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Neuroscience

Entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/64000
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

Summary

El presente protocolo describe una técnica única llamada entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), que puede incorporarse a estudios de rehabilitación de precisión realizados en animales pequeños, como ratones.

Abstract

El entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que implica realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores, puede aumentar la masa muscular y la fuerza en individuos sanos y en poblaciones de pacientes. Se necesitan herramientas de rehabilitación de precisión para probar la seguridad y eficacia de PRT para mantener y / o restaurar la masa muscular y la fuerza en estudios preclínicos en modelos animales pequeños y grandes. La metodología y el dispositivo PRT descritos en este artículo se pueden usar para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El dispositivo DART se puede utilizar como un dinamómetro independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico generado por los dorsiflexores del tobillo en ratones o se puede agregar a un sistema de dinamometría isocinética preexistente. El dispositivo DART se puede fabricar con una impresora 3D estándar basada en las instrucciones y los archivos de impresión 3D de código abierto proporcionados en este trabajo. El artículo también describe el flujo de trabajo de un estudio para comparar el daño muscular inducido por la contracción causado por un solo ataque de DART con el daño muscular causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (ISOM) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B / R2 (ratones BLAZ). Los datos de ocho ratones BLAJ (cuatro animales para cada condición) sugieren que menos del 10% del músculo tibial anterior (TA) se dañó por un solo ataque de DART o ISOM, siendo DART menos dañino que ISOM.

Introduction

El ejercicio confiere numerosos beneficios para la salud en el músculo esquelético (revisado en Vina et al.1). Específicamente, se sabe que el entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que consiste en realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores (por ejemplo, barras, mancuernas, circuitos de cable-polea-peso), ayuda a aumentar la masa muscular y la fuerza tanto en individuos sanos como en poblaciones de pacientes (revisado en publicaciones anteriores 2,3 ). La TRP se basa en el principio de sobrecarga, que establece que, cuando el músculo se contrae contra cargas externas progresivamente mayores, se adapta aumentando su área de sección transversal fisiológica, así como la capacidad de producción de fuerza4. Los modelos existentes de PRT en roedores incluyen subir escaleras con resistencia aplicada a la cola, co-contracción de los músculos agonistas contra la resistencia de los antagonistas, correr con un arnés pesado, un ejercicio de sentadilla provocado por una descarga eléctrica y resistir la carrera de la rueda 5,6,7,8,9,10 (revisado en publicaciones anteriores 11,12 ). Sin embargo, actualmente no existen herramientas de investigación para realizar PRT precisamente dirigida al músculo y ajustada a la dosis en ratones que se asemejen mucho a los métodos y dispositivos PRT utilizados en la investigación clínica humana y la práctica12,13. Esto limita la capacidad de los investigadores para estudiar la seguridad y eficacia de la PRT dosificada con precisión en estudios básicos y preclínicos en ratones.

Para superar esta barrera, en este estudio se desarrolla una metodología y un dispositivo PRT basados en los diseños de circuitos de cable-polea-peso empleados en equipos de entrenamiento de resistencia en gimnasios modernos14,15,16. Este método de PRT se conoce como entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), y el dispositivo se llama dispositivo DART. Además de su funcionalidad como herramienta de entrenamiento de rehabilitación de precisión, el dispositivo DART también se puede utilizar como un instrumento independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico máximo que puede ser generado por el músculo tibial anterior (TA) en un ratón, similar a cómo se evalúa el máximo de una repetición (1RM, la carga máxima que se puede levantar / mover / presionar / poner en cuclillas con éxito solo una vez mientras se mantiene una buena forma) en humanos17, 18. El dispositivo DART también se puede acoplar con un dinamómetro isocinético personalizado o comercial para medir la fuerza tetánica isométrica máxima producida por el músculo TA en un ratón (comparable a la contracción voluntaria máxima [MVC] en humanos) y luego realizar PRT ajustada a la dosis con una resistencia que se basa en la fuerza tetánica máxima (por ejemplo, 50% de la fuerza máxima).

Este artículo describe la construcción del dispositivo DART y explica cómo se puede acoplar con un dinamómetro personalizado, que se ha descrito en publicaciones anteriores 19,20,21,22, para evaluar el par contráctil y realizar DART. El estudio también describe cómo se utilizó el dispositivo DART para comparar el daño muscular inducido por el ejercicio causado por un solo episodio de DART (4 series de 10 contracciones concéntricamente sesgadas con 50% de 1RM) con el daño causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (4 series de 10 contracciones isométricas) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B (LGMD2B, o LGMDR2)23,24. El modelo de ratón que se estudió carece de una proteína llamada disferlina, que desempeña un papel importante en la protección del músculo esquelético contra el daño muscular de aparición tardía después de contracciones excéntricas perjudiciales 22,25,26,27,28,29,30 . También se ha demostrado en ratones machos deficientes en disferina que el ejercicio forzado concéntricamente sesgado no es tan dañino como el ejercicio forzado excéntricamente sesgado y que la exposición previa al entrenamiento concéntricamente sesgado ofrece protección contra lesiones de un episodio posterior de contracciones excéntricamente sesgadas22. Dado que el estudio actual se realizó para probar la viabilidad de la metodología y el dispositivo DART actuales para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis y sesgado concéntricamente, se eligieron ratones machos deficientes en disferlina para la investigación para comparar nuevos datos del dispositivo DART con datos anteriores. En futuros estudios, se incluirán ratones BLAJ hembra para estudiar el efecto del sexo como variable biológica en relación con la respuesta a DART. Se estudiaron ratones que tenían ~ 1,5 años de edad, ya que ya tienen cambios distróficos en muchos grupos musculares y, por lo tanto, modelan el estado fisiopatológico en el que podrían estar los músculos en pacientes que ya tienen debilidad muscular y desgaste y están buscando atención de rehabilitación para mantener la masa muscular y la fuerza26.

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Protocol

Los experimentos descritos en este artículo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne, Detroit, Michigan, EE.UU., de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (1996, publicada por National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, EE.UU.). B6. Para el presente estudio se utilizaron ratones A-Dysfprmd/GeneJ (también conocidos como ratones BLAZ, machos, ~1,5 años de edad) que modelo LGMD2B/R2 Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).

1. Diseño del estudio

  1. Elija la(s) cepa(s) de ratón relevante(s) para la(s) pregunta(s) de investigación, por ejemplo, el estudio B6. Ratones A-Dysfprmd/GeneJ (ratones BLAZ) si se intenta responder a la pregunta de si el DART sesgado concéntricamente induce o no daño muscular generalizado en ratones que modelan LGMD2B/R2.
  2. Asigne ratones a grupos de estudio según el diseño del estudio, por ejemplo, asigne aleatoriamente ratones a un grupo de entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis (DART) o a un grupo de entrenamiento isométrico (ISOM), e intente equilibrar los grupos lo mejor posible según la coincidencia por camada y / o edad (por ejemplo, Tabla 1).

2. Fabricación del dispositivo DART

  1. Diseñe los componentes del dispositivo DART con el software asistido por ordenador (CAD) adecuado (Figura 1) siguiendo los pasos a continuación.
    1. Carcasa de diseño para cojinetes de rueda de baja fricción (consulte la Tabla de materiales, basada en el diseño del cojinete de bloques de almohada) con un transportador incorporado (para usar como goniómetro para medir los ángulos de las articulaciones del tobillo).
    2. Diseñe una torre para la carcasa del rodamiento de la rueda más un transportador.
    3. Diseñe una plataforma para colocar el pie del ratón. Diseñe un eje para conectar la plataforma al cojinete de la rueda.
  2. Fabrice los componentes del dispositivo DART con una impresora 3D adecuada (Figura 1).
    1. Guarde los diseños creados con software CAD como estereolitografía (. STL).
      NOTA: El archivo . Los archivos STL (Supplementary Coding Files 1-4) pueden ser utilizados y modificados dando crédito al autor correspondiente de este artículo y citando este artículo.
    2. Abra el archivo . STL con el software de corte adecuado (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: El software de corte convierte un modelo 3D virtual en una pila de cortes, que puede ser impreso secuencialmente por una impresora 3D para generar un objeto 3D.
    3. Con el software de corte, genere G-CODE de fabricación asistida por computadora (CAM, . GCODE), que son específicos de la impresora 3D y el filamento que se utilizará.
    4. Siga el manual de la impresora 3D (consulte Tabla de materiales) para imprimir componentes del dispositivo DART con . GCODE.
    5. Elija un filamento de impresora 3D adecuado, como ácido poliláctico (PLA) 1.75 mm 1 kg / carrete, gris (consulte la tabla de materiales).
  3. Ensamble el dispositivo DART siguiendo los pasos a continuación.
    1. Inserte un rodamiento de rueda de baja fricción 608 (diámetro de diámetro de 8 mm, diámetro exterior de 22 mm, como uno con bolas de cerámica de nitruro de silicio alojadas en acero inoxidable 420, consulte la Tabla de materiales) en la carcasa del rodamiento de la rueda (figura 1).
    2. Inserte el eje en el orificio del cojinete de la rueda (figura 1).
    3. Pegue el reposapiés en el eje con pegamento (consulte la Tabla de materiales) que sea adecuado para unir el PLA (Figura 1).
    4. Coloque la carcasa del cojinete de la rueda por encima de la torre de la carcasa del cojinete de la rueda y fije todo el conjunto a una base de acrílico con sujetadores de tornillo (Figura 1).
      NOTA: No hay requisitos de tamaño específicos para la base de acrílico, solo necesita ser lo suficientemente grande como para acomodar al animal y al dispositivo DART y lo suficientemente pequeña como para caber en una superficie de trabajo. La base acrílica utilizada para el presente estudio es de unos 30 cm de ancho, 45 cm de largo y 0,5 cm de espesor.

