Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تدريب المقاومة المعدل بالجرعة في الفئران مع تقليل خطر تلف العضلات

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64000
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Summary

يصف البروتوكول الحالي تقنية فريدة تسمى تدريب المقاومة المعدل بالجرعة (DART) ، والتي يمكن دمجها في دراسات إعادة التأهيل الدقيقة التي أجريت على الحيوانات الصغيرة ، مثل الفئران.

Abstract

يمكن أن يؤدي تدريب المقاومة التدريجي (PRT) ، الذي يتضمن إجراء تقلصات عضلية ضد الأحمال الخارجية المتزايدة تدريجيا ، إلى زيادة كتلة العضلات وقوتها لدى الأفراد الأصحاء والمرضى. هناك حاجة إلى أدوات إعادة تأهيل دقيقة لاختبار سلامة وفعالية PRT للحفاظ على و / أو استعادة كتلة العضلات وقوتها في الدراسات قبل السريرية على النماذج الحيوانية الصغيرة والكبيرة. يمكن استخدام منهجية وجهاز PRT الموصوف في هذه المقالة لأداء تدريب المقاومة المعدل بالجرعة (DART). يمكن استخدام جهاز DART كمقياس ديناميكي مستقل لتقييم موضوعي لعزم الدوران المقلص متحد المركز الناتج عن عضلات الكاحل الظهرية في الفئران أو يمكن إضافته إلى نظام قياس ديناميكي متساوي الحركة موجود مسبقا. يمكن تصنيع جهاز DART باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد قياسية بناء على التعليمات وملفات الطباعة ثلاثية الأبعاد مفتوحة المصدر المتوفرة في هذا العمل. تصف المقالة أيضا سير العمل لدراسة لمقارنة تلف العضلات الناجم عن الانقباض الناجم عن نوبة واحدة من DART بتلف العضلات الناجم عن نوبة مماثلة من الانقباضات متساوية القياس (ISOM) في نموذج فأر من الحثل العضلي للأطراف من النوع 2B / R2 (فئران BLAJ). تشير البيانات من ثمانية فئران BLAJ (أربعة لكل حالة) إلى أن أقل من 10٪ من عضلة الظنبوب الأمامية (TA) قد تضررت من نوبة واحدة من DART أو ISOM ، مع كون DART أقل ضررا من ISOM.

Introduction

تمنح التمارين الرياضية العديد من الفوائد الصحية للعضلات الهيكلية (تمت مراجعتها في Vina et al.1). على وجه التحديد ، من المعروف أن تدريب المقاومة التدريجي (PRT) ، والذي يتضمن إجراء تقلصات عضلية ضد أحمال خارجية أكبر تدريجيا (على سبيل المثال ، الحديد ، الدمبل ، دوائر وزن بكرة الكابل) ، يساعد على زيادة كتلة العضلات وقوتها في كل من الأفراد الأصحاء ومجموعات المرضى (تمت مراجعته في المنشورات السابقة 2,3 ). يعتمد PRT على مبدأ الحمل الزائد ، والذي ينص على أنه عندما تنقبض العضلات ضد أحمال خارجية أكبر تدريجيا ، فإنها تتكيف عن طريق زيادة مساحة المقطع العرضي الفسيولوجي بالإضافة إلى قدرتها على إنتاج القوة4. تشمل النماذج الحالية ل PRT في القوارض تسلق السلم مع تطبيق المقاومة على الذيل ، والانقباض المشترك لعضلات الناهض ضد مقاومة الخصوم ، والجري بحزام مرجح ، وتمرين القرفصاء الناجم عن صدمة كهربائية ، ومقاومة تشغيل العجلات5،6،7،8،9،10 (تمت مراجعته في المنشورات السابقة11،12 ). ومع ذلك ، لا توجد حاليا أدوات بحثية لأداء PRT المستهدف بدقة والمعدل بالجرعة في الفئران التي تشبه إلى حد كبير أساليب وأجهزة PRT المستخدمة في الأبحاث والممارسات السريرية البشرية12,13. هذا يحد من قدرة الباحثين على دراسة سلامة وفعالية PRT بجرعات دقيقة في الدراسات الأساسية وما قبل السريرية في الفئران.

للتغلب على هذا الحاجز ، تم تطوير منهجية وجهاز PRT في هذه الدراسة بناء على تصميمات دوائر وزن بكرة الكابل المستخدمة في معدات تدريب المقاومة في الصالات الرياضية الحديثة14،15،16. يشار إلى طريقة PRT هذه باسم تدريب المقاومة المعدل بالجرعة (DART) ، ويسمى الجهاز جهاز DART. بالإضافة إلى وظيفته كأداة تدريب إعادة تأهيل دقيقة ، يمكن أيضا استخدام جهاز DART كأداة قائمة بذاتها لإجراء تقييم موضوعي لأقصى عزم دوران مقلص متحد المركز يمكن أن تولده عضلة الظنبوب الأمامية (TA) في الماوس ، على غرار الطريقة التي يتم بها تقييم الحد الأقصى للتكرار الواحد (1RM ، الحمل الأقصى الذي يمكن رفعه / تحريكه / ضغطه / القرفصاء بنجاح مرة واحدة فقط مع الحفاظ على شكل جيد) في البشر17 ، 18. يمكن أيضا إقران جهاز DART بمقياس ديناميكي متساوي الحركة مصمم خصيصا أو تجاري لقياس ذروة قوة الكزاز متساوية القياس التي تنتجها عضلة TA في الماوس (يمكن مقارنتها بأقصى انكماش طوعي [MVC] في البشر) ثم إجراء PRT المعدل بالجرعة مع مقاومة تعتمد على ذروة قوة الكزاز (على سبيل المثال ، 50٪ من قوة الذروة).

