Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Allenamento di resistenza aggiustato in base al dosaggio nei topi con un rischio ridotto di danni muscolari

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64000
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Summary

Il presente protocollo descrive una tecnica unica chiamata allenamento di resistenza aggiustato dal dosaggio (DART), che può essere incorporata in studi di riabilitazione di precisione eseguiti su piccoli animali, come i topi.

Abstract

L'allenamento di resistenza progressiva (PRT), che comporta l'esecuzione di contrazioni muscolari contro carichi esterni progressivamente maggiori, può aumentare la massa muscolare e la forza in individui sani e in popolazioni di pazienti. Vi è la necessità di strumenti di riabilitazione di precisione per testare la sicurezza e l'efficacia del PRT per mantenere e / o ripristinare la massa muscolare e la forza negli studi preclinici su modelli animali di piccole e grandi dimensioni. La metodologia PRT e il dispositivo descritti in questo articolo possono essere utilizzati per eseguire l'allenamento di resistenza aggiustato per il dosaggio (DART). Il dispositivo DART può essere utilizzato come dinamometro autonomo per valutare oggettivamente la coppia contrattile concentrica generata dai dorsiflessori della caviglia nei topi o può essere aggiunto a un sistema di dinamometria isocinetica preesistente. Il dispositivo DART può essere fabbricato con una stampante 3D standard in base alle istruzioni e ai file di stampa 3D open source forniti in questo lavoro. L'articolo descrive anche il flusso di lavoro per uno studio per confrontare il danno muscolare indotto dalla contrazione causato da un singolo attacco di DART con il danno muscolare causato da un attacco comparabile di contrazioni isometriche (ISOM) in un modello murino di distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2B / R2 (topi BLAJ). I dati di otto topi BLAJ (quattro animali per ogni condizione) suggeriscono che meno del 10% del muscolo tibiale anteriore (TA) è stato danneggiato da un singolo attacco di DART o ISOM, con DART che è meno dannoso di ISOM.

Introduction

L'esercizio fisico conferisce numerosi benefici per la salute al muscolo scheletrico (recensito in Vina et al.1). In particolare, l'allenamento di resistenza progressiva (PRT), che comporta l'esecuzione di contrazioni muscolari contro carichi esterni progressivamente maggiori (ad esempio, bilancieri, manubri, circuiti a cavo-puleggia), è noto per aiutare ad aumentare la massa muscolare e la forza sia in individui sani che in popolazioni di pazienti (recensito in pubblicazioni precedenti 2,3 ). La PRT si basa sul principio di sovraccarico, che afferma che, quando il muscolo si contrae contro carichi esterni progressivamente maggiori, si adatta aumentando la sua area fisiologica della sezione trasversale e la capacità di produrre forza4. I modelli esistenti di PRT nei roditori includono l'arrampicata su scala con resistenza applicata alla coda, la co-contrazione dei muscoli agonisti contro la resistenza degli antagonisti, la corsa con un'imbracatura appesantita, un esercizio accovacciato suscitato da una scossa elettrica e la resistenza alla corsa delle ruote 5,6,7,8,9,10 (recensito in pubblicazioni precedenti 11,12 ). Tuttavia, attualmente non ci sono strumenti di ricerca per eseguire con precisione PRT mirata ai muscoli e aggiustata per il dosaggio nei topi che assomigliano molto ai metodi e ai dispositivi PRT utilizzati nella ricerca clinica umana e nella pratica12,13. Ciò limita la capacità dei ricercatori di studiare la sicurezza e l'efficacia del PRT dosato con precisione negli studi di base e preclinici nei topi.

Per superare questa barriera, in questo studio vengono sviluppati una metodologia e un dispositivo PRT basati sui progetti di circuiti a fune-puleggia impiegati nelle attrezzature per l'allenamento di resistenza nelle moderne palestre14,15,16. Questo metodo di PRT è indicato come allenamento di resistenza regolato dal dosaggio (DART) e il dispositivo è chiamato dispositivo DART. Oltre alla sua funzionalità come strumento di allenamento per la riabilitazione di precisione, il dispositivo DART può anche essere utilizzato come strumento autonomo per valutare oggettivamente la coppia contrattile concentrica massima che può essere generata dal muscolo tibiale anteriore (TA) in un topo, in modo simile a come viene valutato nell'uomo il massimo di una ripetizione (1RM, il carico massimo che può essere sollevato / spostato / premuto / accovacciato con successo solo una volta mantenendo una buona forma)17, 18. Il dispositivo DART può anche essere accoppiato con un dinamometro isocinetico personalizzato o commerciale per misurare la forza tetanica isometrica di picco prodotta dal muscolo TA in un topo (paragonabile alla massima contrazione volontaria [MVC] nell'uomo) e quindi eseguire PRT regolato dal dosaggio con una resistenza basata sulla forza tetanica di picco (ad esempio, 50% della forza di picco).

Questo articolo descrive la costruzione del dispositivo DART e spiega come può essere accoppiato con un dinamometro personalizzato, che è stato descritto nelle pubblicazioni precedenti 19,20,21,22, per valutare la coppia contrattile ed eseguire DART. Lo studio descrive anche come il dispositivo DART è stato utilizzato per confrontare il danno muscolare indotto dall'esercizio causato da un singolo attacco di DART (4 serie di 10 contrazioni concentricamente distorte con 50% 1RM) con danni causati da un attacco comparabile di contrazioni isometriche (4 serie di 10 contrazioni isometriche) in un modello murino di distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2B (LGMD2B, o LGMDR2)23,24. Il modello murino studiato manca di una proteina chiamata disferlina, che svolge un ruolo importante nella protezione del muscolo scheletrico dal danno muscolare a insorgenza ritardata a seguito di contrazioni eccentriche dannose 22,25,26,27,28,29,30 . È stato anche dimostrato in topi maschi carenti di disferlina che l'esercizio forzato concentricamente distorto non è così dannoso come l'esercizio forzato eccentricamente distorto e che l'esposizione precedente all'allenamento concentricamente distorto offre protezione contro le lesioni da un successivo attacco di contrazioni eccentricamente distorte22. Poiché l'attuale studio è stato condotto per testare la fattibilità dell'attuale metodologia DART e del dispositivo nell'esecuzione di un allenamento di resistenza aggiustato in base al dosaggio e con distorsioni concentriche, sono stati scelti topi maschi carenti di disferlina per l'indagine per confrontare i nuovi dati del dispositivo DART con i dati precedenti. In studi futuri, topi BLAJ femmina saranno inclusi per studiare l'effetto del sesso come variabile biologica in relazione alla risposta alla DART. I topi che avevano ~ 1,5 anni sono stati studiati poiché hanno già cambiamenti distrofici in molti gruppi muscolari e, quindi, modellano lo stato fisiopatologico in cui i muscoli potrebbero essere in pazienti che hanno già debolezza muscolare e deperimento e stanno cercando cure riabilitative per mantenere la massa muscolare e la forza26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gli esperimenti descritti in questo articolo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (1996, pubblicato da National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, USA). B6. Topi A-Dysfprmd / GeneJ (a.k.a. topi BLAJ, maschi, ~ 1,5 anni) che modello LGMD2B / R2 sono stati utilizzati per il presente studio. I topi sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Disegno dello studio

  1. Scegliere ceppi di topo pertinenti alle domande di ricerca, ad esempio lo studio B6. Topi A-Dysfprmd / GeneJ (topi BLAJ) se si cerca di rispondere alla domanda se la DART concentricamente distorta induca o meno danni muscolari diffusi nei topi che modellano LGMD2B / R2.
  2. Assegnare i topi ai gruppi di studio in base al disegno dello studio, ad esempio, assegnare in modo casuale i topi a un gruppo di allenamento di resistenza aggiustato per il dosaggio (DART) o a un gruppo di allenamento isometrico (ISOM) e tentare di bilanciare i gruppi nel miglior modo possibile in base alla corrispondenza per cucciolata e / o età (ad esempio, Tabella 1).

2. Fabbricazione del dispositivo DART

  1. Progettare i componenti del dispositivo DART con un software CAD (computer-aided) adatto (Figura 1) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Alloggiamento di progettazione per cuscinetti ruota a basso attrito (vedere la tabella dei materiali, basata sul design del cuscinetto del blocco cuscino) con un goniometro incorporato (da utilizzare come goniometro per misurare gli angoli dell'articolazione della caviglia).
    2. Progettare una torre per l'alloggiamento dei cuscinetti ruota e un goniometro.
    3. Progettare una pedana per posizionare il piede del mouse. Progettare un asse per collegare la pedana al cuscinetto della ruota.
  2. Fabbricare i componenti del dispositivo DART con una stampante 3D adatta (Figura 1).
    1. Salvare i disegni creati con software CAD come stereolitografia (. STL).
      NOTA: . I file STL (Supplementary Coding Files 1-4) possono essere utilizzati e modificati dando credito all'autore corrispondente di questo articolo e citando questo articolo.
    2. Aprire . STL con un software di slicing adatto (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: il software di slicing converte un modello 3D virtuale in una pila di sezioni, che possono essere stampate in sequenza da una stampante 3D per generare un oggetto 3D.
    3. Con il software di slicing, generare G-CODE computer-aided manufacturing (CAM, . GCODE), che sono specifici per la stampante 3D e il filamento che verrà utilizzato.
    4. Seguire il manuale della stampante 3D (vedere Tabella dei materiali) per stampare i componenti del dispositivo DART con . GCODE.
    5. Scegliere un filamento di stampante 3D appropriato, ad esempio acido polilattico (PLA) 1,75 mm 1 kg/bobina, grigio (vedere Tabella dei materiali).
  3. Assemblare il dispositivo DART seguendo i passaggi seguenti.
    1. Inserire un cuscinetto ruota 608 a basso attrito (diametro foro 8 mm, diametro esterno 22 mm, come uno con sfere ceramiche in nitruro di silicio alloggiate in acciaio inossidabile 420, vedere Tabella dei materiali) nell'alloggiamento del cuscinetto ruota (Figura 1).
    2. Inserire l'asse nel foro del cuscinetto della ruota (figura 1).
    3. Incollare la pedana sull'asse con colla (vedi Tabella dei materiali) adatta per incollare PLA (Figura 1).
    4. Posizionare l'alloggiamento del cuscinetto ruota sopra la torre di alloggiamento del cuscinetto ruota e fissare l'intero gruppo a una base acrilica con elementi di fissaggio a vite (Figura 1).
      NOTA: non ci sono requisiti di dimensioni specifici per la base acrilica: deve solo essere abbastanza grande da ospitare l'animale e il dispositivo DART e abbastanza piccola da adattarsi a una superficie di lavoro. La base acrilica utilizzata per il presente studio è larga circa 30 cm, lunga 45 cm e spessa 0,5 cm.

3. Preparazione di topi per DART o ISOM

  1. Porre ogni topo in anestesia generale con isoflurano inalato erogato attraverso un adeguato sistema di anestesia (vedi Tabella dei materiali, 2% -5% per l'induzione; 1% -4% per il mantenimento; per effetto) per ridurre lo stress e il dolore.
    1. Indurre l'anestesia nella camera di induzione del sistema di anestesia (isoflurano 2% -5%).
    2. Trasferire il topo su un cono nasale per mantenere l'anestesia durante l'esecuzione di procedure sull'animale (isoflurano 1% -4%). Confermare l'efficacia dell'anestesia in base alla mancanza di ritiro degli arti posteriori a un pizzico del piede da un paio di pinzette.
    3. Fornire supporto termico, ad esempio con una piastra riscaldante in gel isotermico e una lampada termica posizionata ~ 1 m sopra il mouse. Controllare con un termometro per assicurarsi che la temperatura sopra e intorno alla base acrilica sia mantenuta a ~ 38 ° C, in modo che il mouse non si surriscaldi.
  2. Preparare la pelle sopra il muscolo tibiale anteriore sinistro (TA) del topo e su tutti gli aspetti anteriori e laterali dell'arto posteriore sinistro per DART o ISOM.
    1. Rimuovere la pelliccia del topo con una crema depilatoria (crema depilatoria, vedere Tabella dei materiali). Applicare la crema depilatoria e lasciarla agire per ~ 2 min.
    2. Pulire la coscia con salviette imbevute di acqua distillata per rimuovere il pelo e tutta la crema residua dalla pelle. Le creme depilatorie possono irritare e/o danneggiare la pelle se lasciate sulla pelle del topo per lunghi periodi e, quindi, rimuovere completamente.
    3. Dopo la rimozione del pelo, disinfettare la pelle con un metodo di lavaggio approvato, ad esempio con una soluzione di lavaggio allo iodio povidone e etanolo al 70%.
  3. Applicare un protettivo (ad es. petrolato) sugli occhi e sulla pelle depilata con un batuffolo di cotone pulito per proteggere gli occhi e la pelle depilata dall'essiccazione.
  4. Posizionare un perno stabilizzatore attraverso la metafisi tibiale.
    1. Applicare la crema al 5% di lidocaina sulla tibia per intorpidire l'area.
    2. Passare un ago ipodermico sterile da 26 G, mezzo pollice, attraverso la parte più ampia della porzione prossimale dell'osso tibiale (cioè la metafisi tibiale, nota anche come testa tibiale). Una volta fissato il perno stabilizzatore, rimuovere la parte di plastica dell'ago ipodermico tenendo l'ago con un emostato sterile e piegando la parte di plastica fino a quando non si rompe.
  5. Posizionare il mouse per l'addestramento DART o ISOM.
    1. Appoggiare il mouse in posizione supina. Assicurarsi che il mouse sia ancora saldamente collegato al cono del naso per mantenere l'anestesia.
    2. Con un paio di pinzette con punta sterile, inserire il perno tibiale in una clip a coccodrillo metallico (vedi Tabella dei materiali), in modo che le estremità del perno tibiale siano trattenute dal morsetto a coccodrillo. Spostare il braccio regolabile del morsetto a coccodrillo per assicurarsi che il piede del mouse sia posizionato sulla pedana del dispositivo DART.
    3. Allacciare il piede del mouse alla pedana del dispositivo DART con nastro adesivo da laboratorio.
    4. Posizionare il piede del mouse con un angolo di 90° rispetto all'asse lungo dell'osso tibiale del topo. Se posizionato correttamente, la pedana sarà perpendicolare alla base acrilica (cioè il pavimento o quello che è considerato il piano orizzontale).
    5. Appoggiare la pedana sull'arresto della flessione plantarflesso creato posizionando un ago ipodermico lungo 18 G, 1,5 attraverso i fori preforati sul goniometro del dispositivo DART (Figura 1).

4. Formazione DART o ISOM

  1. Ottimizzare il posizionamento dell'elettrodo posizionando un elettrodo di stimolazione elettrica neuromuscolare bipolare, transcutanea (NMES, vedi Tabella dei materiali) sull'aspetto inferolaterale dell'articolazione del ginocchio del topo (Figura 1B).
    1. Con impulsi singoli (1 Hz) da uno stimolatore elettrico di laboratorio (vedi Tabella dei materiali), stimolare il ramo fibulare del nervo sciatico, che fornisce l'innervazione motoria ai muscoli dorsiflexori della caviglia (Figura 1B).
    2. Poiché il muscolo tibiale anteriore (TA) rappresenta oltre il 90% della forza contrattile totale prodotta dai muscoli dorsifltori della caviglia31, osservare la pancia e il tendine del muscolo TA per evidenziare contrazioni a contrazione elettricamente indotte.
      NOTA: Una leggera prominenza ossea che corrisponde all'osso del perone potrebbe aiutare con il posizionamento dell'elettrodo se il tester può sentirlo attraverso l'elettrodo. Ciò richiede un po 'di pratica e apprendimento da parte del tester per avere un'idea del posizionamento ottimale degli elettrodi.
    3. Spostare l'arresto della flessione plantarflesso sul foro sul goniometro che corrisponde a 20° di flessione plantarflessione dalla posizione in cui il piede è ortogonale (90°) alla tibia - questa è la posizione in cui la coppia contrattile massima dal muscolo TA è tipicamente osservata sulla base dei rapporti precedenti21. Questo potrebbe dover essere personalizzato dall'utente in base a fattori specifici per i topi che vengono studiati.
    4. Visualizza la coppia di contrazione con un dinamometro per mouse collegando la pedana del dispositivo DART alla pedana del dinamometro, ad esempio, collega la pedana del dispositivo DART a una pedana del banco dinamometrico robotico alla caviglia costruita su misura con una sutura di seta non elastica (simile alla Figura 1A) e allaccia la sutura alla pedana del dinamometro (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: la pedana ha fori integrati nel progetto di stampa 3D. Posizionando la sutura attraverso la coppia di fori che si trovano nella seconda fila dall'estremità della punta della pedana si ottiene la sutura a ~ 20 mm dall'asse di dorsiflessione / plantarflessione (Figura 1A, B). Il dinamometro è stato descritto nelle precedenti relazioni 19,20,21,22.
  2. Ottimizzare l'uscita di tensione dallo stimolatore NMES.
    1. Dopo aver ottimizzato il posizionamento dell'elettrodo, ottimizzare l'ampiezza della tensione in uscita dallo stimolatore elettrico: questo è necessario per limitare NMES al nervo fibulare comune e al muscolo TA e ridurre il rischio di provocare co-contrazioni nei flessori plantari.
      NOTA: Se le co-contrazioni sono suscitate, possono essere visualizzate attraverso l'uscita di coppia dal dinamometro e anche essere viste nella flessione plantare delle dita dei piedi.
  3. Impostare lo stimolatore NMES per l'allenamento DART o ISOM.
    NOTA: le seguenti impostazioni potrebbero dover essere personalizzate dall'utente in base a fattori specifici dei topi oggetto di studio e allo scopo degli studi.
    1. Impostare lo stimolatore per produrre treni di impulsi ripetuti che hanno una frequenza di 125 Hz - questa frequenza produce contrazioni tetaniche fuse massime senza overflow di NMES in altri gruppi muscolari nei topi BLAJ21. A tale scopo, regolare i quadranti per la frequenza degli impulsi (125 Hz), la durata del treno (500 ms) e i treni al secondo (1 treno/s) e accendere l'interruttore a levetta per i treni a impulsi ripetuti.
    2. Impostare lo stimolatore per produrre treni di impulsi di 500 ms di durata intervallati da 500 ms di riposo tra i treni di impulsi.
    3. Spostare l'arresto della plantarflessione sul foro sul goniometro che corrisponde a 160° all'asse lungo della tibia (70° di flessione plantare dal piede ortogonale alla tibia). Questa è la posizione in cui il piede del topo BLAJ può essere spostato passivamente senza resistenza dei tessuti molli21.
    4. Per DART, applicare una resistenza adeguata contro la quale il muscolo TA deve lavorare concentricamente, ad esempio 5 g come mostrato in Figura 1A, B; vedere la curva di calibrazione peso/coppia nel file supplementare 1.
    5. Applicare resistenza appendendo il peso con una sutura di seta non elastica legata alla pedana del dispositivo DART (Figura 1A, B).
    6. Regolare la resistenza - cioè, applicare ~ 50% del massimo di una ripetizione (1RM) (ad esempio, 5 g se il mouse può sollevare un peso massimo di 10 g con una singola contrazione), che tira il piede attraverso almeno la metà della gamma attiva disponibile di dorsiflessione.
    7. Eseguire un adeguato allenamento DART nei topi assegnati al gruppo DART - ad esempio, eseguire un singolo attacco di allenamento DART, che comporta quattro serie di 10 ripetizioni di contrazioni concentriche con 2 minuti di riposo tra le serie, simile ai programmi di allenamento di resistenza progressiva utilizzati negli esseri umani32 (vedi Video supplementare 1).
    8. Eseguire un adeguato addestramento ISOM nei topi assegnati al gruppo ISOM - ad esempio, eseguire un singolo attacco di allenamento ISOM, che comporta quattro serie di 10 ripetizioni di contrazioni isometriche con 2 minuti di riposo tra le serie, simile a DART (vedi Video supplementare 2).
    9. Per l'allenamento ISOM, posizionare il piede del mouse a 160° rispetto all'asse lungo della tibia (flessione plantare di 70° dal piede ortogonale alla tibia) e mantenere questa posizione statica fissando la sutura di seta alla pedana del dinamometro robotico.
      NOTA: Poiché la sutura non può scorrere, la pedana del dispositivo DART non può spostarsi in dorsiflessione, costringendo così i flessori dorsiflexor a contrarsi isometricamente.

5. Assistenza post-procedurale per i topi

  1. Prendere precauzioni per mantenere una corretta igiene dell'arto posteriore esercitato e ridurre il dolore al sito dell'ago.
    1. Dopo l'allenamento DART o ISOM, rivestire la porzione visibile del perno tibiale con un triplo unguento antibiotico (400 U / g di bacitracina, 3,5 mg / g di neomicina e 5000 U / g di polimixina-B, vedi Tabella dei materiali) e quindi ritirare con attenzione il perno dal lato mediale della tibia. Risciacquare la pelle sulla coscia laterale e sulla parte superiore della gamba con iodio povidone e acqua sterile. Applicare la crema al 5% di lidocaina sulla tibia per controllare il dolore del sito dell'ago.
  2. Consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia.
    1. Rimuovere il mouse dal cono del naso e lasciarlo recuperare dall'anestesia in una gabbia di recupero priva di lettiera. Fornire supporto termico al topo mentre si riprende dall'anestesia, ad esempio con una piastra riscaldante isotermica in gel.
  3. Riportare il topo nella sua gabbia originale dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia. Quindi, riportare la gabbia nella struttura per animali, dove sono alloggiati i topi di studio fino a quando non vengono eseguiti esperimenti di follow-up. Monitorare i topi ogni giorno.

6. Raccolta dei tessuti

  1. Raccogliere il muscolo TA del topo nella sua interezza e congelare a scatto per la crioconservazione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Sulla base delle domande di ricerca, in un momento opportuno dopo l'addestramento (ad esempio, 3 giorni dopo DART o ISOM), eutanasia i topi secondo protocolli approvati.
      NOTA: Per il presente studio, i topi sono stati eutanizzati per dislocazione cervicale in anestesia generale (isoflurano inalatorio, 2% -5% ad effetto). La toracotomia bilaterale ha assicurato la morte.
    2. Sezionare gli arti posteriori del topo per rimuovere il muscolo TA esercitato (a sinistra) e il muscolo TA non esercitato (a destra). Pesare i muscoli raccolti. Quindi, immergere ogni muscolo in olio minerale per la crioprotezione e posizionare il muscolo su una salvietta di laboratorio pulita per asciugare l'olio in eccesso21.
  2. Posizionare il muscolo su un pezzo di foglio di alluminio. Tenere il bordo della pellicola con un emostatico lungo e immergere rapidamente la lamina e il muscolo in azoto liquido contenuto in un contenitore di plastica adatto per congelare il muscolo.
    1. Dopo circa 2 minuti di immersione in azoto liquido, trasferire il muscolo congelato in fiale criogeniche marcate. Conservare i flaconcini in un congelatore a -80 °C fino a quando necessario per ulteriori studi.

7. Studi istologici sul tessuto muscolare

  1. Preparare sezioni di criostato del muscolo TA che hanno uno spessore di 5 μm. Raccogliere sezioni di criostato su vetrini da microscopio carichi. Fissare le sezioni con acetone che viene mantenuto freddo a -30 ° C e lasciare asciugare le sezioni all'aria.
  2. Colorare le sezioni del tessuto muscolare con ematossilina seguita da eosina (colorazione H & E, vedi Tabella dei materiali).
    1. Immergere le sezioni per 5 minuti in ematossilina (colorazione nucleare blu scuro) in un barattolo di vetro colorante. Rimuovere l'ematossilina in eccesso risciacquando le sezioni con acqua di rubinetto fino a quando non si vede ulteriore bluificazione di acqua.
    2. Immergere le sezioni per 5 minuti nel reagente bluante in un barattolo di vetro. Aspirare il reagente bluante in eccesso dalle sezioni con una pipetta di aspirazione in vetro.
    3. Immergere le sezioni per 5 minuti in eosina (colorazione citoplasmatica rosa) in un barattolo di vetro colorante. Rimuovere l'eosina in eccesso immergendo le sezioni rapidamente e ripetutamente (~ 10 volte) in etanolo al 95% in un barattolo di vetro colorante.
    4. Lasciare asciugare le sezioni all'aria e procedere alla visualizzazione al microscopio ottico.
  3. Preparare immagini piastrellate ad alta risoluzione di intere sezioni trasversali muscolari TA attraverso l'imaging al microscopio.
    NOTA: l'utente potrebbe dover personalizzare le fasi di imaging e analisi delle immagini che seguono in base al microscopio e al software di acquisizione e analisi delle immagini.
    1. Cattura immagini digitali con l'obiettivo 10x di un microscopio ottico e una fotocamera digitale montata sul microscopio.
    2. Cattura circa 15-20 immagini, muovendoti lungo la sezione trasversale di ciascun muscolo in modo simile a una griglia, in modo tale che ogni nuova immagine si sovrapponga ~ 25% con l'immagine precedente.
      NOTA: questo processo consente di acquisire una serie di immagini che possono essere affiancate digitalmente (noto anche come cucitura di immagini) per creare un'immagine composita ad alta risoluzione dell'intera sezione trasversale muscolare TA (Figura 2).
    3. Salvare le immagini digitali in formato . Formato TIFF.
    4. Aprire le immagini digitali con un software di elaborazione e analisi delle immagini adatto (vedi Tabella dei materiali).
    5. Affiancare o cucire singole immagini in un'immagine composita dell'intero muscolo TA attraverso i seguenti passaggi: con tutte le singole immagini sovrapposte di ciascun muscolo TA aperte nel software, fare clic su File > selezionare Automatizza > selezionare Photomerge > selezionare collage > selezionare Aggiungi file aperti > fare clic su OK.
    6. Quando viene preparata e visualizzata una nuova immagine piastrellata/cucita del muscolo TA, salvare l'immagine in . TIFF per ulteriori analisi.
  4. Quantificare il danno muscolare mediante analisi visiva nelle immagini piastrellate dell'intero muscolo TA con un software di analisi delle immagini adatto.
    1. Nel software di analisi delle immagini, selezionare la funzione Misura nel menu Analizza per delineare e misurare l'area dell'intera sezione trasversale del muscolo TA (Figura 2).
    2. Nel software di analisi delle immagini, selezionare la funzione Misura nel menu Analizza per delineare e misurare le aree di ciascun muscolo TA che sono danneggiate, cioè aree che mostrano interruzione citoplasmatica delle fibre muscolari, fibre muscolari assenti e infiltrazione cellulare infiammatoria22 (Figura 2).
    3. Esprimere la somma dell'area totale del danno come percentuale dell'intera area della sezione trasversale del muscolo TA (Figura 2, Tabella 2).

8. Analisi statistiche

  1. Organizzare i dati come mostrato nelle Tabelle 1-3 ed eseguire test T non accoppiati (se vengono superati test di normalità e varianze omogenee)33 o test di Mann-Whitney Rank Sum (se i test di normalità e varianze omogenee non vengono superati)21 con software adatto (vedi Tabella dei materiali).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sono stati studiati topi maschi BLAJ, che avevano ~ 1,5 anni di età. I topi BLAJ modellano la malattia muscolare umana, LGMD2B / R2. Questi topi sono particolarmente suscettibili al danno muscolare a insorgenza ritardata da un singolo attacco di contrazioni muscolari eccentriche22,29. I topi BLAJ sono stati, quindi, scelti per questi studi per imparare se la DART potesse essere eseguita in modo non dannoso regolando con precisione la resistenza contro cui il muscolo TA deve lavorare in modo concentricamente distorto. Se si scoprisse che la DART non è dannosa per i topi BLAJ, allora sarebbe probabilmente utile come forma di allenamento di resistenza non dannoso, che potrebbe essere applicato da solo o in aggiunta alla medicina rigenerativa, agli interventi genetici, farmacologici e di altro tipo.

L'età e il peso dei topi BLAJ erano strettamente abbinati tra i gruppi DART e ISOM (Tabella 1). Il giorno 3 (~ 72 ore), dopo un singolo periodo di allenamento, il muscolo TA esercitato ha avuto bassi livelli di danno in entrambi i gruppi DART e ISOM (area danneggiata <10%) - questo è in contrasto con gli studi precedenti21,22 della risposta dei topi BLAJ alle contrazioni muscolari eccentriche, dove ~ 40% di fibre danneggiate sono state riportate al giorno 3 (Figura 2, Tabella 2). Quando l'area del danno muscolare è stata confrontata tra i muscoli TA esercitati dai gruppi DART e ISOM, è stato riscontrato che il gruppo DART aveva livelli più bassi di danno muscolare rispetto al gruppo ISOM (Figura 2, Tabella 2). La coppia tetanica massima registrata al Giorno 0 (basale) e al Giorno 3 non era statisticamente diversa tra i gruppi DART e ISOM (Tabella 3).

Figure 1
Figura 1: Fabbricazione del dispositivo DART e applicazione in uno studio di allenamento. (A,B) Il dispositivo DART si basa su un design del circuito a peso della puleggia del cavo, che è comune alle attrezzature per l'allenamento di resistenza progettate per gli esseri umani. (A) Il dispositivo DART con un animale durante una sessione di addestramento DART. (B) La pedana che si muove in dorsiflessione durante una contrazione concentrica del muscolo TA (freccia verde curva, a destra). La contrazione concentrica fa sì che la resistenza di 5 g si muova verticalmente contro la gravità (freccia verde verticale, a sinistra). Le contrazioni muscolari sono state provocate con la stimolazione elettrica applicata attraverso un elettrodo bipolare transcutaneo. (C) Vari componenti del dispositivo DART sono stati progettati con software di stereolitografia per generare . STL, che potrebbero essere aperti con un software di slicing. Con il software di slicing, sono stati generati file G-CODE specifici per la stampante 3D e il filamento utilizzato. I componenti stampati in 3D del dispositivo DART includevano (C) alloggiamento per un cuscinetto ruota a basso attrito 608, (D) una torre per l'alloggiamento del cuscinetto della ruota, (E) una pedana e (F) un asse per collegare la pedana al cuscinetto della ruota. I componenti stampati in 3D sono stati combinati e montati su una base acrilica con colla e elementi di fissaggio a vite come descritto nel testo e mostrato in (A). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Studio istologico. Cambiamenti istologici nel muscolo TA al giorno 3 (A) post-DART o (B) post-ISOM. Le criosezioni, che avevano uno spessore di 5 μm, erano colorate con ematossilina ed eosina. Più immagini digitali sovrapposte sono state acquisite e unite insieme al software di imaging per generare immagini piastrellate ad alta risoluzione dell'intera sezione trasversale del muscolo TA. I dati istologici qualitativi indicavano che l'entità del danno muscolare era bassa in entrambi i gruppi DART e ISOM, ma il danno muscolare era leggermente più evidente nel gruppo ISOM. Le frecce gialle indicano alcune delle regioni danneggiate nelle sezioni trasversali dei muscoli TA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Età e peso corporeo dei topi. I topi BLAJ studiati erano strettamente abbinati per età e peso corporeo senza differenze significative tra i gruppi DART e ISOM. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Analisi quantitativa del danno muscolare TA. L'entità del danno muscolare è stata espressa come percentuale dell'area totale della sezione trasversale muscolare TA e analizzata mediante un T-test. Sia l'allenamento DART che ISOM hanno portato a un basso livello di danno muscolare al giorno 3 rispetto agli studi precedenti che coinvolgono un attacco simile di contrazioni eccentriche nei topi BLAJ. Sebbene l'entità del danno muscolare fosse piccola in entrambi i gruppi DART e ISOM, l'entità del danno era statisticamente inferiore nel gruppo DART. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Dati sulla coppia contrattile. La coppia contrattile prodotta dai muscoli dorsiflessori è stata studiata con un dinamometro robotico collegato al dispositivo DART. Non c'era alcuna differenza significativa tra i gruppi DART e ISOM nella coppia tetanica massima basale misurata il giorno dell'esercizio (A, giorno 0) o a 3 giorni dopo l'esercizio (B, giorno 3). Nonostante la mancanza di prove istologiche di danno muscolare diffuso, un singolo attacco di DART e ISOM è stato associato a un deficit di coppia contrattile (~ 40%) il giorno 3. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Video supplementare 1: Addestramento DART nei topi. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare 2: Formazione ISOM nei topi. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: dati di calibrazione peso/coppia, curva e configurazione. Clicca qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementari 1-4: progetti per i componenti del dispositivo DART. Clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo articolo presenta istruzioni dettagliate su come costruire un dispositivo per eseguire un tipo di allenamento di riabilitazione di precisione chiamato allenamento di resistenza aggiustato dal dosaggio (DART). Il lavoro descrive anche l'applicazione del dispositivo DART e la metodologia in uno studio di allenamento per confrontare il danno muscolare 3 giorni dopo un singolo attacco di DART (gruppo DART) con il danno 3 giorni dopo un attacco comparabile di allenamento isometrico (gruppo ISOM).

I passaggi critici del protocollo sono la corretta costruzione del dispositivo DART 34,35, i passaggi precisi coinvolti nell'esecuzione dell'allenamento DART o ISOM, la corretta raccolta e crioconservazione del tessuto muscolare, il corretto sezionamento del tessuto muscolare con un criostato e la corretta colorazione delle sezioni trasversali muscolari con ematossilina ed eosina 22,36 . In particolare, per costruire il dispositivo DART, le parti devono essere fabbricate con le dimensioni esatte e le proprietà ottimali del materiale. Se le dimensioni non sono accurate per l'alloggiamento del cuscinetto ruota, il cuscinetto ruota di tipo 608 non si adatta perfettamente all'alloggiamento del cuscinetto ruota. Se le dimensioni della pedana e dell'asse del mouse non sono accurate, ciò potrebbe influire negativamente sulla capacità del cuscinetto della ruota di muoversi insieme al piede del mouse. Se le parti del dispositivo DART sono fabbricate con un materiale inadatto e / o impostazioni della stampante 3D, le parti del dispositivo DART potrebbero non avere una resistenza meccanica sufficiente, il che potrebbe portare alla flessione e / o alla rottura di vari componenti34.

Potrebbero essere necessarie modifiche di questo protocollo in base alle domande di ricerca specifiche a cui i ricercatori desiderano rispondere. L'attuale protocollo è specifico per la progettazione e l'implementazione del dispositivo DART in uno studio che ha tentato di rispondere alla domanda se un singolo attacco di DART causi o meno danni estesi al muscolo TA nei topi carenti di disferlina, come abbiamo riportato in precedenza con un attacco simile di contrazioni eccentriche22. Poiché altri hanno suggerito che l'esercizio costituito da contrazioni isometriche potrebbe essere non dannoso e, quindi, adatto agli esseri umani con determinate malattie muscolari, abbiamo confrontato l'entità del danno muscolare causato da DART con un attacco comparabile di contrazioni isometriche (ISOM) 37,38. In questo studio, abbiamo scoperto che sia DART che ISOM inducono danni muscolari minimi, con DART che mostra livelli di danno leggermente ma significativamente inferiori rispetto all'ISOM.

In relazione alla risoluzione dei problemi, l'aspetto più impegnativo del protocollo è proprio la stimolazione del ramo fibulare del nervo sciatico, che dà innervazione motoria al muscolo TA. Questa tecnica è particolarmente impegnativa perché il tester tiene un elettrodo transcutaneo e lo posiziona manualmente su un punto preciso che è inferiore e laterale all'articolazione del ginocchio del topo20,39. Il tester deve esercitarsi e imparare a localizzare questo punto sull'arto posteriore del topo sentendo una leggera prominenza ossea corrispondente alla testa dell'osso fibulare del topo40. Per confermare che si sta ottenendo una stimolazione elettrica ottimale del ramo fibulare del nervo sciatico, in modo tale da ottenere le contrazioni massime dal muscolo TA, è meglio che venga utilizzato un sistema dinamometrico affidabile20,21,22,41. Inoltre, gli elettrodi transcutanei o sottocutanei stabilizzati da un morsetto possono anche essere considerati per un posizionamento affidabile e riproducibile degli elettrodi per ridurre al minimo la variabilità e gli errori indotti dall'utente 20,41,42,43.

La principale limitazione del protocollo è che è specificamente progettato per studiare l'effetto della DART sul muscolo TA nei topi. Con metodi che sono stati sviluppati per eseguire valutazioni dinamometriche ed esercizio forzato sul gruppo muscolare del quadricipite femorale nei roditori, il dispositivo DART può essere facilmente adattato per il gruppo muscolare del quadricipite femorale42,43. Applicare il dispositivo DART ad altri gruppi muscolari potrebbe essere più impegnativo; tuttavia, il design del circuito del peso della puleggia del cavo, che è stato utilizzato nel dispositivo DART, può essere incorporato in dispositivi adatti ad altri gruppi muscolari. Un'altra limitazione è che il protocollo viene eseguito in anestesia generale, rendendo l'esercizio forzato e non volontario; Questo è diverso dalla maggior parte dei paradigmi di allenamento di resistenza sviluppati per gli esseri umani12,21.

Il significato del dispositivo DART e della metodologia rispetto ai metodi esistenti o alternativi è che il dosaggio per l'allenamento di resistenza può essere regolato con precisione e l'esercizio può essere mirato con precisione a un particolare gruppo muscolare12. La riabilitazione di precisione è una nuova priorità strategica per il National Institutes of Health degli Stati Uniti e, poiché DART consente di eseguire allenamenti di resistenza di precisione nei topi, DART si presta bene a studi di base e preclinici sulla riabilitazione fisica di precisione44,45.

L'importanza e la potenziale applicazione dell'attuale metodo di esecuzione dell'allenamento di resistenza aggiustato per il dosaggio è che rende possibile eseguire studi di allenamento di resistenza nei topi in modi paragonabili ai test umani e ai protocolli di allenamento utilizzati nella ricerca e nella pratica della riabilitazione clinica. Ad esempio, proprio come il massimo di una ripetizione (1RM, il carico massimo che può essere sollevato / spostato / premuto / accovacciato con successo solo una volta mantenendo una buona forma) viene utilizzato per gli esseri umani per regolare l'entità della resistenza per gli attacchi di allenamento17,18, il carico massimo che il muscolo TA può sollevare con successo può essere utilizzato per impostare la resistenza per l'allenamento nei topi con il dispositivo DART. Oltre a regolare la resistenza in base alla capacità di un animale, l'ulteriore vantaggio è che le contrazioni sono polarizzate concentricamente, il che aiuta a ridurre la lesione muscolare indotta dalla contrazione22. I risultati rappresentativi suggeriscono che un attacco di DART è ancora meno dannoso di un attacco comparabile di contrazioni isometriche (gruppo ISOM). La natura non dannosa della DART la rende appropriata per studi di allenamento in cui è meglio evitare contrazioni dannose - ad esempio, studi di allenamento su topi che modellano distrofie muscolari e studi di allenamento progettati per ricaricare gradualmente il muscolo dopo procedure chirurgiche sperimentali su muscoli e / o tendini 22,46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni della Jain Foundation Inc., R03HD091648 da NICHD, una sovvenzione pilota da AR3T sotto NIH P2CHD086843, un premio FRAP da EACPHS presso la Wayne State University, un pacchetto di avvio della facoltà dalla Wayne State University e un subcontratto da 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) a JAR. Questo studio è stato anche finanziato da una borsa di ricerca dell'American Physical Therapy Association - Michigan (APTA-MI) a JMB, MEP e JAR. Gli autori riconoscono la dott.ssa Renuka Roche (professore associato, Eastern Michigan University, MI) per aver letto criticamente il manoscritto e fornito feedback. Gli autori riconoscono il signor Anselm D. Motha per i consigli sulla stampa 3D. Gli autori ringraziano i pazienti con disferlinopatie che hanno condiviso le loro storie sul sito web della Jain Foundation a https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, in particolare le loro esperienze con l'esercizio fisico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing Anmiao Star (N/A) AMS127 High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA) Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. Stock #012767 Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA BS4 50–6824 Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. S17495 Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software Ultimaker, Utrecht, Netherlands Ultimaker Cura 4.4.1. Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad Braintree Scientific (Braintree, MA) Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y Millipore Sigma (Burlington, MA) HT110132-1L Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) Gorilla Super Glue Micro Precise Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3 Millipore Sigma (Burlington, MA) GHS332-1L Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120 Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014 National Instruments, Austin, Texas, USA Labview 2014 Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks ThermoFisher (Waltham, MA) S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
Metal alligator clip JINSHANGTOPK (web-based business) 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides Globe Scientific (Mahwah, NJ) 1354W. Diamond White Glass Slides Charged microscope slides
Mineral Oil ThermoFisher (Waltham, MA) BP26291 Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) #11778 Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) Mini V2 3D 3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) NIH Image for Windows Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4 Adobe (San Jose, CA) Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit Grass Instruments (West Warwick, RI) PSIU6 isolation unit Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) Roboz Surgical SUT152 Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator Grass Instruments (West Warwick, RI) S48 Stimulator Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent Ricca Chemical Company (Arlington, TX) 6697-32 Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5 Systat Software (San Jose, CA) SigmaStat version 3.5 Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment Global Health Products (wed-based business) Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
  2. Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
  3. Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. Chandler, T. J., Brown, L. E. , Routledge. Oxfordshire, UK. Chapter 20 547-570 (2019).
  4. Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
  5. Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
  6. Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
  7. Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
  8. Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
  9. Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
  10. Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
  11. Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
  12. Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. Greising, S. M., Call, J. A. , Springer International Publishing. New York, NY. 39-59 (2022).
  13. Roche, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. Greising, S. M., Call, J. A. , Springer International Publishing. New York, NY. 61-84 (2022).
  14. Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
  15. Naples, R. Dr. Gustav Zander's Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child's Play. , Smithsonian. Washington, D.C. Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016).
  16. Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
  17. ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
  18. Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
  19. Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , CA2745550A1 patents.google.com/patent/CA2745550A1/en (2012).
  20. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  21. Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
  22. Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
  23. Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies - Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
  24. Kniffin, C. L. DYSFERLIN. , OMIM. Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021).
  25. Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
  26. Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
  27. Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
  28. Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
  29. Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
  30. Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
  31. Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
  32. Dutton, M. Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , Jones & Bartlett Publishers. Burlington, MA. 238 (2011).
  33. Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
  34. Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist's guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
  35. Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
  36. Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers - A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
  37. Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
  38. Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
  39. Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
  40. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  41. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  42. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
  43. Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
  44. Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
  45. Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation - Inaugural Scientific Retreat. , Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021).
  46. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
  47. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).

Tags

Neuroscienze Numero 186 Muscolo scheletrico allenamento di resistenza riabilitazione rigenerativa riabilitazione di precisione lesioni muscolari disferlina distrofia muscolare dei cingoli
Allenamento di resistenza aggiustato in base al dosaggio nei topi con un rischio ridotto di danni muscolari
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Begam, M., Narayan, N., Mankowski,… More

Begam, M., Narayan, N., Mankowski, D., Camaj, R., Murphy, N., Roseni, K., Pepin, M. E., Blackmer, J. M., Jones, T. I., Roche, J. A. Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage. J. Vis. Exp. (186), e64000, doi:10.3791/64000 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter