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Bioengineering

Fabrication de microgels de chitosane-genipine à taille contrôlée et sans émulsion pour des applications d’ingénierie tissulaire

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Le présent protocole décrit une méthode non basée sur l’émulsion pour la fabrication de microgels de chitosane-genipine. La taille de ces microgels peut être contrôlée avec précision et ils peuvent présenter un gonflement dépendant du pH, se dégrader in vivo et être chargés de molécules thérapeutiques qui se libèrent au fil du temps de manière soutenue, ce qui les rend très pertinents pour les applications d’ingénierie tissulaire.

Abstract

Les microgels de chitosane présentent un intérêt considérable dans l’ingénierie tissulaire en raison de leur large éventail d’applications, de leur faible coût et de leur immunogénicité. Cependant, les microgels de chitosane sont généralement fabriqués à l’aide de méthodes d’émulsion qui nécessitent des rinçages au solvant organique, qui sont toxiques et nocifs pour l’environnement. Le présent protocole présente une méthode rapide, non cytotoxique et sans émulsion pour fabriquer des microgels de chitosane-genipine sans avoir besoin de rinçages au solvant organique. Les microgels décrits ici peuvent être fabriqués avec un contrôle précis de la taille. Ils présentent une libération prolongée de biomolécules, ce qui les rend très pertinents pour l’ingénierie tissulaire, les biomatériaux et la médecine régénérative. Le chitosane est réticulé avec la genipine pour former un réseau d’hydrogel, puis passé à travers un filtre à seringue pour produire les microgels. Les microgels peuvent être filtrés pour créer une gamme de tailles, et ils montrent un gonflement dépendant du pH et se dégradent avec le temps de manière enzymatique. Ces microgels ont été utilisés dans un modèle de lésion de plaque de croissance de rat et il a été démontré qu’ils favorisaient une réparation accrue du tissu cartilagineux et montraient une dégradation complète à 28 jours in vivo. En raison de leur faible coût, de leur grande commodité et de leur facilité de fabrication avec des matériaux cytocompatibles, ces microgels de chitosane présentent une technologie passionnante et unique en ingénierie tissulaire.

Introduction

La plaque de croissance, également connue sous le nom de physis, est la structure cartilagineuse située à l’extrémité des os longs qui médie la croissance chez les enfants. Si la plaque de croissance se blesse, un tissu de réparation connu sous le nom de « barre osseuse » peut se former, ce qui interrompt la croissance normale et peut provoquer des défauts de croissance ou des déformations angulaires. Les données épidémiologiques ont montré que 15% à 30% de toutes les blessures squelettiques infantiles sont liées à la plaque de croissance. La formation de barres osseuses se produit dans jusqu’à 30% de ces blessures, ce qui fait des lésions de la plaque de croissance et de leur traitement associé un problème de manifestation clinique important 1,2,3,4. Lorsque la formation d’une barre osseuse se produit, la voie de traitement la plus courante consiste à résectionner la barre osseuse et à insérer un matériau interpositionnel, tel que le silicium ou le tissu adipeux5. Cependant, les patients qui subissent une chirurgie de résection de la barre osseuse ont souvent un mauvais pronostic pour un rétablissement complet, car il n’existe actuellement aucun traitement capable de réparer complètement une plaque de croissance blessée 6,7,8. À la lumière de ces lacunes, il existe un besoin critique de stratégies efficaces pour traiter les blessures de la plaque de croissance, à la fois pour prévenir la formation d’une barre osseuse et pour régénérer le tissu cartilagineux physaire sain.

Les microparticules d’hydrogel, ou microgels, ont récemment gagné en intérêt en tant qu’échafaudages injectables pouvant fournir une libération prolongée de produits thérapeutiques9. En raison de leur grande accordabilité et de leur biocompatibilité, les microgels sont également bien adaptés à l’encapsulation de facteurs bioactifs ou de cellules. Les microgels peuvent être fabriqués à partir de divers matériaux, allant des polymères synthétiques, tels que le polyéthylène glycol (PEG), aux polymères naturels comme l’alginate ou le chitosane 10,11,12. Il a été démontré que le chitosane a plusieurs effets bénéfiques pour l’ingénierie tissulaire, tels que sa capacité à déstabiliser la membrane externe des bactéries à Gram négatif, offrant ainsi une activité antimicrobienne inhérente1 3,14. De plus, le chitosane est rentable, interactif sur les cellules et facilement modifié à l’aide de sa structure contenant des amines. Les microgels à base de chitosane promettent une stratégie de biomatériau pour l’administration de médicaments et la signalisation des matériaux qui peuvent favoriser la régénération des tissus tout en prévenant les infections bactériennes. Cependant, les microgels de chitosane sont souvent fabriqués avec un large éventail de techniques qui nécessitent un équipement spécial, des techniques d’émulsion ou des rinçages au solvant cytotoxique. Par exemple, certaines études ont fabriqué des microgels de chitosane avec des méthodes à base d’émulsion, mais ces protocoles nécessitent des rinçages au solvant et des réticulants cytotoxiques, ce qui pourrait annuler leur traduction en milieu clinique15,16. D’autres études ont utilisé des approches de microfluidique ou d’électropulvérisation pour fabriquer des microgels de chitosane, qui nécessitent un équipement, une préparation et une formation spéciaux17,18. Les microgels de chitosane sont également couramment fabriqués avec un processus goutte à goutte de réticulant en solution de chitosane; cependant, cette méthode dépend fortement de la viscosité de la solution, de la concentration en polymère et du débit, ce qui rend difficile le contrôle de la taille et de la dispersion des microgels19,20. Inversement, la méthode de fabrication de microgels décrite dans le présent document ne nécessite aucun équipement spécialisé ni rinçage au solvant, ce qui rend ces microgels viables pour la fabrication dans presque tous les laboratoires ou environnements. Par conséquent, ces microgels représentent des biomatériaux très pertinents pour un véhicule d’administration de médicaments rapide, rentable et facile à produire pour de nombreuses applications.

En modulant la composition et les caractéristiques matérielles d’un microgel, les chercheurs peuvent obtenir un contrôle précis sur le microenvironnement cellulaire, dirigeant ainsi le comportement cellulaire d’une manière dépendante du matériau. Les microgels peuvent être utilisés seuls ou combinés avec des systèmes de biomatériaux en vrac pour conférer des fonctionnalités spécifiques, telles que la libération prolongée de facteurs bioactifs ou une signalisation spéciale précise pour les cellules natives ou exogènes. Les biomatériaux et les microgels sont devenus des voies de traitement attrayantes pour les lésions des plaques de croissance. Des efforts importants ont été consacrés au développement de biomatériaux à base d’alginate et de chitosane pour traiter les lésions des plaques de croissance 21,22,23,24,25. En raison de la nature temporelle dynamique de l’ossification de la plaque de croissance et de l’allongement osseux, le mécanisme de formation de la barre osseuse n’est pas entièrement compris. Par conséquent, plusieurs modèles animaux ont été développés pour mieux élucider les mécanismes de l’ossification endochondrale et de la formation de barres osseuses, comme chez les rats, les lapins et les moutons 26,27,28. L’un de ces modèles est un modèle de blessure de plaque de croissance de rat, qui utilise un défaut de trou de forage dans le tibia du rat pour produire une barre osseuse de manière prévisible et reproductible et imite les blessures humaines dans les trois zones de la plaque de croissance29,30. Plusieurs stratégies basées sur les biomatériaux pour traiter les lésions des plaques de croissance ont été testées à l’aide de ce modèle. En outre, deux méthodes différentes pour fabriquer des microgels de chitosane ont été développées, qui peuvent être utilisées comme un système de biomatériaux injectables qui libère des produits thérapeutiques de manière soutenue10,31. Ces microgels ont été utilisés dans un modèle de blessure physique chez le rat, et ils ont montré une amélioration de la régénération du cartilage31 lors de la libération de SDF-1a et TGF-b3. Les techniques fournies dans ce protocole décrivent les méthodes développées pour fabriquer ces microgels de chitosane, qui peuvent ensuite être utilisés dans une grande variété d’applications d’ingénierie tissulaire. Par exemple, des études récentes ont utilisé des microgels de chitosane thermo- ou magento-responsive pour des applications d’administration contrôlée de médicaments oncologiques32,33.

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Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Denver. Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 6 semaines ont été utilisés pour la présente étude. Le modèle de blessure à la plaque de croissance du rat a été créé à la suite d’un rapport30 publié précédemment.

1. Préparation du polymère chitosane

  1. Obtenir du chitosane purifié et lyophilisé de faible poids moléculaire (LMW) à partir de sources disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux).
  2. Ajouter 495 mL d’eau double distillée (ddH2O) et un agitateur dans un bécher de 1 L. Ajouter 5 g de chitosane (étape 1.1.) et bien mélanger.
    REMARQUE: Le chitosane n’est que peu soluble dans une solution aqueuse au pH physiologique, de sorte que le chitosane ne se dissoudra pas facilement à cette étape.
  3. Ajouter 5 mL d’acide acétique glacial à la solution de chitosane préparée ci-dessus.
  4. Remuer à 300 tr/min pendant 18 h avec le bécher fixé au bain-marie maintenu à 50 °C.
  5. À l’aide d’une fiole et d’un entonnoir Büchner, filtrez la solution de chitosane en diminuant les tailles de papier filtre : 22 μm, 8 μm et 2,7 μm (voir tableau des matériaux).
  6. Ajouter la solution de chitosane filtrée au tube de dialyse en cellulose (voir Tableau des matériaux) et laisser dialyser dans ddH2O à température ambiante pendant 4 jours, en changeant le ddH2O tous les jours.
    REMARQUE: Utilisez de l’eau ddH2O ultrapure pour la dernière modification.
  7. Transférer la solution de chitosane dialysée dans un bécher et ajuster le pH à 8,0 à l’aide de 1 M NaOH.
  8. Aliquoter le chitosane dans des tubes centrifuges et centrifuger à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante.
  9. Décantez le surnageant à un flux de déchets et remettez en suspension le chitosane en ddH2O, en répétant 2x.
  10. Congeler puis lyophiliser la pastille de chitosane.
    1. Chaque jour, retirez le produit lyophilisé et enregistrez la masse.
      REMARQUE: Lorsque la masse du produit lyophilisé ne change plus, le produit est complètement séché et peut être conservé à -20 ° C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

