarak kolayca ölçeklendirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından R03AR068087 ve R21AR071585 ödül numaraları altında ve Boettcher Vakfı (# 11219) tarafından MDK'ya desteklenmiştir. CBE, NIH/NCATS Colorado CTSA Hibe Numarası TL1 TR001081 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
  2. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
  3. Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
  4. Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
  5. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
  6. Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
  7. Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
  8. Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
  9. Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
  10. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  11. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
  12. Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
  13. Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
  14. Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
  15. Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
  16. Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
  17. Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
  18. Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
  19. Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
  20. Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
  21. Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
  22. Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
  23. Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
  24. Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
  25. Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
  26. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
  27. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
  28. Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
  29. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
  30. Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
  31. Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
  32. Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
  33. Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
  34. Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
  35. Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
  36. Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
  37. Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
  38. Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
  39. Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
  40. Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).

Tags

Biyomühendislik Sayı 182
Doku Mühendisliği Uygulamaları için Boyut Kontrollü ve Emülsiyonsuz Kitosan-Genipin Mikrojellerinin İmalatı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stager, M. A., Erickson, C. B.,… More

Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter