Summary
Den nåværende protokollen beskriver en optimalisert hematopoietisk stamme og stamcelle (HSPC) kulturprosedyre for robust engraftment av genredigerte celler in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 er et svært allsidig og effektivt genredigeringsverktøy som brukes mye for å korrigere ulike genetiske mutasjoner. Muligheten for genmanipulering av hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs) in vitro gjør HSPCs til en ideell målcelle for genterapi. HSPC-er mister imidlertid moderat sitt potensial for innpoding og repopulasjon av flere linjer i ex vivo-kulturen . I denne studien beskrives ideelle kulturforhold som forbedrer HSPC-engraftment og genererer et økt antall genmodifiserte celler in vivo. Den nåværende rapporten viser optimaliserte in vitro-kulturforhold , inkludert type kulturmedier, unikt cocktailtilskudd av små molekyler, cytokinkonsentrasjon, cellekulturplater og kulturtetthet. I tillegg til dette tilbys en optimalisert HSPC-genredigeringsprosedyre, sammen med validering av genredigeringshendelsene. For in vivo validering vises den genredigerte HSPC-infusjonen og post-engraftment-analysen hos musemottakere. Resultatene viste at dyrkningssystemet økte frekvensen av funksjonelle HSC in vitro, noe som resulterte i robust innkapsling av genredigerte celler in vivo.
Introduction
Utilgjengeligheten for humant leukocyttantigen (HLA)-matchede donorer i allogene transplantasjonsmiljøer og den raske utviklingen av svært allsidige og sikre genteknologiske verktøy gjør autolog hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT) til en kurativ behandlingsstrategi for arvelige blodsykdommer 1,2. Autolog hematopoietisk stamme og stamcelle (HSPC) genterapi innebærer innsamling av pasientens HSPC, genetisk manipulasjon, korreksjon av sykdomsfremkallende mutasjoner og transplantasjon av genkorrigerte HSPCer til pasienten 3,4. Det vellykkede resultatet av genterapien er imidlertid avhengig av kvaliteten på det transplanterbare genmodifiserte transplantatet. Genmanipulasjonstrinnene og ex vivo-kulturen til HSPCer påvirker kvaliteten på transplantatet ved å redusere frekvensen av langsiktige hematopoietiske stamceller (LT-HSC), noe som nødvendiggjør infusjon av store doser genmanipulerte HSPCs 2,5,6.
Flere små molekyler, inkludert SR1 og UM171, blir for tiden ansatt for å utvide ledningsblod HSPCs robust 7,8. For voksne HSPCer, på grunn av høyere celleutbytte oppnådd ved mobilisering, er det ikke nødvendig med robust ekspansjon. Imidlertid er det avgjørende for genterapiapplikasjonene å beholde stammen til isolerte HSPC-er i ex vivo-kulturen. Derfor utvikles en tilnærming med fokus på kulturberikelse av hematopoietiske stamceller (HSC) ved hjelp av en kombinasjon av små molekyler: Resveratrol, UM729 og SR1 (RUS)7. De optimaliserte HSPC-kulturforholdene fremmer anrikning av HSC, noe som resulterer i økt frekvens av genmodifiserte HSC-er in vivo, og reduserer behovet for genmanipulering av store doser HSPC, noe som letter kostnadseffektive genterapitilnærminger8.
Her beskrives en omfattende protokoll for HSPC-dyrkelse, sammen med infusjon og analyse av genredigerte celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo eksperimenter på immunsviktende mus ble godkjent av og utført i henhold til retningslinjene fra Institute Animal Ethics Committee (IAEC), Christian Medical College, Vellore, India. Granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF)-mobiliserte perifere blodprøver ble samlet inn fra friske humane donorer med informert samtykke etter å ha innhentet godkjenning fra Institutional Review Board (IRB).
1. Isolering av mononukleære celler i perifert blod (PBMNC) og rensing av CD34 + celler
- Utfør PBMNC-isolasjon ved å følge trinnene nedenfor.
MERK: For in vitro HSPC-kultur og genredigering er det ideelt å starte med minst 1 x 106 HSPCer / gruppe. For in vivo engraftmentanalyse er et startcellenummer på minst 5 x 106 HSPCs/gruppe ideelt hvis en gruppe inneholder åtte mus og hver mus er infundert med minst 6 x 105 celler. For å oppnå et tilstrekkelig antall PBMNC (~ 1 x 109) for prosedyren, anbefales det å starte med 20 ml mobilisert perifert blod (mPB).- Etter innsamling av mPB, fortynn 20 ml mPB med steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i et 1: 1-forhold.
MERK: Effektiviteten av G-CSF-mobilisering kan variere mellom individene9, og derfor varierer antall HSPCer oppnådd fra 20 ml mobilisert blod mellom givere. - Tilsett 10 ml tetthetsgradientmedium (Lymphoprep, se materialtabell) til et 50 ml rør og lag det fortynnede blodet gjennom sidene av røret i et 1: 2-forhold.
MERK: Å vippe 50 ml røret i en vinkel på 20 ° mens du tilsetter det fortynnede blodet, forhindrer det i å blande seg med Lymphoprep, noe som fører til klar separasjon av blodkomponenter etter sentrifugering. - Sentrifuge ved 600 x g i 30 minutter ved romtemperatur (RT) med en akselerasjonshastighet på 1 m/s² og en retardasjonshastighet på 1 m/s². Kast det øvre laget (plasma) ved hjelp av en serologisk pipette og høst den buffy pelsen som er tilstede ved interfasen (PBMNCs) over tetthetsgradientmediumlaget.
MERK: Aspirer buffycoaten med en serologisk pipette ved å rotere den forsiktig på sidene av røret. Unngå å samle et høyere volum interfase mens du aspirerer buffycoaten for å forhindre granulocytt- og RBC-forurensning. - Overfør PBMNC-ene til et nytt 50 ml konisk rør og fortynn cellesuspensjonen med 1x PBS i forholdet 1:2.
MERK: Fortynn cellesuspensjonen med 1x PBS i forholdet 1:4 hvis det ble samlet inn et overskudd av interfase under aspirasjon av buffycoaten. - Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur med en akselerasjonshastighet på 9 m/s² og en retardasjonshastighet på 7 m/s² og kast supernatanten med en serologisk pipette. Tilsett 30 ml iskald RBC-lysebuffer (se tabell 7) til pelleten og inkuber i is i 10 minutter. Bland ved å snu røret hvert 2. minutt.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur med en akselerasjonshastighet på 9 m/s² og en retardasjonshastighet på 7 m/s², og kast supernatanten. Gjenta trinn 1.1.5.-1.1.6. til pelletrødheten forsvinner. Resuspendere pelleten med basale medier (IMDM, se materialtabell) og utfør en celletelling ved hjelp av trypanblå i et Neubauer-kammer10.
MERK: De isolerte PBMNC-ene kan umiddelbart brukes til å rense CD34+ HSPC-er. For kryopreservering, sentrifuger 5 x 108 celler ved 200 x g i 5 minutter og tilsett 4 ml kryomedier som inneholder IMDM: FBS: DMSO (se materialtabell) i forholdet 7:2:1. - Overfør hetteglassene til en kryokjøler på 1 °C og oppbevar dem ved -80 °C i opptil 12 timer. Overfør og oppbevar kryovialene i en beholder med flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.
- Etter innsamling av mPB, fortynn 20 ml mPB med steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i et 1: 1-forhold.
- Gjenopplive de kryopreserverte PBMNC-ene.
- Halvtine kryoialene i et vannbad på 37 °C ved å virvle forsiktig i <1 min. Overfør cellesuspensjonen av kryovialet til et 50 ml rør som inneholder IMDM i forholdet 1:10.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur med en akselerasjonshastighet på 9 m/s² og en retardasjonshastighet på 7 m/s², og kast supernatanten med en serologisk pipette.
- Rens CD34+ -cellene fra PBMNC-er ved å følge trinnene nedenfor.
- Forbered rensebufferen med steril 1x PBS som inneholder 2% filtrert føtalt bovint serum (FBS). Resuspend PBMNC-cellepelleten i bufferen i henhold til tabell 1.
MERK: Bufferen må være Ca++ og Mg++ fri. - Overfør cellesuspensjonen inneholdende 1 x 108-5 x 108 celler med ferske eller kryopreserverte PBMNC-er til 5 ml polystyren rundbunnsrør (se materialtabell).
MERK: Tilsett DNase (se materialtabell) ved en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml til cellesuspensjonen for å forhindre celleklumping. Vi brukte et kommersielt tilgjengelig sett for CD34-rensing som inneholder Human CD34 Positive Selection Cocktail og Dextran Rapid Spheres (se materialtabell). - Legg til kommersielt tilgjengelig Human CD34 Positive Selection Cocktail (se materialtabell) i konsentrasjonen av 100 μL / ml celler og resuspend forsiktig.
- Inkuber ved RT i 30 minutter og resuspender cellesuspensjonen forsiktig hvert 5. minutt. Tilsett 50 μL / ml kommersielt tilgjengelige Dextran Rapid Spheres (se materialtabell) og resuspend forsiktig.
MERK: Vortex dextran kuler med høy hastighet i 5 s for å sikre at partiklene vises jevnt dispergert og deretter legge dem til cellene. - Inkuber ved RT i 15 minutter og resuspender cellesuspensjonen forsiktig hvert 5. minutt. Gjør cellesuspensjonen til et totalt volum på 2,5 ml med rensebuffer og resuspend den forsiktig.
- Plasser røret i en kommersielt tilgjengelig immunomagnetisk kolonnefri magnet (se materialtabell) og inkuber i 5 minutter ved RT. Etter inkubasjon, inverter magneten og kast supernatanten i en kontinuerlig bevegelse.
MERK: De Dextran Rapid Spheres-merkede CD34+ -cellene forblir tiltrukket av sidene av røret av magnetfeltet. Røret må holdes i omvendt stilling i 2-3 s. Unngå skjelving eller blotting av dråpene som forblir hengende fra munnen av røret. - Fjern røret fra magneten og tilsett 2,5 ml rensebuffer. Gjenta trinn 1.3.6-1.3.7 fem ganger.
MERK: Under tilsetning av rensebuffer, plasser røret i en skarp vinkel og legg til buffer ved å virvle røret, da cellene kan feste seg til overflateveggene mens du inverterer magneten. - Etter å ha fullført fem vasker, fjern røret fra magneten, tilsett 4 ml 1x steril PBS, og resuspend cellesuspensjonen. Overfør cellesuspensjonen til 15 ml sentrifugerøret og gjør den opp til 10 ml med 1x PBS. Utfør en celletelling ved hjelp av trypanblå i et Neubauer-kammer10.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT (akselerasjon ~9 m/s², retardasjon ~7 m/s²) og kast supernatanten med pipette. For å dyrke HSPC-ene, resuspendere cellene i HSPC-kulturmedier, som nevnt i trinn 2.1.
MERK: Overskuddene til rensede HSPC-er ble kryopreservert i et kommersielt tilgjengelig kryopreserveringsmedium (se materialtabell) med en tetthet på 9 x 106 celler /ml etter dyrking av HSPC-ene i 12 timer i HSPC-kulturmedier.
- Forbered rensebufferen med steril 1x PBS som inneholder 2% filtrert føtalt bovint serum (FBS). Resuspend PBMNC-cellepelleten i bufferen i henhold til tabell 1.
- Gjenopplive de kryopreserverte HSPC-ene.
- Tine kryoialene i <1 min i et vannbad på 37 °C ved forsiktig virvling. Overfør cellesuspensjonen i kryovialet til et 50 ml rør.
- Tilsett 1% BSA resuspended i 1x PBS dråpe for dråpe med konstant agitasjon og gjør den opp til 20 ml. Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur med en akselerasjonshastighet på 9 m/s² og en retardasjonshastighet på 7 m/s² og kast supernatanten med en serologisk pipette.
- Gjenta trinn 1.4.2. 1x. Resuspendere cellene i HSPC-kulturmedier og -kultur som beskrevet i trinn 2.1.
2. In vitro-dyrkning av rensede HSPC-er
- Forbered kulturmediene ved hjelp av SFEM-II med SCF (240 ng / ml), FLT3 (240 ng / ml), TPO (80 ng / ml), IL6 (40 ng / ml) og 1x antibiotika-antimykotisk (se materialtabell).
MERK: Nylagde kulturmedier anbefales på det sterkeste. Mediet kan imidlertid oppbevares ved 4 °C i opptil 24 timer etter tilberedning. - Resuspend CD34+ pelleten med kulturmediet, tilsett 3 μL RUS cocktail / ml media (Resveratrol, 10 μM; UM729, 500 nM; StemReginin-1, 750 nM; se tabell over materialer), og dyrk cellene ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: UM171 (10 nm) kan brukes til å erstatte UM729 (500 nM) da begge har lignende effekter på HSPC stemness vedlikehold7. Hetteglassene kan ikke fryse-tines mer enn to ganger. - Til å begynne med frø de rensede cellene ved et sammenløp på 5 x 105/ml i kommersielt tilgjengelige delta-overflatebehandlede 6-brønnsplater (se Materialtabell) for å fjerne de tilhørende cellene.
- Reseed cellene i suspensjonen ved en sammenløp av 2 x 105 celler / ml i en ny 6-brønns plate etter 6 timers rensing.
- Karakteriser stammen til HSPC-ene ved hjelp av flowcytometri før genredigering.
- For flowcytometrianalyse, ta 1 x 105 celler i 100 μL av 1x PBS og tilsett 3 μL (75 ng) CD34 PE, 4 μL (100 ng) CD133 FITC og 4 μL (100 ng) CD90 APC (se materialtabell).
- Inkuber røret på RT i 20 min i mørket. Vask cellene med 2 ml 1x PBS 2x og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten med en pipette, resuspend cellepelleten med 150 μL 1x PBS, og oppnå den i flowcytometri.
MERK: Hvis prosentandelen CD34+ -celler er <90 %, øker du antall vasker opptil seks ganger i trinn 1.3.7. Frø de rensede HSPC-ene i kulturmedier, og etter 6 timer samler du bare cellene i suspensjonen. De fleste CD34-cellene fester seg til kulturplaten.
3. Genredigering av HSPCer
- Utfør RNA-rekonstituering.
MERK: Syntetisk sgRNA med fosforothioatmodifikasjoner rettet mot CCR5-lokuset ble hentet fra kommersielle kilder (se Materialtabell).- For rekonstituering setter du termoblanderen på 37 °C og forvarmer bufferen 1x TE (se materialtabell) ved 37 °C i 10 minutter. Sentrifuge det syntetisk kjemisk modifiserte sgRNA-hetteglasset ved 11 000 x g i 1 min ved 4 °C.
- Til sgRNA hetteglasset som inneholder 1,5 nM lyofilisert sgRNA, tilsett 15 μL 1x TE-buffer, noe som gir en endelig konsentrasjon på 100 pM / μL. Resuspend forsiktig opp til 5x, virvle spissen rundt hjørnene.
- Inkuber i termomikseren ved 37 °C i 30-40 s med minimal risting. Etter et kort spinn, samle 15 μL sgRNA og lagre som 1 μl aliquots (100 pM / μL) ved -80 ° C for fremtidig bruk i opptil 1 år.
MERK: Unngå gjentatt fryse-tining. Maksimalt én fryse-tine-syklus med aliquoted gRNA anbefales.
- Utfør nukleofeksjon ved å følge trinnene nedenfor.
- På dag 3 av kulturen teller cellene ved hjelp av Neubauers forbedrede celletellingskammer10.
- For RNP-forberedelse (for nukleofekting 2 x 10 5 celler), ta 1 μL sgRNA rettet mot CCR5-genet (100 pM) i et0,5 ml rør og tilsett 2,65 μL Cas9 (50 pM) ved forsiktig virvling rundt bunnen av hetteglasset. Inkuber ved RT i 10 min.
MERK: gRNA-sekvens: (CCR5) TGACATCAATTATTATACATCGG. - For bufferpreparering, tilsett 16,4 μL P3 primærcelleoppløsning og 3,6 μL supplement, forsynt med det kommersielle nukleofeksjonssettet (se Materialtabell), og inkuber ved RT i 10 minutter. Forbered kulturmedier (trinn 2.1.) og preinkuber det ved 37 °C i kulturplaten før nukleofeksjon.
- Pellet 2 x 10 5 celler ved sentrifugering ved 200 x g i5 minutter ved RT og kast supernatanten forsiktig med en pipette uten å forstyrre pelleten. Resuspend pelleten med 20 μL av bufferen fremstilt i trinn 3.2.3. og forsiktig resuspend det.
- Bland cellesuspensjonen forsiktig med det tilberedte RNP-komplekset (trinn 3.2.2.) uten luftbobler. Overfør suspensjonen til den kommersielle nukleofeksjonsstrimmelen (se materialtabell) og velg pulskoden DZ100 for å elektroporere cellene ved hjelp av 4D-nukleofektoren (se materialtabell).
MERK: Cellesuspensjonens endelige volum, inkludert buffer- og RNP-komponentene, må ikke overstige mer enn 27 μL / elektroporering. - For eksperimentell kontroll, pellet 2 x 10 5 uredigerte HSPCer ved sentrifugering ved 200 x g i5 minutter ved RT, og resuspendere pelleten med 20 μL av bufferen fremstilt i trinn 3.2.3. uten RNP-kompleks.
- Tilsett 100 μL pre-inkuberte dyrkningsmedier (trinn 3.2.3.) til de elektroporerte cellene og la cellene stå uforstyrret i 10 minutter i nukleofeksjonsstrimmelen ved RT. Etter 10 minutters inkubasjon, overfør innholdet til kulturplaten i henhold til eksperimentelle krav.
MERK: Denne protokollen kan brukes på ikke-homolog endekobling (NHEJ)-mediert målrettet forstyrrelse av ethvert genomisk lokus ved bruk av målspesifikt gRNA. Den samme protokollen kan brukes for å innføre store slettinger ved å inkludere dobbelt gRNA i trinn 3.2.2. 11. Videre, etter 10 min RNP-inkubasjon, kan den samme protokollen brukes til homologi rettet reparasjon (HDR) -basert genredigering når den leveres med en donormal12. Protokollen er validert ved målrettet forstyrrelse av AAVS1, pseudo β-globin, β-globin og CCR5 locus 7,8.
4. Validering av genredigeringshendelser i HSPC-er
- Utfør DNA-ekstraksjon.
- Etter 72 timer etter nukleofeksjon, utfør en celletelling ved hjelp av trypanblå i et Neubauer-kammer. Samle 1 x 105 genredigerte HSPCer for DNA-ekstraksjon.
- Sentrifuger cellene ved 11 000 x g i 5 minutter ved RT og kast supernatanten ved hjelp av en pipette. Resuspend pelleten med 1 ml 1x PBS og gjenta sentrifugeringen og kast supernatanten. Til pelleten tilsettes 20 μL hurtig ekstraktoppløsning (se materialtabell) for 1 x 105 celler og resuspenderer pelleten.
- Inkuber blandingen i en termosyklus ved 68 °C i 30 minutter. Etter en kort sentrifisering inkuberer du blandingen i en termosyklus ved 98 °C i 10 minutter. Mål konsentrasjonen av DNA i rålysatet ved hjelp av et spektrofotometer13.
- Utfør forsterkningen av det genredigerte lokuset ved PCR.
- Ved hjelp av Primer3 (se Materialtabell) utformer du de locusspesifikke primerne som spenner over DSB-området (double-stranded break) med amplikonstørrelser mellom 400-700 bp (tabell 2).
MERK: Primer3 er et nettbasert åpen kildekodeverktøy for design av PCR-primere. - Forbered reaksjonsblandingen som angitt i tabell 3 og kjør termocykleren med sykkelforholdene nevnt i tabell 4. For å bekrefte forsterkningen av ønsket lokus, bland 5 μL PCR-produkt med 6x lastfargestoff og last på 2% agarosegelelektroforese laget ved hjelp av TAE-buffer.
MERK: TAE-bufferkomponentene er angitt i tabell 7. - Kjør i 30-40 minutter ved 100 V og oppdag amplikonen ved hjelp av et gelavbildningssystem (se materialtabell). I henhold til PCR-rensingsprodusentens protokoll (se Materialtabell), rydd opp det forsterkede PCR-produktet.
- Mål konsentrasjonen av det rensede PCR-produktet ved hjelp av et nanodrop-spektrofotometer (se materialtabell).
- Ved hjelp av Primer3 (se Materialtabell) utformer du de locusspesifikke primerne som spenner over DSB-området (double-stranded break) med amplikonstørrelser mellom 400-700 bp (tabell 2).
- Utfør Sanger-sekvensering og fjerning av fri fargestoffterminator ved å følge trinnene nedenfor.
- Forbered reaksjonsblandingen som vist i tabell 5. Kjør termosykleren med sykkelforholdene som nevnt i tabell 6.
- Tilsett 10 μL HighPrep DTR-reagens (se materialtabell) og 40 μL 85% etanol til 10 μL PCR-prøve i et 1,5 ml rør og bland det ved kraftig pipettering ca. 8x-10x.
- Inkuber blandingen ved RT i 5 minutter og plasser 1,5 ml røret på det magnetiske separasjonsstativet i 5 minutter. Fjern supernatanten med en pipette og tilsett 100 μL 85% etanol.
- Kast supernatanten og gjenta trinn 4.3.3. 1x. Ta ut 1,5 ml rørene fra magnetstativet og inkuber dem ved 37 °C i 10 minutter i en termomikser for å tørke etanolen.
- Resuspend perlene kraftig med 40 μL nukleasefritt vann og inkuber ved RT i 5 minutter. Plasser røret på det magnetiske separasjonsstativet i 5 minutter, og utfør Sanger-sekvensering etter publiserte rapporter14,15.
- Utføre en indelfrekvensvurdering ved ICE-analyse16.
- Bruk Synthego (se Materialtabell) for ICE-analysen.
- Last opp ab1-filer med redigerte og uredigerte prøver og gRNA-sekvenser og klikk på analyser for å få frekvensen til Indels.
5. Transplantasjon av genredigerte HSPCer
- Forutsetning for kommersielt tilgjengelig NOD scid gammamus (NSG)17 og NOD. CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 mus (se materialtabell) for benmargstransplantasjon.
- For å prekondisjonere NSG-mus, velg 6-8 uker gamle hunnmus og skill dem inn i kontroll- og redigerte grupper ved blindet randomisering.
- Plasser NSG-musene i paiburene og bestråling ved 3,5 Gy ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig bestråler (se Materialtabell) 6-8 timer før HSPC-transplantasjon.
MERK: Det anbefales å veie musene før bestråling, og mus som veier >20 g vil bli utsatt for bestråling. - For forkondisjonering av 6-8 uker gamle mannlige og kvinnelige NBSGW-mus, injiser busulfan (se materialtabell) gjennom intraperitoneal (IP) injeksjon i en dose på 12,5 mg / kg kroppsvekt 48 timer før HSPC-transplantasjon.
MERK: Busulfan kondisjonering øker transplantatet av humane HSPCer i musebenmargen og reduserer behovet for infusjon av store doser genredigerte HSPCs19. Det ideelle utvalget av busulfandose for kondisjonering er mellom 10 mg/kg og 15 mg/kg kroppsvekt. Økte doser av busulfan vil føre til alvorlige dødelighetsproblemer.
- Forbered cellesuspensjonen for benmargstransplantasjon.
- Etter 10 minutter med inkubering av de genredigerte HSPC-ene i nukleofeksjonsstrimmelen (se trinn 3.2.7), overfør cellesuspensjonen til 10 ml 1x PBS. Tell cellene ved hjelp av Neubauers forbedrede celletellingskammer10.
- For infusjon av en mus, pellet 6 x 10 5 celler i et 1,5 ml rør ved sentrifugering ved 200 x g i5 minutter ved RT og kast supernatanten forsiktig med en pipette uten å forstyrre pelleten. Resuspend cellepelleten med 100 μL 1x PBS.
- Infuser HSPC-ene ved haleveneinjeksjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Plasser den forhåndsbetingede NSG- eller NBSGW-musen i museholderen (se Materialtabell).
- Hold musehalen og skyv forsiktig på pluggen for å holde musen fast. Tørk forsiktig musehalen med 70% etanol. Aspirer 100 μL av cellesuspensjonen i en 31 G insulinsprøyte.
MERK: Unngå bobler i infusjonsproduktet strengt ved å banke forsiktig på sprøyten eller bevege stempelet forsiktig. - Rett lyset fra den infrarøde lampen på halen i 30-40 s, og dekk kroppsområdet på musen med bretter av silkepapir. Stikk forsiktig skrådelen av nålen inn i venstre eller høyre kaudale halevene i en vinkel på 20°.
- Løft halen med venstre pekefinger for å holde den i den plane aksen med sprøyten. Skyv stempelet for å infisere cellesuspensjonen i venen. Påfør forsiktig trykk nær det gjennomborede området med silkepapir og trekk ut nålen.
- Etter 30 s med å bruke forsiktig trykk, fjern musen fra begrensningen og overfør den til buret.
6. Vurdering av kortsiktig engraftmentpotensial
- Etter 4 uker med human HSPC-transplantasjon, vurder kortsiktig engraftment ved å samle blod via orbital venøs sinus i et heparinisert rør ved hjelp av en Pasteur pipette.
- Bedøv dyret med ketamin (90-120 mg/kg) og xylazin (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneal (IP) injeksjon før prøvetaking.
NOTAT: Legg forsiktig press på bakre lemmer av den bedøvede musen for å bekrefte tap av følelse. - Etter bedøvelse, plasser dyret i ventral liggende og forsiktig skrubb musen for å åpne øyet, noe som gjør at øyets klode kan stikke litt ut.
- Sett pasteurpipetten forsiktig inn i øyets mediale canthus under nictating membranen i en 30 ° -45 ° vinkel. Etter å ha plassert Pasteur-pipetten i riktig posisjon, bruk lite trykk på røret og begynn å rotere røret forsiktig.
MERK: Blod vil komme inn i røret ved kapillær virkning så snart retro-orbital plexus er punktert.
- Bedøv dyret med ketamin (90-120 mg/kg) og xylazin (8-12 mg/kg) formulering via intraperitoneal (IP) injeksjon før prøvetaking.
- Etter å ha samlet 50-80 μL perifert blod, trekk forsiktig pipetten ut av øyets mediale canthus.
- For å stoppe blødningen rundt øyets bane, lukk øyelokkene og bruk forsiktig trykk ved hjelp av et stykke gasbind.
- Stain cellene med respektive antistoffer (tabell 8) og inkuber cellene i mørket i 25-30 min ved RT.
- For RBC-lyse, til cellesuspensjonen, tilsett 3 ml 1x RBC-lysebuffer (tabell 7) og inkuber i 10 minutter i is.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved RT og kast supernatanten med en pipette. Gjenta trinn 6.4. til pelletens rødhet forsvinner.
- Tilsett 2 ml 1x PBS og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT for å fjerne celleavfall assosiert med RBC-lyse.
- Tilsett 150 μL 1x PBS til pelleten og fortsett deretter med immunfenotyping for flowcytometri for å evaluere prosentandelen av transplanterte humane celler7.
7. Vurdering av langsiktig engraftmentpotensial
- Avlive musene.
- Ofre de transplanterte musene i uke 16 for engraftmentanalyse ved å introdusere 100% CO 2 kvelning20 inne i museburet i1-2 minutter.
- Bekreft eutanasi ved å fastslå hjerte- og respirasjonsstans og fravær av muskulære bevegelser med forsiktig klemming av bakre lemmer. Hvis begge betingelsene er oppfylt, fjern musene fra buret.
- For å evaluere menneskelig cellekimærisme, samle cellene fra benmarg.
- Isoler celler fra benmargen ved å følge trinnene nedenfor.
- Etter avliving, gjør et vertikalt snitt 1 cm over urinrøret og strekker seg til 1 cm under membranen. Klipp horisontalt i hjørnene av det innskårne området for å åpne bukregionen bredt.
- Disseker lårbenet og tibia og fjern det myke vevet som er festet til lårbenet og tibia ved hjelp av saks. Skrubb forsiktig med silkepapir og lag et lite hull med en diameter ikke høyere enn 0,2 cm i bunnen av et 0,5 ml mikrosentrifugerør ved hjelp av en skalpell.
- Fjern de proksimale endene av beinene ved hjelp av en skalpell og plasser beinene med kuttsiden vendt mot hullet på 0,5 ml mikrosentrifugeringsrøret. Plasser 0,5 ml røret med beinene i 1,5 ml røret som inneholder 100 μL steril 1x PBS.
- Lukk lokket, spinn rørene i 3 minutter ved 1000 x g under sterile forhold ved RT, og kast 0,5 ml rørene som inneholder bein med et tomt marghulrom. Tilsett 1 ml 1x PBS til 1,5 ml reaksjonsrøret som inneholder benmarg, og resuspender cellene forsiktig ca. ikke mindre enn 10x ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Overfør 1 ml av cellesuspensjonen til et 15 ml rør som inneholder 9 ml RBC lysebuffer. Inkuber cellene i is i 7 minutter med forsiktig inversjon av rørene hvert 2. minutt.
- Etter 7 min, sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved RT med en akselerasjon på 9 m/s² og en deacceleration på 7 m/s². Gjenta trinn 7.2.5. inntil en klar, blek hvit pellet observeres.
- Resuspend cellene med 10 ml steril 1x DPBS og filtrer benmargscellesuspensjonen ved hjelp av en 40 μm cellesil på et 15 ml rør. Skyll cellesilen med 2 ml 1x PBS 2x for å unngå tap av celler.
- Sentrifuge i 5 minutter ved 200 x g, RT, og kast supernatanten med en pipette. Resuspend cellene med 10 ml IMDM med DNase-I ved en arbeidskonsentrasjon på 100 μg / ml.
- Ta 1 x 106 mononukleære celler i et FACS-rør for engraftmentanalyse ved flowcytometri. For å vurdere genredigeringsfrekvensen i transplanterte mononukleære celler i benmargen, pellet 1 x 106 mononukleære celler ved 11 000 x g i 5 minutter ved RT og kast supernatanten ved hjelp av en pipette.
8. Immunfenotyping
- Inkuber benmargscellene med 1,5 μL av et renset rekombinant humant Fc-protein (se materialtabell) i 15 minutter ved 4 °C før farging med antistoffer.
MERK: Det humane Fc-proteinet som brukes her er formulert for å blokkere ikke-spesifikk antistofffarging forårsaket av reseptorer for IgG; Dermed øker det spesifisiteten til antistoffmerking 7,21,22. Før antistofffarging av målcellene, utfør antistofftitrering. Det anbefales på det sterkeste å inkludere FMO-kontroller og isotypekontroller mens du arbeider med flerfarget flowcytometrisk analyse. - For å bestemme prosentandelen av human celletransplantasjon ved flowcytometer, ta 1 x 106 mononukleære celler i et FACS-rør og flekker cellene som nevnt i tabell 8.
- Inkuber cellene i mørket i 25-30 min ved RT. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved RT og kast supernatanten med en pipette.
- Skaff cellene ved et flowcytometer, port cellepopulasjonen (P1) ved hjelp av fremover (FSC) og sidespredninger (SSC) av mononukleære celler, og juster spenningen i henhold til cellepopulasjonen. Skaff deg 50 000 cellehendelser i P1-populasjonen.
- For å analysere humane leukocyttpopulasjoner i musebenmarg, gate de humane CD45+ -cellene og musen CD45.1 fra P1-cellepopulasjonen ved hjelp av en programvare for analyse av flowcytometridata (se Materialtabell).
- Beregn engraftment av humane celler ved hjelp av følgende formel8:
% av engraftment = (% hCD45) / (% hCD45 + % mCD45) × 100.
MERK: Terskelen for human engraftment ble ansett å være 0,1 % positiv for CD45. - Videre analyserer du prosentandelen av hCD34+-celler fra humane CD45+-celler for å evaluere de langsiktige repopulasjonscellene. For å vurdere flerlinjet rekonstituering av de transplanterte humane cellene, er det flekk 100 μL cellesuspensjon etter tabell 9.
MERK: Antistoffene må titreres før eksperimenter. - Ved hjelp av flowcytometriprogramvaren kan du portere hCD45 fra P1-cellepopulasjonen og, fra hCD45, kvantifisere prosentandelen av hCD19, hCD3 og hCD13 (lymfoide og myeloide undergrupper).
9. Vurdering av genredigeringsfrekvens i entransplanterte benmargs mononukleære celler
- Til benmargens mononukleære cellepellet, tilsett 50 μL hurtig ekstraktløsning (se materialtabell) for 5 x 105 celler og resuspendere pelleten.
- Inkuber blandingen i en termosyklus ved 68 °C i 30 minutter. Etter en kort sentrifisering inkuberer du blandingen i en termosyklus ved 98 °C i 10 minutter.
- Mål konsentrasjonen av DNA i rålysatet ved hjelp av et spektrofotometer. Følg trinn 4.2.-4.4. å validere genredigeringsfrekvensen ved hjelp av ICE-analyse 8,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien identifiserer ideelle HSPC-kulturforhold som letter oppbevaring av CD34 + CD133 + CD90 + HSC i ex vivo-kultur. For å demonstrere kulturberikelsen av HSC-er sammen med den forbedrede genereringen av genmodifiserte HSC-er, er de optimaliserte prosedyrene for PBMNC-isolasjon, CD34+-cellerensing, kultur, genredigering, transplantasjon, karakterisering av engraftment og genmodifiserte celler in vivo gitt (figur 1). Etter rensing ble det utført flowcytometrievaluering for å kontrollere HSPC-markørene, og HSPC-er ble dyrket i 72 timer. Etter 72 timers kultur ble HSPCene nukleofisert med Cas9 RNP og dyrket i ytterligere 2 dager. De optimaliserte kulturforholdene som inneholdt RUS-cocktailen viste økt levedyktighet og høyere frekvens av CD34+CD133+CD90+ HSC og økt genredigeringsfrekvens (figur 2). For ytterligere å demonstrere at de optimaliserte kulturforholdene øker frekvensen av genmodifiserte celler in vivo, ble dag 3 HSPCer rettet mot CCR5-lokuset genredigert og infundert i sub-dødelig bestrålt NSG-mus. Transplantatet av humane celler i musebeinmarg (BM) ble analysert 16 uker etter infusjon (figur 3A). Flowcytometrianalyse av humane CD45+ (hCD45)-celler i NSG-mus viste økt transplantat i kulturforholdene (figur 3B,C). Analyse av genredigeringsfrekvensen i musens BM-celler viste økt innkapsling av genredigerte HSPCer i RUS-supplerte kulturforhold (figur 3D).
Figur 1: Sammendrag av denne studien. Grafisk sammendrag av prosedyren involvert i isolering av PBMNC, magnetisk anrikning av CD34+ -celler fra PBMNC, dyrking, karakterisering av humane hematopoietiske stamceller og stamceller (HSPC), genredigering og transplantasjon er representert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RUS-cocktailen beriker frekvensen av HSC-er. mPB-HSPCene ble dyrket i stamcellekulturmediene som inneholdt cytokiner med kjøretøy (DMSO) og RUS-cocktail i 3 dager og genredigert med 25 pM Cas9-RNP. De genredigerte cellene ble analysert av FACS for markørene for HSPCs 48 timer etter nukleofeksjon. (A) Strømningsplott representerer populasjonen av levende celler (7AAD-) og CD34+ CD90+. (B) Prosentandelen og frekvensen av indelmønstre analysert 72 timer etter redigering i DMSO- og RUS-behandlet gruppe. (C) Det absolutte antallet CD34+ CD90+-celler analyserte 48 timer etter redigering (n = 2) (donor = 1). (D) Det absolutte antall totale nukleerte celler (TNC) analysert 48 timer etter redigering (n = 2) (donor = 1). Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *p ≤ 0,05 (uparret t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optimaliserte kulturforhold øker frekvensen av genmodifiserte celler in vivo. (A) Skjematisk fremstilling av eksperimentet. (B) Representativt FACS-plott som viser hCD45+-cellene i musens BM. Innfellingen refererer til menneskelige celler (venstre) og museceller (høyre). HSPCs ble dyrket i 3 dager, genredigert med sgRNA på dag 3, og transplantert umiddelbart etter elektroporering. (C) Transplantering av humane celler i mus BM ved 16 uker etter infusjon (n = 4). (D) Den humane genmodifiserte cellen (hCD45+ genredigerte celler) kimærisme i mus BM ved 16 uker etter infusjon (n = 4) (donor = 1). Hver prikk representerer en individuell mus, og datapunktene er fra et individuelt eksperiment. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SEM, *p≤ 0,05 (uparret t-test). Figuren er tilpasset med tillatelse fra Christopher et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antall celler | Buffer for rensing (ml) |
| < 1 x 107 celler | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 celler | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 celler | 1 |
Tabell 1: Volumet av rensebuffer for å forberede den cellulære suspensjonen for CD34+ cellerensing.
| Primer navn | Sekvens |
| CCR5 fremover | CAGAGCCAAGCTCTCCATC |
| CCR5 Omvendt | AGAGACGCAAACACAGCCA |
| CCR5-sekvensering Fremoverprimer | AATGTAGACATCTATGTAGG |
Tabell 2: Primersekvens for forsterkning av CCR5-lokuset.
| Komponenter | 50 μL reaksjon |
| Buffer (5x) | 10 mikroliter |
| Primer fremover (10 μM) | 1 mikroliter |
| Omvendt primer (10 μM) | 1 mikroliter |
| dNTP | 4 mikroliter |
| Polymerase | 1 mikroliter |
| Genomisk DNA | 200 ng |
| Nukleasefritt vann | opptil 50 μL |
Tabell 3: Reaksjonsblandingen for forsterkning av CCR5-lokuset ved bruk av PCR.
| Trinn | Varighet | Temperatur | Ingen av sykluser |
| Innledende denaturering | 1 min | 95 °C | 1 |
| Denaturering | 10 s | 98 °C | 35 |
| Annealing | 15 s | 56 °C | |
| Forlengelse | 30-tallet | 68 °C | |
| Endelig forlengelse | 1 min | 72 °C | 1 |
| Holde | ∞ | 15 °C |
Tabell 4: Termosyklusbetingelser for forsterkning av CCR5-lokuset.
| Komponenter | 10 μL reaksjon |
| Buffer (5x) | 2 mikroliter |
| primer (2 μM) | 1,6 μL |
| RR-blanding | 0,75 mikroliter |
| PCR opprydding produkt | 80 ng |
| Nukleasefritt vann | opptil 10 μL |
Tabell 5: Reaksjonsblandingen for Sanger-sekvensering PCR.
| Trinn | Varighet | Temperatur | Ingen av sykluser |
| Denaturering | 15 s | 96 °C | 27 |
| Annealing | 20-tallet | 55 °C | |
| Forlengelse | 4 minutter | 60 °C | |
| Holde | ∞ | 15 °C |
Tabell 6: Termosyklusbetingelser for Sanger-sekvensering PCR.
| Buffer | Komposisjon |
| 10x RBC lysis buffer - 100 ml (pH - 7,3) | 8,26 g NH4Cl, 1,19 g NaHCO3, 200 μL EDTA (0,5 M, pH8) |
| 50x TAE-buffer (pH – 8,3) | Løs opp 50 mM EDTA natriumsalt, 2 M Tris, 1 M iseddik i 1 liter vann |
Tabell 7: Buffersammensetninger
| Antistoffer | Volum |
| Anti-human CD45 APC | 3 mikroliter |
| Anti-mus CD45.1 PerCP-Cy5 | 4,5 mikroliter |
| Anti-mus CD34 PE | 3 mikroliter |
Tabell 8: Antistoffer brukt til å vurdere human celletransplantasjon.
| Antistoffer | Volum |
| Anti-human CD45 APC | 3 mikroliter |
| Anti-mus CD19 PerCP | 15 mikroliter |
| Anti-mus CD13 PE | 15 mikroliter |
| Anti-mus CD3 PE-Cy7 | 2 mikroliter |
Tabell 9: Antistoffer brukt til å vurdere andelen flerlinjeceller avledet fra transplanterte HSPCer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vellykkede resultatet av HSPC-genterapi er hovedsakelig avhengig av kvaliteten og mengden av implanterbare HSC-er i transplantatet. Imidlertid påvirkes de funksjonelle egenskapene til HSC sterkt i den forberedende fasen av genterapiprodukter, inkludert ved in vitro-kultur og toksisitet forbundet med genmanipuleringsprosedyren. For å overvinne disse begrensningene har vi identifisert ideelle HSPC-kulturforhold som beholder stammen til CD34 + CD133 + CD90 + HSC i ex vivo-kultur. Mange forskningsgrupper har brukt SR1 eller UM171 eller andre molekyler som frittstående molekyler for å utvide navlestrengsblod (UCB) HSPCs in vitro23,24. En tidligere studie brukte en kombinasjon av både SR1 og UM17125. De små molekylene og cytokinene i kulturmediet ble spesielt optimalisert for mobiliserte voksne HSPCer og deres anvendelse i autolog genterapi. Screeningeksperimentet viste at kombinasjon av tre små molekyler Resveratrol, UM729 og SR1, er viktig for å generere et høyt antall CD34 + CD90+ celler og hemme spredning av differensierte og engasjerte stamceller. UM729 i RUS-cocktailen kan erstattes med UM171. Den kommersielle anskaffelsen av UM171 er imidlertid mindre gjennomførbar. Cytokinkonsentrasjonene er hentet fra protokollen som ble brukt i kliniske studier26 for å redusere variabilitetene under oppskaleringsprosessen. Cytokincocktailen inneholder IL6 i stedet for IL3 for å minimere progenitorproliferasjon og HSC-utmattelse in vitro27. Tilberedning av ferske aliquots av kulturmediet (basalmedier + RUS + cytokincocktails) anbefales for å redusere eksperimentell variasjon og oppnå høy reproduserbarhet. Protokollen gjelder for både NHEJ- og HDR-mediert genredigering. Spesielt er HSPC-kultur på 48-72 timer før elektroporering og 24 timer etter elektroporering avgjørende for HDR-genredigering. De optimaliserte kulturforholdene bør være til nytte for HDR-genredigering ved å bevare stamcellene. Det ble også observert at kulturforholdene hjelper lentiviral transduksjon i langsiktige HSC. Dette antyder at hvis viruspartikler som AAV6 eller IDLV brukes som HDR-donor, forventes HDR-redigeringseffektiviteten å bli bedre, ettersom de optimaliserte kulturforholdene fremmer donorlevering til HSC-er.
For å vurdere genredigeringsresultater, inkludert NHEJ og HDR, foreslås NGS-analyse, sonde- eller ddPCR-analyse, eller Sanger-sekvensering, 7,8,28, etterfulgt av dekonvolusjon ved hjelp av elektroniske verktøy (ICE / ICE Knock-In) 16, på grunn av sin robuste kvantitative natur. Alternativt kan en T7-endonukleaseanalyse utføres på redigerte DNA-prøver, og de fragmenterte DNA-båndene kan kvantifiseres ved hjelp av ImageJ. Imidlertid er T7 endonuklease-analysemetoden mindre presis enn dekonvolusjonsanalyse og retter seg mot neste generasjons sekvensering.
Transplantasjonsprotokollen er også optimalisert ved å kondisjonere NBSGW-musene med busulfan, slik at lave celledoser kan vurdere HSPC-engraftment og repopulasjon. Samlet sett må denne prosedyren redusere dosene av HSPC-er som kreves for genmanipulering og øke tilgjengeligheten av HSPC-genterapi i utviklingsland.
I denne studien ble protokollene for PBMNC-isolasjon, CD34+ HSPC-rensing, genredigering og validering og vurdering av de transplanterte genredigerte HSPC-ene i musebeinmarg vist. Det har også vist seg at den optimaliserte HSPC-kulturen beriker CD34 + CD133 + CD90 + HSPCs og øker kimerismen til genredigerte celler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke eksisterer konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne personalet på flowcytometrianlegget og dyreanlegget til CSCR. A. C. er finansiert av et ICMR-SRF-fellesskap, K. V. K. er finansiert av et DST-INSPIRE-fellesskap, og PB er finansiert av et CSIR-JRF-fellesskap. Dette arbeidet ble finansiert av Department of Biotechnology, Government of India (grant no. BT/PR26901/MED/31/377/2017 og BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
References
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F.
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V.
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