2. Fabrication de l’hydrogel de chitosane

  1. Ajouter 2 mL d’acide acétique à 6 % et 120 mg de chitosane purifié (étape 1) à une seringue Luer-lock de 10 mL pour former une solution de chitosane à 6 % p/v.
  2. Connectez la seringue Luer-lock à une autre seringue identique à l’aide d’un connecteur Luer-lock femelle-femelle et mélangez la solution d’avant en arrière pendant 30 s, ou jusqu’à ce que le chitosane soit complètement dissous dans l’acide acétique.
  3. Avant la réticulation, ajoutez tout agent thérapeutique ou bioactif à la solution de chitosane (si nécessaire). Pour la présente étude, 200 ng de SDF-1a et de TGF-b3 (voir tableau des matériaux) ont été ajoutés aux microgels.
    REMARQUE: SDF-1a et TGF-b3 sont des agents bioactifs pertinents pour la régénération des tissus de la plaque de croissance. SDF-1a favorise la migration des cellules souches mésenchymateuses vers le site du défaut, et le TGF-b3 sert de facteur chondrogène pour induire la différenciation de ces cellules souches dans la lignée chondrogène31.
    REMARQUE: Mélanger à nouveau le chitosane entre les seringues pour incorporer complètement le thérapeutique.
  4. Préparer 100 mM de solution de réticulation de genipine (voir tableau des matériaux) dans de l’éthanol à 100 %.
  5. Ajouter 100 μL de la solution de genipine préparée (étape 2.4.) à la seringue contenant du chitosane, et mélanger à nouveau entre les seringues pendant 30 s.
  6. Extruder le mélange de la seringue sur une boîte de Petri de 35 mm, le recouvrir d’un film de paraffine et l’incuber à 37 °C pendant la nuit dans une atmosphère humidifiée.
    REMARQUE: La solution deviendra bleu foncé, indiquant que la réaction de réticulation entre le chitosane et la genipine s’est produite, conduisant à la formation de microgel de chitosane.
  7. Filtrer le microgel de chitosane préparé en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Casser doucement l’hydrogel en plus petits morceaux à l’aide d’une spatule.
      REMARQUE: Les pièces doivent être suffisamment petites pour être transférées à l’arrière d’une seringue de 10 mL, d’environ 1 à 2 cm de diamètre.
    2. Placez un filtre de la taille de maille souhaitée à l’arrière d’une seringue propre de 10 mL.
      REMARQUE: La gamme de taille typique pour les microgels est comprise entre 50 et 200 μm.
    3. Transférer les morceaux de gel cassés dans la seringue équipée du filtre et ajouter 6 mL de ddH2O.
      REMARQUE: Le gel de chitosane gonflera considérablement dans le milieu aqueux, de sorte qu’un grand changement dans le volume de gel est attendu.
    4. Connectez la seringue via un connecteur Luer-lock à une autre seringue propre de 10 mL.
    5. Forcez le mélange gel + eau à travers la seringue avec le filtre pour créer des microgels d’un diamètre maximal spécifié.
      1. Après la première filtration, ouvrez l’arrière de la seringue contenant le filtre et extrudez le mélange dans cette seringue.
      2. Remplacez l’arrière de la seringue et forcez à nouveau le mélange à travers le filtre.
      3. Répétez la filtration 5-6x ou jusqu’à ce qu’il y ait peu de résistance à travers le filtre.
  8. Rincez et purifiez les microgels filtrés.
    1. Transférer le mélange de gel filtré dans un tube conique de 50 mL, porter le volume total à 20 mL avec ddH2O, puis vortexer le mélange pour assurer une dispersion homogène.
    2. Centrifuger les microgels à 100 x g pendant 5 min à température ambiante et décanter la phase aqueuse supérieure.
    3. Remettre en suspension les microgels dans 10 mL d’éthanol à 70%, vortex, et placer sous lumière UV pendant 1 h pour stériliser.
    4. Centrifuger les microgels à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter l’éthanol et rincer 3x avec ddH2O.

3. Préparation de microgels pour des applications in vitro ou in vivo

REMARQUE: Pour la présente étude, la régénération du cartilage dans les lésions de la plaque de croissance a été étudiée dans un modèle de rat. Pour plus de détails, voir la référence31.

  1. Remettre en suspension les granulés de microgel 1:1 dans ddH2O. Les microgels peuvent être conservés jusqu’à 1 mois en suspension dans ddH2O à 4 °C. Si un agent bioactif est utilisé, les microgels doivent être utilisés immédiatement.
  2. Créez le site de la blessure chez l’animal à la suite d’un rapport30 publié précédemment.
  3. Rincer le site de la blessure avec une solution saline et soit garder l’animal non traité (pour l’étude de contrôle), soit injecter les microgels de chitosane uniquement ou les microgels chargés des agents bioactifs (étape 3.2.).
  4. Fermer la plaie chez l’animal et administrer des analgésiques post-chirurgicaux30.
  5. Aux jours 7 ou 28 après la chirurgie, euthanasier le rat par surdosage de CO2 , exciser les membres et effectuer une histologie pour évaluer la réparation tissulaire au site de la blessure31.

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Representative Results

La fabrication réussie de microgels de chitosane repose sur la réaction de réticulation entre la genipine et le chitosane, impliquant spécifiquement les amines sur les chaînes de polymères de chitosane. Contrairement à d’autres techniques de fabrication de microgels, cette méthode ne nécessite pas d’émulsions ou de rinçages au solvant et peut être rapidement et facilement réalisée avec un équipement peu coûteux. Un indicateur caractéristique de la fabrication réussie de microgels est le changement de couleur distinct du blanc cassé au bleu foncé après le mélange du chitosane et de la genipine. La réaction de réticulation entre la genipine et les composés contenant des amines, tels que le chitosane ou d’autres protéines, a été bien caractérisée dans la littérature34. En bref, le mécanisme de réticulation est considéré comme une attaque nucléophile par les groupes aminés du chitosane, dans laquelle la genipine agit comme un dialdéhyde avec des produits de condensation stables35. Les chaînes courtes de la genipine stable et condensée agissent comme des ponts de réticulation entre les polymères de chitosane. La réaction de réticulation fait que la solution devient bleu foncé, probablement en raison de la polymérisation induite par les radicaux oxygénés et de la déshydrogénation des composés intermédiaires, qui suit la réaction d’ouverture de l’anneau de l’attaque nucléophile36.

Une fois que les microgels ont été filtrés et remis en suspension dans une dilution d’eau de 1:1, ils peuvent être facilement utilisés dans diverses applications de biomatériaux. Des travaux ont récemment été publiés en utilisant ces microgels de chitosane sans émulsion pour favoriser la régénération du cartilage dans les lésions des plaques de croissance. Les microgels ont été fabriqués comme décrit ici et soit maintenus vides, soit chargés de SDF-1a et de TGF-b3, qui sont des agents bioactifs pertinents dans la régénération des tissus de la plaque de croissance, le SDF-1a favorisant la migration des cellules souches mésenchymateuses vers le site du défaut et le TGF-b3 servant de facteur chondrogène pour induire la différenciation de ces cellules souches dans la lignée chondrogène37, 38. Le taux de libération des protéines a été quantifié in vitro via ELISA, et la libération de ces molécules a été maintenue au fil du temps31. Ensuite, les microgels ont été injectés dans une lésion de plaque de croissance dans un modèle de rat in vivo , et les microgels injectés ont empêché la formation précoce de barres osseuses in vivo31. Ces microgels de chitosane injectables, rentables et simples à produire pourraient facilement être utilisés dans de nombreuses applications de biomatériaux.

Bien que ce processus de fabrication de microgels ait été optimisé pour une configuration et des applications simples, plusieurs problèmes pourraient encore survenir dont les chercheurs devraient être conscients. Un mélange insuffisant du polymère et des composants de réticulation est la cause la plus probable de résultats différents lors de la fabrication. Le chitosane solide doit être mélangé vigoureusement entre les seringues et la solution de chitosane résultante doit être entièrement homogène avant l’ajout du réticulant à la génoficine. Si la solution n’est pas homogène, les morceaux de chitosane solides restant dans la solution formeront des grumeaux et une réticulation inégale se produira, empêchant un filtrage efficace et entraînant des microgels polydispergés de diamètres significativement variables. Un autre facteur important à prendre en compte lors de la fabrication est d’éviter l’évaporation pendant la période de réticulation, qui doit être évitée avec un film de paraffine ou d’autres techniques de piégeage par évaporation. Si l’hydrogel de chitosane se dessèche, il ne gonflera pas pendant les rinçages à l’eau et ne filtrera pas à travers la seringue. Enfin, les microgels doivent être mis en suspension dans l’excès d’eau pendant le processus de filtration et stockés dans de l’eau à 4 °C lorsqu’ils ne sont pas utilisés. Les microgels ne sont ni extrudables ni injectables à moins d’être mis en suspension dans une dilution d’eau d’au moins 1:1.

La figure 1 donne un aperçu général du processus de fabrication des microgels. Le même processus est représenté à nouveau à la figure 2, qui montre des photographies du processus, mettant l’accent sur les étapes du protocole qui sont difficiles à comprendre à partir du texte seul. Par exemple, la figure 2D montre comment un filtre en treillis métallique est inséré dans la seringue de 10 mL. Une fois complètement installé contre le dessus de la seringue, ce filtre en treillis métallique permet une filtration rapide et pratique des microgels de chitosane sans équipement spécialisé ni solvants. De même, la figure 2E montre l’écoulement du gel de chitosane hydraté à travers le filtre à mailles, qui est à la base de la fabrication de microgels. La figure 3 a été adaptée de notre publication précédente sur ces microgels et montre leur comportement de gonflement dépendant du pH et les différences de taille des microgels en fonction de la taille des pores du filtre à mailles. Différents maillages peuvent être commandés auprès du fabricant, ce qui permet un contrôle pratique de la taille des microgels. Ce contrôle précis de la taille des microgels est très important lors de la conception de systèmes d’administration de médicaments avec des taux de libération de charge thérapeutique bien définis. Des travaux antérieurs sur les microgels ont également montré qu’ils se dégradent de manière significative en présence de lysozyme à 2-4 semaines31. Enfin, la figure 4 montre les imageshistologiques 31 dans un modèle de blessure de plaque de croissance de rat traité avec les microgels de chitosane chargés de SDF-1a et de TGF-b3.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la fabrication de microgel de chitosane. La figure a été créée à l’aide de biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Photographies du procédé de fabrication de microgels. (A) Solution de chitosane dans des seringues connectées à l’aide de Luer lock. B) Extrusion de gel de chitosane dans une boîte de Petri de 35 mm. (C) La récupération du gel de chitosane après la réticulation de la couleur passe du blanc cassé au bleu foncé. (D) Vue de haut en bas à l’intérieur de la seringue montrant le tamis en treillis métallique monté contre la buse de la seringue. (E) Le gel de chitosane a été pressé à travers un filtre à mailles pour produire des microgels. (F) Les microgels ont été stockés dans une dilution 1:1 de ddH2O dans un tube conique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Comportement de gonflement dépendant du pH des microgels. (A) Graphique de distribution normale du diamètre de Feret montrant le comportement de gonflement des microgels en réponse aux changements de pH. (B) Images fluorescentes de microgels fabriqués à l’aide d’un maillage n° 200 (image supérieure : microgels de taille <75 μm) et d’un maillage n° 100 (image inférieure : microgels de taille 75-150 μm). La figure est réimprimée avec la permission de la référence31. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images histologiques dans un modèle de lésion de plaque de croissance de rat traité avec les microgels de chitosane chargés de SDF-1a et de TGF-b3. Images histologiques 10x montrant des tissus de réparation de plaques de croissance intacts (A) et (E), non traités (B) et (F), traités par microgel (C) et (G), microgel + SDF-1a traités (D) et (H), et microgel + TGF-b3 traités (I ), les membres. Aucun jour 7 animaux n’ont été traités avec du microgel + TGFb3. L’hématoxyline bleu Alcian (ABH) colore l’os orange à rouge, le tissu fibreux rose et le cartilage bleu. Le microgel apparaît comme un tissu fibreux rouge foncé. Barres d’échelle = 500 μm. La figure est réimprimée avec la permission de la référence31. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les microgels ont fait l’objet de nombreuses recherches ces dernières années en raison de leur haut niveau d’applicabilité à diverses fins, telles que l’administration de médicaments ou l’encapsulation cellulaire9. La facilité de fabrication de constructions de biomatériaux à micro-échelle est d’une importance significative dans l’ingénierie tissulaire, car elle permet aux chercheurs de développer des stratégies à base d’hydrogel à une taille et à une échelle de temps spécifiques. Cependant, la plupart des méthodes de fabrication de microgels de chitosane nécessitent un équipement et des réactifs coûteux, des émulsions ou des rinçages au solvant cytotoxiques, ce qui empêche leur traduction à l’usage clinique 15,16,17,18,19,20. Ces microgels excellent en termes de commodité de fabrication importante, ne nécessitant aucune technique d’émulsion ou de rinçage au solvant. De plus, ces microgels conservent les propriétés idéales pour une construction issue de l’ingénierie tissulaire, telles que l’enflure dépendante du pH et la charge en médicaments, le comportement de dégradation réglé et la libération soutenue de produits thérapeutiques.

L’étape la plus critique dans la fabrication de ces microgels de chitosane est la filtration entre les seringues. Ces microgels commencent comme de l’hydrogel en vrac et sont filtrés dans une gamme de taille spécifique à l’aide de filtres en treillis métallique. Sans filtrage, l’applicabilité, les propriétés mécaniques et les caractéristiques de libération des médicaments des microgels seraient significativement différentes. L’étape de filtrage permet un contrôle précis de la taille des hydrogels, et elle permet également la fabrication à haut débit de microgels qui présentent un gonflement dépendant du pH et une libération prolongée de produits thérapeutiques.

Une limitation de ce processus est que l’étape de filtrage n’a pas conduit à des hydrogels de forme parfaitement sphérique, ce qui peut être un facteur important à prendre en compte pour certaines applications. Pour cette raison, la taille caractéristique des microgels a été décrite en utilisant le diamètre de Feret (Figure 3), ce qui est utile pour quantifier les particules de forme irrégulière39. Bien que la géométrie des microgels n’était pas une sphère parfaite, la taille moyenne des particules était facile à contrôler en fonction de la taille du maillage du filtre à seringue et, pour de nombreuses applications, il n’était pas nécessaire d’avoir des particules parfaitement sphériques. L’indice de polydispersité (ICP) des microgels a été quantifié en utilisant le rapport carré de l’écart type du diamètre de Feret au diamètre moyen de Feret obtenu à partir d’une grande population de particules (n = 74). L’ICP a été calculé à 0,076 à l’aide de l’équation

ICP = (s/D)2

où s est l’écart-type du diamètre moyen du feret et D est le diamètre moyen duferet 40. En raison du filtrage effectué au cours de ce processus et de l’utilisation du diamètre de la féret pour les particules de forme irrégulière, l’indice de polydispersité de ces particules était assez faible, dans la mesure où elles pouvaient être considérées comme monodispersées.

Pour les recherches futures, plusieurs modifications pourraient être apportées à ce protocole pour mieux répondre au besoin de recherche donné. Par exemple, seules deux protéines, SDF1-a et TGF-b3, ont été étudiées pour leur libération contrôlée avec ces microgels. Des travaux antérieurs ont montré une libération prolongée de ces facteurs bioactifs jusqu’à environ 30 jours in vitro. Cependant, d’autres produits thérapeutiques pertinents, tels que les nanoparticules, les molécules interférant avec l’ARN (ARNi), d’autres produits biologiques ou des médicaments à petites molécules pourraient également être explorés pour quantifier leur taux de libération et leur efficacité lorsqu’ils sont appliqués avec cette technologie de microgel de chitosane. Une autre variable qui pourrait être étudiée à l’avenir est la modification de la gamme de taille des microgels, ce qui se fait simplement en changeant la taille du maillage du filtre de la seringue. Cela pourrait également avoir un impact significatif sur le taux de libération des produits thérapeutiques à partir des microgels, permettant un contrôle pratique de la cinétique de libération sans altérer la chimie de la réticulation. De plus, ce protocole peut être facilement mis à l’échelle à l’aide de seringues et de filtres plus grands ou de techniques de filtration sous vide pour produire de grandes quantités de microgels de chitosane.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées de l’Institut national de la santé sous les numéros d’attribution R03AR068087 et R21AR071585 et par la Fondation Boettcher (n ° 11219) à MDK. CBE a été soutenu par NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingénierie numéro 182
Fabrication de microgels de chitosane-genipine à taille contrôlée et sans émulsion pour des applications d’ingénierie tissulaire
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Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

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