توضح هذه المقالة بناء جهاز DART وتشرح كيف يمكن أن يقترن بمقياس ديناميكي مصمم خصيصا ، والذي تم وصفه في المنشورات السابقة19،20،21،22 ، لتقييم عزم الدوران المقلص وأداء DART. تصف الدراسة أيضا كيفية استخدام جهاز DART لمقارنة تلف العضلات الناجم عن التمرين الناجم عن نوبة واحدة من DART (4 مجموعات من 10 تقلصات متحيزة بشكل مركز مع 50٪ 1RM) للضرر الناجم عن نوبة مماثلة من الانقباضات متساوية القياس (4 مجموعات من 10 تقلصات متساوية القياس) في نموذج فأر من الحثل العضلي لحزام الأطراف من النوع 2B (LGMD2B ، أو LGMDR2)23,24. يفتقر نموذج الفأر الذي تمت دراسته إلى بروتين يسمى dysferlin ، والذي يلعب دورا مهما في حماية العضلات الهيكلية من تلف العضلات المتأخر بعد الانقباضات اللامركزية الضارة 22،25،26،27،28،29،30 . وقد ثبت أيضا في الفئران الذكور التي تعاني من نقص dysferlin أن التمرين القسري المتحيز بشكل مركز ليس ضارا مثل التمرين القسري المتحيز غريب الأطوار وأن التعرض المسبق للتدريب المتحيز بشكل مركز يوفر الحماية ضد الإصابة من نوبة لاحقة من الانقباضات المتحيزة بشكل غريب الأطوار22. نظرا لأن الدراسة الحالية أجريت لاختبار جدوى منهجية DART الحالية والجهاز في أداء تدريب المقاومة المعدل بالجرعة والمتحيز بشكل مركز، فقد تم اختيار ذكور الفئران التي تعاني من نقص الديسفيرلين للتحقيق لمقارنة البيانات الجديدة من جهاز DART مع البيانات السابقة. في الدراسات المستقبلية ، سيتم تضمين إناث فئران BLAJ لدراسة تأثير الجنس كمتغير بيولوجي فيما يتعلق بالاستجابة ل DART. تمت دراسة الفئران التي كانت ~ 1.5 سنة لأن لديها بالفعل تغيرات ضمور في العديد من مجموعات العضلات ، وبالتالي ، نموذج الحالة الفيزيولوجية المرضية التي قد تكون فيها العضلات في المرضى الذين يعانون بالفعل من ضعف العضلات والهزال ويسعون للحصول على رعاية إعادة التأهيل للحفاظ على كتلة العضلات وقوتها26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب الموضحة في هذه المقالة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة واين ستيت ، ديترويت ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر (1996 ، نشرته National Academy Press ، 2101 Constitution Ave. NW ، واشنطن العاصمة 20055 ، الولايات المتحدة الأمريكية). ب6. تم استخدام فئران A-Dysfprmd / GeneJ (المعروفة أيضا باسم فئران BLAJ ، الذكور ، ~ 1.5 سنة) التي تم استخدام نموذج LGMD2B / R2 للدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. تصميم الدراسة

  1. اختر سلالة (سلالات) الماوس ذات الصلة بسؤال (أسئلة) البحث - على سبيل المثال ، الدراسة B6. A-Dysfprmd / GeneJ الفئران (الفئران BLAJ) إذا كنت تحاول الإجابة على السؤال حول ما إذا كان DART المتحيز بشكل مركز يؤدي إلى تلف عضلي واسع النطاق في الفئران التي موديل LGMD2B / R2 أم لا.
  2. قم بتعيين الفئران لمجموعات الدراسة بناء على تصميم الدراسة - على سبيل المثال ، قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي لمجموعة تدريب المقاومة المعدلة بالجرعة (DART) أو لمجموعة تدريب متساوية القياس (ISOM) ، وحاول موازنة المجموعات على أفضل وجه ممكن بناء على المطابقة حسب القمامة و / أو العمر (على سبيل المثال ، الجدول 1).

2. تصنيع جهاز DART

  1. صمم مكونات جهاز DART باستخدام برنامج مناسب بمساعدة الكمبيوتر (CAD) (الشكل 1) باتباع الخطوات أدناه.
    1. غلاف تصميم لمحمل عجلة منخفض الاحتكاك (انظر جدول المواد ، بناء على تصميم محمل كتلة الوسادة) مع منقلة مدمجة (لاستخدامها كمقياس زوايا لقياس زوايا مفصل الكاحل).
    2. تصميم برج للإسكان تحمل عجلة بالإضافة إلى منقلة .
    3. صمم صفيحة قدم لوضع قدم الماوس. صمم محورا لتوصيل صفيحة القدم بمحمل العجلة.
  2. قم بتصنيع مكونات جهاز DART باستخدام طابعة 3D مناسبة (الشكل 1).
    1. احفظ التصميمات التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج CAD كطباعة حجرية مجسمة (. STL extension) الملفات.
      ملاحظة: ملف . يمكن استخدام ملفات STL (ملفات الترميز التكميلية 1-4) وتعديلها من خلال منح الفضل للمؤلف المقابل لهذه المقالة والاستشهاد بهذه المقالة.
    2. افتح ملف. STL مع برنامج تقطيع مناسب (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يقوم برنامج التقطيع بتحويل نموذج ثلاثي الأبعاد افتراضي إلى مجموعة من الشرائح، والتي يمكن طباعتها بالتتابع بواسطة طابعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء كائن ثلاثي الأبعاد.
    3. باستخدام برنامج التقطيع ، قم بإنشاء التصنيع بمساعدة الكمبيوتر G-CODE (CAM، . GCODE extension) ، وهي خاصة بالطابعة 3D والخيوط التي سيتم استخدامها.
    4. اتبع دليل الطابعة ثلاثية الأبعاد (انظر جدول المواد) لطباعة مكونات جهاز DART باستخدام . ملفات GCODE.
    5. اختر خيوط طابعة ثلاثية الأبعاد مناسبة ، مثل حمض اللبنيك (PLA) 1.75 مم 1 كجم / بكرة ، رمادي (انظر جدول المواد).
  3. قم بتجميع جهاز DART باتباع الخطوات أدناه.
    1. أدخل محمل عجلة منخفض الاحتكاك 608 (قطر تجويف 8 مم ، قطر خارجي 22 مم ، مثل محمل به كرات سيراميك نيتريد السيليكون الموجودة في 420 من الفولاذ المقاوم للصدأ ، انظر جدول المواد) في مبيت محمل العجلة (الشكل 1).
    2. أدخل المحور في تجويف محمل العجلة (الشكل 1).
    3. الصق صفيحة القدم على المحور بالغراء (انظر جدول المواد) المناسب لربط PLA (الشكل 1).
    4. ضع غلاف محمل العجلة فوق برج مبيت محمل العجلة وأرفق المجموعة بأكملها بقاعدة أكريليك مع مثبتات لولبية (الشكل 1).
      ملاحظة: لا توجد متطلبات حجم محددة لقاعدة الأكريليك - يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب الحيوان وجهاز DART وصغيرة بما يكفي لتناسب سطح العمل. يبلغ عرض قاعدة الأكريليك المستخدمة في هذه الدراسة حوالي 30 سم وطولها 45 سم وسمكها 0.5 سم.

3. إعداد الفئران ل DART أو ISOM

  1. ضع كل فأر تحت التخدير العام مع إيزوفلوران مستنشق يتم توصيله من خلال نظام تخدير مناسب (انظر جدول المواد ، 2٪ -5٪ للتحريض ؛ 1٪ -4٪ للصيانة ؛ للتأثير) لتقليل التوتر والألم.
    1. تحفيز التخدير في غرفة الحث في نظام التخدير (2٪ -5٪ إيزوفلوران).
    2. نقل الماوس إلى مخروط الأنف للحفاظ على التخدير أثناء إجراء الإجراءات على الحيوان (1٪ -4٪ إيزوفلوران). تأكد من فعالية التخدير بناء على عدم انسحاب الأطراف الخلفية إلى قرصة إصبع القدم من زوج من الملقط.
    3. توفير الدعم الحراري - على سبيل المثال ، مع وسادة تسخين هلام متساوي الحرارة ومصباح حراري يوضع ~ 1 متر فوق الماوس. تحقق باستخدام مقياس حرارة للتأكد من الحفاظ على درجة الحرارة على قاعدة الأكريليك وحولها عند ~ 38 °C ، حتى لا يسخن الماوس.
  2. تحضير الجلد فوق عضلة الظنبوب الأمامية اليسرى (TA) للفأر وعلى كامل الجوانب الأمامية والجانبية للطرف الخلفي الأيسر ل DART أو ISOM.
    1. قم بإزالة فرو الماوس باستخدام كريم إزالة الشعر (كريم مزيل الشعر ، انظر جدول المواد). ضع كريم مزيل الشعر واتركه يعمل لمدة ~ 2 دقيقة.
    2. نظف الساق بمناديل مبللة بالماء المقطر لإزالة الفراء وجميع الكريمات المتبقية من الجلد. كريمات إزالة الشعر يمكن أن تهيج و / أو تتلف الجلد إذا تركت على جلد الفأر لفترات طويلة ، وبالتالي إزالتها تماما.
    3. بعد إزالة الفراء ، قم بتطهير الجلد بطريقة تنظيف معتمدة ، مثل محلول تنقية البوفيدون واليود و 70٪ إيثانول.
  3. ضع مادة واقية (مثل الفازلين) على العينين والجلد المزيل الشعر باستخدام قطعة قطن نظيفة لحماية العينين والجلد المزيل من الجفاف.
  4. ضع دبوسا مثبتا من خلال الميتافيزيس الظنبوبي.
    1. ضع 5٪ كريم ليدوكائين على الساق لتخدير المنطقة.
    2. مرر إبرة 26 جم ، نصف بوصة ، معقمة ، تحت الجلد عبر أوسع جزء من الجزء القريب من عظم الظنبوب (أي الميتافيزيس الظنبوبي ، المعروف أيضا باسم رأس الظنبوب). بمجرد تثبيت دبوس التثبيت ، قم بإزالة الجزء البلاستيكي من الإبرة تحت الجلد عن طريق إمساك الإبرة بمرقئ معقم وثني الجزء البلاستيكي حتى ينكسر.
  5. ضع الماوس لتدريب DART أو ISOM.
    1. ضع الماوس في وضع ضعيف. تأكد من أن الماوس لا يزال متصلا بإحكام بمخروط الأنف للحفاظ على التخدير.
    2. باستخدام زوج من الملقط المعقم ، قم بتغذية دبوس الظنبوب في مشبك تمساح معدني (انظر جدول المواد) ، بحيث يتم تثبيت نهايات دبوس الظنبوب بواسطة مشبك التمساح. حرك الذراع القابل للتعديل لمشبك التمساح لضمان وضع قدم الماوس على صفيحة قدم جهاز DART.
    3. اربط قدم الماوس على صفيحة قدم جهاز DART بشريط مختبر لاصق.
    4. ضع قدم الفأر بزاوية 90 درجة بالنسبة للمحور الطويل لعظم الظنبوب للفأر. إذا تم وضعه بشكل صحيح ، فسيكون لوح القدم عموديا على قاعدة الأكريليك (أي الأرضية أو ما يعتبر المستوى الأفقي).
    5. ضع صفيحة القدم على حاجز الانثناء الأخمصي الناتج عن وضع إبرة طويلة تحت الجلد 18 جم و 1.5 من خلال الثقوب المحفورة مسبقا على منقلة جهاز DART (الشكل 1).

