Summary
腸内微生物は、特定のまたは保存されたメカニズム を介して 宿主の健康にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります。 カエノラブディティスエレガンスは 、そのような微生物をスクリーニングするための便利なプラットフォームです。本プロトコルは、線虫の健康状態の代理として使用される、線虫ストレス耐性への影響についての48の細菌分離株のハイスループットスクリーニングを記載している。
Abstract
Caenorhabditis elegansは、サイズが小さく、寿命が短く、遺伝学が容易なため、微生物分離株が宿主生理機能に与える影響を研究するための便利なプラットフォームを提供します。また、死ぬと青色に蛍光を発し、死を特定する便利な手段を提供します。この特性を利用して、ハイスループットラベルフリーのC.エレガンス生存アッセイ(LFASS)を開発しました。これらには、マルチウェルプレートにセットされた線虫集団のタイムラプス蛍光記録が含まれ、そこから集団死亡時間の中央値を導き出すことができます。本研究では、LFASSアプローチを採用して、複数の微生物分離株を一度にスクリーニングし、 C.エレガンス 重度の熱および酸化ストレスに対する感受性。このような微生物スクリーニングパイプラインは、特にプロバイオティクスをプレスクリーニングするために使用でき、宿主の健康の代理として重度のストレス耐性を使用することがここで報告されています。このプロトコルでは、C. elegans腸内細菌叢分離コレクションと同期線虫集団の両方をマルチウェルアレイで増殖させてから、アッセイのためにそれらを組み合わせる方法を説明しています。提供された例は、2つのストレスアッセイを並行して行う2つのワーム株に対する47の細菌分離株と1つの対照株のテストをカバーしています。ただし、アプローチパイプラインは容易に拡張可能であり、他の多くのモダリティのスクリーニングに適用できます。したがって、C.エレガンスの健康に影響を与える生物学的および生化学的条件のマルチパラメトリックランドスケープを迅速に調査するための汎用性の高いセットアップを提供します。
Introduction
人体には、主に腸、皮膚、粘膜環境に見られる推定10〜100兆個の生きた微生物細胞(細菌、古細菌)が生息しています1。健康な状態では、これらはビタミン産生、免疫系の成熟、病原体に対する自然免疫応答および適応免疫応答の刺激、脂肪代謝の調節、ストレス応答の調節など、宿主に利益をもたらし、成長と発達、疾患の発症、および老化に影響を与えます2,3,4,5.腸内細菌叢も生涯を通じてかなり進化します。最も劇的な進化は乳児期と幼児期に起こりますが6、ビフィズス菌の存在量の減少やクロストリジウム、ラクトバチルス、腸内細菌科、 エンテロコッカス種の増加など、年齢とともに大きな変化も起こります7。ライフスタイルは腸内微生物の組成をさらに変化させ、腸内細菌叢症(有益な細菌の喪失、日和見細菌の異常増殖)を引き起こし、炎症性腸疾患、糖尿病、肥満などのさまざまな病状を引き起こす可能性があります5だけでなく、アルツハイマー病やパーキンソン病にも寄与します8,9,10,11。
この認識は、腸生理学(現在はその中の微生物を含む)と神経系の間の相互作用が動物の代謝と生理学的機能の主要な調節因子と考えられている腸脳軸(GBA)の概念の洗練に大きく貢献しています12。しかし、腸脳シグナル伝達における微生物叢の正確な役割とそれに関連する作用機序は完全には理解されていません13。腸内細菌叢が健康的な老化の重要な決定要因であるため、細菌が老化プロセスをどのように調節するかは、激しい研究と論争の対象となっています6,14,15。
回虫Caenorhabditis elegansが、他の種と同様に、バクテロイデス、ファーミキューテス、および放線菌によって優勢な正真正銘の腸内細菌叢を宿主としていることの実証により16,17,18,19,20、宿主と腸の共生相互作用を研究するための実験プラットフォームとしての急速な台頭21,22,23,24、25,26は、調査兵器26,27,28,29を大幅に拡大しました。特に、C.エレガンスが遺伝子-食事、遺伝子-薬物、遺伝子-病原体などの相互作用を研究するために利用できるハイスループット実験アプローチを適応させて、細菌分離株とカクテルがC.エレガンスの健康と老化にどのように影響するかを迅速に調査することができます。
本プロトコルは、健康の代理として C.エレガンスの ストレス耐性への影響についてマルチウェルプレートにセットされた細菌分離株または混合物のアレイを一度にスクリーニングするための実験パイプラインを説明し、プロバイオティクスを同定するために使用することができる。蛍光プレートリーダーを使用した自動ストレス耐性分析のためにワームを処理する前に、大規模なワーム集団を増殖させ、96ウェルおよび384ウェルプレートフォーマットで細菌アレイを処理する方法について詳しく説明します(図1)。このアプローチは、死に至る線虫が死の時間を特定するために使用できる青色蛍光のバーストを生成する死の蛍光31 の現象を利用するラベルフリー自動生存アッセイ(LFASS)30に基づいています。青色蛍光は、 C.エレガンス 腸顆粒(リソソーム関連オルガネラの一種)に貯蔵されたアントラニル酸のグルコシルエステルによって放出され、死亡時に線虫腸内で壊死カスケードがトリガーされると破裂します31。
図1: ストレスに対するC.エレガンスの 耐性に影響を与える細菌分離株のハイスループットスクリーニングのための実験ワークフロー 。 (A)ワームとバクテリアのメンテナンスとアッセイのセットアップのタイムライン。(B)96ウェル細菌プレートアレイのセットアップと取り扱い。(C)384ウェルウォームプレートのセットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究で並行して使用された2つの C.エレガンス 株は、ブリストルN2野生型とHT1890: daf-16(mgDf50)であり、これらは同様の速度で成長します。しかしながら、プロトコルは、類似した増殖速度を有する2つの株の任意の組み合わせで複製することができる。他の株(例えば、野生型と成長の遅い daf-2 変異体)を並行して試験する場合、異なる増殖速度を考慮する必要があり、それに応じてプロトコルを調整する必要があることに注意してください。以下のプロトコルのワームとバクテリアのタイムスケールと量は、テトラプリケートの2つのLFASSアッセイで2つのワーム株で48の細菌分離株を並行してテストするために最適化されています。より多くの条件を並行してテストする場合は、調整が必要になります。 大腸菌 OP50細菌株は、ミネソタ大学のカエノラブディティス遺伝学センター(CGC)から入手した。48の細菌分離株は、Schulenburgラボから取得され、LB寒天培地で維持されました。
1. OP50で培養する C.エレガンス (1日目から8日目)
注:現在のアプローチは、すべての段階で固体培地上でC.エレガンス雌雄同体を成長させることを目的としており、不必要な食事の変更を回避します(つまり、NA22などの代替のより急速に成長する大腸菌株または卵板などのより豊富な増殖培地を使用)まだ広く使用されている標準的な成長条件32,33に可能な限り近いままにします。線虫の成長温度(ここでは15°Cに設定)は、使用するC.エレガンス株に依存し、調整が必要な場合があります(たとえば、温度感受性表現型またはバイオマーカーの発現を回避またはトリガーするため)。ワーム飼育については、参考文献33を参照してください。
- 直径6cmのNGMプレート(線虫増殖培地寒天培地10mL、NGM、補足ファイル1)32,33を8枚用意し、室温で1日間乾燥させます。
- 50 mLコニカルチューブ内の25 mLのOP50培地(補足ファイル1)に、新たに成長したLysogeny Broth寒天培地(LB寒天培地、補足ファイル1)プレートから単一の細菌クローンを播種することにより、大腸菌OP50細菌の飽和液体培養を準備します。培養物をシェーカーインキュベーター内で37°Cで一晩増殖させる。
- 1株あたり8枚の6 cm NGMプレートに、プレートあたり100 μLの大腸 菌 OP50の飽和液体培養液を接種し、プレートを20°Cに2日間保ってから使用します。
- メスを使用して、最近飢餓したNGMプレートからワームを含む0.5 cmの正方形の寒天チャンクを切り取り、接種した8つの6 cm NGMプレートのそれぞれに移し、これらのプレートを20°Cで3日間(またはワームが餌を食べ終わるまで)インキュベートします。
- ワーム株ごとに5つの15 cm NGMプレートを準備し(プレートあたり30 mLのNGM培地)、3 mLのOP50を接種します。プレートを乾燥させてから、37°Cで一晩インキュベートします。後のステップで使用するまで、プレートを20°Cに保ちます。
- P-1000ピペットを使用して、最大3 mLの滅菌M9バッファー(補足ファイル1)を6 cm NGMプレート(ステップ1.1)に加えてワームを再懸濁し、1つの15 mLコニカルチューブで1株ごとに8つのプレートすべてからワーム溶液を回収します。
- 142 x g で 4 °C で 2 分間遠心分離します。 P-5000ピペットまたは滅菌パスツールピペットまたはチップを備えたウォーターポンプを使用して、上清を慎重に除去します。10 mLの滅菌M9バッファーを加えて、ワームペレットを洗浄します。2回繰り返します。
- 上清を(可能な限り)除去し、ピペットを使用してワームを15 cm OP50接種NGMプレートに移します(ステップ1.5)。0.5 mLの濃縮OP50培養液を追加します。
- 濃縮OP50を作るには、LBの1 Lボトル4本にそれぞれ2 mLのOP50スターター培養液(ステップ1.2で調製)を接種し、振とうインキュベーター内で37°C、160 x gで6時間増殖させます。細菌を3057 x g 、20°Cで15分間ペレット化します。上清を廃棄し、細菌ペレットを6 mLのOP50培地で再懸濁し、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに回収します。
注:細菌は4°Cで最大1週間保存できます。
- 直径15 cmのNGMプレート上で、毎日0.5 mLの濃縮OP50をワームに再給餌することにより、15°Cで3〜4日間、各ワーム株を増殖させます。
- ワームが餌をほぼ食べ終わったら、M9バッファーで集めて洗浄し(ステップ1.6.1)、各ワーム株培養物を2つの15 cm NGMプレートに移し(ステップ1.5)、個体数の~95%が妊娠成虫になるまで20°Cでワームを繁殖させます(野生型ブリストルN2の場合は約24時間かかります)。
注:妊娠した成虫は、ワーム内に卵が存在することを特徴とし、理想的なプレートには、幼虫が多すぎずにプレート上に大量の孵化していない卵が置かれている必要があります33。
- ワームが餌をほぼ食べ終わったら、M9バッファーで集めて洗浄し(ステップ1.6.1)、各ワーム株培養物を2つの15 cm NGMプレートに移し(ステップ1.5)、個体数の~95%が妊娠成虫になるまで20°Cでワームを繁殖させます(野生型ブリストルN2の場合は約24時間かかります)。
2.腸内細菌叢分離コレクションの維持(9日目)
- 48個の細菌分離株を個々の6 cm LB寒天プレートにストリークし、20°Cで48時間増殖させます。
注:細菌は、必要に応じて25°Cで24〜36時間増殖させることができますが、20°Cの増殖が長いほど、潜在的な汚染物質を見つけることができます。 - 多数のC.エレガンスを同期させます。
- 標準的な卵の準備方法33 に従って妊娠した成虫を漂白し、卵を播種していない2つの15 cm NGMプレートに15°Cで24時間移して、すべてのL1幼虫が後続のステップで孵化して同期的に成長できるようにします。
注意: 漂白剤溶液を取り扱うときは注意してください。
- 標準的な卵の準備方法33 に従って妊娠した成虫を漂白し、卵を播種していない2つの15 cm NGMプレートに15°Cで24時間移して、すべてのL1幼虫が後続のステップで孵化して同期的に成長できるようにします。
3.大規模なC.エレガンス培養の成長(10日目)
- 孵化したら、L1幼虫(ステップ2.2.1から)をきれいな円錐形の15 mLチューブに3〜4 mLのM9で集めます。10 μLのワーム溶液4滴をスライドまたはプレートにピペットで移し、実体顕微鏡下で16倍の倍率で各滴中のワームの数をカウントします。ワーム溶液のすべての滴からの幼虫の数を平均することによって、溶液のワーム濃度を決定する。この値に残りの量を掛けて、各菌株の合計ワーム数を推定します。
注:この段階では、後で384ウェルプレートまたは2つのハーフプレートを満たすために、株あたり46,000〜50,000 L1幼虫が必要です。- 各菌株について、すべてのL1幼虫を2つの15 cm NGMプレート(プレートあたり23,000〜25,000 L1)に移し、3 mLのOP50を事前に接種し(ステップ1.5)、0.5 mLの濃縮OP50を再播種します。
- 15°Cでインキュベートし、ワームがL4段階に達するまで、必要に応じて毎日0.5 mLの濃縮OP50を補充します。
注:L4ステージは、わずかに暗い腸と、外陰部が最終的に32,33を形成する半円盤または三日月形の白いパッチが特徴です。 - 以下の手順に従って96ウェルNGM-アガロースプレートを準備します。
- 各ウェルに125 μLのNGMアガロースを充填することにより、8枚の96ウェルNGM-アガロースプレートを調製します(アッセイごとに4枚のプレート)。
注意: 後続の手順で一部が汚染された場合は、いくつかの追加のプレートをメッキすることをお勧めします。アッセイを並行して実行するには2つのプレートリーダーが必要ですが、わずか6時間で実行できるため、熱ストレスアッセイから連続して実行することもできます。これらのプレートでは、<4%の灰寒天がアガロースで置換されており( 材料の表を参照)、NGMプラグ全体でよりゆっくりと均一な乾燥を可能にし、ワームの穴掘りを減らしてより良い回収を可能にします。 - ウェルが均等に満たされ、気泡がないことを確認してください。プロセス中に混合物が固まらないように、70°Cに設定されたヒートブロックを使用します(マルチウェルプレートのプラスチックを介した熱伝達が遅いため、NGM-アガロースは約55〜60°Cまでしか加熱できません)。ウェル内の気泡を除去するには、滅菌火炎加熱針を使用します。
- 96ウェルプレートを無菌環境で室温にセットしてから反転させ(結露を防ぐために蓋を下ろします)、必要になるまでクリーンボックスに4°Cで保管します。
- 各ウェルに125 μLのNGMアガロースを充填することにより、8枚の96ウェルNGM-アガロースプレートを調製します(アッセイごとに4枚のプレート)。
- 11日目に、ステップ3.2のワームをチェックし、汚染が発生しておらず、ワームがまだいっぱいであることを確認します。
- 12日目に、ステップ3.1のワームをチェックし、汚染が発生しておらず、ワームがまだいっぱいであることを確認します。また、ワームの発生段階を確認してください。
注:使用されるL4またはL4 + 24時間のワームなど、ワームの性別/系統および発生段階は、ワームが受ける治療によって異なります。ここでは、野生型の雌雄同体をL4からの細菌分離株に36時間曝露した。
4.ワームを再給餌するための腸内細菌叢分離コレクションの準備
- ステップ2.1からLB寒天プレート上の細菌増殖を監視します。20°Cでインキュベートを続けます。
注:理想的ではありませんが、一部のクローンが成長しない、または汚染を明らかにしない場合は、細菌をクリーンストックから6 cm LBプレートに再ストリークし、25〜28°Cで24時間成長させて実験の準備をすることができます。 - テスト対象の細菌コレクションの96ウェルアレイレイアウトを定義し、後続のステップでの体系的なプレート播種とデータ分析を容易にします(補足表1)。
- 各6 cm細菌プレートから細菌塊を収集し(ステップ4.1)、1 mLのM9バッファーを含む標識された1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。これは、直径2mmの使い捨て滅菌プラスチックループまたは直径5mmの金属ループを使用して実行します。細菌株間の金属ループを100%エタノールに浸し、炎上させ、5秒間冷却して滅菌します。
- 細菌ペレットが完全に再懸濁されるまで、マイクロ遠心チューブをボルテックスします(細菌株によっては、~1〜10秒かかる場合があります)。
- 室温で9,300 x g で5分間スピンダウンし、700 μLの上清を除去し、ボルテックスによって細菌ペレットを再懸濁します。
- 各細菌懸濁液200 μLを、ステップ4.2に記載されているレイアウトに従って、空の滅菌96ウェルプレートの単一ウェルに移します。
- このプレートから、マルチチャンネルピペットを使用して8枚の96ウェルNGM-アガロースプレート(ステップ3.3で調製)に10 μLの細菌溶液を接種し、蓋をした状態で25°Cで24時間インキュベートします。プレートの乾燥と細菌の好気性増殖を可能にし、過剰な結露を避けるために、プレートを密封しないでください。
- ステップ4.6で準備した96ウェルサスペンションプレートを密封します。きれいな粘着シーリングフィルム( 材料の表を参照)を使用し、15°Cで最大5日間保管します。これは、必要に応じてワームの再給餌に使用されます。
5. LFASSヒートショックと酸化アッセイのセットアップ(13〜14日目)
- ステップ3.5のプレートを見て、ワームの発生段階を評価します。ワームの>90%がL434に達したら、15 mLコニカルチューブ内の最大10 mLの滅菌M9溶液にワームを収集します。
- 142 x g で4°Cで2分間スピンダウンし、上清を取り除き、各洗浄の間に10 mLの新鮮な滅菌M9を加えてOP50細菌を取り除くことにより、ワームを広範囲に(少なくとも4x)洗浄します。ワームペレットを10 mLのM9に再懸濁します。
- 50 μLのワーム溶液を、950 μLのM9を含む低表面結合チューブ( 材料の表を参照)に移します。ワームの沈降を避けるためにチューブの内容物を穏やかに混合した後、濡れた低結合ピペットチップを使用して、スライドガラスまたはNGMプレートに3〜4個の別々の10 μL滴を移し、実体顕微鏡( 材料の表を参照)でワーム数を16倍の倍率でカウントします。3〜4滴のカウントを平均し、ワーム溶液中のマイクロリットルあたりのワームの数を決定します(ステップ3.1を参照)。
- 10 mLチューブ内のワーム濃度を調整して、8 μLで~120ワームに到達します。ステップ5.2で調製した溶液の場合。十分に濃縮されていない場合は、ワームをスピンダウンし、それに応じてM9を除去して、8μLあたり120ワームに到達します。
- マルチチャンネルピペットまたはリピートピペットを使用して、ステップ4.7の8つの96ウェルNGMアガロースプレートの各ウェルに8 μLのワーム溶液(~120ワーム)を移します。ワームの損失を制限するために、保持期間の少ないヒントを使用してください。また、大きな成虫が成虫への機械的ストレスを制限できるように、先端を切る必要があるかもしれません。
注:このアッセイでは、確実に機能するために最低30匹の生きた健康なワームが必要ですが、ウェルあたり約100匹のワームで最適に機能します。 - ワームと細菌を播種した96ウェルNGMアガロースプレートを25°Cで36時間インキュベートします。
- 12〜24時間の間にプレートをチェックし、ワームが全体を通していっぱいのままであることを確認します。再給餌が必要な場合は、ステップ4.8で15°Cで保存した96ウェル細菌アレイプレート内に細菌を再懸濁し、36時間のインキュベーション期間が終了する前に、ワームが飢餓のリスクがある96ウェルNGM-アガロースプレートに対応する細菌溶液を最大10 μL追加します(飢餓状態のワームは大きく異なる結果をもたらします。 したがって、これは非常に重要です)。
注:次の手順は15日目に実行する必要があります。アッセイを開始する前に、読み取り高さを最適化する必要がある場合があります。最適な読み取り値は、ウェルの底から20〜50μm上で達成されます。これは、プレートリーダーのモデルによって異なります。Z-スキャンが可能なものもあれば、手動で高さを入力できるものもあります。最高の青色蛍光(365 nm/430 nm)シグナルが検出されるレベルで最適な高さを設定します。プレートリーダーの中には、接着細胞アッセイ用に最適化された固定高さで動作するものがあり、LFASSアッセイには理想的ではない場合があります。 - 36時間後、30 μLのM9を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。
注意: 熱ストレスアッセイの場合、プレートリーダーはアッセイを実行するために必要な温度に達している必要があり、事前にオンにする必要があります。現在のプロトコルでは、殺傷速度を最大化するために42°Cを使用していますが、このアプローチは30°Cを超える他の温度にも適用されます。 - 低保持チップを使用して、設定されたレイアウトに従ってワーム(約20 μL)を384ウェルプレートに移します(大きなワームが成虫の機械的ストレスを軽減できるように、チップの端を切り取ることを検討してください)。
注:本研究では、ここで説明する2つのアッセイ(熱ストレスと酸化ストレス)に2つの異なるプレートリーダー設定が使用されるため、これら2つのアッセイを対象としたサンプルを同じ384ウェルプレートにプレーティングしないでください。 - プレートリーダーが正しくセットアップされていることを確認します(表1)。
- 384ウェルプレートにさらにM9を補充し、ウェルあたり60 μLの最終容量を目指します。熱ストレスアッセイの場合は40 μLのM9を加え、t-BHP誘発酸化ストレスの場合は6 μlのt-BHPに34 μlのM9を加えます(材料の表を参照)。
- t-BHPを追加してから2分以内にアッセイを開始します(理想的には、すべてのワームを同時にt-BHPに曝露する必要があり、アッセイ時間の分解能は2分です)。不可能な場合は、タイマーを使用してアッセイ開始前にt-BHPをピペッティングするのに費やした時間を推定し、後で死亡時間の中央値を調整できるようにします。
- 透明な蓋でプレートを閉じます。384ウェルプレートの端をマスキングテープ(プレートと蓋の上にテープで貼る)で密封し、テープが蓋の上やプレートの下に入らないようにします。メスを使用して蓋とプレートの間にテープを間隔を置いてスリットし、アッセイ中の蒸発を最小限に抑えながら空気交換を可能にします。
- プレートをプレートリーダーに挿入し( 材料表を参照)、実行を開始します。365 nmで励起し、435 nmで2分ごとに6〜12時間発光を検出することを目指します(表1)。
注:通常、42°Cの熱ストレスアッセイには6時間、7%t-BHP酸化ストレスアッセイには8時間で十分です。
6. プレートリーダーのデータ処理
- プレートリーダーからの生の蛍光データをカンマまたはタブ区切りの.txt、.csv、または.xls/.xlsx形式で保存し、xls /.xlsx形式に変換します。データ形式に応じて、LFASS分析に必要なExcelシートレイアウトに合わせて再編成します。参考文献30に記載されている詳細な指示に従ってください。
注:データは手動で分析し、各時系列を正規化し、死亡蛍光が半極大に達する時間を探すことができますが、LFASSルーチン30を実行するMatlabで自動分析を実行できます。 - https://github.com/ABA80/LFASS からMatlab(バージョン2014a以上)とLFASSソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールします。その中にあるガイドラインと注釈に従ってください。
メモ: 図 1C に、このアプローチの簡単な説明を示します。LFASSルーチンを実行するには、Matlabが必要です。あるいは、Matlabコードは、独自のフィッティング関数を除いて、Oracleに変換することもできます。新しいスムージング関数とシグモイド関数を書き直して、完全にオープンソースのプラットフォームで使用できるようにすることができます。 - LFASS解析ではデータフォルダ内のすべてのファイルが処理され、結果フォルダ内のファイルが上書きされるため、LFASS解析と結果を新しい場所に移動します。
7. データ検査
- Excelファイルを開き、384ウェルプレート上のウェル位置に従って行にラベルを付けます。 補足ファイル2 は、ヒートショックアッセイ用に生成された生の蛍光データのExcelファイルの例を示す。384ウェルプレートのウェル位置を使用して、ワームおよび細菌株を標識します。
- Matlab分析の前に、Excelでデータを視覚的に検査し、代表的なウェルの蛍光強度を経時的にプロットします。使用するプレートリーダーによっては、データにノイズが多い場合がありますが、明確なピークが表示されるはずです。特に:
- ピークがノイズと有意に異ならない蛍光値を決定します(LFASSでこのようなしきい値を設定すると、空のウェルを除外して分析が高速化されます)。
- 上昇する前に蛍光の変動が減衰する最も早い時点に注意してください(動物は最大30分間激しく叩きつけ、青色の蛍光測定値が急速に変動する可能性があります)。
注: ピークフィットは、カーブフィットウィンドウからこれらの初期の時点を除外することで改善される場合があります。 - カーブフィッティングに使用されるため、最小蛍光値と最大蛍光値が下がると予想される時点に注意してください(これらの範囲を特定するためにいくつかのウェルを見てください)。
- 蛍光ピークの振幅がウェル間で有意に異なるかどうかを確認し、次の式を使用してさらに分析する前にデータを正規化します。
正規化蛍光ウェルn(t)=(蛍光ウェルn[t]-最小蛍光ウェル[Dt])/(最大蛍光ウェル[Dt]-最小蛍光ウェル[Dt])
ここで、「n」は現在のウェル番号、「t」は時点、「Dt」はアッセイの一連の時点です。
8. LFASSデータ処理
注:詳細は、参考文献30の https://github.com/ABA80/LFASS および補足資料に記載されています。
- LFASS フォルダー内に 2 つのサブフォルダーを作成し、1 つは分析するデータ用、もう 1 つは結果 ("マイ データ" や "結果" など) 用です。
- データ検査後、アッセイエクセルデータファイルをLFASSサブフォルダー「マイデータ」にコピーします。
- MATLABを起動し、LFASSフォルダーに移動し、コマンドウィンドウ(補足ファイル3)にfitfolderと入力して実行します。次に、画面の指示に従います。
- 「fitfolder」と入力すると、システムはExcelファイルが配置されているフォルダーの名前(「マイデータ」など)を尋ねられます。データ フォルダーの名前を入力します (この例では "マイ データ")。
- 画面の指示に従って、要求されたさまざまなパラメーターを入力します。
- 現在のプロトコルで連続する測定間の時間間隔として「2」を入力します(これを指定すると、結果をタイムポイント単位ではなく分で表すことができます)。
注:時間間隔は、蛍光測定を多かれ少なかれ頻繁に実行するように変更でき(時間分解能を増減するため)、プレートリーダーの機能に応じて(つまり、十分な速度で測定を実行できないプレートリーダーの場合は時間間隔を増やす必要がある場合があります)。実験時間間隔を LFASS ルーチンと常に一致させてください。 - 「0.95」と入力して上側公差しきい値を割り当て(これはフィットを改善するために必要に応じて変更できます)、下側許容しきい値に「0.05」と入力して割り当て(これはフィットを改善するために必要に応じて変更できます)、シグモイドフィットを拘束します。
注: その他の時間パラメータは、データ インスペクションからのユーザ メモに基づいています (ステップ 7.2)。
- 現在のプロトコルで連続する測定間の時間間隔として「2」を入力します(これを指定すると、結果をタイムポイント単位ではなく分で表すことができます)。
- フィットおよびスムージングされたカーブを表示するかどうかを選択するには、プロンプトが表示されたら「はい」に「y」、NOに「n」と入力します。収束適合を視覚的に検査するには、前者を選択します。
注: 後者は、平滑化されたすべてのデータを視覚化するのに便利ですが、生成されるポップアップ グラフが多すぎるため、通常は選択されません。これに続いて、MatlabはLFASSルーチンを実行しますが、複数のExcelファイルが一度に処理されている場合は1〜10分かかる場合があります。曲線のあるポップアップウィンドウは、ステップ8.6の選択に従って表示されます。 補足ファイル4A は、フィット曲線の例を示しています。 - (1)ノイズとして識別されたカーブを解析するか、(2)[y/n]オプションを使用して適合不良のカーブを再修正するかを選択します。承認するには「 y 」、拒否するには 「n 」と入力します。
注記: 特に、適合不良または不適合のカーブが多数ある場合は、再フィットを承認することをお勧めします。これにより、ユーザーは画面に表示される各カーブに合わせたカーブフィットパラメータを提供し、シグモイドフィットの前後の境界のみを要求できます。必要な回数だけ試行できます。 - データが分析されたら、Matlabを閉じて LFASS フォルダーを開きます。
- LFASSサブフォルダをクリックします 私の結果、結果ファイルは.txtとして 結果フォルダに自動的に保存されます。
注: Matlab は、"バッチ適合.txt"、"バッチおよびノイズ適合.txt"、および "再適合.txt" の 3 つの.txtファイルを生成します。前者の2つは、再調整中にコンピューターがクラッシュしたりユーザーエラーが発生したりした場合の予防措置として保存されます。最も正確な完全な分析を含むファイルは「再適合.txt」です。 - Microsoft Excelでファイル再 調整.txt を開き、さらに処理するために.xlsとして保存します。 補足ファイル4B は、このような結果ファイルの例を示しています。
注:各ウェル(行に編成)について、ワーム集団の死亡時間の中央値の推定値を示す3つの値が列に提供されます。 「生」:実験データピークの半極大で交差する時間を報告します。「バッチフィット」: バッチフィット曲線の半値で交差する時間を報告します。「再フィット」: 再フィット曲線の半値で交差する時間を報告します。 - ファイルを.xls形式でコピーとして安全な場所に保存します。これを行わないと、LFASS ルーチンの次の実行時にファイルが上書きされるリスクがあります。
注:その後、結果はグラフ化または統計分析のためにさらに処理できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LFASSアッセイは、ストレス耐性や老化に寄与する多数の遺伝的および微生物叢パラメータのスクリーニングなど、複数の試験条件の堅牢でハイスループットかつ迅速なスクリーニングを一度に提供します。実験が複数のテスト条件の広範なデータセットを取得するのに2〜3週間しかかかりません。L4 + 36時間の成体野生型ワーム集団は、48腸内微生物分離株で36時間培養した後、42°Cの熱ストレスと7% t-BHP誘発酸化ストレスにさらされました。アッセイは4回実施され、各条件は各アッセイで4回複製された。テストされたすべての条件にわたって、死亡時間の中央値は、熱ストレスアッセイで40〜130分、 t-BHP誘発酸化ストレスアッセイで90〜240分の間で変化しました。成人期初期の熱ストレスアッセイは、通常、酸化ストレスアッセイよりも一貫性のある結果を示し、日中および日中の変動が少なく、その後の寿命のより良い予測因子です30。異なる微生物食を与えられたワームの死亡時間の中央値の違いは、腸の共生が宿主のストレス耐性にどのように影響するかを決定的に例示しています。 図 2は、目的の2つの腸内細菌叢分離株と標準的な実験室株 大腸菌 OP50に対するブリストルN2野生型ワームの16の生物学的複製からの典型的な結果を示しています。
図2:2つの細菌分離株と対照株で増殖したワームからの熱/酸化ストレス耐性ペアアッセイの代表的な結果。 (A)熱ストレスアッセイ。野生型ワームは、MYb11(シュードモナス・ルリダ)またはMYb115(シュードモナスプ)の分離株またはOP50コントロール細菌のいずれかに36時間給餌されました。MYb11は死亡時間の中央値が有意に早くなった(p < 0.001)。(B)酸化ストレスアッセイ。野生型ワームは、MYb11またはMYb115細菌分離株またはOP50対照細菌のいずれかに36時間給餌されました。MYb11は死亡時間の中央値が有意に早くなりました(p < 0.05)。120〜150匹のワームを4セットのサンプルで分析し、各実験を4連で実行しました。質の悪い/適合度の低いデータの井戸は欠損値につながりました。箱ひげ図の表現は、単一ウェル値、最小値、中央値、および最大値を示します。*は、一元配置分散分析で、p < 0.05および ***p < 0.001 での統計的有意性を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ある | |||
| パラメーター | 設定 | コメント | |
| 温度 | 25 °C | ||
| 蛍光励起 | 365 ナノメートル | 10 nm の帯域幅 | |
| 蛍光発光 | 430 nm | 20nmの帯域幅 | |
| 点滅回数 | 8回点滅、1msのセトリング時間 | ||
| 得 | 100から130 | サンプルに応じて調整します。アッセイ開始時に2〜5 kの読み取り値を目指します | |
| ラグタイム | 1 マイクロ秒 | ||
| 積分時間 | 30マイクロ秒 | ||
| 読み取り時間間隔 | 2分ごと | ストレスの重症度に応じて、期間と時間間隔を調整する必要がある場合があります(7%t-BHPで8時間で十分です) | |
| 期間 | 8-12時間 | ||
| 読み取り方向 | 下から | ||
| B | |||
| パラメーター | 設定 | コメント | |
| 温度 | 42 °C | ||
| 蛍光励起 | 365 ナノメートル | 10 nm の帯域幅 | |
| 蛍光発光 | 430 nm | 20nmの帯域幅 | |
| 点滅回数 | 8回点滅、1msのセトリング時間 | ||
| 得 | 100から130 | サンプルに応じて調整します。アッセイ開始時に2〜5 kの読み取り値を目指します | |
| ラグタイム | 1 マイクロ秒 | ||
| 積分時間 | 30マイクロ秒 | ||
| 読み取り時間間隔 | 2分ごと | ストレスの重大度、期間、時間間隔によっては調整が必要な場合があります(42°Cで6時間で十分です) | |
| 期間 | 6-12時間 | ||
| 読み取り方向 | 下から | ||
表1:酸化および熱ストレスアッセイの設定。 この研究で使用した蛍光プレートリーダーの酸化(A)および熱(B)ストレスアッセイに使用される設定の例。
補足ファイル1:培地、バッファー、および培養レシピ。 本研究で使用したさまざまな培地、バッファー、および培養物の組成。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:プレートリーダーからの生の蛍光データをエクスポートしてExcel.xls形式に変換した後。 (A)エクセルファイルは、ヒートショックアッセイの生の蛍光データを示しています。生の蛍光データは2分間隔で示される。(B)384ウェルプレート上の「ウェル位置」のカラムが強調表示され、ワームおよび細菌株の標識に使用できます。(C)ファイルは、ワームおよび細菌株でラベル付けされています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:Matlabを使用したLFASS分析。 (A) MatlabでLFASSフォルダを開くと、コマンドウィンドウがポップアップします。(B)コマンドウィンドウに「fitfolder」と入力してプログラムを起動し、分析するファイルを含むフォルダー名を示します。(C)プログラムが分析用のデータExcelファイルを見つけたら、ユーザーは画面の指示に従って、要求されたさまざまなパラメーターを提供する必要があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:Matlabを使用してLFASSデータを分析しました。 (A)Matlab解析によるカーブフィットの例で、黒い線はカーブフィッティングの前の時間境界に対応する時間ポイントを示し、青い線は後の時間境界を示します。適合シグモイド曲線は赤で表示されます。(B) Matlabによって生成された結果ファイルは.xls形式で開かれます。値が強調表示され、数値形式で表示されます。2 番目の列は、生データ曲線の値が最初に最大値の 50% を超えた時間を示します。3列目は、バッチフィット解析中に決定された適合曲線の値が最大値の50%に等しい時間を示します。4番目の列は、バッチ分析と必要に応じて最終修正を行った後、適合曲線上の値が最大値の50%に等しくなる時間を示します。したがって、4番目の列は最も信頼性の高い結果を提供するはずです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:実験プレートレイアウトの例。(A)2つの別々のワーム株で47の異なるワーム腸内細菌叢細菌分離株をテストするための96ウェルプレートレイアウト、ライブOP50をコントロールとして使用しました。このプレートのコピーは、実行するアッセイごとに4つ必要です。(B)熱または酸化ストレスアッセイのための384ウェルレイアウトは、(A)における前の96ウェルプレートアッセイに対応する。この設定により、各条件に対してテトラプリケートを実行でき、各ワーム株には独自のOP50コントロールがあります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegansは、その小型、透明性、迅速な開発、短寿命、安価、取り扱いの容易さにより、一度に複数の実験パラメータを迅速にスクリーニングするための多くの利点を提供します。そのかなり単純なゲノム、ボディプラン、神経系、腸、およびマイクロバイオームでありながら、複雑で人間と十分に類似しているため、生物活性の有効性または毒性をテストしながらメカニズムの洞察を得ることができる強力な前臨床モデルになります。疾患8,9,34,35に対する微生物介入の開発への関心が高まっているため、このような前臨床モデルを利用してプロバイオティクスを迅速に調査することは、微生物のほとんど未開発でほぼ無制限の治療の可能性を備えた魅力的な選択肢です34。ここで説明するプロトコルは、環境細菌がC.エレガンスの健康に与える影響を研究するのに適していますが、他の目的にも容易に適応できます。
万芸
このパイプラインを形成するさまざまな「モジュール」は、実験またはラボ固有の要件に合わせて調整できます。例えば、細菌分離株は、細菌混合物、細菌変異体、またはRNAi産生細菌の代わりにすることができ、セットアップを使用して、宿主と微生物の相互作用に関与する細菌遺伝子のスクリーニング、ストレス耐性に関与する宿主遺伝子のスクリーニング、または定義された細菌群集の一部としての個々の微生物の影響の研究を行うことができます。この方法は、単一のワームの遺伝的背景におけるいくつかの細菌分離株のスクリーニングを記述します。ただし、このアッセイはスケーラブルであり、複数の宿主および細菌の遺伝子型を一度に研究できます。これをさらに、異なる薬物治療および/または食事療法と組み合わせて、宿主遺伝子-微生物遺伝子-食事相互作用に関する洞察を得ることができます。
このプロトコルは、他の線虫種ではまだ試みられていませんが、 C. remanei とC. briggsaeにも直接適用できるはずであり、形態、サイズ、および死の蛍光の特徴を共有するL3段階寄生線虫種にも適用される可能性があります C. elegans30.最後に、他のストレッサー(ジュグロン、パラコート、ヒ酸塩、その他の温度)を同じパイプライン内で使用して、補完的または確認的な情報を提供できます。
潜在的な課題
アッセイの前にワームやバクテリアを増殖させるための12日目までの時間投資は重要ですが、アプローチのスループットのために、収集されたデータの幅をはるかに上回ります。それにもかかわらず、そのようなアッセイを計画する際の注意は、アッセイが開始されるまでに材料が最適ではないため、準備ステップを繰り返すことによって時間を無駄にすることを避けるために不可欠です。初期の主な問題には、サンプルの汚染(ワームまたはバクテリア)、同期が不十分なワームの個体数、および材料の不足(ワームの個体数は予想よりも早く餌を食べ、計画よりも頻繁に動物を再給餌または移送する)が含まれます。
汚染の回避
プロトコルの規模と期間のために、1つの主要な潜在的な問題は、真菌や細菌による汚染であり、その発生は確かに結果を混乱させるでしょう。したがって、理想的なセットアップは、無菌消耗品を使用して、実験ベンチの上に直接空気の流れがない、空調および空気ろ過された専用ラボスペースです。ただし、通常の清掃手順(作業前後のベンチの除染、プレートボックスの清掃、滅菌消耗品の使用)を遵守し、封じ込められたスペース(廊下、開いたドアの近くのスペース、窓を避ける)で炎で作業するだけで、通常は清潔な環境を維持できます。ステップ2.2.1の卵の準備前に軽度の汚染が発生した場合、漂白手順がそれらを処理し、プロトコルは計画どおりに進行できます。逆に、テスト細菌プレートに移る前に増加するワームの個体数に影響を与える汚染は、その試みの終了を意味し、プロトコルはステップ1から再開する必要があります。その後の汚染は、単一の細菌株または試験条件に影響を与える傾向があります。その程度によっては、プロトコルを継続または再起動する価値がある場合があります。
ワームの同期
線虫が発達して成長するにつれて、熱的および酸化的課題に対する耐性が変化するため、LFASSアッセイが実行されるまでに異なる発達段階につながる試験条件を容易に比較することはできません。エンドポイントアッセイでは、十分に同期された集団を生成することが不可欠です。アッセイはL4またはL4 + 48時間段階で大量に収集されたワームに対して実行されるため、完全にステージされたワームを収集するためのワームソーターまたはその他の選別手順がない場合、ワーム集団はL1で非常によく同期している必要があります。試験コホートを成長させる前に、すべての生きた卵が孵化するのに十分な時間、孵化したばかりの子ガメが食物から遠ざけられていることを確認する必要があります(20°Cで>15時間、15°Cで>18時間)。遺伝子型は発生タイミングの広がりに影響を与える可能性があり、温度の影響も受けます。15°Cで成長する線虫集団は、線虫集団拡大段階(特にインスリンシグナル伝達変異体を扱う場合)の温度感受性突然変異の影響を制限しながら、これをより適切に制御します。L4またはL4 + 48時間からの微生物の影響を研究する主な理由は、異なる食事の発達への影響を回避し、食事への影響ではなく生きた腸内細菌の影響を研究することです。幼虫の初期段階で異なる細菌分離株または混合物で増殖したワームは、必然的に不均一な発育速度と同期の喪失につながります。
青色蛍光に頼ることの結果
個々の線虫追跡やSytox green36などの追加の試薬を必要とせずにLFASSアッセイで死を特定できることは、従来の線虫バイオマーカーと重複する可能性が低い蛍光範囲の内因性シグナルを利用することは、明らかな利点です。ただし、多くの試験条件で線虫の死の蛍光を一貫して検出できるようにすることは依然として重要です。アッセイは蛍光定量ではなくそのダイナミクスに依存していますが、死亡時間の中央値(TOD)を正確に推定するには、ワームから十分な蛍光を発する必要があります。このアッセイでは単一の線虫による死の解決ができないため、死にかけている個体が発する青色蛍光バーストは、蛍光蓄積が単一の集団蛍光ピークを出すのに十分な時間的オーバーラップを持っている必要があります。そうして初めて、TODの中央値を正確に推測することができます。これは、十分なレベルの青色蛍光を生成できないワームをこのプロトコルで使用できないことを意味し、特にtdo-2やkynu-130,31などのキヌレニン経路のいくつかの変異体、および飢餓動物が含まれます。したがって、ワームが全体を通して完全な状態に保たれていることを確認することが重要です。これは、IPTGと抗生物質を添加したNGM培地上のHT115芝生がOP50芝生よりも薄い傾向があるため、HT115駆動RNAiスクリーニングを実行する場合に特に問題になる可能性があります。したがって、アッセイに至るまでの数日間のワームの餌供給を監視することは非常に重要です。
死の蛍光のダイナミクスの別の結果は、同じ集団からの線虫がより同期的に死滅し、より明確な集団死蛍光ピークを生成するため、アッセイが速いほど感度が向上することです。したがって、アッセイが長いほど、良好なデス蛍光ピークを生成するために必要な集団サイズが大きくなります。 eat-2 や daf-230などの代謝が低い変異体も、蛍光が少なく、ウェルあたりの数が多くなります。ウェルあたり10〜15匹の野生型ワームは、4時間以内にそれらすべてを殺す42°Cの熱ストレスアッセイには十分ですが、同じアッセイの daf-2(e1370) ワームにはそのほぼ2倍の量が必要であり、24時間にわたってワームを殺すアッセイには>100の野生型ワームが必要です。
環境細菌分離株の状況では、異なる微生物代謝も、青色蛍光化合物を生成するキヌレニン経路に異なる影響を与える可能性があります。したがって、一部の細菌分離株はピークデス蛍光が低く、他の細菌分離株はOP50よりも高いピークにつながります。その結果、すべての不測の事態に対応するために、ウェルごとに十分なワームを目指す必要があります。
最後に、プレート読み取りパラメータを正しく最適化することが不可欠です。このプロトコルは、蛍光励起および発光パラメータの設定と、読み取りが理想的に実行されるべき深さをカバーしています。1回のアッセイで複数の条件にわたって広範囲のデス蛍光が得られる可能性があるため、弱いシグナルが検出され、検出器が飽和しないようにすることが重要です。したがって、高いダイナミックレンジを誇る検出器を備えた機器は、より優れた性能を発揮します。
メソッドの制限
ここで説明する方法は堅牢で柔軟性があり、さまざまな条件に容易に適応できます。便宜上、主要な制限と制限は、それらが作用するプロトコルに沿って言及されています。簡単に言えば、死の内因性マーカーとしての死の蛍光への依存は、これらのアッセイの強みと限界の両方です。
限られた数の特定の食事条件(低トリプトファン食または飢餓)およびトリプトファン代謝に影響を与える変異条件(すなわち、 tdo-2、kynu-1、一部の daf-2 対立遺伝子)では、ピーク蛍光の検出が困難であり、TOD推定値の信頼性が低い程度まで、死亡蛍光(DF)が強く減衰する可能性があります。
逆に、一部の微生物は、励起スペクトルと発光スペクトルがDFシグナルと重複する青色蛍光化合物を生成する場合があります(すなわち、 エンテロコッカスフェカリス)。それらのダイナミクスはDFとは異なり、多くの場合、結合解除できますが、分析を混乱させる可能性があります。
次に、アッセイは死にかけている個々のワームからのシグナルの累積に依存していますが、DFは時間の経過とともに消光します。したがって、ワームが離れすぎて死ぬと、個々の蛍光ピークが集団ピークを生成できず、集団中央値TODの測定が妨げられます。アッセイの死滅が遅いほど、各ウェル30に必要なワーム数が多くなります。したがって、2時間以内にワームの半分を殺す42°Cの熱ストレスアッセイには、ウェルあたり10〜15匹の成虫で十分ですが、12時間でワームの半分を殺す細菌の高速殺傷アッセイには、ウェルあたり70匹以上のワームが必要です。
最後に、ユーザーは、必要な波長でタイムラプス蛍光測定を実行できるアッセイを実行するために、プレートリーダーにアクセスする必要があります。励起波長と発光波長も系によってわずかに異なり、線虫種間でも異なります(前述のように30)。
他のC.エレガンスアッセイとの比較と相補性
過去10〜15年にわたって、複数の条件でのC.エレガンスの健康状態を一度に評価するために多くのアッセイが開発され、多様な戦略を採用し、さまざまなレベルのデータの深さと幅を提供してきました30、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46。特に、マルチワーム追跡アルゴリズムおよび/または微細加工された個々のワームアレイを備えたカメラアレイおよびスキャナーを使用して、寿命全体にわたって固体培地上の多数のワームを一度に自動的に監視するために、いくつかの強力なアッセイが開発されました37,38,39,40,41,43.宿主と微生物の相互作用の文脈では、上記のプロトコルに対する同様のアプローチがDFに依存しないことでも、細菌感染に関与するC.エレガンス遺伝子のゲノムワイドRNAiスクリーニングが可能になりました46,47,48。ただし、これらのハイスループットアッセイは、全体を通して液体中のワームを処理することに依存しており、交差汚染のリスクが高く、液体培養が宿主および微生物の代謝に影響を与えるため、一度に複数の細菌タイプを処理する場合は望ましくありません。したがって、従来の感染症、ストレス、健康寿命、および長寿アッセイでは、C.エレガンスは固体培地で成長した細菌の芝生で維持および熟成されます。このプロトコルの場合と同様に、このパイプラインで実行されたスクリーニングの結果は、スクリーンヒットを伴うダウンストリームの確認実験の結果とより容易に関連し、結果を予測できます。
LFASSアプローチ自体の利点は、参考文献30で十分にカバーされています。同様の研究に再利用できるより精巧な連続イメージングセットアップと比較して、LFASSは安価であり(必要な読み出しの中央値が中央値である場合)、そのシンプルさは、多くの技術的能力や特殊な機器を必要としないことを意味します。LFASSは主に深さよりも幅についてです。LFASSデータは、ワーム集団の死亡時間の中央値とキヌレニン経路出力の間接的な読み出し以外の情報を提供しません。逆に、スループットは低いがまともなため、複雑な形質を他のアッセイ37、38、39、40、41、43からワームの全寿命にわたって測定できるため、LFASSスクリーンからのヒットを研究するための優れたダウンストリームアプローチになります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
我々は、寄生虫株を提供してくれたCGCミネソタ州(米国マディソン、NIH - P40 OD010440)と、ここに描かれているすべての環境微生物分離株を提供してくれたOP50およびPr. Hinrich Schulenburg(CAU、キール、ドイツ)に感謝する。この研究は、ABへのUKRI-BBSRC助成金(BB / S017127 / 1)によって資金提供されました。JMは、ランカスター大学FHM博士号奨学金によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
| 15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
| 384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
| 6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
| 96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB agar | Difco | 240110 | |
| LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
| LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
| LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
| Plate reader- Spark | Tecan | ||
| Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
| t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
- Amon, P., Sanderson, I.
- Belkaid, Y., Harrison, O. J.
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
- Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
- Mitsuoka, T.
- Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
- Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
- Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
- Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
- Miller, I.
- Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
- Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
- Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
- Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
- Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
- Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
- Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
- Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
- Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
- Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
- Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
- Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
- Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
- Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
- Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
- Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
- Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).
