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Neuroscience

Treinamento de resistência ajustado pela dosagem em camundongos com um risco reduzido de dano muscular

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64000
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Summary

O presente protocolo descreve uma técnica única chamada treinamento resistido ajustado à dosagem (DART), que pode ser incorporada em estudos de reabilitação de precisão realizados em pequenos animais, como camundongos.

Abstract

O treinamento resistido progressivo (PRT), que envolve a realização de contrações musculares contra cargas externas progressivamente maiores, pode aumentar a massa muscular e a força em indivíduos saudáveis e em populações de pacientes. Há necessidade de ferramentas de reabilitação de precisão para testar a segurança e a eficácia do PRT para manter e/ou restaurar a massa muscular e a força em estudos pré-clínicos em modelos animais pequenos e grandes. A metodologia PRT e o dispositivo descritos neste artigo podem ser usados para realizar treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART). O dispositivo DART pode ser usado como um dinamômetro autônomo para avaliar objetivamente o torque contrátil concêntrico gerado pelos dorsiflexores do tornozelo em camundongos ou pode ser adicionado a um sistema de dinamometria isocinética pré-existente. O dispositivo DART pode ser fabricado com uma impressora 3D padrão com base nas instruções e arquivos de impressão 3D de código aberto fornecidos neste trabalho. O artigo também descreve o fluxo de trabalho para um estudo para comparar o dano muscular induzido pela contração causado por um único ataque de DART com o dano muscular causado por um surto comparável de contrações isométricas (ISOM) em um modelo de camundongo de distrofia muscular da cintura dos membros tipo 2B / R2 (camundongos BLAT). Os dados de oito camundongos BLAJ (quatro animais para cada condição) sugerem que menos de 10% do músculo tibial anterior (AT) foi danificado por um único ataque de DART ou ISOM, com o DART sendo menos prejudicial que o ISOM.

Introduction

O exercício confere inúmeros benefícios para a saúde do músculo esquelético (revisado em Vina et al.1). Especificamente, o treinamento de resistência progressiva (PRT), que envolve a realização de contrações musculares contra cargas externas progressivamente maiores (por exemplo, barras, halteres, circuitos cabo-polia-peso), é conhecido por ajudar a aumentar a massa muscular e a força em indivíduos saudáveis e populações de pacientes (revisado em publicações anteriores 2,3 ). O PRT baseia-se no princípio da sobrecarga, que afirma que, quando o músculo se contrai contra cargas externas progressivamente maiores, ele se adapta aumentando sua área transversal fisiológica, bem como a capacidade de produção de força4. Os modelos existentes de PRT em roedores incluem escalada de escada com resistência aplicada à cauda, cocontração dos músculos agonistas contra a resistência dos antagonistas, corrida com um arnês pesado, um exercício de agachamento provocado por um choque elétrico e corrida de roda resistida 5,6,7,8,9,10 (revisada em publicações anteriores 11,12 ). No entanto, atualmente não existem ferramentas de pesquisa para realizar com precisão o PRT direcionado ao músculo e ajustado à dosagem em camundongos que se assemelhem aos métodos e dispositivos de PRT usados na pesquisa e prática clínica humana12,13. Isso limita a capacidade dos investigadores de estudar a segurança e a eficácia do PRT dosado com precisão em estudos básicos e pré-clínicos em camundongos.

Para superar essa barreira, uma metodologia e um dispositivo PRT são desenvolvidos neste estudo com base nos projetos de circuitos cabo-polia-peso empregados em equipamentos de treinamento resistido em ginásios modernos14,15,16. Este método de PRT é referido como treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART), e o dispositivo é chamado de dispositivo DART. Além de sua funcionalidade como ferramenta de treinamento de reabilitação de precisão, o dispositivo DART também pode ser usado como um instrumento autônomo para avaliar objetivamente o torque contrátil concêntrico máximo que pode ser gerado pelo músculo tibial anterior (AT) em um rato, semelhante à forma como o máximo de uma repetição (1RM, a carga máxima que pode ser levantada com sucesso / movida / pressionada / agachada apenas uma vez, mantendo a boa forma) é avaliada em humanos17, 18. O dispositivo DART também pode ser acoplado a um dinamômetro isocinético personalizado ou comercial para medir o pico de força tetânica isométrica produzida pelo músculo TA em um camundongo (comparável à contração voluntária máxima [MVC] em humanos) e, em seguida, executar o PRT ajustado pela dosagem com uma resistência baseada no pico de força tetânica (por exemplo, 50% da força de pico).

Este artigo descreve a construção do dispositivo DART e explica como ele pode ser acoplado a um dinamômetro personalizado, que já foi descrito em publicações anteriores 19,20,21,22, para avaliar o torque contrátil e realizar o DART. O estudo também descreve como o dispositivo DART foi usado para comparar o dano muscular induzido pelo exercício causado por um único ataque de DART (4 séries de 10 contrações concentricamente tendenciosas com 50% de 1RM) com danos causados por um surto comparável de contrações isométricas (4 conjuntos de 10 contrações isométricas) em um modelo de camundongo de distrofia muscular tipo 2B da cintura do membro (LGMD2B, ou LGMDR2)23,24. O modelo de camundongo que foi estudado carece de uma proteína chamada disferina, que desempenha um papel importante na proteção do músculo esquelético contra danos musculares de início tardio após contrações excêntricas prejudiciais 22,25,26,27,28,29,30 . Também foi demonstrado em camundongos machos deficientes em disferlina que o exercício forçado concentricamente tendencioso não é tão prejudicial quanto o exercício forçado excentricamente tendencioso e que a exposição prévia ao treinamento concentricamente tendencioso oferece proteção contra lesões de um surto subsequente de contrações excentricamente tendenciosas22. Uma vez que o presente estudo foi realizado para testar a viabilidade da presente metodologia e dispositivo DART na realização de treinamento de resistência concentricamente tendencioso e ajustado à dosagem, camundongos machos deficientes em disferlina foram escolhidos para a investigação para comparar novos dados do dispositivo DART com dados anteriores. Em estudos futuros, camundongos fêmeas BLAJ serão incluídos para estudar o efeito do sexo como variável biológica em relação à resposta ao DART. Camundongos com idade ~1,5 anos foram estudados, uma vez que já apresentam alterações distróficas em muitos grupos musculares e, portanto, modelam o estado fisiopatológico em que os músculos podem estar em pacientes que já apresentam fraqueza e perda muscular e estão buscando cuidados de reabilitação para manter a massa e a força muscular26.

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Protocol

Os experimentos descritos neste artigo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Wayne State University, Detroit, Michigan, EUA, de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996, publicado pela National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, EUA). B6. Camundongos A-Dysfprmd/GeneJ (também conhecidos como camundongos BLAJ, machos, ~1,5 anos de idade) que modelo LGMD2B/R2 foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Desenho do estudo

  1. Escolha linha(s) de camundongo relevante(s) para a(s) questão(ões) de pesquisa — por exemplo, estudo B6. Camundongos A-Dysfprmd/GeneJ (camundongos BLAJ) se tentarem responder à pergunta sobre se o DART concentricamente tendencioso induz ou não danos musculares generalizados em camundongos que modelam LGMD2B/R2.
  2. Atribua camundongos a grupos de estudo com base no desenho do estudo - por exemplo, atribua aleatoriamente camundongos a um grupo de treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART) ou a um grupo de treinamento isométrico (ISOM) e tente equilibrar os grupos da melhor forma possível com base na correspondência por ninhada e / ou idade (por exemplo, Tabela 1).

2. Fabricação do dispositivo DART

  1. Projete os componentes do dispositivo DART com o software adequado de auxílio por computador (CAD) (Figura 1) seguindo as etapas abaixo.
    1. Caixa de projeto para rolamento de roda de baixo atrito (consulte Tabela de materiais, com base no projeto de rolamento de bloco de travesseiro) com um transferidor embutido (para uso como goniômetro para medir os ângulos da junta do tornozelo).
    2. Projete uma torre para a carcaça do rolamento da roda mais um transferidor.
    3. Projete uma placa de pé para posicionar o pé do mouse. Projete um eixo para conectar a placa de pé ao rolamento da roda.
  2. Fabrique os componentes do dispositivo DART com uma impressora 3D adequada (Figura 1).
    1. Salve os projetos criados com software CAD como estereolitografia (. STL extensão) arquivos.
      NOTA: O . Arquivos STL (Arquivos de Codificação Suplementar 1-4) podem ser usados e modificados, dando crédito ao autor correspondente deste artigo e citando este artigo.
    2. Abra o arquivo . Arquivos STL com software de fatiamento adequado (consulte Tabela de materiais).
      NOTA: O software de fatiamento converte um modelo 3D virtual em uma pilha de fatias, que podem ser impressas sequencialmente por uma impressora 3D para gerar um objeto 3D.
    3. Com o software de fatiamento, gere a fabricação assistida por computador G-CODE (CAM, . GCODE extensão) arquivos, que são específicos para a impressora 3D e filamento que será usado.
    4. Siga o manual da impressora 3D (consulte Tabela de materiais) para imprimir componentes do dispositivo DART com o . Arquivos GCODE.
    5. Escolha um filamento de impressora 3D apropriado, como ácido polilático (PLA) 1,75 mm 1 kg/carretel, cinza (consulte Tabela de materiais).
  3. Monte o dispositivo DART seguindo as etapas abaixo.
    1. Insira um rolamento de roda de baixo atrito 608 (diâmetro de furo de 8 mm, diâmetro externo de 22 mm, como um com esferas cerâmicas de nitreto de silício alojadas em aço inoxidável 420, consulte Tabela de materiais) no alojamento do rolamento da roda (Figura 1).
    2. Insira o eixo no furo do rolamento da roda (Figura 1).
    3. Cole a placa de apoio no eixo com cola (ver Tabela de Materiais) adequada para unir o PLA (Figura 1).
    4. Coloque a carcaça do rolamento da roda acima da torre do alojamento do rolamento da roda e prenda todo o conjunto a uma base acrílica com fixadores de parafuso (Figura 1).
      NOTA: Não há requisitos de tamanho específicos para a base acrílica - ela só precisa ser grande o suficiente para acomodar o animal e o dispositivo DART e pequena o suficiente para caber em uma superfície de trabalho. A base acrílica utilizada para o presente estudo tem cerca de 30 cm de largura, 45 cm de comprimento e 0,5 cm de espessura.

3. Preparação de camundongos para DART ou ISOM

  1. Coloque cada rato sob anestesia geral com isoflurano inalado administrado através de um sistema de anestesia adequado (ver Tabela de Materiais, 2%-5% para indução; 1%-4% para manutenção; para efeito) para reduzir o stress e a dor.
    1. Induzir anestesia na câmara de indução do sistema anestésico (isoflurano a 2%-5%).
    2. Transfira o rato para um cone nasal para manter a anestesia durante a realização de procedimentos no animal (1%-4% de isoflurano). Confirme a eficácia da anestesia com base na falta de retirada do membro posterior para uma pitada de dedo do pé de um par de pinças.
    3. Forneça suporte térmico — por exemplo, com uma almofada de aquecimento de gel isotérmico e uma lâmpada de calor colocada ~ 1 m acima do mouse. Verifique com um termômetro para garantir que a temperatura sobre e ao redor da base acrílica seja mantida em ~ 38 ° C, para que o mouse não superaqueça.
  2. Prepare a pele sobre o músculo tibial anterior (AT) esquerdo do rato e sobre todos os aspectos anteriores e laterais do membro posterior esquerdo para DART ou ISOM.
    1. Remova a pele do rato com um creme de depilação (creme depilatório, ver Tabela de Materiais). Aplique creme depilatório e deixe funcionar por ~2 min.
    2. Limpe a perna com toalhetes embebidos em água destilada para remover a pele e todo o creme residual da pele. Cremes depilatórios podem irritar e / ou danificar a pele se deixados na pele do rato por longos períodos e, portanto, remover completamente.
    3. Após a remoção da pele, desinfete a pele com um método de lavagem aprovado, como com uma solução de lavagem de iodopovidona e etanol a 70%.
  3. Aplique um protetor (por exemplo, petrolato) sobre os olhos e a pele depilada com um cotonete limpo para proteger os olhos e a pele depilada da secagem.
  4. Coloque um pino estabilizador através da metáfise tibial.
    1. Aplique 5% de creme de lidocaína sobre a tíbia para anestesiar a área.
    2. Passe uma agulha hipodérmica estéril de 26 G, meia polegada, através da parte mais larga da porção proximal do osso tibial (ou seja, a metáfise tibial, também conhecida como cabeça tibial). Uma vez que o pino estabilizador esteja fixado, remova a porção plástica da agulha hipodérmica segurando a agulha com um hemostato estéril e dobrando a porção plástica até que ela se rompa.
  5. Posicione o mouse para o treinamento DART ou ISOM.
    1. Coloque o rato em decúbito dorsal. Certifique-se de que o mouse ainda esteja firmemente conectado ao cone do nariz para manter a anestesia.
    2. Com um par de pinças de ponta estéril, alimente o pino tibial em um clipe de jacaré de metal (ver Tabela de Materiais), de modo que as extremidades do pino tibial sejam seguradas pela braçadeira de jacaré. Mova o braço ajustável da braçadeira de jacaré para garantir que o pé do mouse seja colocado na placa de pé do dispositivo DART.
    3. Prenda o pé do rato na placa de apoio do dispositivo DART com fita adesiva de laboratório.
    4. Coloque o pé do rato num ângulo de 90° em relação ao eixo longo do osso tibial do rato. Se colocada corretamente, a placa de pé será perpendicular à base acrílica (ou seja, o piso ou o que é considerado o plano horizontal).
    5. Apoiar a placa de pé na parada plantarflexão criada pela colocação de uma agulha hipodérmica longa de 18 G, 1,5 em 18 G, através dos orifícios pré-perfurados no transferidor do dispositivo DART (Figura 1).

4. Treinamento DART ou ISOM

  1. Otimize a colocação do eletrodo colocando um eletrodo de estimulação elétrica bipolar, transcutânea e neuromuscular (EENM, ver Tabela de Materiais) na face inferolateral da articulação do joelho do rato (Figura 1B).
    1. Com pulsos únicos (1 Hz) de um estimulador elétrico de laboratório (ver Tabela de Materiais), estimular o ramo fibular do nervo ciático, que proporciona inervação motora aos músculos dorsiflexores do tornozelo (Figura 1B).
    2. Como o músculo tibial anterior (AT) é responsável por mais de 90% da força contrátil total produzida pelos músculos dorsiflexores do tornozelo31, observe a barriga e o tendão do músculo AT em busca de evidências de contrações de contração da contração eletricamente provocadas.
      NOTA: Uma ligeira proeminência óssea que corresponde ao osso da fíbula pode ajudar na colocação do eletrodo se o testador puder senti-lo através do eletrodo. Isso requer alguma prática e aprendizado por parte do testador para ter uma ideia da colocação ideal do eletrodo.
    3. Mova a parada de flexão plantar para o orifício no transferidor que corresponde a 20° de flexão plantar da posição em que o pé é ortogonal (90°) para a tíbia - esta é a posição na qual o torque contrátil máximo do músculo AT é tipicamente observado com base em relatos anteriores21. Isso pode ter que ser personalizado pelo usuário com base em fatores específicos dos camundongos que estão sendo estudados.
    4. Visualize o torque de contração com um dinamômetro de mouse ligando a placa de pé do dispositivo DART à placa de pé do dinamômetro — por exemplo, vincule a placa de pé do dispositivo DART a uma placa de pé de dinamômetro de tornozelo robótico personalizada com uma sutura de seda não elástica (semelhante à Figura 1A) e prenda a sutura à placa de pé do dinamômetro (consulte Tabela de materiais).
      NOTA: A placa de rodapé tem orifícios embutidos no design de impressão 3D. A colocação da sutura através do par de orifícios que estão na segunda fileira da ponta do dedo do pé coloca a sutura a ~20 mm do eixo de dorsiflexão/flexão plantar (Figura 1A, B). O dinamômetro já foi descrito em relatos anteriores 19,20,21,22.
  2. Otimize a saída de tensão do estimulador NMES.
    1. Depois de otimizar a colocação do eletrodo, otimize a amplitude da saída de tensão do estimulador elétrico - isso é necessário para confinar a EENM ao nervo fibular comum e ao músculo AT e reduzir o risco de provocar cocontrações nos plantarflexores.
      NOTA: Se as co-contrações forem provocadas, elas podem ser visualizadas através da saída de torque do dinamômetro e também ser vistas na flexão plantar dos dedos dos pés.
  3. Defina o estimulador NMES para treinamento DART ou ISOM.
    NOTA: As configurações a seguir podem ter que ser personalizadas pelo usuário com base em fatores específicos dos camundongos que estão sendo estudados e no objetivo dos estudos.
    1. Ajuste o estimulador para produzir trens de pulso repetidos com 125 Hz de frequência - essa frequência produz contrações tetânicas máximas fundidas sem transbordamento de EENM para outros grupos musculares em camundongos BLAJ21. Efetue este procedimento ajustando os mostradores para a frequência de pulso (125 Hz), a duração do comboio (500 ms) e os comboios por segundo (1 comboio/s) e ligando o interruptor de alternância para repetir comboios de impulso.
    2. Ajuste o estimulador para produzir trens de pulso com 500 ms de duração intercalados com 500 ms de descanso entre os trens de pulso.
    3. Mova a parada de flexão plantar para o orifício no transferidor que corresponde a 160° ao eixo longo da tíbia (flexão plantar de 70° do pé ortogonal para a tíbia). Esta é a posição para a qual o pé do rato BLAJ pode ser movido passivamente sem resistência dos tecidos moles21.
    4. Para DART, aplique uma resistência adequada contra a qual o músculo AT tem que trabalhar concêntrico - por exemplo, 5 g, como mostrado na Figura 1A, B; consulte a curva de calibração peso/torque no Arquivo Suplementar 1.
    5. Aplique resistência pendurando o peso com uma sutura de seda não elástica que esteja presa à placa de pé do dispositivo DART (Figura 1A, B).
    6. Ajuste a resistência - ou seja, aplique ~50% do máximo de uma repetição (1RM) (por exemplo, 5 g se o mouse puder levantar um peso máximo de 10 g com uma única contração), o que puxa o pé através de pelo menos metade da faixa ativa disponível de dorsiflexão.
    7. Realizar treinamento adequado de DART em camundongos designados para o grupo DART – por exemplo, realizar uma única sessão de treinamento DART, que envolve quatro séries de 10 repetições de contrações concêntricas com 2 minutos de descanso entre as séries, semelhante aos programas de treinamento de resistência progressiva usados em humanos32 (ver Vídeo Suplementar 1).
    8. Realizar treinamento ISOM adequado em camundongos designados para o grupo ISOM - por exemplo, realizar uma única sessão de treinamento ISOM, que envolve quatro séries de 10 repetições de contrações isométricas com 2 minutos de descanso entre as séries, semelhante ao DART (ver Vídeo Suplementar 2).
    9. Para o treinamento ISOM, coloque o pé do mouse a 160° do eixo longo da tíbia (flexão plantar de 70° do pé ortogonal à tíbia) e mantenha essa posição estática colando a sutura de seda na placa de pé do dinamômetro robótico.
      NOTA: Como a sutura não pode deslizar, a placa de pé do dispositivo DART não pode se mover para a dorsiflexão, restringindo assim os dorsiflexores a se contraírem isometricamente.

5. Cuidados pós-procedimento para camundongos

  1. Tome precauções para manter a higiene adequada do membro posterior exercitado e reduzir a dor no local da agulha.
    1. Após o treinamento DART ou ISOM, revestir a porção visível do pino tibial com pomada antibiótica tripla (400 U/g de bacitracina, 3,5 mg/g de neomicina e 5000 U/g de polimixina-B, ver Tabela de Materiais) e, em seguida, retirar o pino cuidadosamente do lado medial da tíbia. Lave a pele sobre a coxa lateral e a parte superior da perna com iodopovidona e água estéril. Aplique creme de lidocaína a 5% sobre a tíbia para controlar a dor no local da agulha.
  2. Permita que os ratos se recuperem da anestesia.
    1. Remova o rato do cone do nariz e deixe-o recuperar da anestesia numa gaiola de recuperação livre de cama. Forneça suporte térmico ao rato enquanto ele se recupera da anestesia, por exemplo, com uma almofada de aquecimento em gel isotérmico.
  3. Devolva o rato à sua gaiola original depois de se recuperar completamente da anestesia. Em seguida, devolva a gaiola à instalação animal, onde os ratos do estudo são alojados até que os experimentos de acompanhamento sejam realizados. Monitore os ratos diariamente.

6. Coleta de tecidos

  1. Colha o músculo TA do rato na sua totalidade e congele rapidamente para criopreservação seguindo os passos abaixo.
    1. Com base na(s) pergunta(s) de pesquisa, em um momento adequado após o treinamento (por exemplo, 3 dias após o DART ou ISOM), eutanasie os camundongos de acordo com os protocolos aprovados.
      NOTA: Para o presente estudo, camundongos foram eutanasiados por luxação cervical sob anestesia geral (isoflurano inalatório, 2%-5% para efeito). A toracotomia bilateral garantiu a morte.
    2. Dissecar os membros posteriores do rato para remover o músculo AT exercitado (esquerda) e o músculo AT não exercitado (direita). Pese os músculos colhidos. Em seguida, mergulhe cada músculo em óleo mineral para crioproteção e coloque o músculo em uma limpeza de laboratório limpa para apagar o excesso de óleo21.
  2. Coloque o músculo em um pedaço de papel alumínio. Segure a borda da folha com um hemostato longo e mergulhe rapidamente a folha e o músculo em nitrogênio líquido contido em um recipiente de plástico adequado para congelar o músculo.
    1. Após cerca de 2 minutos de imersão em nitrogênio líquido, transfira o músculo congelado para frascos criogênicos marcados. Conservar os frascos para injetáveis num congelador de -80 °C até que seja necessário para estudos adicionais.

7. Estudos histológicos do tecido muscular

  1. Prepare seções de criostato do músculo AT com 5 μm de espessura. Colete seções de criostato em lâminas de microscópio carregadas. Fixe as secções com acetona que é mantida fria a -30 °C e deixe as secções secarem ao ar.
  2. Coloração das seções do tecido muscular com hematoxilina seguida de eosina (coloração H&E, ver Tabela de Materiais).
    1. Mergulhe as seções por 5 min em hematoxilina (mancha nuclear azul escura) em um vitral de vidro. Remova o excesso de hematoxilina enxaguando as seções com água da torneira até que não se veja mais rubor de água.
    2. Mergulhe as seções por 5 minutos em reagente azulado em um frasco de vidro. Aspirar o excesso de reagente de rubor das secções com uma pipeta de sucção de vidro.
    3. Mergulhe as seções por 5 min em eosina (mancha citoplasmática rosa) em um vitral de vidro. Remova o excesso de eosina mergulhando as seções rápida e repetidamente (~ 10 vezes) em etanol a 95% em um vitral de vidro.
    4. Deixe as seções secarem ao ar e prossiga para visualizar sob um microscópio de luz.
  3. Prepare imagens em azulejo de alta resolução de seções transversais inteiras do músculo AT através de imagens de microscópio.
    NOTA: O usuário pode ter que personalizar as etapas de imagem e análise de imagem que se seguem com base em seu microscópio e software de aquisição e análise de imagem.
    1. Capture imagens digitais com a lente objetiva de 10x de um microscópio de luz e uma câmera digital montada no microscópio.
    2. Capture cerca de 15-20 imagens, movendo-se ao longo da seção transversal de cada músculo de uma maneira semelhante a uma grade, de modo que cada nova imagem se sobreponha ~ 25% com a imagem anterior.
      NOTA: Esse processo ajuda a capturar um conjunto de imagens que podem ser lado a lado digitalmente (também conhecido como costura de imagem) para criar uma imagem composta de alta resolução de toda a seção transversal do músculo TA (Figura 2).
    3. Salve imagens digitais no . Formato TIFF.
    4. Abra imagens digitais com software de processamento e análise de imagens adequado (consulte Tabela de Materiais).
    5. Mosaice ou costure imagens individuais em uma imagem composta de todo o músculo TA através das seguintes etapas: com todas as imagens individuais sobrepostas de cada músculo TA abertas no software, clique em Arquivo > Selecione Automatizar > Selecione Photomerge > Selecione Colagem > Selecione Adicionar Arquivos Abertos > Clique em OK.
    6. Quando uma nova imagem lado a lado/costurada do músculo TA for preparada e exibida, salve a imagem em . Formato TIFF para análises posteriores.
  4. Quantifique o dano muscular por análise visual nas imagens em azulejo de todo o músculo AT com um software de análise de imagem adequado.
    1. No software de análise de imagens, selecione a função Measure no menu Analyze para delinear e medir a área de toda a seção transversal do músculo TA (Figura 2).
    2. No software de análise de imagens, selecione a função Medir no menu Analisar para delinear e medir as áreas de cada músculo AT que estão danificadas — ou seja, áreas que apresentam ruptura citoplasmática das fibras musculares, fibras musculares ausentes e infiltração de células inflamatórias22 (Figura 2).
    3. Expressar a soma da área total de dano em porcentagem de toda a área transversal do músculo AT (Figura 2, Tabela 2).

8. Análises estatísticas

  1. Organize os dados conforme mostrado nas Tabelas 1-3 e realize testes T não pareados (se os testes de normalidade e variâncias homogêneas forem aprovados)33 ou os testes de Mann-Whitney Rank Sum (se os testes de normalidade e variâncias homogêneas não forem aprovados)21 com software adequado (ver Tabela de Materiais).

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Representative Results

Camundongos machos BLAJ, que tinham ~ 1,5 anos de idade, foram estudados. Os ratos BLAJ modelam a doença muscular humana, LGMD2B/R2. Esses camundongos são particularmente suscetíveis a danos musculares de início tardio decorrentes de um único ataque de contrações musculares excêntricas22,29. Os camundongos BLAJ foram, portanto, escolhidos para esses estudos para saber se o DART poderia ser realizado de maneira não prejudicial, ajustando precisamente a resistência contra a qual o músculo AT tem que trabalhar de maneira concêntrica e tendenciosa. Se fosse descoberto que o DART não era prejudicial aos camundongos BLAG, provavelmente seria útil como uma forma de treinamento de resistência não prejudicial, que poderia ser aplicado sozinho ou como adjuvante à medicina regenerativa, genética, farmacológica e outras intervenções.

As idades e os pesos dos camundongos BLAJ foram estreitamente pareados entre os grupos DART e ISOM (Tabela 1). No Dia 3 (~ 72 h), após uma única sessão de treinamento, o músculo TA exercitado teve baixos níveis de dano nos grupos DART e ISOM (<10% de área danificada) – isso contrasta com estudos anteriores21,22 da resposta de camundongos BLAJ a contrações musculares excêntricas, onde ~40% de fibras danificadas foram relatadas no Dia 3 (Figura 2, Tabela 2). Quando a área de dano muscular foi comparada entre os músculos AT exercitados dos grupos DART e ISOM, verificou-se que o grupo DART apresentou níveis mais baixos de dano muscular do que o grupo ISOM (Figura 2, Tabela 2). O torque tetânico máximo registrado no Dia 0 (linha de base) e no Dia 3 não foi estatisticamente diferente entre os grupos DART e ISOM (Tabela 3).

Figure 1
Figura 1: Fabricando o dispositivo DART e aplicando-o em um estudo de treinamento. (A,B) O dispositivo DART é baseado em um projeto de circuito de peso de polia de cabo, que é comum ao equipamento de treinamento de resistência projetado para seres humanos. (A) O dispositivo DART com um animal durante uma sessão de treinamento DART. (B) A placa do pé movendo-se para dorsiflexão durante uma contração concêntrica do músculo AT (seta verde curva, direita). A contração concêntrica faz com que a resistência de 5 g se mova verticalmente contra a gravidade (seta verde vertical, à esquerda). As contrações musculares foram provocadas com estimulação elétrica aplicada através de um eletrodo bipolar transcutâneo. (C) Vários componentes do dispositivo DART foram projetados com software de estereolitografia para gerar . STL, que podem ser abertos com software de fatiamento. Com o software de fatiamento, foram gerados arquivos G-CODE específicos para a impressora 3D e filamento utilizado. Os componentes impressos em 3D do dispositivo DART incluíam (C) carcaça para um rolamento de roda de baixo atrito 608, (D) uma torre para a carcaça do rolamento da roda, (E) uma placa de pé e (F) um eixo para conectar a placa de pé ao rolamento da roda. Os componentes impressos em 3D foram combinados e montados sobre uma base acrílica com cola e fixadores de parafuso, conforme descrito no texto e mostrado em (A). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Estudo histológico. Alterações histológicas no músculo AT no Dia 3 (A) pós-DART ou (B) pós-ISOM. As criosecções, com 5 μm de espessura, foram coradas com hematoxilina e eosina. Múltiplas imagens digitais sobrepostas foram capturadas e fundidas com software de imagem para gerar imagens em mosaico de alta resolução de toda a seção transversal do músculo AT. Os dados histológicos qualitativos indicaram que a extensão do dano muscular foi baixa nos grupos DART e ISOM, mas o dano muscular foi um pouco mais óbvio no grupo ISOM. As setas amarelas apontam para algumas das regiões danificadas nas seções transversais do músculo AT. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Idades e pesos corporais dos camundongos. Os ratos BLAJ que foram estudados foram estreitamente pareados em idade e peso corporal, sem diferença significativa entre os grupos DART e ISOM. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Análise quantitativa do dano muscular AT. A extensão do dano muscular foi expressa como uma porcentagem da área total da secção transversal do músculo AT e analisada por um teste T. Tanto o treinamento DART quanto o ISOM resultaram em um baixo nível de dano muscular no Dia 3 quando comparados a estudos anteriores envolvendo um ataque semelhante de contrações excêntricas em camundongos BLAB. Embora a magnitude do dano muscular tenha sido pequena nos grupos DART e ISOM, a extensão do dano foi estatisticamente menor no grupo DART. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Dados de torque contrátil. O torque contrátil produzido pelos músculos dorsiflexores foi estudado com um dinamômetro robótico conectado ao dispositivo DART. Não houve diferença significativa entre os grupos DART e ISOM no torque tetânico basal máximo medido no dia do exercício (A, Dia 0) ou aos 3 dias após o exercício (B, Dia 3). Apesar da falta de evidências histológicas de dano muscular generalizado, um único ataque de DART e ISOM foi associado a um déficit de torque contrátil (~40%) no Dia 3. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Vídeo Suplementar 1: Treinamento DART em camundongos. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 2: Treinamento ISOM em camundongos. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo Suplementar 1: Dados de calibração de peso para torque, curva e configuração. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivos de codificação suplementares 1-4: Designs para os componentes do dispositivo DART. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este artigo apresenta instruções passo a passo sobre como construir um dispositivo para realizar um tipo de treinamento de reabilitação de precisão chamado treinamento de resistência ajustado à dosagem (DART). O trabalho também descreve a aplicação do dispositivo DART e metodologia em um estudo de treinamento para comparar o dano muscular 3 dias após uma única sessão de DART (grupo DART) com o dano 3 dias após um ataque comparável de treinamento isométrico (grupo ISOM).

As etapas críticas do protocolo são a construção adequada do dispositivo DART 34,35, as etapas precisas envolvidas na realização do treinamento DART ou ISOM, a colheita e criopreservação adequadas do tecido muscular, o corte adequado do tecido muscular com criostático e a coloração adequada das seções transversais musculares com hematoxilina e eosina 22,36 . Especificamente, para construir o dispositivo DART, as peças devem ser fabricadas com as dimensões exatas e as propriedades ideais do material. Se as dimensões forem imprecisas para a carcaça do rolamento da roda, o rolamento da roda do tipo 608 não se encaixará confortavelmente dentro da carcaça do rolamento da roda. Se as dimensões da placa de apoio e do eixo do mouse não forem precisas, isso poderá afetar negativamente a capacidade do rolamento da roda de se mover junto com o pé do mouse. Se as peças do dispositivo DART forem fabricadas com um material inadequado e/ou configurações de impressora 3D, as peças do dispositivo DART podem não ter resistência mecânica suficiente, o que pode levar à flexão e/ou quebra de vários componentes34.

Modificações deste protocolo podem ser necessárias com base nas perguntas de pesquisa específicas que os pesquisadores desejam responder. O protocolo atual é específico para projetar e implementar o dispositivo DART em um estudo que tentou responder à questão de saber se um único ataque de DART causa ou não danos extensos ao músculo AT em camundongos deficientes em disferina, como relatamos anteriormente com um ataque semelhante de contrações excêntricas22. Uma vez que outros sugeriram que o exercício consistindo de contrações isométricas pode não ser prejudicial e, portanto, adequado para humanos com certas doenças musculares, comparamos a extensão do dano muscular causado pelo DART a um surto comparável de contrações isométricas (ISOM)37,38. Neste estudo, descobrimos que tanto o DART quanto o ISOM induzem danos musculares mínimos, com o DART mostrando níveis de dano levemente, mas significativamente mais baixos do que o ISOM.

Em relação à solução de problemas, o aspecto mais desafiador do protocolo é precisamente estimular o ramo fibular do nervo ciático, o que dá inervação motora ao músculo AT. Essa técnica é particularmente desafiadora, pois o testador segura um eletrodo transcutâneo e o coloca manualmente em um ponto preciso, inferior e lateral à articulação do joelho do camundongo20,39. O testador deve praticar e aprender a localizar esse ponto no membro posterior do rato, sentindo uma ligeira proeminência óssea correspondente à cabeça do osso fibular do rato40. Para confirmar que a estimulação elétrica ideal do ramo fibular do nervo ciático está sendo alcançada, de modo que as contrações máximas do músculo AT sejam alcançadas, é melhor que um sistema de dinamômetro confiável seja utilizado20,21,22,41. Além disso, eletrodos transcutâneos ou subcutâneos estabilizados por pinça também podem ser considerados para a colocação confiável e reprodutível de eletrodos para minimizar a variabilidade e os erros induzidos pelo usuário 20,41,42,43.

A principal limitação do protocolo é que ele é projetado especificamente para estudar o efeito do DART sobre o músculo AT em camundongos. Com métodos desenvolvidos para a realização de avaliações dinamométricas e exercícios forçados no grupo muscular quadríceps femoral em roedores, o dispositivo DART pode ser facilmente adaptado para o grupo muscular quadríceps femoral42,43. Aplicar o dispositivo DART a outros grupos musculares pode ser mais desafiador; no entanto, o projeto do circuito cabo-polia-peso, que tem sido usado no dispositivo DART, pode ser incorporado em dispositivos que são adequados para outros grupos musculares. Outra limitação é que o protocolo é realizado sob anestesia geral, tornando o exercício forçado e não voluntário; isso é diferente da maioria dos paradigmas de treinamento resistido desenvolvidos para humanos12,21.

A importância do dispositivo e da metodologia DART em relação aos métodos existentes ou alternativos é que a dosagem para o treinamento resistido pode ser ajustada com precisão e o exercício pode ser direcionado com precisão para um determinado grupo muscular12. A reabilitação de precisão é uma nova prioridade estratégica para os Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos e, uma vez que o DART possibilita a realização de treinamento resistido de precisão em camundongos, o DART se presta bem a estudos básicos e pré-clínicos sobre reabilitação física de precisão44,45.

A importância e a aplicação potencial do método atual de realizar treinamento de resistência ajustado à dosagem são que ele torna possível realizar estudos de treinamento de resistência em camundongos de maneiras comparáveis aos testes humanos e protocolos de treinamento usados na pesquisa e prática de reabilitação clínica. Por exemplo, assim como o máximo de uma repetição (1RM, a carga máxima que pode ser levantada com sucesso / movida / pressionada / agachada apenas uma vez, mantendo a boa forma) é usada para os seres humanos ajustarem a magnitude da resistência para ataques de treinamento17,18, a carga máxima que o músculo TA pode levantar com sucesso pode ser usada para definir a resistência para o treinamento em camundongos com o dispositivo DART. Além de ajustar a resistência com base na capacidade de um animal, a vantagem adicional é que as contrações são concêntricas tendenciosas, o que ajuda a reduzir a lesão muscular induzida pela contração22. Os resultados representativos sugerem que um ataque de DART é ainda menos prejudicial do que um ataque comparável de contrações isométricas (grupo ISOM). A natureza não prejudicial do DART o torna apropriado para estudos de treinamento em que contrações prejudiciais são melhor evitadas – por exemplo, estudos de treinamento em camundongos que modelam distrofias musculares e estudos de treinamento projetados para recarregar gradualmente o músculo após procedimentos cirúrgicos experimentais em músculos e / ou tendões 22,46,47.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este estudo foi financiado por doações da Jain Foundation Inc., R03HD091648 do NICHD, uma Bolsa Piloto da AR3T sob NIH P2CHD086843, um Prêmio FRAP da EACPHS da Wayne State University, um Pacote de Inicialização da Faculdade da Wayne State University e um subcontrato de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) para a JAR. Este estudo também foi financiado por uma bolsa de pesquisa da American Physical Therapy Association - Michigan (APTA-MI) para JMB, MEP e JAR. Os autores reconhecem a Dra. Renuka Roche (Professora Associada, Eastern Michigan University, MI) por ler criticamente o manuscrito e fornecer feedback. Os autores agradecem ao Sr. Anselm D. Motha por conselhos sobre impressão 3D. Os autores agradecem aos pacientes com disferlinopatias que compartilharam suas histórias no site da Fundação Jain em https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, particularmente suas experiências com o exercício.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing Anmiao Star (N/A) AMS127 High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA) Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. Stock #012767 Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA BS4 50–6824 Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. S17495 Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software Ultimaker, Utrecht, Netherlands Ultimaker Cura 4.4.1. Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad Braintree Scientific (Braintree, MA) Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y Millipore Sigma (Burlington, MA) HT110132-1L Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) Gorilla Super Glue Micro Precise Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3 Millipore Sigma (Burlington, MA) GHS332-1L Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120 Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014 National Instruments, Austin, Texas, USA Labview 2014 Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks ThermoFisher (Waltham, MA) S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
Metal alligator clip JINSHANGTOPK (web-based business) 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides Globe Scientific (Mahwah, NJ) 1354W. Diamond White Glass Slides Charged microscope slides
Mineral Oil ThermoFisher (Waltham, MA) BP26291 Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) #11778 Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) Mini V2 3D 3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) NIH Image for Windows Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4 Adobe (San Jose, CA) Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit Grass Instruments (West Warwick, RI) PSIU6 isolation unit Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) Roboz Surgical SUT152 Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator Grass Instruments (West Warwick, RI) S48 Stimulator Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent Ricca Chemical Company (Arlington, TX) 6697-32 Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5 Systat Software (San Jose, CA) SigmaStat version 3.5 Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment Global Health Products (wed-based business) Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

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References

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Neurociência Edição 186 Músculo esquelético treinamento de resistência reabilitação regenerativa reabilitação de precisão lesão muscular disferlina distrofia muscular da cintura dos membros
Treinamento de resistência ajustado pela dosagem em camundongos com um risco reduzido de dano muscular
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Begam, M., Narayan, N., Mankowski, D., Camaj, R., Murphy, N., Roseni, K., Pepin, M. E., Blackmer, J. M., Jones, T. I., Roche, J. A. Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage. J. Vis. Exp. (186), e64000, doi:10.3791/64000 (2022).

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