4. تدريب DART أو ISOM

  1. قم بتحسين وضع القطب الكهربائي عن طريق وضع قطب كهربائي ثنائي القطب ، عبر الجلد ، عصبي عضلي (NMES ، انظر جدول المواد) على الجانب السفلي من مفصل ركبة الفأر (الشكل 1 ب).
    1. مع نبضات مفردة (1 هرتز) من محفز كهربائي مختبري (انظر جدول المواد) ، قم بتحفيز الفرع الشظوي للعصب الوركي ، والذي يوفر التعصيب الحركي لعضلات الكاحل الظهرية (الشكل 1 ب).
    2. نظرا لأن العضلة الأمامية الظنبوبية (TA) تمثل أكثر من 90٪ من إجمالي قوة الانقباض التي تنتجها عضلات الكاحل الظهرية31 ، راقب بطن عضلة TA والوتر للحصول على دليل على تقلصات الارتعاش المستحثة كهربائيا.
      ملاحظة: قد يساعد البروز العظمي الطفيف الذي يتوافق مع عظم الشظية في وضع القطب الكهربائي إذا كان بإمكان المختبر الشعور به من خلال القطب. يتطلب ذلك بعض الممارسة والتعلم من جانب المختبر للتعرف على وضع القطب الأمثل.
    3. حرك توقف الانثناء الأخمصي إلى الفتحة الموجودة على المنقلة التي تتوافق مع 20 درجة من الانثناء الأخمصي من الموضع الذي تكون فيه القدم متعامدة (90 درجة) إلى الساق - هذا هو الموضع الذي يلاحظ فيه عادة عزم الدوران المقلص الأقصى من عضلة TA بناء على التقارير السابقة21. قد يتعين على المستخدم تخصيص ذلك بناء على عوامل خاصة بالفئران التي تتم دراستها.
    4. تصور عزم الدوران باستخدام مقياس قوة الماوس عن طريق ربط صفيحة قدم جهاز DART بصفيحة القدم الدينامومتر - على سبيل المثال ، اربط صفيحة قدم جهاز DART بصفيحة قدم آلية مصممة خصيصا لمقياس الكاحل مع خياطة حريرية غير مرنة (على غرار الشكل 1 أ) وربط الخيط بصفيحة القدم الدينامومتر (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تحتوي لوحة القدم على ثقوب مدمجة في تصميم الطباعة 3D. وضع الخيط من خلال زوج من الثقوب الموجودة في الصف الثاني من نهاية إصبع القدم يضع الخيط عند ~ 20 مم من محور الانثناء الظهري / الانثناء الأخمصي (الشكل 1 أ ، ب). تم وصف الدينامومتر في التقارير السابقة19،20،21،22.
  2. تحسين خرج الجهد من محفز NMES.
    1. بعد تحسين وضع القطب ، قم بتحسين سعة خرج الجهد من المحفز الكهربائي - وهذا ضروري لحصر NMES في العصب الشظوي المشترك وعضلة TA وتقليل خطر إثارة الانقباضات المشتركة في المنعكسات الأخمصية.
      ملاحظة: إذا تم استنباط تقلصات مشتركة ، فيمكن تصورها من خلال خرج عزم الدوران من مقياس القوة ويمكن رؤيتها أيضا في الثني الأخمصي لأصابع القدم.
  3. اضبط محفز NMES لتدريب DART أو ISOM.
    ملاحظة: قد يتعين على المستخدم تخصيص الإعدادات التالية بناء على عوامل خاصة بالفئران التي تتم دراستها والغرض من الدراسات.
    1. اضبط المحفز لإنتاج قطارات نبضية متكررة بتردد 125 هرتز - ينتج هذا التردد تقلصات كزازية تنصهر قصوى دون تدفق NMES إلى مجموعات عضلية أخرى في فئران BLAJ21. قم بذلك عن طريق ضبط الأقراص لتردد النبض (125 هرتز) ومدة القطار (500 مللي ثانية) والقطارات في الثانية (1 قطار / قطارات) وتشغيل مفتاح التبديل لتكرار قطارات النبض.
    2. اضبط المحفز لإنتاج قطارات نبضية مدتها 500 مللي ثانية تتخللها راحة 500 مللي ثانية بين قطارات النبض.
    3. حرك توقف الثني الأخمصي إلى الفتحة الموجودة على المنقلة التي تتوافق مع 160 درجة للمحور الطويل للساق (70 درجة من الانثناء الأخمصي من القدم المتعامدة إلى الظنبوب). هذا هو الموضع الذي يمكن تحريك قدم فأر BLAJ إليه بشكل سلبي دون مقاومة الأنسجة الرخوة21.
    4. بالنسبة ل DART ، قم بتطبيق مقاومة مناسبة يجب أن تعمل ضدها عضلة TA بشكل مركز - على سبيل المثال ، 5 جم كما هو موضح في الشكل 1A ، B ؛ راجع منحنى معايرة الوزن إلى عزم الدوران في الملف التكميلي 1.
    5. قم بتطبيق المقاومة عن طريق تعليق الوزن بخياطة حريرية غير مرنة مرتبطة بصفيحة قدم جهاز DART (الشكل 1 أ ، ب).
    6. اضبط المقاومة - أي ضع ~ 50٪ من الحد الأقصى للتكرار الواحد (1RM) (على سبيل المثال ، 5 جم إذا كان الماوس قادرا على رفع وزن أقصى يبلغ 10 جم مع تقلص واحد) ، والذي يسحب القدم من خلال نصف النطاق النشط المتاح على الأقل من الانثناء الظهري.
    7. قم بإجراء تدريب DART مناسب في الفئران المخصصة لمجموعة DART - على سبيل المثال ، قم بإجراء نوبة واحدة من تدريب DART ، والذي يتضمن أربع مجموعات من 10 تكرارات للانقباضات متحدة المركز مع راحة لمدة دقيقتين بين المجموعات ، على غرار برامج تدريب المقاومة التقدمية المستخدمة في البشر32 (انظر الفيديو التكميلي 1).
    8. قم بإجراء تدريب ISOM مناسب على الفئران المخصصة لمجموعة ISOM - على سبيل المثال ، قم بإجراء نوبة واحدة من تدريب ISOM ، والذي يتضمن أربع مجموعات من 10 تكرارات للانقباضات متساوية القياس مع راحة لمدة دقيقتين بين المجموعات ، على غرار DART (انظر الفيديو التكميلي 2).
    9. لتدريب ISOM ، ضع قدم الفأر عند 160 درجة على المحور الطويل للساق (70 درجة من الثني الأخمصي من القدم المتعامدة إلى الظنبوب) ، وحافظ على هذا الوضع الثابت عن طريق لصق خياطة الحرير على صفيحة القدم في مقياس القوة الآلي.
      ملاحظة: نظرا لأن الخيط لا يمكن أن ينزلق ، لا يمكن أن تتحرك صفيحة قدم جهاز DART إلى الانثناء الظهري ، مما يقيد المنعكسات الظهرية للانقباض بشكل متماثل.

5. رعاية ما بعد الإجراء للفئران

  1. اتخذ الاحتياطات اللازمة للحفاظ على النظافة المناسبة للطرف الخلفي الممارس وتقليل ألم موقع الإبرة.
    1. بعد تدريب DART أو ISOM ، قم بتغطية الجزء المرئي من دبوس الظنبوب بمرهم مضاد حيوي ثلاثي (400 وحدة / جم من باسيتراسين ، 3.5 مجم / جم من نيومايسين ، و 5000 وحدة / جم من بولي ميكسين-ب ، انظر جدول المواد) ثم اسحب الدبوس بعناية من الجانب الإنسي من الظنبوب. شطف الجلد على الفخذ الجانبي والساق العليا مع البوفيدون اليود والماء المعقم. ضع 5٪ كريم ليدوكائين على الساق للسيطرة على ألم موقع الإبرة.
  2. اسمح للفئران بالتعافي من التخدير.
    1. أخرج الفأر من مخروط الأنف واتركه يتعافى من التخدير في قفص التعافي الخالي من الفراش. توفير الدعم الحراري للفأر أثناء تعافيه من التخدير ، على سبيل المثال ، مع وسادة تسخين هلام متساوي الحرارة.
  3. أعد الماوس إلى قفصه الأصلي بعد أن يتعافى تماما من التخدير. بعد ذلك ، أعد القفص إلى منشأة الحيوانات ، حيث يتم إيواء فئران الدراسة حتى يتم إجراء تجارب المتابعة. راقب الفئران يوميا.