3. Preparación de ratones para DART o ISOM

  1. Coloque cada ratón bajo anestesia general con isoflurano inhalado administrado a través de un sistema de anestesia adecuado (ver Tabla de materiales, 2% -5% para inducción; 1% -4% para mantenimiento; al efecto) para reducir el estrés y el dolor.
    1. Inducir anestesia en la cámara de inducción del sistema de anestesia (2% -5% isoflurano).
    2. Transfiera el ratón a un cono nasal para mantener la anestesia mientras realiza procedimientos en el animal (1% -4% isoflurano). Confirme la efectividad de la anestesia en función de la falta de retirada de las extremidades posteriores a un pellizco del dedo del pie de un par de pinzas.
    3. Proporcione soporte térmico, por ejemplo, con una almohadilla térmica de gel isotérmico y una lámpara de calor colocada ~ 1 m por encima del mouse. Verifique con un termómetro para asegurarse de que la temperatura en y alrededor de la base de acrílico se mantenga a ~ 38 ° C, para que el mouse no se sobrecaliente.
  2. Prepare la piel sobre el músculo tibial anterior izquierdo (TA) del ratón y sobre todos los aspectos anterior y lateral de la extremidad posterior izquierda para DART o ISOM.
    1. Retire el pelaje del ratón con una crema depilatoria (crema depilatoria, consulte la Tabla de materiales). Aplique crema depilatoria y deje que actúe durante ~ 2 min.
    2. Limpie la pierna con toallitas empapadas en agua destilada para eliminar el pelaje y toda la crema residual de la piel. Las cremas depilatorias pueden irritar y/o dañar la piel si se dejan en la piel del ratón durante largos períodos y, por lo tanto, se eliminan por completo.
    3. Después de la eliminación del pelaje, desinfecte la piel con un método de lavado aprobado, como con una solución de lavado de povidona yodada y etanol al 70%.
  3. Aplique un protector (por ejemplo, vaselina) sobre los ojos y la piel depilada con un hisopo de algodón limpio para proteger los ojos y la piel depilada de la sequedad.
  4. Coloque un alfiler estabilizador a través de la metáfisis tibial.
    1. Aplique crema de lidocaína al 5% sobre la tibia para adormecer el área.
    2. Pase una aguja hipodérmica estéril de 26 G, media pulgada a través de la parte más ancha de la porción proximal del hueso tibial (es decir, la metáfisis tibial, también conocida como cabeza tibial). Una vez que el pasador estabilizador esté asegurado, retire la porción plástica de la aguja hipodérmica sosteniendo la aguja con un hemostático estéril y doblando la porción de plástico hasta que se rompa.
  5. Coloque el ratón para el entrenamiento DART o ISOM.
    1. Coloque el ratón en posición supina. Asegúrese de que el ratón todavía esté conectado de forma segura al cono de la nariz para mantener la anestesia.
    2. Con un par de pinzas de punta estéril, introduzca el pasador tibial en un clip de cocodrilo metálico (consulte la Tabla de materiales), de modo que los extremos del pasador tibial estén sujetos por la pinza de cocodrilo. Mueva el brazo ajustable de la abrazadera de cocodrilo para asegurarse de que el pie del ratón esté colocado en la placa del dispositivo DART.
    3. Sujete el pie del ratón a la placa del dispositivo DART con cinta adhesiva de laboratorio.
    4. Coloque el pie del ratón en un ángulo de 90° en relación con el eje largo del hueso tibial del ratón. Si se coloca correctamente, el reposapiés será perpendicular a la base acrílica (es decir, el piso o lo que se considera el plano horizontal).
    5. Apoye la plataforma sobre el tope de flexión plantar creado al colocar una aguja hipodérmica larga de 18 G, 1.5 in a través de los orificios preperforados en el transportador del dispositivo DART (Figura 1).

4. Formación DART o ISOM

  1. Optimice la colocación del electrodo colocando un electrodo bipolar, transcutáneo y de estimulación eléctrica neuromuscular (NMES, consulte la Tabla de materiales) en el aspecto inferolateral de la articulación de la rodilla del ratón (Figura 1B).
    1. Con pulsos simples (1 Hz) de un estimulador eléctrico de laboratorio (ver Tabla de materiales), estimule la rama fibular del nervio ciático, que proporciona inervación motora a los músculos dorsiflexores del tobillo (Figura 1B).
    2. Dado que el músculo tibial anterior (AT) representa más del 90% de la fuerza contráctil total producida por los músculos dorsiflexores del tobillo31, observe el vientre y el tendón del músculo TA para detectar evidencia de contracciones de contracción provocadas eléctricamente.
      NOTA: Una ligera prominencia ósea que se corresponde con el hueso del peroné podría ayudar con la colocación del electrodo si el probador puede sentirlo a través del electrodo. Esto requiere algo de práctica y aprendizaje por parte del probador para tener una idea de la colocación óptima de los electrodos.
    3. Mueva el tope de flexión plantar al orificio en el transportador que corresponde a 20° de flexión plantar desde la posición en la que el pie es ortogonal (90°) hasta la tibia — esta es la posición en la que se observa típicamente el torque contráctil máximo del músculo TA basado en informes anteriores21. Esto podría tener que ser personalizado por el usuario en función de los factores específicos de los ratones que se están estudiando.
    4. Visualice el torque de contracción con un dinamómetro de ratón vinculando la placa de pie del dispositivo DART a la placa del dinamómetro, por ej., vincule la placa del dispositivo DART a una placa robótica del dinamómetro de tobillo hecha a medida con una sutura de seda no elástica (similar a la Figura 1A) y amarre la sutura a la placa del dinamómetro (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La placa tiene agujeros integrados en el diseño de impresión 3D. Colocar la sutura a través del par de orificios que están en la segunda fila desde el extremo del dedo del pie coloca la sutura a ~ 20 mm del eje de dorsiflexión/flexión plantar (Figura 1A, B). El dinamómetro ha sido descrito en informes anteriores 19,20,21,22.
  2. Optimice la salida de voltaje del estimulador NMES.
    1. Después de optimizar la colocación del electrodo, optimice la amplitud de la salida de voltaje del estimulador eléctrico; esto es necesario para confinar NMES al nervio fibular común y al músculo TA y reducir el riesgo de provocar cocontracciones en los flexores plantares.
      NOTA: Si se provocan co-contracciones, se pueden visualizar a través de la salida de par del dinamómetro y también se pueden ver en la flexión plantar de los dedos.
  3. Configure el estimulador NMES para el entrenamiento DART o ISOM.
    NOTA: Es posible que el usuario tenga que personalizar la siguiente configuración en función de los factores específicos de los ratones que se están estudiando y el propósito de los estudios.
    1. Configure el estimulador para producir trenes de pulsos repetidos que tengan una frecuencia de 125 Hz: esta frecuencia produce contracciones tetánicas fusionadas máximas sin desbordamiento de NMES en otros grupos musculares en ratones BLAJ21. Para ello, ajuste los diales para la frecuencia de pulso (125 Hz), la duración del tren (500 ms) y los trenes por segundo (1 tren/s) y encienda el interruptor de palanca para repetir trenes de impulsos.
    2. Estimulador configurado para producir trenes de pulsos de 500 ms de duración intercalados con 500 ms de descanso entre trenes de pulsos.
    3. Mueva el tope de flexión plantar hasta el orificio en el transportador que corresponde a 160° al eje largo de la tibia (flexión plantar de 70° desde el pie ortogonal hasta la tibia). Esta es la posición a la que el pie del ratón BLAJ puede ser movido pasivamente sin resistencia de los tejidos blandos21.
    4. Para DART, aplique una resistencia adecuada contra la cual el músculo TA tiene que trabajar concéntricamente, por ejemplo, 5 g como se muestra en la Figura 1A, B; consulte la curva de calibración peso/par en el archivo complementario 1.
    5. Aplique resistencia colgando el peso con una sutura de seda no elástica que está atada a la placa de pie del dispositivo DART (Figura 1A, B).
    6. Ajuste la resistencia, es decir, aplique ~ 50% del máximo de una repetición (1RM) (por ejemplo, 5 g si el mouse puede levantar un peso máximo de 10 g con una sola contracción), que tira del pie a través de al menos la mitad del rango activo disponible de dorsiflexión.
    7. Realizar un entrenamiento DART adecuado en ratones asignados al grupo DART — por ejemplo, realizar un solo episodio de entrenamiento DART, que involucra cuatro series de 10 repeticiones de contracciones concéntricas con 2 minutos de descanso entre series, similar a los programas de entrenamiento de resistencia progresiva utilizados en humanos32 (ver Video Suplementario 1).
    8. Realizar un entrenamiento ISOM adecuado en ratones asignados al grupo ISOM, por ejemplo, realizar un solo episodio de entrenamiento ISOM, que implica cuatro series de 10 repeticiones de contracciones isométricas con 2 minutos de descanso entre series, similar a DART (ver Video suplementario 2).
    9. Para el entrenamiento ISOM, coloque el pie del ratón a 160° del eje largo de la tibia (flexión plantar de 70° desde el pie ortogonal hasta la tibia) y mantenga esta posición estática pegando la sutura de seda a la placa del dinamómetro robótico.
      NOTA: Dado que la sutura no puede deslizarse, la placa del reposapiés del dispositivo DART no puede moverse hacia la dorsiflexión, lo que limita a los dorsiflexores a contraerse isométricamente.

5. Cuidados post-procedimiento para ratones

  1. Tome precauciones para mantener una higiene adecuada de la extremidad posterior ejercitada y reducir el dolor en el sitio de la aguja.
    1. Después del entrenamiento DART o ISOM, cubra la porción visible del clavo tibial con ungüento antibiótico triple (400 U/g de bacitracina, 3.5 mg/g de neomicina y 5000 U/g de polimixina-B, consulte la Tabla de materiales) y luego retire el alfiler cuidadosamente del lado medial de la tibia. Enjuague la piel sobre el muslo lateral y la parte superior de la pierna con povidona yodada y agua estéril. Aplique crema de lidocaína al 5% sobre la tibia para controlar el dolor en el sitio de la aguja.
  2. Permita que los ratones se recuperen de la anestesia.
    1. Retire el ratón del cono de la nariz y permita que se recupere de la anestesia en una jaula de recuperación que esté libre de ropa de cama. Proporcione soporte térmico al ratón mientras se recupera de la anestesia, por ejemplo, con una almohadilla térmica de gel isotérmico.
  3. Devuelva el ratón a su jaula original después de que se recupere completamente de la anestesia. Luego, devuelva la jaula a la instalación de animales, donde se alojan los ratones de estudio hasta que se realicen experimentos de seguimiento. Controle a los ratones diariamente.

6. Recolección de tejidos

  1. Cosecha el músculo TA del ratón en su totalidad y congela rápidamente para la criopreservación siguiendo los pasos a continuación.
    1. Sobre la base de la(s) pregunta(s) de investigación, en un momento adecuado después del entrenamiento (por ejemplo, 3 días después de DART o ISOM), eutanasia a los ratones de acuerdo con los protocolos aprobados.
      NOTA: Para el presente estudio, los ratones fueron sacrificados por luxación cervical bajo anestesia general (isoflurano inhalado, 2% -5% al efecto). La toracotomía bilateral aseguró la muerte.
    2. Diseccionar las extremidades posteriores del ratón para eliminar el músculo TA ejercitado (izquierda) y el músculo TA no ejercitado (derecha). Pesa los músculos cosechados. Luego, sumerja cada músculo en aceite mineral para crioprotección y coloque el músculo en una toallita de laboratorio limpia para secar el exceso de aceite21.
  2. Coloque el músculo en un trozo de papel de aluminio. Sostenga el borde de la lámina con un hemostático largo y sumerja rápidamente la lámina y el músculo en nitrógeno líquido contenido en un recipiente de plástico adecuado para congelar el músculo.
    1. Después de aproximadamente 2 minutos de inmersión en nitrógeno líquido, transfiera el músculo congelado a viales criogénicos marcados. Guarde los viales en un congelador de -80 °C hasta que sea necesario para estudios adicionales.

7. Estudios histológicos en tejido muscular

  1. Preparar secciones de criostato del músculo TA que tengan un grosor de 5 μm. Recoja secciones de criostato en portaobjetos de microscopio cargados. Fijar las secciones con acetona que se mantenga fría a -30 °C y dejar que las secciones se sequen al aire.
  2. Manchar las secciones de tejido muscular con hematoxilina seguida de eosina (tinción H&E, ver Tabla de materiales).
    1. Sumerja las secciones durante 5 minutos en hematoxilina (tinción nuclear azul oscuro) en un frasco de tinción de vidrio. Elimine el exceso de hematoxilina enjuagando las secciones con agua del grifo hasta que no se vea más azulado del agua.
    2. Sumerja las secciones durante 5 minutos en un reactivo azulado en un frasco de vidrio. Aspirar el exceso de reactivo azulado de las secciones con una pipeta de succión de vidrio.
    3. Sumerja las secciones durante 5 minutos en eosina (tinción citoplasmática rosa) en un frasco de tinción de vidrio. Elimine el exceso de eosina sumergiendo las secciones rápida y repetidamente (~ 10 veces) en etanol al 95% en un frasco de tinción de vidrio.
    4. Deje que las secciones se sequen al aire y proceda a visualizar bajo un microscopio óptico.
  3. Prepare imágenes en mosaico de alta resolución de secciones transversales musculares completas de TA a través de imágenes de microscopio.
    NOTA: Es posible que el usuario tenga que personalizar los pasos de procesamiento de imágenes y análisis de imágenes que siguen en función de su microscopio y software de adquisición y análisis de imágenes.
    1. Capture imágenes digitales con la lente objetivo 10x de un microscopio óptico y una cámara digital montada en el microscopio.
    2. Capture alrededor de 15-20 imágenes, moviéndose a lo largo de la sección transversal de cada músculo en forma de cuadrícula, de modo que cada nueva imagen se superponga ~ 25% con la imagen anterior.
      NOTA: Este proceso ayuda a capturar un conjunto de imágenes que se pueden colocar digitalmente en mosaico (también conocido como costura de imágenes) para crear una imagen compuesta de alta resolución de toda la sección transversal del músculo TA (Figura 2).
    3. Guardar imágenes digitales en . Formato TIFF.
    4. Abra imágenes digitales con un software adecuado de procesamiento y análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
    5. Coloque mosaicos o puntadas imágenes individuales en una imagen compuesta de todo el músculo TA a través de los siguientes pasos: con todas las imágenes individuales superpuestas de cada músculo TA abiertas en el software, haga clic en Archivo > Seleccione Automatizar > Seleccione Photomerge > Seleccione Collage > Seleccione Agregar archivos abiertos > Haga clic en Aceptar.
    6. Cuando se prepare y muestre una nueva imagen en mosaico/cosida del músculo TA, guarde la imagen en . Formato TIFF para análisis posteriores.
  4. Cuantificar el daño muscular mediante análisis visual en las imágenes en mosaico de todo el músculo TA con el software de análisis de imágenes adecuado.
    1. En el software de análisis de imágenes, seleccione la función Medir en el menú Analizar para delinear y medir el área de toda la sección transversal del músculo TA (Figura 2).
    2. En el software de análisis de imágenes, seleccione la función Medir en el menú Analizar para delinear y medir las áreas de cada músculo TA que están dañadas, es decir, áreas que muestran alteración citoplasmática de las fibras musculares, fibras musculares ausentes e infiltración celular inflamatoria22 (Figura 2).
    3. Exprese la suma del área total de daño como porcentaje de toda el área transversal del músculo TA (Figura 2, Tabla 2).

8. Análisis estadísticos

  1. Organice los datos como se muestra en las Tablas 1-3 y realice pruebas T no pareadas (si se superan las pruebas de normalidad y varianzas homogéneas)33 o pruebas de suma de rangos de Mann-Whitney (si no se superan las pruebas de normalidad y varianzas homogéneas)21 con el software adecuado (véase la Tabla de materiales).

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Representative Results

Se estudiaron ratones machos BLAZ, que tenían ~ 1.5 años de edad. Los ratones BLAJ modelan la enfermedad muscular humana, LGMD2B / R2. Estos ratones son particularmente susceptibles al daño muscular de aparición tardía de un solo episodio de contracciones musculares excéntricas22,29. Por lo tanto, se eligieron ratones BLAJ para estos estudios para saber si DART podría realizarse de manera no perjudicial ajustando con precisión la resistencia contra la cual el músculo TA tiene que trabajar de manera concéntricamente sesgada. Si se descubriera que DART no era perjudicial para los ratones BLAZ, entonces probablemente sería útil como una forma de entrenamiento de resistencia no perjudicial, que podría aplicarse solo o como complemento de la medicina regenerativa, genética, farmacológica y otras intervenciones.

Las edades y los pesos de los ratones BLAJ se emparejaron estrechamente entre los grupos DART e ISOM (Tabla 1). En el día 3 (~ 72 h), después de una sola sesión de entrenamiento, el músculo TA ejercitado tuvo bajos niveles de daño en los grupos DART e ISOM (<10% de área dañada) - esto está en contraste con estudios anteriores21,22 de la respuesta de ratones BLAJ a contracciones musculares excéntricas, donde ~ 40% de fibras dañadas se han reportado en el día 3 (Figura 2, Tabla 2). Cuando se comparó el área de daño muscular entre los músculos TA ejercitados de los grupos DART e ISOM, se encontró que el grupo DART tenía niveles más bajos de daño muscular que el grupo ISOM (Figura 2, Tabla 2). El torque tetánico máximo registrado en el día 0 (línea de base) y el día 3 no fue estadísticamente diferente entre los grupos DART e ISOM (Tabla 3).

Figure 1
Figura 1: Fabricación del dispositivo DART y aplicación en un estudio de entrenamiento. (A, B) El dispositivo DART se basa en un diseño de circuito de cable-polea-peso, que es común a los equipos de entrenamiento de resistencia que están diseñados para humanos. (A) El dispositivo DART con un animal durante una sesión de entrenamiento DART. (B) La placa del pie que se mueve hacia la dorsiflexión durante una contracción concéntrica del músculo TA (flecha verde curvada, derecha). La contracción concéntrica hace que la resistencia de 5 g se mueva verticalmente contra la gravedad (flecha verde vertical, izquierda). Las contracciones musculares se obtuvieron con estimulación eléctrica aplicada a través de un electrodo bipolar transcutáneo. (C) Varios componentes del dispositivo DART fueron diseñados con software de estereolitografía para generar . STL, que se pueden abrir con software de corte. Con el software de corte, los archivos G-CODE se generaron específicos para la impresora 3D y el filamento utilizado. Los componentes impresos en 3D del dispositivo DART incluían (C) carcasa para un rodamiento de rueda de baja fricción 608, (D) una torre para la carcasa del rodamiento de la rueda, (E) un reposapiés y (F) un eje para conectar el reposapiés al cojinete de la rueda. Los componentes impresos en 3D se combinaron y montaron sobre una base de acrílico con pegamento y sujetadores de tornillo como se describe en el texto y se muestra en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Estudio histológico. Cambios histológicos en el músculo TA en el día 3 (A) post-DART o (B) post-ISOM. Las criosecciones, que tenían un grosor de 5 μm, se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se capturaron múltiples imágenes digitales superpuestas y se fusionaron con el software de imágenes para generar imágenes en mosaico de alta resolución de toda la sección transversal del músculo TA. Los datos histológicos cualitativos indicaron que la extensión del daño muscular fue baja en los grupos DART e ISOM, pero el daño muscular fue ligeramente más obvio en el grupo ISOM. Las flechas amarillas apuntan a algunas de las regiones dañadas en las secciones transversales del músculo TA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Edades y pesos corporales de ratones. Los ratones BLAJ que se estudiaron fueron estrechamente emparejados en edad y peso corporal sin diferencias significativas entre los grupos DART e ISOM. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Análisis cuantitativo del daño muscular TA. La extensión del daño muscular se expresó como un porcentaje del área total de la sección transversal del músculo TA y se analizó mediante una prueba T. Tanto el entrenamiento DART como el ISOM resultaron en un bajo nivel de daño muscular en el Día 3 en comparación con estudios anteriores que involucran un episodio similar de contracciones excéntricas en ratones BLAZ. Aunque la magnitud del daño muscular fue pequeña en los grupos DART e ISOM, la extensión del daño fue estadísticamente menor en el grupo DART. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Datos de par contráctil. El torque contráctil producido por los músculos dorsiflexores se estudió con un dinamómetro robótico conectado al dispositivo DART. No hubo diferencias significativas entre los grupos DART e ISOM en el torque tetánico basal máximo medido el día del ejercicio (A, Día 0) o a los 3 días después del ejercicio (B, Día 3). A pesar de la falta de evidencia histológica de daño muscular generalizado, un solo ataque de DART e ISOM se asoció con un déficit de torque contráctil (~ 40%) en el día 3. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Video complementario 1: Entrenamiento DART en ratones. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 2: Entrenamiento ISOM en ratones. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: Datos de calibración de peso a par, curva y configuración. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivos de codificación suplementarios 1-4: Diseños para los componentes del dispositivo DART. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este artículo presenta instrucciones paso a paso sobre cómo construir un dispositivo para realizar un tipo de entrenamiento de rehabilitación de precisión llamado entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El trabajo también describe la aplicación del dispositivo y la metodología DART en un estudio de entrenamiento para comparar el daño muscular 3 días después de un solo episodio de DART (grupo DART) con el daño 3 días después de un episodio comparable de entrenamiento isométrico (grupo ISOM).

Los pasos críticos en el protocolo son la construcción adecuada del dispositivo DART 34,35, los pasos precisos involucrados en la realización del entrenamiento DART o ISOM, la recolección y criopreservación adecuadas del tejido muscular, la sección adecuada del tejido muscular con un criostatino y la tinción adecuada de las secciones transversales musculares con hematoxilina y eosina 22,36 . Específicamente, para construir el dispositivo DART, las piezas deben fabricarse con las dimensiones exactas y las propiedades óptimas del material. Si las dimensiones son inexactas para la carcasa del rodamiento de la rueda, el rodamiento de rueda tipo 608 no encajará perfectamente dentro de la carcasa del rodamiento de la rueda. Si las dimensiones del reposapiés y el eje del ratón no son precisas, podría afectar negativamente a la capacidad del rodamiento de la rueda para moverse junto con el pie del ratón. Si las piezas del dispositivo DART se fabrican con un material inadecuado y/o configuraciones de impresora 3D, las piezas del dispositivo DART pueden carecer de suficiente resistencia mecánica, lo que podría provocar la flexión y/o rotura de varios componentes34.

Es posible que se necesiten modificaciones de este protocolo en función de las preguntas de investigación específicas que los investigadores deseen responder. El protocolo actual es específico para diseñar e implementar el dispositivo DART en un estudio que intentó responder a la pregunta de si un solo ataque de DART causa o no daño extenso al músculo TA en ratones deficientes en disferlina, como informamos anteriormente con un episodio similar de contracciones excéntricas22. Dado que otros han sugerido que el ejercicio que consiste en contracciones isométricas podría no ser perjudicial y, por lo tanto, adecuado para humanos con ciertas enfermedades musculares, comparamos la extensión del daño muscular causado por DART con un episodio comparable de contracciones isométricas (ISOM)37,38. En este estudio, encontramos que tanto DART como ISOM inducen un daño muscular mínimo, con DART mostrando niveles de daño ligeramente pero significativamente más bajos que ISOM.

En relación con la resolución de problemas, el aspecto más desafiante del protocolo es precisamente estimular la rama fibular del nervio ciático, lo que da inervación motora al músculo TA. Esta técnica es particularmente desafiante porque el probador sostiene un electrodo transcutáneo y lo coloca manualmente en un lugar preciso que es inferior y lateral a la articulación de la rodilla del ratón20,39. El probador debe practicar y aprender a localizar este punto en la extremidad posterior del ratón sintiendo una ligera prominencia ósea correspondiente a la cabeza del hueso fibular del ratón40. Para confirmar que se está logrando una estimulación eléctrica óptima de la rama fibular del nervio ciático, de modo que se logren contracciones máximas del músculo TA, es mejor que se utilice un sistema de dinamometría confiable20,21,22,41. Además, los electrodos transcutáneos o subcutáneos estabilizados por una pinza también pueden considerarse para la colocación confiable y reproducible de electrodos para minimizar la variabilidad inducida por el usuario y los errores 20,41,42,43.

La principal limitación del protocolo es que está diseñado específicamente para estudiar el efecto de DART en el músculo TA en ratones. Con métodos que se han desarrollado para realizar evaluaciones dinamométricas y ejercicio forzado en el grupo muscular cuádriceps femoral en roedores, el dispositivo DART se puede adaptar fácilmente para el grupo muscular cuádriceps femoral42,43. Aplicar el dispositivo DART a otros grupos musculares podría ser más difícil; sin embargo, el diseño del circuito cable-polea-peso, que se ha utilizado en el dispositivo DART, se puede incorporar en dispositivos que son adecuados para otros grupos musculares. Otra limitación es que el protocolo se realiza bajo anestesia general, haciendo ejercicio forzado y no voluntario; Esto es diferente de la mayoría de los paradigmas de entrenamiento de resistencia desarrollados para humanos12,21.

La importancia del dispositivo y la metodología DART con respecto a los métodos existentes o alternativos es que la dosis para el entrenamiento de resistencia se puede ajustar con precisión y el ejercicio puede dirigirse con precisión a un grupo muscular particular12. La rehabilitación de precisión es una nueva prioridad estratégica para los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y, dado que DART permite realizar entrenamiento de resistencia de precisión en ratones, DART se presta bien a estudios básicos y preclínicos sobre rehabilitación física de precisión44,45.

La importancia y la aplicación potencial del método actual para realizar entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis es que hace posible realizar estudios de entrenamiento de resistencia en ratones de manera comparable a las pruebas en humanos y los protocolos de entrenamiento utilizados en la investigación y práctica de rehabilitación clínica. Por ejemplo, al igual que el máximo de una repetición (1RM, la carga máxima que se puede levantar / mover / presionar / poner en cuclillas con éxito solo una vez mientras se mantiene una buena forma) se usa para que los humanos ajusten la magnitud de la resistencia para los combates de entrenamiento17,18, la carga máxima que el músculo TA puede levantar con éxito se puede usar para establecer la resistencia para entrenar en ratones con el dispositivo DART. Además de ajustar la resistencia en función de la capacidad de un animal, la ventaja adicional es que las contracciones están sesgadas concéntricamente, lo que ayuda a reducir la lesión muscular inducida por la contracción22. Los resultados representativos sugieren que un ataque de DART es incluso menos perjudicial que un episodio comparable de contracciones isométricas (grupo ISOM). La naturaleza no perjudicial de DART lo hace apropiado para estudios de entrenamiento donde es mejor evitar las contracciones perjudiciales, por ejemplo, estudios de entrenamiento en ratones que modelan distrofias musculares y estudios de entrenamiento diseñados para recargar gradualmente el músculo después de procedimientos quirúrgicos experimentales en músculos y / o tendones 22,46,47.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por subvenciones de Jain Foundation Inc., R03HD091648 del NICHD, una subvención piloto de AR3T bajo NIH P2CHD086843, un premio FRAP de EACPHS en Wayne State University, un paquete de inicio de la facultad de Wayne State University y un subcontrato de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) a JAR. Este estudio también fue financiado por una subvención de investigación de la Asociación Americana de Terapia Física - Michigan (APTA-MI) a JMB, MEP y JAR. Los autores reconocen a la Dra. Renuka Roche (Profesora Asociada, Eastern Michigan University, MI) por leer críticamente el manuscrito y proporcionar comentarios. Los autores agradecen al Sr. Anselm D. Motha por sus consejos sobre impresión 3D. Los autores agradecen a los pacientes con disferlinopatías que han compartido sus historias en el sitio web de la Fundación Jain en https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, particularmente sus experiencias con el ejercicio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing Anmiao Star (N/A) AMS127 High precision, low friction wheel bearing.  If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter,  22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice.  Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions.
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA) Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. Stock #012767 Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2.
Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode Harvard Apparatus, Holliston, MA BS4 50–6824 Electrode for NMES.  If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives.
Coplin Staining Dish ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. S17495 Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections
Cura 4.4.1. Software Ultimaker, Utrecht, Netherlands Ultimaker Cura 4.4.1. Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files
Deltaphase isothermal gel heating pad Braintree Scientific (Braintree, MA) Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
Eosin Y Millipore Sigma (Burlington, MA) HT110132-1L Pink cytoplasmic stain
Gorilla Super Glue The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) Gorilla Super Glue Micro Precise Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components
Hematoxylin solution, Gill No.3 Millipore Sigma (Burlington, MA) GHS332-1L Dark blue stain for nuclei
HM525NX cryostat ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX Cryostat to make frozen sections of muscle
Lab Wipes.  Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog No. 06-666.  Manufacturer #34120 Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes.
Labview 2014 National Instruments, Austin, Texas, USA Labview 2014 Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator.
Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks ThermoFisher (Waltham, MA) S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMD Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue
Magic depilatory cream Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
Metal alligator clip JINSHANGTOPK (web-based business) 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps Spring clamp to hold tibial pin
Micrscope slides Globe Scientific (Mahwah, NJ) 1354W. Diamond White Glass Slides Charged microscope slides
Mineral Oil ThermoFisher (Waltham, MA) BP26291 Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing
Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) #11778 Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray.  This is the material used to 3D print device components.
Monoprice Select Mini V2 3D printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) Mini V2 3D 3D printer for computer-aided fabrication of device components.
NIH Image software National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) NIH Image for Windows Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage.  NIH Image is also known as Image J.
Photoshop CS4 Adobe (San Jose, CA) Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields
PSIU6 stimulation isolation unit Grass Instruments (West Warwick, RI) PSIU6 isolation unit Isolation unit for NMES.  Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit
Roboz 4-0 silk black braided suture material Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) Roboz Surgical SUT152 Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training
S48 square pulse stimulator Grass Instruments (West Warwick, RI) S48 Stimulator Laboratory electrical stimulator for NMES .  If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative.  Please contact co-author Jones for more information.
Scott’s bluing reagent Ricca Chemical Company (Arlington, TX) 6697-32 Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining
SigmaStat version 3.5 Systat Software (San Jose, CA) SigmaStat version 3.5 Statistical software package for statistical analyses
Tabletop isoflurane vaporizer VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled tabletop anesthesia system
Triple antibiotic first aid ointment Global Health Products (wed-based business) Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care

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