6. جمع الأنسجة

  1. حصاد عضلة TA الماوس في مجملها وتجميد المفاجئة للحفاظ على التبريد باتباع الخطوات أدناه.
    1. بناء على سؤال (أسئلة) البحث ، في وقت مناسب بعد التدريب (على سبيل المثال ، 3 أيام بعد DART أو ISOM) ، القتل الرحيم للفئران وفقا للبروتوكولات المعتمدة.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير العام (استنشاق إيزوفلوران ، 2٪ -5٪ للتأثير). بضع الصدر الثنائي يضمن الموت.
    2. تشريح الأطراف الخلفية للفأر لإزالة عضلة TA التي تم تمرينها (يسار) وعضلة TA غير التمرينة (يمين). وزن العضلات المحصودة. بعد ذلك ، اغمس كل عضلة في الزيت المعدني للحماية من البرودة وضع العضلات على مناديل معملية نظيفة لمسح الزيت الزائد21.
  2. ضع العضلات على قطعة من رقائق الألومنيوم. امسك حافة الرقاقة بمرقئ طويل واغمر الرقاقة والعضلات بسرعة في النيتروجين السائل الموجود في حاوية بلاستيكية مناسبة لتجميد العضلات.
    1. بعد حوالي 2 دقيقة من الغمر في النيتروجين السائل ، انقل العضلات المجمدة إلى قوارير مبردة مبوسة. قم بتخزين القوارير في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الحاجة لمزيد من الدراسات.

7. الدراسات النسيجية على الأنسجة العضلية

  1. تحضير مقاطع cryostat من عضلة TA التي يبلغ سمكها 5 ميكرومتر. اجمع أقسام cryostat على شرائح مجهر مشحونة. ثبت الأقسام بالأسيتون الذي يبقى باردا عند -30 درجة مئوية واترك الأقسام تجف في الهواء.
  2. قم بتلطيخ أقسام الأنسجة العضلية بالهيماتوكسيلين متبوعا بالإيوزين (تلطيخ H&E ، انظر جدول المواد).
    1. اغمر الأقسام لمدة 5 دقائق في الهيماتوكسيلين (صبغة نووية زرقاء داكنة) في وعاء تلطيخ زجاجي. قم بإزالة الهيماتوكسيلين الزائد عن طريق شطف الأقسام بماء الصنبور حتى لا يرى المزيد من الماء الأزرق.
    2. اغمر الأقسام لمدة 5 دقائق في كاشف أزرق في وعاء زجاجي. نضح كاشف الازرقاق الزائد من الأقسام باستخدام ماصة شفط زجاجية.
    3. اغمر الأقسام لمدة 5 دقائق في eosin (صبغة السيتوبلازم الوردي) في وعاء تلطيخ زجاجي. قم بإزالة اليوزين الزائد عن طريق غمس الأقسام بسرعة وبشكل متكرر (~ 10 مرات) في 95٪ إيثانول في وعاء تلطيخ زجاجي.
    4. اسمح للأقسام أن تجف في الهواء واستمر في التصور تحت المجهر الضوئي.
  3. قم بإعداد صور مبلطة عالية الدقة للمقاطع العرضية لعضلات TA بالكامل من خلال التصوير المجهري.
    ملاحظة: قد يضطر المستخدم إلى تخصيص خطوات التصوير وتحليل الصور التي تتبع بناء على برنامج المجهر والحصول على الصور وتحليلها.
    1. التقط صورا رقمية باستخدام عدسة موضوعية 10x لمجهر ضوئي وكاميرا رقمية مثبتة على المجهر.
    2. التقط حوالي 15-20 صورة ، تتحرك على طول المقطع العرضي لكل عضلة بطريقة تشبه الشبكة ، بحيث تتداخل كل صورة جديدة ~ 25٪ مع الصورة السابقة.
      ملاحظة: تساعد هذه العملية في التقاط مجموعة من الصور التي يمكن تجانبها رقميا (تعرف أيضا باسم خياطة الصور) لإنشاء صورة مركبة عالية الدقة للمقطع العرضي لعضلة TA بالكامل (الشكل 2).
    3. احفظ الصور الرقمية في . تنسيق TIFF.
    4. افتح الصور الرقمية باستخدام برنامج مناسب لمعالجة الصور وتحليلها (انظر جدول المواد).
    5. قم بتجانب أو غرزة الصور الفردية في صورة مركبة لعضلة TA بأكملها من خلال الخطوات التالية: مع فتح جميع الصور المتداخلة الفردية لكل عضلة TA في البرنامج ، انقر فوق ملف > حدد أتمتة > حدد Photomerge > حدد > مجمعة حدد إضافة ملفات مفتوحة > انقر فوق موافق.
    6. عند إعداد صورة جديدة مبلطة/مخيطة لعضلة التحليل الفني وعرضها، احفظ الصورة في . شكل TIFF لمزيد من التحليلات.
  4. قم بتحديد تلف العضلات عن طريق التحليل البصري في الصور المتجانبة لعضلة TA بأكملها باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب.
    1. في برنامج تحليل الصور ، حدد وظيفة القياس في قائمة التحليل لتحديد وقياس مساحة المقطع العرضي لعضلة TA بالكامل (الشكل 2).
    2. في برنامج تحليل الصور ، حدد وظيفة القياس في قائمة التحليل لتحديد وقياس مناطق كل عضلة TA تالفة - أي المناطق التي تظهر اضطرابا سيتوبلازميا لألياف العضلات ، وألياف العضلات الغائبة ، وتسلل الخلايا الالتهابية22 (الشكل 2).
    3. عبر عن مجموع المساحة الإجمالية للضرر كنسبة مئوية من مساحة المقطع العرضي لعضلة TA بأكملها (الشكل 2 ، الجدول 2).

8. التحليلات الإحصائية

  1. تنظيم البيانات كما هو موضح في الجداول 1-3 وإجراء اختبارات T غير المقترنة (إذا تم اجتياز اختبارات الحالة الطبيعية والفروق المتجانسة)33 أو اختبارات Mann-Whitney Rank Sum (إذا لم يتم اجتياز اختبارات الحالة الطبيعية والفروق المتجانسة)21 باستخدام برنامج مناسب (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمت دراسة ذكور الفئران BLAJ ، التي كانت ~ 1.5 سنة في العمر. نموذج الفئران BLAJ مرض العضلات البشرية ، LGMD2B / R2. هذه الفئران معرضة بشكل خاص لتلف العضلات المتأخر من نوبة واحدة من تقلصات العضلات غريب الأطوار22,29. لذلك ، تم اختيار فئران BLAJ لهذه الدراسات لمعرفة ما إذا كان يمكن إجراء DART بطريقة غير ضارة عن طريق ضبط المقاومة التي يجب أن تعمل ضدها عضلة TA بطريقة متحيزة بشكل مركز. إذا وجد أن DART لم يكن ضارا بفئران BLAJ ، فمن المحتمل أن يكون مفيدا كشكل من أشكال تدريب المقاومة غير الضارة ، والذي يمكن تطبيقه بمفرده أو كعامل مساعد للطب التجديدي والتدخلات الجينية والدوائية وغيرها.

تمت مطابقة أعمار وأوزان فئران BLAJ بشكل وثيق بين مجموعتي DART و ISOM (الجدول 1). في اليوم 3 (~ 72 ساعة) ، بعد نوبة واحدة من التدريب ، كان لعضلة TA التي تم تمرينها مستويات منخفضة من الضرر في كل من مجموعتي DART و ISOM (<10٪ منطقة متضررة) - وهذا على عكس الدراسات السابقة21,22 من استجابة فئران BLAJ لتقلصات العضلات اللامتراكزة ، حيث تم الإبلاغ عن ~ 40٪ من الألياف التالفة في اليوم 3 (الشكل 2 ، الجدول 2). عندما تمت مقارنة منطقة تلف العضلات بين عضلات TA التي تمارس من مجموعتي DART و ISOM ، وجد أن مجموعة DART لديها مستويات أقل من تلف العضلات من مجموعة ISOM (الشكل 2 ، الجدول 2). لم يكن الحد الأقصى لعزم دوران الكزاز المسجل في اليوم 0 (خط الأساس) واليوم 3 مختلفا إحصائيا بين مجموعتي DART و ISOM (الجدول 3).

Figure 1
الشكل 1: تصنيع جهاز DART وتطبيقه في دراسة تدريبية. (أ ، ب) يعتمد جهاز DART على تصميم دائرة وزن بكرة الكابل ، وهو أمر شائع في معدات تدريب المقاومة المصممة للبشر. (أ) جهاز DART مع أثناء جلسة تدريب DART. (ب) تتحرك صفيحة القدم إلى الانثناء الظهري أثناء انقباض متحد المركز لعضلة TA (سهم أخضر منحني، يمين). يتسبب الانكماش متحد المركز في تحرك مقاومة 5 جم عموديا ضد الجاذبية (سهم أخضر عمودي ، يسار). تم استنباط تقلصات العضلات عن طريق التحفيز الكهربائي المطبق من خلال قطب كهربائي ثنائي القطب عبر الجلد. (ج) تم تصميم مكونات مختلفة من جهاز DART مع برنامج الطباعة الحجرية المجسمة لتوليد . STL، والتي يمكن فتحها باستخدام برنامج التقطيع. باستخدام برنامج التقطيع ، تم إنشاء ملفات G-CODE خاصة بطابعة 3D والخيوط المستخدمة. تضمنت المكونات المطبوعة ثلاثية الأبعاد لجهاز DART (C) مبيت لمحمل عجلة منخفض الاحتكاك 608 ، (D) برج لمبيت محمل العجلة ، (E) صفيحة قدم ، و (F) محور لتوصيل صفيحة القدم بمحمل العجلة. تم دمج المكونات المطبوعة 3D وتركيبها على قاعدة أكريليك مع مثبتات غرائية ولولبية كما هو موضح في النص وموضح في (أ). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: دراسة نسيجية. التغيرات النسيجية في عضلة TA في اليوم 3 (A) بعد DART أو (B) بعد ISOM. كانت عمليات التجميد ، التي كان سمكها 5 ميكرومتر ، ملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين. تم التقاط العديد من الصور الرقمية المتداخلة ودمجها مع برنامج التصوير لإنشاء صور مبلطة عالية الدقة للمقطع العرضي لعضلات TA بالكامل. أشارت البيانات النسيجية النوعية إلى أن مدى تلف العضلات كان منخفضا في كل من مجموعتي DART و ISOM ، لكن تلف العضلات كان أكثر وضوحا قليلا في مجموعة ISOM. تشير الأسهم الصفراء إلى بعض المناطق المتضررة في المقاطع العرضية لعضلات TA. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: الأعمار وأوزان الجسم من الفئران. كانت فئران BLAJ التي تمت دراستها متطابقة بشكل وثيق في العمر ووزن الجسم مع عدم وجود فرق كبير بين مجموعتي DART و ISOM. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: التحليل الكمي لتلف العضلات TA. تم التعبير عن مدى تلف العضلات كنسبة مئوية من المساحة الإجمالية للمقطع العرضي لعضلة TA وتحليلها بواسطة اختبار T. أدى كل من تدريب DART و ISOM إلى انخفاض مستوى تلف العضلات في اليوم 3 مقارنة بالدراسات السابقة التي تنطوي على نوبة مماثلة من الانقباضات الغريبة في فئران BLAJ. على الرغم من أن حجم تلف العضلات كان صغيرا في كل من مجموعتي DART و ISOM ، إلا أن مدى الضرر كان أقل إحصائيا في مجموعة DART. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: بيانات عزم الدوران المقلص. تمت دراسة عزم الدوران المقلص الناتج عن العضلات الظهرية باستخدام مقياس ديناميكي آلي متصل بجهاز DART. لم يكن هناك فرق كبير بين مجموعتي DART و ISOM في الحد الأقصى لعزم دوران الكزاز الأساسي المقاس في يوم التمرين (A ، اليوم 0) أو في 3 أيام بعد التمرين (B ، اليوم 3). على الرغم من عدم وجود دليل نسيجي على تلف العضلات على نطاق واسع ، ارتبطت نوبة واحدة من DART و ISOM بعجز عزم الدوران المقلص (~ 40٪) في اليوم 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

فيديو تكميلي 1: تدريب DART على الفئران. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 2: تدريب ISOM على الفئران. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الملف التكميلي 1: الوزن إلى بيانات معايرة عزم الدوران والمنحنى والإعداد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملفات الترميز التكميلية 1-4: تصميمات لمكونات جهاز DART. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه المقالة إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إنشاء جهاز لأداء نوع من تدريب إعادة التأهيل الدقيق يسمى تدريب المقاومة المعدلة بالجرعة (DART). يصف العمل أيضا تطبيق جهاز DART والمنهجية في دراسة تدريبية لمقارنة تلف العضلات بعد 3 أيام من نوبة واحدة من DART (مجموعة DART) مع الضرر بعد 3 أيام من نوبة مماثلة من التدريب متساوي القياس (مجموعة ISOM).

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي البناء السليم لجهاز DART 34,35 ، والخطوات الدقيقة التي ينطوي عليها أداء تدريب DART أو ISOM ، والحصاد السليم والحفاظ على الأنسجة العضلية بالتبريد ، والتقسيم الصحيح للأنسجة العضلية باستخدام cryostat ، والتلوين المناسب للمقاطع العرضية للعضلات باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوزين 22,36 . على وجه التحديد ، لبناء جهاز DART ، يجب تصنيع الأجزاء بالأبعاد الدقيقة وخصائص المواد المثلى. إذا كانت الأبعاد غير دقيقة لمبيت محمل العجلة ، فلن يتناسب محمل العجلة من النوع 608 بشكل مريح مع مبيت محمل العجلة. إذا كانت أبعاد صفيحة قدم الماوس والمحور غير دقيقة ، فقد يؤثر ذلك سلبا على قدرة محمل العجلة على التحرك جنبا إلى جنب مع قدم الماوس. إذا تم تصنيع أجزاء جهاز DART بمادة غير مناسبة و / أو إعدادات طابعة ثلاثية الأبعاد ، فقد تفتقر أجزاء جهاز DART إلى القوة الميكانيكية الكافية ، مما قد يؤدي إلى ثني و / أو كسر المكونات المختلفة34.

قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على هذا البروتوكول بناء على أسئلة البحث المحددة التي يرغب الباحثون في الإجابة عليها. البروتوكول الحالي خاص بتصميم وتنفيذ جهاز DART في دراسة حاولت الإجابة على سؤال حول ما إذا كانت نوبة واحدة من DART تسبب أضرارا جسيمة لعضلة TA في الفئران التي تعاني من نقص dysferlin ، كما ذكرنا سابقا مع نوبة مماثلة من الانقباضات اللامركزية22. نظرا لأن آخرين اقترحوا أن التمرين الذي يتكون من تقلصات متساوية القياس قد يكون غير ضار ، وبالتالي فهو مناسب للبشر المصابين بأمراض عضلية معينة ، فقد قارنا مدى تلف العضلات الناجم عن DART بنوبة مماثلة من الانقباضات متساوية القياس (ISOM)37,38. في هذه الدراسة ، وجدنا أن كلا من DART و ISOM يحدثان الحد الأدنى من تلف العضلات ، حيث يظهر DART مستويات ضرر أقل قليلا ولكن بشكل ملحوظ من ISOM.

فيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، فإن الجانب الأكثر تحديا في البروتوكول هو تحفيز الفرع الشظوي للعصب الوركي بدقة ، والذي يعطي التعصيب الحركي لعضلة TA. هذه التقنية صعبة بشكل خاص لأن جهاز الاختبار يحمل قطبا كهربائيا عبر الجلد ويضعه يدويا في مكان دقيق يكون أدنى وجانبيا من مفصل ركبة الفأر20,39. يجب أن يتدرب المختبر ويتعلم كيفية تحديد موقع هذه البقعة على الطرف الخلفي للفأر من خلال الشعور ببروز عظمي طفيف يتوافق مع رأس عظم الفأرالشظوي 40. من أجل التأكد من تحقيق التحفيز الكهربائي الأمثل للفرع الشظوي للعصب الوركي ، بحيث يتم تحقيق الانقباضات القصوى من عضلة TA ، فمن الأفضل استخدام نظام ديناميكي موثوق به20،21،22،41. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا النظر في الأقطاب الكهربائية عبر الجلد أو تحت الجلد المثبتة بواسطة المشبك لوضع أقطاب كهربائية موثوقة وقابلة للتكرار لتقليل التباين والأخطاء التي يسببها المستخدم20،41،42،43.

القيد الرئيسي للبروتوكول هو أنه مصمم خصيصا لدراسة تأثير DART على عضلة TA في الفئران. من خلال الأساليب التي تم تطويرها لإجراء تقييمات دينامومترية وتمرين قسري على مجموعة عضلات الفخذ رباعية الرؤوس في القوارض ، يمكن بسهولة تكييف جهاز DART مع مجموعة عضلات الفخذالفخذية 42,43. قد يكون تطبيق جهاز DART على مجموعات العضلات الأخرى أكثر صعوبة. ومع ذلك ، يمكن دمج تصميم دائرة وزن بكرة الكابل ، والذي تم استخدامه في جهاز DART ، في الأجهزة المناسبة لمجموعات العضلات الأخرى. قيد آخر هو أن البروتوكول يتم تحت التخدير العام ، مما يجعل التمرين قسريا وليس طوعيا. هذا يختلف عن معظم نماذج تدريب المقاومة التي تم تطويرها للبشر12,21.

تكمن أهمية جهاز DART ومنهجيته فيما يتعلق بالطرق الحالية أو البديلة في أنه يمكن تعديل جرعة تدريب المقاومة بدقة ويمكن استهداف التمرين بدقة لمجموعة عضلية معينة12. تعد إعادة التأهيل الدقيق أولوية استراتيجية جديدة للمعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة ، وبما أن DART يجعل من الممكن إجراء تدريب مقاومة دقيق في الفئران ، فإن DART يفسح المجال جيدا للدراسات الأساسية وما قبل السريرية حول إعادة التأهيل البدني الدقيق44,45.

تكمن الأهمية والتطبيق المحتمل للطريقة الحالية لأداء تدريب المقاومة المعدل بالجرعة في أنه يجعل من الممكن إجراء دراسات تدريب المقاومة في الفئران بطرق مماثلة للاختبار البشري وبروتوكولات التدريب المستخدمة في أبحاث وممارسات إعادة التأهيل السريري. على سبيل المثال ، تماما كما يتم استخدام الحد الأقصى للتكرار مرة واحدة (1RM ، الحد الأقصى للحمل الذي يمكن رفعه / تحريكه / ضغطه / القرفصاء بنجاح مرة واحدة فقط مع الحفاظ على شكل جيد) للبشر لضبط حجم المقاومة لنوبات التدريب17,18 ، يمكن استخدام الحمل الأقصى الذي يمكن لعضلة TA رفعه بنجاح لضبط المقاومة للتدريب في الفئران باستخدام جهاز DART. بالإضافة إلى ضبط المقاومة بناء على قدرة الحيوان ، فإن الميزة الإضافية هي أن الانقباضات متحيزة بشكل مركز ، مما يساعد على تقليل إصابة العضلات الناتجة عن الانقباض22. تشير النتائج التمثيلية إلى أن نوبة واحدة من DART أقل ضررا من نوبة مماثلة من الانقباضات متساوية القياس (مجموعة ISOM). الطبيعة غير الضارة ل DART تجعلها مناسبة لدراسات التدريب حيث من الأفضل تجنب الانقباضات الضارة - على سبيل المثال ، دراسات التدريب في الفئران التي تمثل ضمور العضلات ودراسات التدريب المصممة لإعادة تحميل العضلات تدريجيا بعد الإجراءات الجراحية التجريبية على العضلات و / أو الأوتار22،46،47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح من مؤسسة Jain Foundation Inc. ، R03HD091648 من NICHD ، منحة تجريبية من AR3T بموجب NIH P2CHD086843 ، جائزة FRAP من EACPHS في جامعة واين ستيت ، حزمة بدء تشغيل أعضاء هيئة التدريس من جامعة واين ستيت ، وعقد من الباطن من 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) إلى JAR. تم تمويل هذه الدراسة أيضا من قبل منحة بحثية من جمعية العلاج الطبيعي الأمريكية - ميشيغان (APTA-MI) إلى JMB و MEP و JAR. يعترف المؤلفون بالدكتورة رينوكا روش (أستاذ مشارك ، جامعة ميشيغان الشرقية ، ميتشيغن) لقراءتها النقدية للمخطوطة وتقديم الملاحظات. يعترف المؤلفون بالسيد Anselm D. Motha للحصول على المشورة بشأن الطباعة 3D. يشكر المؤلفون المرضى الذين يعانون من اعتلال خلل النطق الذين شاركوا قصصهم على موقع مؤسسة جاين في https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories ، وخاصة تجاربهم مع ممارسة الرياضة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing Anmiao Star (N/A) AMS127 High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA) Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. Stock #012767 Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA BS4 50–6824 Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. S17495 Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software Ultimaker, Utrecht, Netherlands Ultimaker Cura 4.4.1. Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad Braintree Scientific (Braintree, MA) Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y Millipore Sigma (Burlington, MA) HT110132-1L Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) Gorilla Super Glue Micro Precise Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3 Millipore Sigma (Burlington, MA) GHS332-1L Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120 Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014 National Instruments, Austin, Texas, USA Labview 2014 Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks ThermoFisher (Waltham, MA) S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
Metal alligator clip JINSHANGTOPK (web-based business) 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides Globe Scientific (Mahwah, NJ) 1354W. Diamond White Glass Slides Charged microscope slides
Mineral Oil ThermoFisher (Waltham, MA) BP26291 Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) #11778 Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) Mini V2 3D 3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) NIH Image for Windows Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4 Adobe (San Jose, CA) Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit Grass Instruments (West Warwick, RI) PSIU6 isolation unit Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) Roboz Surgical SUT152 Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator Grass Instruments (West Warwick, RI) S48 Stimulator Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent Ricca Chemical Company (Arlington, TX) 6697-32 Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5 Systat Software (San Jose, CA) SigmaStat version 3.5 Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment Global Health Products (wed-based business) Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
  2. Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
  3. Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. Chandler, T. J., Brown, L. E. , Routledge. Oxfordshire, UK. Chapter 20 547-570 (2019).
  4. Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
  5. Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
  6. Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
  7. Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
  8. Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
  9. Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
  10. Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
  11. Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
  12. Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. Greising, S. M., Call, J. A. , Springer International Publishing. New York, NY. 39-59 (2022).
  13. Roche, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. Greising, S. M., Call, J. A. , Springer International Publishing. New York, NY. 61-84 (2022).
  14. Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
  15. Naples, R. Dr. Gustav Zander's Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child's Play. , Smithsonian. Washington, D.C. Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016).
  16. Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
  17. ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
  18. Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
  19. Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , CA2745550A1 patents.google.com/patent/CA2745550A1/en (2012).
  20. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
  21. Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
  22. Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
  23. Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies - Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
  24. Kniffin, C. L. DYSFERLIN. , OMIM. Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021).
  25. Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
  26. Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
  27. Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
  28. Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
  29. Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
  30. Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
  31. Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
  32. Dutton, M. Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , Jones & Bartlett Publishers. Burlington, MA. 238 (2011).
  33. Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
  34. Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist's guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
  35. Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
  36. Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers - A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
  37. Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
  38. Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
  39. Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
  40. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  41. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
  42. Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
  43. Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
  44. Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
  45. Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation - Inaugural Scientific Retreat. , Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021).
  46. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
  47. Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).

Tags

علم الأعصاب، العدد 186، العضلات الهيكلية، تدريب المقاومة، إعادة التأهيل التجديدي، إعادة التأهيل الدقيق، إصابة العضلات، خلل التنسج، ضمور عضلات الأطراف
تدريب المقاومة المعدل بالجرعة في الفئران مع تقليل خطر تلف العضلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Begam, M., Narayan, N., Mankowski,… More

Begam, M., Narayan, N., Mankowski, D., Camaj, R., Murphy, N., Roseni, K., Pepin, M. E., Blackmer, J. M., Jones, T. I., Roche, J. A. Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage. J. Vis. Exp. (186), e64000, doi:10.3791/64000 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter