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Neuroscience

एमआरआई, ऊतक समाशोधन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क एकल-कोशिका इमेजिंग और बरकरार नवजात माउस दिमाग का विश्लेषण

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल आईडीआईएससीओ + का उपयोग करके बरकरार माउस दिमाग के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग के संचालन के तरीकों का वर्णन करता है, इसके बाद लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेजिंग का विस्तृत विवरण और न्यूमोर्फ का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करता है।

Abstract

लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के बाद ऊतक समाशोधन बरकरार मस्तिष्क संरचना के सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे आनुवंशिक या पर्यावरणीय गड़बड़ी के कारण संरचनात्मक परिवर्तनों के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है। पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की अधिक सटीक मात्रा और क्षेत्र-विशिष्ट मतभेदों का अध्ययन होता है जो शारीरिक रूप से विभाजित ऊतक के आमतौर पर उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी के साथ याद किया जा सकता है। साफ़ किए गए दिमाग की छवि के लिए लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिग्रहण की गति बहुत बढ़ जाती है। यद्यपि ये छवियां बहुत बड़ी मात्रा में मस्तिष्क संरचनात्मक डेटा का उत्पादन करती हैं, अधिकांश कम्प्यूटेशनल उपकरण जो साफ ऊतक की छवियों में सुविधा परिमाणीकरण करते हैं, सभी नाभिकों के बजाय विरल सेल आबादी की गिनती तक सीमित हैं।

यहां, हम न्यूमोर्फ (परमाणु-आधारित मॉर्फोमेट्री), विश्लेषण उपकरणों का एक समूह प्रदर्शित करते हैं, जो एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप पर समाशोधन और इमेजिंग के बाद प्रसवोत्तर दिन 4 (पी 4) माउस मस्तिष्क के एनोटेट क्षेत्रों के भीतर सभी नाभिक और परमाणु मार्करों को निर्धारित करने के लिए है। हम चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का वर्णन ऊतक समाशोधन निर्जलीकरण चरणों के कारण होने वाले संकोचन से पहले मस्तिष्क की मात्रा को मापने के लिए करते हैं, इम्यूनोलेबलिंग सहित आईडीआईएससीओ + विधि का उपयोग करके ऊतक समाशोधन, इसके बाद सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर माउस दिमाग की छवि बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मंच का उपयोग करके लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं। फिर हम न्यूमोर्फ का उपयोग करके इस छवि विश्लेषण पाइपलाइन का प्रदर्शन करते हैं, जिसका उपयोग तीव्रता अंतर को ठीक करने, छवि टाइलों को सिलाई करने, कई चैनलों को संरेखित करने, नाभिक की गणना करने और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एटलस में पंजीकरण के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों को एनोटेट करने के लिए किया जाता है।

हमने सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इस दृष्टिकोण को डिजाइन किया, जिससे किसी भी शोधकर्ता को इन तकनीकों को करने के लिए आवश्यक माइक्रोस्कोप और कम्प्यूटेशनल संसाधनों की अनुमति मिली। ये ऊतक समाशोधन, इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल उपकरण कॉर्टेक्स में सेल-प्रकारों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन के माप और परिमाणीकरण की अनुमति देते हैं और किसी भी जंगली-प्रकार / नॉकआउट माउस अध्ययन डिजाइन पर व्यापक रूप से लागू होना चाहिए।

Introduction

एकल-कोशिका संकल्प पर पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन मस्तिष्क छवियां मस्तिष्क सर्किटरी के विस्तृत विश्लेषण और सिस्टम-स्तरीय मानचित्रण की अनुमति देती हैं और न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों, विकासशील भ्रूण में सेलुलर व्यवहार, साथ ही वयस्क मस्तिष्क में तंत्रिका सर्किट के लिए आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोखिम कारकों द्वारा सर्किटरीकैसे बाधित होती है। कई हिस्टोलॉजिकल विधियां हैं जो पुनर्निर्मित 3 डी मस्तिष्क की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की अनुमति देती हैं; हालांकि, इन तकनीकों को महंगे, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, इम्यूनोलेबलिंग के साथ संगत नहीं हो सकते हैं, और कुछ तरीकों की दो-आयामी (2 डी) प्रकृति से सेक्शनिंग 4,5 के दौरान ऊतक क्षति और कतरन हो सकता है।

हाल की प्रगति ने पूरे दिमाग की इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान किया है जिसे ऊतक सेक्शनिंग की आवश्यकता नहीं है; वे दिमाग को पारदर्शी बनाने के लिए ऊतक समाशोधन का उपयोग करना शामिल करते हैं। लिपिड को हटाकर अधिकांश ऊतक समाशोधन विधियों में पारदर्शिता प्राप्त की जाती है, क्योंकि वे प्रकाश प्रकीर्णन का एक प्रमुख स्रोत हैं, और इमेजिंग के दौरान नमूना विसर्जन समाधान के आरआई के साथ वस्तु के अपवर्तक सूचकांक (आरआई) का मिलान करते हैं। प्रकाश तब बिखरे हुए 6,7,8,9 के बिना सामग्री के बीच की सीमा से गुजर सकता है।

ऊतक समाशोधन विधियों, जैसे कि आईडीआईएससीओ +, को अक्सर एकल-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके तेजी से 3 डी इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, जैसे कि एलएसएफएम 6,7,10। फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए पारदर्शी ऊतकों के भीतर, प्रकाश-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रकाश 11 के पतले विमान के साथ उत्तेजना द्वारा वर्गों कोचित्रित करती है। एलएसएफएम का मुख्य लाभ यह है कि एक एकल ऑप्टिकल खंड एक समय में रोशन होता है, जिसमें उस खंड के भीतर अणुओं से सभी प्रतिदीप्ति उत्तेजित होती है, जो फोटोब्लीचिंग को कम करती है। इसके अलावा, एक पूरे ऑप्टिकल स्लाइस की इमेजिंग उस उत्तेजित स्लाइस का कैमरा-आधारित पता लगाने में सक्षम बनाती है, जिससे पॉइंट स्कैनिंग12 के सापेक्ष गति बढ़ जाती है। एलएसएफएम गैर-विनाशकारी रूप से अच्छी तरह से पंजीकृत ऑप्टिकल वर्गों का उत्पादन करता है जो 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयुक्त हैं।

जबकि आईडीआईएससीओ + विधि ~ 3 सप्ताह के भीतर सस्ती ऊतक समाशोधन की अनुमति देती है, प्रोटोकॉल के भीतर निर्जलीकरण चरणों से ऊतक संकोचन और नमूना आकृति विज्ञान का संभावित परिवर्तन हो सकता है, इस प्रकार वॉल्यूमेट्रिक माप 6,10 को प्रभावित कर सकता है। ऊतक समाशोधन प्रक्रिया से पहले उपयोग की जाने वाली एमआरआई जैसी द्वितीयक इमेजिंग विधि को जोड़ना नमूने में ऊतक समाशोधन-प्रेरित संकोचन की डिग्री को माप सकता है। निर्जलीकरण चरणों के दौरान, ग्रे और सफेद पदार्थ के बीच यांत्रिक गुणों में अंतर से गैर-समान मस्तिष्क पदार्थ विरूपण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती नमूनों के बीच असमान ऊतक समाशोधन-प्रेरित मात्रा विरूपण हो सकता है और इन नमूनों में वॉल्यूमेट्रिक अंतर की व्याख्या को भ्रमित कर सकताहै 10,13 . एमआरआई पहले जानवर को एक कंट्रास्ट एजेंट (जैसे, गैडोलीनियम) के साथ जोड़कर किया जाता है, इसके बाद इमेजिंग14 से पहले विसर्जन समाधान (जैसे, फोम्ब्लिन) में रुचि के निकाले गए ऊतक को इंजेक्ट किया जाता है। एमआरआई ऊतक समाशोधन और एक ही नमूने पर एलएसएफएम करने के साथ संगत है।

एलएसएफएम का उपयोग अक्सर मस्तिष्क संरचना के मात्रात्मक मूल्यांकन के बजाय रुचि के मस्तिष्क ऊतक के गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बड़े पैमाने पर माइक्रोस्कोपी छवियां बनाने के लिए किया जाता है (चित्रा 1)। मात्रात्मक मूल्यांकन के बिना, आनुवंशिक या पर्यावरणीय अपमान के परिणामस्वरूप संरचनात्मक अंतर प्रदर्शित करना मुश्किल है। चूंकि ऊतक-समाशोधन और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में सुधार होता है, भंडारण और कंप्यूटिंग शक्ति की लागत में कमी के साथ, रुचि के ऊतक के भीतर सेल प्रकार के स्थानीयकरण की मात्रा निर्धारित करना अधिक सुलभ होता जा रहा है, जिससे अधिक शोधकर्ता इन आंकड़ों को अपने अध्ययन में शामिल कर सकते हैं।

माउस मस्तिष्क15 और पूरे मस्तिष्क इमेजिंग सत्रों में 100 मिलियन से अधिक कोशिकाओं के साथ जो डेटा के टेराबाइट उत्पन्न कर सकते हैं, उन्नत छवि विश्लेषण उपकरणों की मांग बढ़ जाती है जो छवियों के भीतर सुविधाओं की सटीक मात्रा की अनुमति देते हैं, जैसे कि कोशिकाएं। ऊतक-साफ़ छवियों के लिए विभाजन विधियों की एक मेजबानी मौजूद है जो परमाणु धुंधला तीव्रता के लिए दहलीज लागू करती है और पूर्वनिर्धारित आकृतियों, आकारों या घनत्व10,16,17,18 के साथ वस्तुओं को फ़िल्टर करती है। हालांकि, परिणामों की गलत व्याख्या सेल आकार, छवि कंट्रास्ट और लेबलिंग तीव्रता जैसे मापदंडों में भिन्नता से उत्पन्न हो सकती है। यह पेपर माउस मस्तिष्क में सेल नाभिक को निर्धारित करने के लिए हमारे स्थापित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। सबसे पहले, हम पी 4 माउस मस्तिष्क के ऊतक संग्रह के लिए चरणों का विस्तार करते हैं, इसके बाद सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आईडीआईएससीओ + विधि10 से अनुकूलित ऊतक समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल। दूसरा, हम एमआरआई और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि अधिग्रहण का वर्णन करते हैं, जिसमें छवियों को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर शामिल हैं। अंत में, हम न्यूमोर्फ19 का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, हमारे समूह द्वारा विकसित छवि विश्लेषण उपकरणों का एक सेट जो ऊतक समाशोधन, परमाणु मार्करों के साथ इम्यूनोलेबलिंग और एनोटेटेड क्षेत्रों की लाइट-शीट इमेजिंग के बाद सेल-प्रकार विशिष्ट परिमाणीकरण की अनुमति देता है।

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Protocol

सभी चूहों का उपयोग चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार और अनुमोदित किया गया था।

1. माउस विच्छेदन और छिड़काव

नोट: सिरिंज का उपयोग करके पी 4 और पी 14 चूहों पर निम्नलिखित विच्छेदन किए गए थे। छिड़काव द्रव की मात्रा जानवर की उम्र के आधार पर अलग-अलग होगी।

  1. छिड़काव
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) एक खतरनाक रसायन है। एक रासायनिक फ्यूम हुड में सभी छिड़काव चरणों का प्रदर्शन करें।
    1. सर्जरी से पहले, इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (100 मिलीग्राम / किग्रा) के माध्यम से पेंटोबार्बिटल का प्रशासन करें और एनेस्थेटिक को प्रभावी होने की अनुमति दें।
    2. एक बार जब जानवर संज्ञाहरण के सर्जिकल प्लेन तक पहुंच जाता है, तो अनुक्रियाशीलता की पुष्टि करने के लिए पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया विधि का उपयोग करें।
    3. जानवर के वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए पसली पिंजरे के नीचे एक पार्श्व चीरा लगाएं।
    4. घुमावदार, सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक पसली के पिंजरे के माध्यम से जानवर के एक तरफ कॉलरबोन तक काटें और विपरीत तरफ एक समान कट बनाएं, जिससे उरोस्थि को दूर उठाया जा सके, जिससे दिल को उजागर किया जा सके।
    5. अवरोही महाधमनी को नुकसान पहुंचाए बिना, दाहिने आलिंद पर एक छोटा सा चीरा लगाने से पहले दिल से जुड़े किसी भी ऊतक को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें ताकि रक्त वाहिका से बाहर निकल सके।
    6. एक सिरिंज-आधारित विधि का उपयोग करके, सिस्टम के माध्यम से 1.5 एमएल / मिनट की छिड़काव दर के साथ क्रमशः पी 14 और पी 4 के लिए 10 एमएल और 7 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से माउस को इंजेक्ट करें।
    7. एक बार रक्त साफ हो जाने के बाद, जानवर को ठीक करने के लिए 1.5 एमएल / मिनट की छिड़काव दर के साथ क्रमशः पीबीएस + 4% पीएफए के 10 एमएल + 4% पीएफए और पीबीएस + पीबीएस के 7 एमएल + 4% पीएफए के साथ फिर से छिड़काव करें।
      नोट: निर्धारण झटके देखे जाएंगे, और पूरा होने पर जानवर कठोर होगा। यदि नमूनों पर एमआरआई का उपयोग किया जाता है, तो पीएफए समाधान में प्रत्येक टाइमपॉइंट + 20% गैडोलिनियम-आधारित एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट के लिए पीबीएस और पीएफए की समान मात्रा के साथ अध्ययन करें।
    8. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके सिर को हटा दें और पूर्ण निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए पीबीएस + 4% पीएफए के साथ ड्रॉप-फिक्स करें।
      नोट: इस स्तर पर, मस्तिष्क खोपड़ी के साथ बरकरार रहता है (अनुभाग 2 देखें)। विराम बिंदु: मस्तिष्क को इस स्तर पर कई महीनों तक पीबीएस + 0.1% सोडियम एज़ाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. बरकरार खोपड़ी और विश्लेषण के साथ एमआर-आधारित सकल मस्तिष्क संरचना इमेजिंग

नोट: मस्तिष्क को खोपड़ी से हटाए बिना ऊपर वर्णित गैडोलिनियम में संक्रमित और इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। विच्छेदन के दौरान अनपेक्षित ऊतक हानि से बचने के लिए खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने से पहले सभी एमआरआई होते हैं। एक बरकरार खोपड़ी के साथ इमेजिंग नमूना तैयार करने और इमेजिंग के दौरान नमूना धारक (यानी, सिरिंज) में मस्तिष्क को समर्थन भी प्रदान करता है।

  1. नमूना तैयार करना
    नोट: निम्न चरण P4 और P14 माउस मस्तिष्क नमूने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। आवश्यक सिरिंज आकार नमूने के भौतिक आकार पर निर्भर करेगा।
    1. यदि नमूने पर एमआरआई कर रहे हैं, तो खोपड़ी से त्वचा को हटा दें और इमेजिंग14 से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 23 दिनों के लिए पीबीएस + 3% गैडोलिनियम में इनक्यूबेट करें। 23 दिनों के बाद, पीबीएस में नमूने को जल्दी से धो लें।
    2. एमआरआई के लिए नमूना धारक बनाने के लिए 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें, सिरिंज पिस्टन का उपयोग करके सिरिंज20 के साथ बनाए गए धारक के प्रत्येक छोर को बंद करें। धारक में खोपड़ी को कसकर पकड़ने के लिए प्लास्टिक के टुकड़ों का उपयोग करें (चित्रा 2 ए)। इमेजिंग पर कलाकृतियों को रोकने के लिए इथेनॉल के साथ सिरिंज पर निशान हटा दें।
    3. खोपड़ी को सुरक्षित रूप से नमूना धारक में रखें और एमआरआई के साथ संगत विसर्जन समाधान से भरें ( सामग्री की तालिका देखें)। धारक को बंद करें और सिरिंज का उपयोग करके सभी हवा के बुलबुले को हटा दें।
      नोट: विराम बिंदु: खोपड़ी को इमेजिंग से पहले कई महीनों तक विसर्जन समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सकल मस्तिष्क संरचना इमेजिंग (एमआरआई)
    1. नमूनों को 9.4T/30 सेमी क्षैतिज-बोर, 15 मिमी वॉल्यूम कॉइल का उपयोग करके पशु एमआरआई प्रणाली और निम्नलिखित मापदंडों के साथ स्पिन-इको-आधारित अनुक्रम के साथ चित्रित करें: स्थानिक संकल्प: 60 μm x 60 μm; कुल स्कैन समय: 7 घंटे 12 मिनट; प्रतिध्वनि का समय (टीई): 6.83 एमएस; पुनरावृत्ति समय (टीआर): 40 एमएस; उत्तेजना / पुन: ध्यान केंद्रित करने वाले फ्लिप कोण: 90/180 डिग्री; छवि का आकार: 166 x 168 x 209 voxels; क्षेत्र (एफओवी): 9.9 मिमी x 10.1 मिमी x 12.4 मिमी; बैंडविड्थ: 100,000 kHz.
  3. कम्प्यूटेशनल सकल मस्तिष्क संरचना विश्लेषण
    1. विभाजन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके माउस मस्तिष्क को मैन्युअल रूप से ट्रेस करके कच्चे एमआरआई छवियों से आसपास की खोपड़ी को हटा दें। इसके बाद, खोपड़ी-छीन मस्तिष्क एमआरआई छवि उत्पन्न करने के लिए मास्क छवि और कच्चे एमआरआई छवि के बीच वोक्सेल-वार गुणन ऑपरेशन लागू करें।
      नोट: आउटपुट एक द्विआधारी मुखौटा छवि है जहां मस्तिष्क वोक्सल्स के लिए तीव्रता 1 और 0 पर सेट की जाती है।
    2. खोपड़ी-छीनी गई एमआरआई छवि (चलती छवि) को संबंधित प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी छवि (संदर्भ छवि) से संरेखित करने के लिए एफएसएल पैकेज21,22 में 'फ्लर्ट' का उपयोग करके कठोर छवि पंजीकरण (केवल अनुवाद और रोटेशन का अनुमान) लागू करें।
    3. चरण2.3.2 में कठोर-संरेखित एमआरआई छवि के बीच प्रकाश-शीट छवि (चरण 2.3.2 में एक ही संदर्भ छवि) के बीच बिंदु-से-बिंदु पत्राचार खोजने के लिए गैर-कठोर पंजीकरण (ANTS सॉफ्टवेयर 23 में 'SyN' का उपयोग करके) लागू करें।
      नोट: आउटपुट में विकृत एमआरआई छवि और वॉल्यूम परिवर्तन से जुड़े विरूपण क्षेत्र शामिल हैं जो एमआरआई से प्रकाश-शीट छवियों में बदलते हैं।
    4. चरण 2.3.3 में उत्पन्न विरूपण क्षेत्र पर जैकोबियन निर्धारक की गणना करें, जो 3 x 3 x 3 वोक्सेल स्थानीय पड़ोस में आयतन परिवर्तन को निर्धारित करता है।
    5. विकृत छवि पंजीकरण का उपयोग करके एलन डेवलपमेंटल माउस ब्रेन एटलस में खोपड़ी-छीनी गई छवियों को संरेखित करें।
      नोट: स्थापित स्थानिक बिंदु-से-बिंदु पत्राचार नई माउस छवि (चित्रा 2 सी-एच) में रुचि के मस्तिष्क क्षेत्रों के स्वचालित एनोटेशन की अनुमति देता है।

3. खोपड़ी से मस्तिष्क विच्छेदन

  1. खोपड़ी को उजागर करने के लिए गर्दन से नाक तक खोपड़ी के शीर्ष के साथ एक मध्य रेखा चीरा लगाएं।
  2. शेष गर्दन की मांसपेशियों और अन्य सभी अवशिष्ट मांसपेशियों को ट्रिम करके खोपड़ी के आधार को उजागर करें।
  3. तेज सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी की आंतरिक सतह के साथ सावधानीपूर्वक काटा जाता है, इस बात का ध्यान रखा जाता है कि तेज सर्जिकल उपकरणों के साथ काटते समय कोमल ऊपर की ओर दबाव बनाए रखकर मस्तिष्क को नुकसान न पहुंचे।
  4. मस्तिष्क से खोपड़ी के दो कटे हुए हिस्सों को छीलने के लिए चिमटी का उपयोग करें और मस्तिष्क से जुड़े अतिरिक्त वसा को सावधानीपूर्वक काट दें।
  5. मस्तिष्क को खोपड़ी से जोड़ने वाले किसी भी ड्यूरा को ट्रिम करने के लिए एक सर्जिकल कैंची का उपयोग करें, और फिर मस्तिष्क को सिर से धीरे से हटाने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें।
  6. मस्तिष्क को हटा दें, पीबीएस के साथ धो लें, और फिर 0.1% सोडियम एज़ाइड के साथ पीबीएस में स्वैप करें और दीर्घकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

4. ऊतक समाशोधन

नोट: यह प्रोटोकॉल मामूली परिवर्तनों के साथ पी 4 चूहों6 के लिए आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल से अनुकूलित है। कुछ विवरण अलग-अलग समय बिंदुओं / प्रजातियों / प्रयोगों के लिए बदल सकते हैं)। चेतावनी: मेथनॉल, डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम), और डिबेंजिल ईथर (डीबीई) खतरनाक रसायन हैं। ये ऊतक समाशोधन चरण एक रासायनिक फ्यूम हुड में किए जाते हैं।

  1. एंटीबॉडी सत्यापन
    नोट: अप्रमाणित एंटीबॉडी की मेथनॉल संगतता की जांच करने की आवश्यकता है क्योंकि वे आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल में आवश्यक कठोर मेथनॉल वॉश से नकारात्मक रूप से प्रभावित हो सकते हैं। एंटीबॉडी की एक सूची के लिए जिन्हें आईडीआईएससीओ + में काम करने के लिए दिखाया गया है, वेबसाइट24 देखें।
    1. टीरियोलॉजिकल स्लाइड्स पर पीएफए-फिक्स्ड ऊतक के 10 μm जमे हुए खंडों की कटाई करें।
    2. कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    3. मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले पीबीएस में रिहाइड्रेट यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एंटीबॉडी मेथनॉल वॉश के बाद फ्लोरेसेंस के अपेक्षित पैटर्न को दर्शाता है। सकारात्मक नियंत्रण के लिए, मेथनॉल के साथ इलाज नहीं की जाने वाली स्लाइड का उपयोग करें।
  2. बफर तैयारी
    1. आधिकारिक आईडीआईएससीओ प्रोटोकॉल के अनुसार बफर तैयार करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर और अन्य समाधानों की संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  3. प्रथागत
    1. पीबीएस श्रृंखला के साथ नमूने को निर्जलित करें: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; कमरे के तापमान पर प्रत्येक 1 घंटे।
      ध्यान दें: निर्जलीकरण के दौरान पीबीएस का उपयोग मेथनॉल वॉश में नमूनों की दरार को रोकने में मदद करता है।
    2. नमूने को 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में धो लें, और फिर कमरे के तापमान पर 66% डीसीएम / 33% मेथनॉल में झटकों के साथ रात भर इनक्यूबेट करने से पहले 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
    3. कमरे के तापमान पर 100% मेथनॉल में नमूना 2x धोएं, और फिर इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने को ब्लीच करने के लिए मेथनॉल में ताजा 5% एच2 ओ 2 का उपयोग करें।
    5. पीबीएस श्रृंखला के साथ नमूने को फिर से हाइड्रेट करें: 80%, 60%, 40%, 20%, पीबीएस; कमरे के तापमान पर प्रत्येक 1 घंटे और कमरे के तापमान पर PTx.2 में 1 घंटे के लिए 2x धोएं।
    6. नमूने को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO में इनक्यूबेट करें।
    7. नमूने को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS/0.1% ट्वीन-20/0.1% TritonX-100/0.1% Deoxycholate/0.1% NP40/20% DMSO में इनक्यूबेट करें।
    8. PTx.2 में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए दो बार धोएं।
  4. इम्यूनोलेबलिंग
    1. 2 दिनों (~ 48 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर परमेबिलाइजेशन समाधान में नमूने इनक्यूबेट करें।
    2. ब्लॉकिंग समाधान में नमूने को 2 दिनों (~ 48 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक करें।
    3. 4 दिनों (~ 96 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीटीडब्ल्यूएच / 5% डीएमएसओ / 3% सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, खरगोश (आरबी) बीएन 2 / पीओयू 3 एफ 2 एमएबी (1: 100) और एंटी-सीटीआईपी 2 चूहा (आरटी) एंटीबॉडी (1: 400) (सामग्री की तालिका)।
    4. PTwH में 3 x 1 घंटे धो लें। PTwH में एक और 2 घंटे के लिए धो लें। कमरे के तापमान पर रात भर धोने के घोल में छोड़ दें।
    5. द्वितीयक एंटीबॉडी और परमाणु डाई, जैसे कि टीओ-प्रो -3, 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें (~ 96 घंटे; उदाहरण के लिए, बकरी एंटी-आरबी (1: 50) और (बकरी एंटी-आरटी (1: 200)) (सामग्री की तालिका)।
    6. PTwH में 3 x 1 घंटे धोएं और PTwH में एक और 2 घंटे के लिए धो लें। कमरे के तापमान पर रात भर धोने के घोल में छोड़ दें।
  5. समाशोधन
    1. पीबीएस श्रृंखला में निर्जलित - कमरे के तापमान पर 20%, 40%, 60%, 80%, 100% -1 घंटे। कमरे के तापमान पर 66% डीसीएम / 33% मेथनॉल में, झटकों के साथ 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: नमूना 100% मेथनॉल में निर्जलीकरण के तुरंत बाद कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ा जा सकता है।
    2. एमईओएच को धोने के लिए कमरे के तापमान पर दो बार (झटकों के साथ) 15 मिनट के लिए 100% डीसीएम में इनक्यूबेट करें।
    3. कमरे के तापमान पर हिलाए बिना डिबेंजाइल ईथर (डीबीई) में इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि नमूने के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए ट्यूब लगभग पूरी तरह से डीबीई से भरा हुआ है। इमेजिंग से पहले कुछ बार इनवर्ट करके घोल को मिलाना समाप्त करें।

5. लाइट-शीट इमेजिंग

नोट: आईडीआईएससीओ ऊतक-साफ़ किए गए दिमाग को एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था, जो 2X/0.5 NA उद्देश्य, एक पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक कैमरा, और P4 टाइमपॉइंट के लिए 0.75 x 0.75 x 4 μm/ voxel पर माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस था क्योंकि इसने कॉर्टेक्स के भीतर एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन की अनुमति दी थी (चित्रा 3 ए, बी)।

  1. नमूना माउंटिंग
    1. नमूने को सही नमूना आकार धारक में सावधानीपूर्वक माउंट करें ताकि नमूना प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप (5.7 मिमी माइनस 0.5 मिमी सुरक्षा मार्जिन) 25 की रेटेड कार्य दूरी के कारण जेड-आयाम गहराई में 5.2 मिमी से अधिक नहीं है।
    2. नमूना पालने में धारक को 45° कोण पर धारक के पेंच के साथ पालना समर्थन (चित्रा 1 बी) पर रखें। पालने को रखें ताकि प्रकाश पथ नमूने के लंबवत हो (चित्रा 1 सी)।
  2. इमेजिंग पैरामीटर
    1. माइक्रोस्कोप पर ज़ूम बॉडी को 4x आवर्धन या 0.75 μm / पिक्सेल पर सेट करें।
      नोट: पी 4 लाइट-शीट छवियों पर एकल-सेल कम्प्यूटेशनल विश्लेषण किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है जो 0.75 x 0.75 x 4 μm / voxel या उच्चतर के रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है। बाद के समय बिंदुओं पर दिमाग के लिए एक कम रिज़ॉल्यूशन पर्याप्त है जिसमें नाभिक अधिक विरल रूप से वितरित होते हैं।
    2. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, NA = ~ 0.08 (9 μm मोटाई/ 4 μm z step) के साथ एक एकल प्रकाश-शीट का चयन करें।
      नोट: क्षैतिज गतिशील फोकसिंग के साथ संयुक्त यह सेटिंग उचित समय के भीतर माउस मस्तिष्क के एकल-कोशिका संकल्प पर पूरे मस्तिष्क इमेजिंग की अनुमति देती है। प्रसवोत्तर दिन 4 (पी 4) मस्तिष्क के लिए, मस्तिष्क के आकार के आधार पर तीन चैनलों के लिए छवि अधिग्रहण का समय 11-15 घंटे होने का अनुमान है।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवि की चौड़ाई के साथ अक्षीय रिज़ॉल्यूशन बनाए रखा गया है, क्षैतिज गतिशील फोकसिंग का चयन करें और लेजर तरंग दैर्ध्य के आधार पर चरणों की अनुशंसित संख्या लागू करें। पूरे पी 4 माउस मस्तिष्क के लिए, क्षैतिज गतिशील फोकस को 11 पर सेट करें। पंजीकरण चैनल के संबंध में प्रत्येक चैनल के लिए फाइन फोकस समायोजित करें।
      नोट: यहां, TO-PRO-3 चैनल (647 nm) एलन डेवलपमेंटल माउस ब्रेन एटलस में पंजीकृत है क्योंकि यह सभी नाभिकों को लेबल करता है।
    4. चैनल गुणों के संबंध में प्रति चैनल लेजर पावर समायोजित करें।
      नोट: लंबी तरंग दैर्ध्य को कम तरंग दैर्ध्य की तुलना में उच्च लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, 780 एनएम को उच्च लेजर पावर (70% - 75%) और कम एक्सपोजर (50 एमएस) पर चित्रित करने की आवश्यकता होती है, जबकि 647 एनएम चैनल को औसत लेजर पावर (40% - 45%) और कम एक्सपोजर (50 एमएस) की आवश्यकता होती है।
    5. यह सुनिश्चित करने के लिए कि शीट पावर इस नमूना आकार के लिए वाई आयाम में बेहतर रूप से वितरित की जाती है, लाइट-शीट चौड़ाई को ~ 50% तक समायोजित करें।
      नोट: क्षैतिज गतिशील फोकसिंग के साथ संयोजन में, 50% शीट चौड़ाई फोटोब्लीचिंग25 के कम जोखिम के साथ छवि में शक्ति का औसत वितरण प्रदान करती है।
    6. टाइलों के बीच 15% के अनुशंसित ओवरलैप के साथ नमूने के आकार के संबंध में टाइलों की संख्या सेट करें, और किसी दिए गए टाइल की स्थिति में प्रत्येक स्टैक के लिए क्रमिक रूप से प्रत्येक चैनल के लिए छवियों को कैप्चर करें।

6. न्यूमोर्फ का उपयोग कर छवि प्रसंस्करण

नोट: न्यूमोर्फ पाइपलाइन में 3 डी छवि विश्लेषण के लिए तीन मुख्य भाग हैं: प्रीप्रोसेसिंग, विश्लेषण और मूल्यांकन। इन भागों को क्रमशः NMp_template बजे, NMa_template बजे और NMe_template बजे में व्यवस्थित किया गया है, जिनकी चर्चा नीचे की गई है। इसके अतिरिक्त, nuMorph को सुचारू रूप से चलाने के लिए आवश्यक सॉफ़्टवेयर पैकेज डाउनलोड और इंस्टॉल करने के लिए NM_setup.m जोड़ा जाता है। NM_samples.एम छवि अधिग्रहण जानकारी इनपुट करने के लिए एक टेम्पलेट भी प्रदान करता है।

  1. NuMorph सेटअप
    1. डाउनलोड करें और लिनक्स26 के लिए कोंडा पर्यावरण प्रबंधक स्थापित करें। डाउनलोड और NuMorph19 छवि प्रसंस्करण उपकरण स्थापित करें।
    2. कमांड लाइन पर, Matlab चलाएँ। विश्लेषण के लिए आवश्यक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज डाउनलोड और इंस्टॉल करने के लिए NuMorph से NM_setup.m चलाएँ।
      नोट: यह कदम सुनिश्चित करता है कि कोंडा वातावरण ठीक से स्थापित किया गया है और साथ ही यह सुनिश्चित करता है कि मैटलैब को तीन पाइपलाइनों में से प्रत्येक को चलाने के लिए आवश्यक सभी उपकरण और ऐड-ऑन डाउनलोड और सही तरीके से स्थापित किए गए हैं। यहां सबसे उल्लेखनीय पंजीकरण चलाने के लिए इलास्टिक्स और सेल का पता लगाने और गिनती के लिए 3 डी-यूनेट हैं।
  2. फ़ाइल NM_samples.m संपादित करके नमूना नाम, इनपुट और आउटपुट निर्देशिकाएँ, चैनल जानकारी और लाइट-शीट इमेजिंग पैरामीटर निर्दिष्ट करें.
    नोट: यहां, यह सुनिश्चित करने के लिए डबल-चेक करने की सिफारिश की जाती है कि सही जानकारी, विशेष रूप से छवि इनपुट निर्देशिका, ठीक से निर्दिष्ट है। त्रुटियों को आमतौर पर बाद के चरणों को चलाने तक यहां नहीं बुलाया जाता है।
  3. छवि प्रीप्रोसेसिंग
    1. तीव्रता समायोजन
      1. NMp_template में, सेट तीव्रता समायोजन = सत्य।
        नोट: यदि तीव्रता समायोजन की आवश्यकता है तो सच पर सेट करें। यदि नहीं, तो तीव्रता समायोजन सेट करें = गलत। पिछले समायोजन मापदंडों को ओवरराइट करने के लिए 'अपडेट' का उपयोग करने का विकल्प भी है।
      2. छवियों के एक नए सेट के साथ काम करते समय संसाधित छवियों का उपयोग करें = गलत । अन्यथा, आउटपुट निर्देशिका में पहले से सहेजे गए किसी भी छवि डेटासेट को इंगित करें (उदाहरण के लिए, "संरेखित", "स्टिच") बाद के प्रसंस्करण चरणों के लिए उपयोग करने के लिए।
        नोट: यह विकल्प उस मामले में प्रदान किया जाता है जहां इनपुट छवियां पहले से ही पूर्व-संसाधित की गई हैं। इस मामले में, प्रीप्रोसेस्ड छवियों का उपयोग इनपुट छवियों के रूप में किया जाएगा और विकल्प आउटपुट निर्देशिका में उपनिर्देशिका के नाम पर सेट किया जाएगा।
      3. सहेजें सेट करें = सत्य.
        नोट: इस विकल्प का उपयोग सुनिश्चित करता है कि संसाधित छवियों को आउटपुट निर्देशिका में सहेजा जाए; अन्यथा, केवल पैरामीटर की गणना और सहेजा जाएगा।
      4. सहेजें नमूने सेट करें = सत्य.
        नोट: यह विकल्प सुनिश्चित करता है कि नमूना परिणाम प्रत्येक प्रमुख चरण के लिए सहेजे गए हैं।
      5. विशिष्ट प्रकाश-शीट चौड़ाई पर प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप से माप का उपयोग करके टाइल छायांकन सुधार लागू करने के लिए बीएएसआईसी एल्गोरिदम27 या मैनुअल का उपयोग करके छायांकन सुधार लागू करने के लिए समायोजित टाइल छायांकन = मूल सेट करें।
        नोट: यह विकल्प शीट कमर के आकार के कारण वाई आयाम के साथ असमान रोशनी के लिए सही करता है।
    2. छवि चैनल संरेखण
      1. NMp_template में, सेट चैनल संरेखण = सत्य। यदि चैनल संरेखण की आवश्यकता है तो इस विकल्प को सत्य पर सेट करें। यदि नहीं, तो झूठ पर सेट करें। चैनल संरेखण विधि को या तो अनुवाद (कठोर) या इलास्टिक्स (नॉनरिजिड) पर सेट करें।
        नोट: अनुवाद विधि कई चैनलों को संरेखित करने में कठोर 2 डी पंजीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करती है, जबकि इलास्टिक्स विधि घूर्णी बहाव के लिए सही करने के लिए गैर-कठोर बी-स्प्लिन28 का उपयोग करती है, जो लंबी छवि अधिग्रहण19 के दौरान हो सकती है।
    3. पुनरावृत्ति छवि सिलाई
      1. NMp_template में, सेट स्टिच छवियां = सत्य।
        नोट: यदि सिलाई की आवश्यकता है तो इस विकल्प को सही पर सेट करें।
      2. सेट शुद्धिकरण = सत्य।
        नोट: इस विकल्प का उपयोग स्केल अपरिवर्तनीय सुविधा ट्रांसफॉर्म29 का उपयोग करके xy में अनुवाद को और परिष्कृत करने के लिए किया जाता है।
      3. लोड संरेखण परम = सत्य सेट करें।
        नोट: यह विकल्प सिलाई के दौरान चैनल संरेखण अनुवाद का उपयोग करता है। मल्टीचैनल इमेजिंग के साथ इस विकल्प की सिफारिश की जाती है। अन्यथा, झूठ पर सेट करें।
      4. इमेजिंग के दौरान टाइल ओवरलैप से मेल खाने के लिए ओवरलैप = 0.15 सेट करें।
    4. इनमें से कोई भी प्रीप्रोसेसिंग चरण चलाने के लिए, NMp_template वातावरण के बाहर Matlab में निम्न चलाएँ:
      1. नमूना नाम निर्दिष्ट करें. कॉन्फ़िगरेशन सेट = NM_config (प्रक्रिया, नमूना)।
      2. NM_process (कॉन्फ़िगरेशन, स्टेज) निर्दिष्ट करके किसी भी प्रीप्रोसेसिंग चरण को चलाएं और किसी भी प्रक्रिया के लिए तीव्रता, संरेखण या स्टिच का उपयोग करके चरण निर्दिष्ट करें। प्रत्येक चरण (चित्रा 3 और चित्रा 4) के लिए आउटपुट फ़ाइलों के लिए आउटपुट निर्देशिका की जांच करें।
  4. छवि विश्लेषण
    1. NuMorph से पहले
      1. एक 3 डी एटलस छवि और एक संबद्ध एनोटेशन छवि से शुरू करें जो प्रत्येक वोक्सेल को एक विशेष संरचना को प्रदान करता है।
        नोट: मैगलनमैपर30 से उत्पन्न पी 4 एलन डेवलपमेंटल माउस ब्रेन एटलस का उपयोग यहां किया जाता है।
      2. एटलस छवि और एनोटेशन फ़ाइल दोनों को संरेखित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे सही अभिविन्यास में सही ढंग से मेल खाते हैं।
    2. NuMorph के भीतर
      नोट: अब जब एटलस और इसके एनोटेशन सही ढंग से संरेखित होते हैं, तो फ़ाइलों को NuMorph के भीतर "म्यूंग" या संसाधित किया जाना चाहिए ताकि उन्हें बाद में उपयोग के लिए सहेजा जा सके। ऐसा करने के लिए, नीचे दिखाए गए अनुसार इनपुट निर्दिष्ट करने के लिए munge_atlas फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      1. Atlas_file निर्दिष्ट करें: (स्ट्रिंग). एटलस फ़ाइल के लिए पूर्ण पथ प्रदान करें।
      2. Annotation_file निर्दिष्ट करें: (स्ट्रिंग). संबंधित एनोटेशन के लिए पूर्ण पथ प्रदान करें।
      3. समाधान निर्दिष्ट करें: (1x3 संख्यात्मक). एटलस y, x, z रिज़ॉल्यूशन को माइक्रोन प्रति पिक्सेल के रूप में निर्दिष्ट करें।
      4. अभिविन्यास निर्दिष्ट करें: (1 x 3 char). एटलस अभिविन्यास प्रदान करें और सुनिश्चित करें कि यह पालने में नमूने के सेटअप से मेल खाता है (पूर्ववर्ती (ए)/पश्चवर्ती (पी), बेहतर (एस)/अवर (आई), बाएं (एल)/दाएं (आर))।
      5. गोलार्ध निर्दिष्ट करें: निर्दिष्ट करें कि किस मस्तिष्क गोलार्ध को चित्रित किया गया था ("बाएं", "दाएं", "दोनों", "कोई नहीं")।
      6. निर्दिष्ट करें out_resolution:(int). माइक्रोन में एटलस आउटपुट के आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन को निर्दिष्ट करें। (डिफ़ॉल्ट: 25).
      7. डेटा/annotation_data में म्यूंज्ड एनोटेशन और एटलस/डेटा/एटलस में एटलस इमेज की एक प्रति उत्पन्न करने के लिए "munge_atlas (atlas_file, annotation_file, रिज़ॉल्यूशन, ओरिएंटेशन, गोलार्द्ध)" कमांड चलाएं।
      8. यह सत्यापित करने के लिए मैटलैब संरचना और एटलस फ़ाइल पढ़ें कि दोनों फ़ाइलें सही अभिविन्यास में सही तरीके से म्यूंग की गई हैं।
        नोट: इम्यूनोलेबल प्रोटीन मार्करों के सह-स्थानीयकरण के आधार पर सेल-प्रकारों को निर्धारित करने के लिए एक अतिरिक्त सेल वर्गीकरण चरण किया जा सकता है।
    3. रिसैंपलिंग
      1. NMa_template में, सेट रीसैंपल छवियां = सच, यदि एटलस को संदर्भित करने के लिए छवि पंजीकरण कर रहे हैं या उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटासेट के डाउनसैंपल वॉल्यूम उत्पन्न करते हैं।
        नोट: NMa_template का उपयोग रिसैंपलिंग, पंजीकरण, नाभिक का पता लगाने और सेल गिनती के लिए मापदंडों को सेट करने के लिए किया जाएगा।
      2. एटलस से मेल खाने के लिए रिज़ॉल्यूशन सेट करें।
        नोट: यहां, 25 μm3/ voxel आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन का उपयोग किया जाता है क्योंकि संदर्भ एटलस इस रिज़ॉल्यूशन पर है।
      3. रीसैंपल चैनलों का उपयोग करके पुन: नमूना किए जाने वाले चैनल नंबर निर्दिष्ट करें = []।
        नोट: यहां, चैनल नंबर परमाणु चैनल से मेल खाने के लिए सेट किया गया है। यदि यह विकल्प खाली है, तो केवल पंजीकरण चैनल का पुन: नमूना लिया जाएगा।
    4. पंजीकरण
      1. NMa_template में, सेट रजिस्टर छवियां = सत्य। यदि पंजीकरण की आवश्यकता है तो सच होने के लिए सेट करें। यदि नहीं, तो पंजीकरण = गलत सेट करें।
      2. एटलस निर्देशिका में फ़ाइल से मेल खाने के लिए एटलस फ़ाइल निर्दिष्ट करें।
      3. पंजीकरण पैरामीटर सेट करें = डिफ़ॉल्ट।
        नोट: यह विकल्प स्थानिक पत्राचार का अनुमान लगाने के लिए बी स्प्लिन परिवर्तन के बाद एक एफफाइन का उपयोग करता है। अन्यथा, /डेटा/elastix_parameter_files/atlas_registration में इलास्टिक्स के माध्यम से पंजीकरण मापदंडों का एक नया सेट परिभाषित करें।
      4. पंजीकृत छवियों को सहेजें सेट करें = सत्य।
        नोट: पंजीकरण और रीसैंपलिंग से आउटपुट फ़ाइलों को मैटलैब या अन्य विज़ुअलाइज़ेशन टूल जैसे फिजी31 में डाउनलोड और नेत्रहीन निरीक्षण किया जा सकता है।
    5. नाभिक का पता लगाना, कोशिका गणना और वर्गीकरण
      नोट: यहां होने वाली त्रुटियां एनोटेशन फ़ाइल को सही ढंग से निर्दिष्ट नहीं करने या सही एनोटेशन के साथ नमूने की उम्र से मेल नहीं खाने के कारण हो सकती हैं।
      1. NMa_template में, दोनों गणना नाभिक सेट करें और कोशिकाओं को वर्गीकृत करें = सत्य।
      2. गणना विधि सेट करें = 3dunet.
        नोट: यह विकल्प प्रशिक्षित 3 डी-यूनेट मॉडल19 के उपयोग की अनुमति देता है। अन्यथा, हेसियन का चयन करें जो हेसियन ब्लॉब डिटेक्शन विधि का उपयोग करता है।
      3. पता लगाए गए ऑब्जेक्ट्स के लिए न्यूनतम तीव्रता सीमा निर्धारित करने के लिए min_intensity सेट करें।
        नोट: परमाणु लेबलिंग के सिग्नल-टू-शोर अनुपात के आधार पर एक उपयुक्त सीमा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जाती है।
      4. classify_method को किसी भी सीमा पर सेट करें, जो केन्द्रक पदों या एसवीएम पर एक असुरक्षित प्रतिदीप्ति तीव्रता पर आधारित है, जो एक पर्यवेक्षित रैखिक समर्थन वेक्टर मशीन (एसवीएम) क्लासिफायर मॉडल करता है।
        नोट: यह चरण सभी पता लगाए गए कोशिकाओं को 3-चैनल इमेजिंग के साथ चार प्रमुख वर्गों में वर्गीकृत करेगा। इस प्रोटोकॉल के साथ, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2-, और आउटलायर्स उत्पन्न होते हैं।
    6. विश्लेषण के चरण
      1. नमूना नाम निर्दिष्ट करें. कॉन्फ़िगरेशन = NM_config (विश्लेषण, नमूना) सेट करें।
      2. NM_analyze (कॉन्फ़िगरेशन, स्टेज) निर्दिष्ट करके किसी भी विश्लेषण चरण को चलाएं और पुन: नमूना, रजिस्टर, गिनती या वर्गीकृत का उपयोग करके चरण निर्दिष्ट करें। प्रत्येक चरण के लिए आउटपुट फ़ाइलों के लिए आउटपुट निर्देशिका की जाँच करें (चित्रा 5)।
    7. सेल-प्रकार वर्गीकरण और समूह विश्लेषण
      1. NMe_template में, अद्यतन = सही सेट करें और गणना किए गए सभी पिछले आंकड़ों को अधिलेखित करें।
        नोट: NMe_template.एम विश्लेषण किए जा रहे एक ही मस्तिष्क के मस्तिष्क क्षेत्रों में सेल-प्रकार समूह विश्लेषण करने का विकल्प प्रदान करता है।
      2. तालिका के अनुसार संरचनाओं की तुलना करने के लिए सभी अद्वितीय एनोटेशन या तालिका द्वारा तुलना करने के लिए compare_structures_by को या तो इंडेक्स पर सेट करें।
      3. template_file सेट करें, जो सभी संभावित संरचना अनुक्रमणिकाओं को निर्दिष्ट करता है और / एनोटेशन में मौजूद होना चाहिए।
      4. structure_table सेट करें और मूल्यांकन करने के लिए संरचनाओं को निर्दिष्ट करें।
      5. NMa_template.एम. में वर्णित सेल गिनती और सेल-प्रकार वर्गीकरण निर्दिष्ट करें।
      6. तुलना करने के लिए समूह निर्दिष्ट करने के लिए compare_groups सेट करें.
      7. युग्मित टी-टेस्ट या दो-नमूना टी-टेस्ट करने के लिए या तो सही या गलत पर युग्मित सेट करें।
    8. विश्लेषण चलाएँ.
      नोट:: इस चरण को करने के लिए, NMe_template.m वातावरण के बाहर Matlab में निम्न चलाएँ।
      1. नमूना नाम निर्दिष्ट करें. कॉन्फ़िगरेशन = NM_config (मूल्यांकन, नमूना) सेट करें।
      2. NM_evaluate (कॉन्फ़िगरेशन, चरण) निर्दिष्ट करके विश्लेषण चरण चलाएं और चरण निर्दिष्ट करें। समूह विश्लेषण के लिए आउटपुट फ़ाइलों के लिए आउटपुट निर्देशिका की जाँच करें।

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Representative Results

जैसा कि आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण ऊतक संकोचन का परिचय देता है, जो आंखों द्वारा आसानी से ध्यान देने योग्य है (चित्रा 2 बी), हमने ऊतक समाशोधन से प्रेरित संकोचन को निर्धारित करने के लिए ऊतक समाशोधन से पहले इस पाइपलाइन में एक एमआरआई कदम जोड़ा। वर्कफ़्लो एमआर छवि (चित्रा 2 सी) से गैर-मस्तिष्क ऊतक को हटाने के साथ शुरू होता है। इसके बाद, एमआर छवि को प्रकाश-शीट छवि (चित्रा 2 डी) में संरेखित करने के लिए एक कठोर परिवर्तन (3 अनुवाद और 3 रोटेशन कोण) लागू किया जाता है। ऐसा करने से, हमने ऊतक समाशोधन प्रक्रिया (चित्रा 2 ई) द्वारा प्रेरित 60% कुल मात्रा हानि देखी, जो आंखों द्वारा मात्रा परिवर्तन अनुमानों के अनुरूप थी (चित्रा 2 बी)। यह परिणाम पिछली रिपोर्ट से काफी अलग है जहां 5% -10% 10,32 की सिकुड़न की सूचना दी गई थी। संकोचन में अंतर दो अध्ययनों (पी 4 बनाम वयस्क दिमाग) के बीच पशु आयु में अंतर के कारण या आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल (16 एच बनाम 2 एच) के समाशोधन चरण में मेथनॉल धोने में समय के अंतर के कारण हो सकता है। मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में ऊतक संकोचन की डिग्री को मैप करने के लिए, हमने आगे एक विकृत छवि पंजीकरण तैनात किया जहां प्रकाश-शीट छवि का उपयोग संदर्भ के रूप में किया जाता है। पंजीकृत एमआर छवि (चित्रा 2 एफ) में दिखाया गया है। ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के कारण अनुमानित मात्रा परिवर्तन रंग-कोडित है, जहां अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की तुलना में कॉर्टेक्स में सिकुड़ने की एक बड़ी डिग्री देखी जाती है (चित्रा 2 जी)।

मस्तिष्क क्षेत्रों की मात्रा को मापने के लिए, हमने एक एनोटेटेड एटलस में पंजीकरण के माध्यम से एमआरआई का विभाजन किया। एमआर-इमेज्ड दिमाग के विभाजन को सफल माना जाता था यदि संदर्भ एटलस ओवरले कच्चे एमआरआई छवियों (चित्रा 2 एच) में अंतर से पहचाने गए शारीरिक सीमाओं से निकटता से मेल खाता था। पंजीकरण के दौरान ओवरले अच्छी नमूना तैयारी (चित्रा 2 ए), छवि अधिग्रहण और खोपड़ी स्ट्रिपिंग पर निर्भर है। खोपड़ी स्ट्रिपिंग चरण अच्छे पंजीकरण परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि पंजीकरण एटलस से संदर्भ छवि को पूरी एमआर छवि तक विकृत करने का प्रयास करेगा, जिसमें छवि में रहने वाली कोई भी खोपड़ी भी शामिल है। पंजीकरण में खोपड़ी को शामिल करने से परिणाम विकृत हो सकते हैं और विभाजन का गलत तरीके से पंजीकृत 3 डी वॉल्यूम रेंडरिंग हो सकता है। अंतिम 3 डी वॉल्यूम रेंडरिंग को तब आईटीके-एसएनएपी33 (चित्रा 2 एच) का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। इस विधि का उपयोग नमूना समूहों में सकल मस्तिष्क की मात्रा के अंतर का आकलन करने के लिए किया जाता है। एमआरआई के साथ खोजे गए सेलुलर आधार अंतर्निहित मात्रा अंतर को ऊतक समाशोधन, लाइटशीट माइक्रोस्कोपी और न्यूमोर्फ के साथ सेल गिनती का उपयोग करके आगे बढ़ाया जा सकता है।

ऊतक समाशोधन और विश्लेषण का लक्ष्य न्यूमोर्फ का उपयोग करके व्यक्तिगत नाभिक की गणना करके प्रयोगात्मक स्थितियों (जैसे, जीनोटाइप, पर्यावरणीय जोखिम) में अंतर के लिए विभिन्न सेल प्रकारों के योगदान का आकलन करना है। आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल और न्यूरोनल परत विशिष्ट नाभिक मार्करों का उपयोग करके ऊतक समाशोधन के परिणामस्वरूप आइसोकॉर्टेक्स में ऊपरी और निचली परत न्यूरॉन्स के स्पष्ट रूप से परिभाषित सेल समूह हुए (चित्रा 3)।

न्यूमोर्फ का उपयोग करके सेल गिनती तीव्रता समायोजन, चैनल संरेखण और सिलाई (चित्रा 4 ए) से जुड़े सफल प्रीप्रोसेसिंग चरणों पर निर्भर है। इनमें से किसी भी चरण में होने वाली त्रुटियों के परिणामस्वरूप अनुचित सिलाई हो सकती है (चित्रा 4 बी, सी)। उदाहरण के लिए, अनुचित छवि अधिग्रहण के परिणामस्वरूप प्रीप्रोसेसिंग (चित्रा 4 सी) के दौरान इन-फोकस और आउट-ऑफ-फोकस पैटर्न वाली छवियां हो सकती हैं। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से नाभिक की गणना करने के लिए, सिले हुए चित्रों को सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एटलस का उपयोग करके एनोटेट किया जाता है। हमने अपनी सिले हुए छवियों को पी 4 एलन डेवलपमेंटल माउस ब्रेन एटलस34 के सही संस्करण में पंजीकृत किया। यहां, सिले हुए चित्रों को एटलस के रिज़ॉल्यूशन से मेल खाने के लिए एक उच्च रिज़ॉल्यूशन (0.75 x 0.75 x 4 μm3/voxel) से कम रिज़ॉल्यूशन (25 μm3/voxel आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन) तक नीचे नमूना लिया गया था। एटलस के रिज़ॉल्यूशन का मिलान एटलस में छवियों का सही पंजीकरण सुनिश्चित करता है और अधिग्रहित छवियों में क्षेत्रीय एनोटेशन प्रदान करता है (चित्रा 5 ए)।

विशिष्ट सेल-प्रकार विशिष्ट गिनती करने के लिए, हमने ऊपरी परत न्यूरॉन्स को Brn2 को व्यक्त करने, Ctip2 को व्यक्त करने वाले निचली परत न्यूरॉन्स और TO-PRO-3 (चित्रा 3B) के साथ सभी नाभिकों को लेबल किया। इमेजिंग व्यक्तिगत नाभिक (0.75 x 0.75 x 4 μm3/voxel) को अलग करने के लिए पर्याप्त स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर किया जाता है। नाभिक के केन्द्रक का पता न्यूमोर्फ (चित्रा 5 बी, सी) में एक प्रशिक्षित 3 डी-यूनेट मॉडल के साथ लगाया जाता है। हमने ~ 12 × 10 6 कुल नाभिकका पता लगाया जो आइसोकॉर्टेक्स में टो-प्रो -3 + थे, जिसमें ~ 2.6 × 106 Brn2+ और 1.6 × 106 Ctip2 + नाभिक शामिल थे। हमने बेसल गैन्ग्लियाऔर हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स में क्रमशः ~ 3.7 × 10 6 और 2.9 × 106 टू-प्रो -3 + कुल नाभिक का भी पता लगाया। लगभग 1.5 × 106 और <1 × 106 सीटीआईपी 2 + कोशिकाओं को क्रमशः बेसल गैन्ग्लिया और हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स में गिना गया था, हालांकि बीएन 2 + कोशिकाओं की एक नगण्य संख्या का पता लगाया गया था (चित्रा 5 डी)। आइसोकॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स संयुक्त (~ 15 मिलियन कोशिकाओं) में कुल नाभिक की गिनती माउस15 के सेरेब्रल कॉर्टेक्स में पहले रिपोर्ट की गई कुल कोशिका गणना के समान है। ये परिणाम प्रयोगात्मक समूहों में माउस मस्तिष्क संरचना में अंतर्निहित अंतर को प्रकट करने के लिए एमआरआई इमेजिंग, आईडीआईएससीओ + ऊतक समाशोधन पद्धति और न्यूमोर्फ कम्प्यूटेशनल विश्लेषण की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: बरकरार नवजात 3 डी ऊतक के पूरे मस्तिष्क एकल-कोशिका विश्लेषण का अवलोकन माउस दिमाग को साफ़ करता है। (ए) आईडीआईएससीओ + ऊतक समाशोधन, प्रकाश शीट इमेजिंग और 3 डी छवि विश्लेषण का अवलोकन। (बी) प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप पर सही नमूना माउंटिंग दिखाने वाली छवियां। (सी) कार्टून प्रकाश-शीट पथ के सापेक्ष नमूना बढ़ते हुए दिखाता है। संक्षिप्त नाम: एबी = एंटीबॉडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एमआरआई के साथ सकल मस्तिष्क संरचना माप। (ए) एमआरआई के लिए नमूना तैयारी दिखाने वाली छवि। (बी) आईडीआईएससीओ + ऊतक समाशोधन से पहले और बाद में प्रतिनिधि पी 4 दिमाग की छवियां। स्केल बार = 5.0 सेमी (सी) 60 x 60 x 60 μm3 पर जुड़ी खोपड़ी के साथ कच्ची MR छवि। स्केल बार = 800 μm. (D) माउस मस्तिष्क की प्रकाश-शीट छवि 25 x 25 x 25 xm3 पर। कुल आयतन = 68.7 मिमी3. ध्यान दें कि पृष्ठीय आइसोकॉर्टेक्स का एक छोटा सा हिस्सा अनजाने में तीर (सफेद) द्वारा चिह्नित विच्छेदन के दौरान हटा दिया गया था। स्केल बार = 800 μm. (E) खोपड़ी स्ट्रिपिंग और कठोर पंजीकरण के बाद माउस मस्तिष्क की MR छवि। कुल आयतन = 171.9 मिमी3. प्रकाश-शीट छवि से मस्तिष्क समोच्च (पीला) डालें। स्केल बार = 800 μm. (F) विरूपण का आकलन करने के लिए प्रकाश-शीट छवि के संदर्भ में पंजीकृत MR छवि। (जी) प्रकाश-शीट छवि और एमआर छवि के बीच मात्रा परिवर्तन का आकलन करने के लिए वोक्सेल-वार मस्तिष्क मानचित्रण जहां नीला और लाल क्रमशः एमआर छवि से प्रकाश-शीट छवि तक संकोचन और विस्तार का संकेत देता है। कुल मिलाकर 60% मात्रा हानि थी, लेकिन आइसोकॉर्टेक्स जैसे कुछ क्षेत्रों ने दूसरों के सापेक्ष अधिक संकोचन दिखाया। (एच) बाएं पैनल: एलन डेवलपमेंटल ब्रेन एटलस से पंजीकृत विभाजन के साथ एमआरआई छवि का अक्षीय दृश्य। दाएं पैनल: विभाजन का 3 डी वॉल्यूम रेंडरिंग। स्केल बार = 800 μm. संक्षेप: ओबी = घ्राण बल्ब; डीपीएल = पृष्ठीय पैलियम / एमबी = मिडब्रेन; सीबी = सेरिबैलम। अभिविन्यास: आर = रोस्ट्रल; एल = पार्श्व; D = पृष्ठीय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सेलुलर रिज़ॉल्यूशन छवियां और चैनल संरेखण। (ए) टीओ-प्रो -3 (टीपी 3) का ऑप्टिकल अक्षीय खंड और पी 4 माउस मस्तिष्क में सीटीआईपी 2 (निचली परत न्यूरॉन) और बीएन 2 (ऊपरी परत न्यूरॉन) मार्करों के लिए परमाणु धुंधलापन और इम्यूनोलेबलिंग। स्केल बार = 1 मिमी (बी) ए (बॉक्स) में कॉर्टिकल क्षेत्रों का बढ़ा हुआ इनसेट जो बीएन 2-इम्यूनोलेबल ऊपरी परत और सीटीआईपी 2-इम्यूनोलेबल निचली परत न्यूरॉन्स के अपेक्षित स्थानीयकरण के साथ सही चैनल संरेखण दिखाता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: छवि सिलाई उदाहरण. (A) नमूना 2D पुनरावृत्ति, सही ढंग से सिले गए छवि से उत्पन्न होता है. स्केल बार = 1 मिमी। सम्मिलित करने से सही सिलाई का एक उदाहरण दिखाई देता है। स्केल बार = 500 μm. (B) नमूना 2D पुनरावृत्ति, गलत तरीके से सिले गए छवि से परिणाम देता है। स्केल बार = 1 मिमी। सम्मिलित करने से गलत सिलाई का एक उदाहरण दिखाई देता है जिसमें ज़ूम इन (ओवरहैंग) शामिल है। स्केल बार = 100 μm. (C) नमूना 2D पुनरावृत्ति गलत तरीके से सिले गए छवि से उत्पन्न होता है। स्केल बार = 1 मिमी। सम्मिलित करने से गलत सिलाई का एक उदाहरण दिखाई देता है जो ज़ूम इन (आउट-ऑफ-फ़ोकस) है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पी 4 माउस मस्तिष्क में कम रिज़ॉल्यूशन छवि पंजीकरण, उच्च रिज़ॉल्यूशन नाभिक का पता लगाना और सेल गिनती। (ए) बाएं पैनल: पूरे मस्तिष्क प्रकाश शीट 3 डी छवियों से जेड-स्लाइस का एक उदाहरण 25 μm आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन तक पुन: नमूना लिया गया। स्केल बार = 1 मिमी। मध्य पैनल: माइक्रोस्कोपी छवि के लिए पंजीकृत एलन डेवलपमेंटल ब्रेन एटलस (पी 4) से एनोटेशन। स्केल बार = 1 मिमी। दाएं पैनल: बाएं और मध्य पैनलों का ओवरले। स्केल बार = 1 मिमी (बी) अक्षीय दृश्य में तीव्रता समायोजित सिले हुए छवि का उदाहरण। बॉक्स किए गए क्षेत्र (C) में दिखाया गया है। स्केल बार = 1 मिमी (सी) नाभिक (लाल) का स्वचालित पता लगाना। (डी) पी 4 मस्तिष्क के विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों (बेसल गैन्ग्लिया, हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स और इसोकॉर्टेक्स) में सेल प्रकारों का परिमाणीकरण। लाल = ऊपरी परत न्यूरॉन्स को Brn2 के साथ लेबल किया गया है, हरा = निचली परत न्यूरॉन्स Ctip2 के साथ लेबल किया गया है, और नीला = सभी नाभिक को To-Pro-3 डाई के साथ लेबल किया गया है। संक्षिप्तरूप: डीपैल = पृष्ठीय पैलियम (आइसोकॉर्टेक्स); एमपीएल = मेडियल पैलियम (हिप्पोकैम्पल एलोकॉर्टेक्स); CSPall = सेंट्रल सबपैलियम (क्लासिक बेसल गैन्ग्लिया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

न्यूमोर्फ विश्लेषण चरण अनुमानित समय
तीव्रता समायोजन 1 घंटे
चैनल संरेखण 2 मिनट
2 डी पुनरावृत्ति सिलाई 12 घंटे
रिसैंपलिंग 3 मिनट
पंजीकरण 3 मिनट
सेल की गिनती 5 घंटे
सेल वर्गीकरण 10 मिनट

तालिका 1: न्यूमोर्फ विश्लेषण समय।

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Discussion

ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क के 3 डी सेलुलर संगठन को मापने के लिए उपयोगी तकनीकें हैं। साहित्य में वर्णित ऊतक समाशोधन विधियों की एक मेजबानी है, जिनमें से प्रत्येक के फायदे और सीमाएं 6,7,8,9 हैं। ऊतक-साफ़ छवियों में सेल प्रकारों का विश्लेषण करने के लिए कम्प्यूटेशनल टूल के विकल्प अपेक्षाकृत सीमित हैं। अन्य उपलब्ध उपकरणों को विरल सेल आबादी के लिए लागू किया गया है जिसमें विभाजन कम कठिनहै 10,35 या ऊतक विस्तार16 का लाभ उठाया है। यह पेपर आईडीआईएससीओ + ऊतक समाशोधन के साथ इमेजिंग के लिए एक माउस मस्तिष्क की तैयारी का वर्णन करता है और एलएसएफएम द्वारा कैप्चर किए गए माउस कॉर्टेक्स की संरचनाओं के भीतर नाभिक को संसाधित करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन न्यूमोर्फ को प्रदर्शित करता है। यह इमेजिंग समय की लंबाई, सेल नाभिक की पहचान सटीकता और कम्प्यूटेशनल संसाधनों के बीच एक उपयुक्त संतुलन बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह पाइपलाइन लेबल कोशिकाओं 10,36,37 की विरल आबादी के बजाय सभी नाभिकों को मज़बूती से विभाजित करके अन्य वर्तमान में उपलब्ध उपकरणों के साथ विरोधाभासी है। हमने पहले दिखाया है कि सेल डिटेक्शन सटीकता अधिक है, जिसमें अन्य तरीकों की तुलना में पूरे गोलार्ध अधिग्रहण के लिए काफी कम इमेजिंग समय और बहुत कम अधिग्रहित डेटा आकारहैं। न्यूमोर्फ मल्टी-चैनल लाइट-शीट छवियों के विश्लेषण के लिए कई महत्वपूर्ण चुनौतियों को संबोधित करता है, जैसे कि चैनल संरेखण के लिए उपकरण प्रदान करना, सिलाई उपकरण के साथ मंच आंदोलनों को सही करना और छवि टाइलों में सिग्नल चमक को सही करना। इस पेपर में प्रस्तुत वर्कफ़्लो व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपयोगी है और अनुसंधान संस्थानों में सभी समूहों के लिए सुलभ है। प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में देखा जा सकता है।

माउस छिड़काव से कम्प्यूटेशनल विश्लेषण तक इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो छवियों, परिमाणीकरण और परिणामों की डाउनस्ट्रीम गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। यह आवश्यक है कि छिड़काव इस तरह किया जाए कि मस्तिष्क से सभी रक्त को हटा दिया जाए, क्योंकि रक्त वाहिकाओं में एक प्राकृतिक ऑटोफ्लोरेसेंस होता है जो छवियों में तीव्रता को प्रभावित करेगा और परिणामों पर प्रतिकूल प्रभाव डालते हुए पाइपलाइन में समायोजन की आवश्यकता होगी। पीएफए निर्धारण की अवधि भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि 24 घंटे से अधिक समय तक 4% पीएफए में फंसे दिमाग को छोड़ने से नमूने का 'ओवरफिक्सिंग' हो सकता है और मस्तिष्क की दरार हो सकती है, जो आईडीआईएससीओ + प्रक्रिया के दौरान भंगुर हो जाती है। ऊपर वर्णित आईडीआईएससीओ प्रोटोकॉल को वेबसाइट24 पर पाए गए आधिकारिक प्रोटोकॉल से थोड़ा संशोधित किया गया है। एक महत्वपूर्ण संशोधन मूल प्रोटोकॉल में पानी के बजाय मेथनॉल / पीबीएस श्रृंखला में पीबीएस को जोड़ना है। यह भ्रूण और प्रारंभिक प्रसवोत्तर दिमाग में कॉर्टिकल क्रैकिंग को रोकने के लिए है, जो संभवतः ग्लियल कोशिकाओं, अक्षीय अनुमानों और बाह्य मैट्रिक्स के अपूर्ण विकास के कारण होता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए ऊतक के आधार पर, आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल के हर चरण में संशोधन करना पड़ सकता है, जैसे एंटीबॉडी सांद्रता को बदलना और बड़े ऊतक नमूनों के इनक्यूबेशन गुना बढ़ाना, ताकि पसंद के मार्कर को पकड़ने और इसका सटीक विश्लेषण करने के लिए आदर्श मापदंडों को अनुकूलित किया जा सके।

ऊतक संकोचन को आईडीआईएससीओ + ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के दौरान होने के लिए जाना जाता है, जो तबवॉल्यूमेट्रिक माप को डाउनस्ट्रीम 6,10 में बदल सकता है। वैकल्पिक तरीकों, जैसे ऊतक समाशोधन से पहले आयोजित एमआरआई, का उपयोग नियंत्रण बनाम प्रयोगात्मक जानवरों में ऊतक के आकार में किसी भी बदलाव की सीमा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या कोई वॉल्यूमेट्रिक अंतर अध्ययन किए गए फेनोटाइप के कारण है और ऊतक समाशोधन प्रक्रिया से नहीं। उत्परिवर्ती के कॉर्टिकल क्षेत्रों की मात्रा में विषम परिवर्तन क्षेत्रीय सेलुलर सामग्री के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि मस्तिष्क के भूरे और सफेद पदार्थ मेथनॉल निर्जलीकरण से अलग-अलग प्रभावित हो सकते हैं। एमआरआई डेटा का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या ऊतक संकोचन मस्तिष्क के उप-क्षेत्रों में गैर-समान है (चित्रा 2 जी), और समाशोधन प्रोटोकॉल द्वारा किए गए किसी भी परिवर्तन को डाउनस्ट्रीम कम्प्यूटेशनल विश्लेषण में समायोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, आईडीआईएससीओ + प्रक्रिया नमूने को निर्जलित करने के लिए कठोर मेथनॉल वॉश का उपयोग करती है, जिसके परिणामस्वरूप नाभिक सतहों पर कुछ एंटीजन में क्षति या परिवर्तन हो सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोग किए जा रहे किसी भी एंटीबॉडी को पहले मस्तिष्क के ऊतक वर्गों पर परीक्षण किया जाता है जिन्हें 100% मेथनॉल में ~ 3 घंटे के लिए धोया गया है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एंटीबॉडी आईडीआईएससीओ + प्रोटोकॉल के साथ संगत है।

बड़े डेटासेट के लिए जिन्हें लंबे प्रसंस्करण समय की आवश्यकता होती है, हम लिनक्स में MATLAB के नो-विंडो संस्करण का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो "नोहप" कमांड को लागू करने जैसी रणनीतियों की अनुमति देता है, जो सर्वर से कनेक्शन खो जाने के बाद भी एक प्रक्रिया चलाना जारी रखेगा। इसके अलावा, न्यूमोर्फ को उच्च कंप्यूटिंग शक्ति की आवश्यकता होती है, इसलिए हम विश्लेषण के लिए कम से कम 10 जीबी मेमोरी की सलाह देते हैं। हम CentOS 7 चलाने वाले लिनक्स वर्कस्टेशन का उपयोग करके नमूने का विश्लेषण करते हैं, जो 2.6 GHz 14-कोर प्रोसेसर, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM मेमोरी, 4 x 11 GB GPUs, और 2 x 4TB बाहरी SSDs से लैस है। यहां इस्तेमाल किया गया कच्चा प्रकाश-शीट डेटा 620 जीबी था और प्रक्रियाओं के लिए मेमोरी की आवश्यकता 10 जीबी थी। यहां, हमने तालिका 1 में देखे गए न्यूमोर्फ विश्लेषण के प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए अनुमानित समय के साथ एक तालिका शामिल की है।

छवि प्रीप्रोसेसिंग चरणों में प्रत्येक जेड-प्लेन, चैनल संरेखण और सिलाई के लिए एक्सवाई आयाम में तीव्रता समायोजन शामिल है। छवि तीव्रता को वाई-आयाम के साथ टाइल्स और असमान रोशनी के बीच तीव्रता में अंतर के लिए समायोजित किया जाता है। तीव्रता में अंतर प्रकाश-शीट के अंतर्निहित तकनीकी गुणों के कारण होता है क्योंकि यह टाइल्स25 के बीच छवियां बनाता है। इसके बाद, चैनल संरेखण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि छवि चैनल मल्टीचैनल इमेजिंग में सही ढंग से संरेखित होते हैं। इस चरण की सिफारिश की जाती है क्योंकि मल्टीचैनल इमेजिंग में प्रत्येक चैनल व्यक्तिगत रूप से अधिग्रहित किया जाता है और चरण के सूक्ष्म आंदोलनों से नमूना बहाव हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप स्थानिक संरेखण हो सकताहै। अंत में, प्रत्येक जेड-प्लेन में एक एकल छवि बनाने के लिए प्रति जेड-प्लेन टाइल्स को एक साथ सिला जाता है। अंत में, नमूने की पूरी मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रति चैनल सिले हुए चित्रों का एक ढेर होगा। पुनरावृत्ति छवि सिलाई नमूना19 के 3 डी वॉल्यूम में प्रति चैनल सभी 2 डी छवियों को व्यवस्थित करने के लिए एक कस्टम विधि पर आधारित है। विधि पहले अक्षीय दिशा में एक जोड़ीवार जेड-पत्राचार को लागू करती है ताकि टाइल क्षेत्रों से मेल खाया जा सके जो क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशा दोनों में अतिव्यापी हैं। प्रत्येक टाइल का अंतिम जेड-विस्थापन न्यूनतम फैलाव पेड़38 का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। 2 डी पुनरावृत्ति सिलाई कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ स्टैक के केंद्र में एक स्थान पर शुरू होने वाले स्टैक में की जाती है। जेड आयाम में छवियों के सूक्ष्म बदलाव को रोकने के लिए प्रत्येक सिलाई पुनरावृत्ति के लिए शीर्ष बाएं टाइल को पहले रखा जाता है।

हम प्रत्येक प्रीप्रोसेसिंग पाइपलाइन को क्रमिक रूप से चलाने की सलाह देते हैं, खासकर जब त्रुटियों को ठीक करने के लिए अनुकूलन किया जाता है। सिलाई चरणों के दौरान अक्सर प्रमुख समस्याएं होती हैं। एक समस्या जो उत्पन्न हो सकती है वह है प्रकाश-पत्रक पर गलत छवि अधिग्रहण। यह समस्या तब हो सकती है जब क्षैतिज गतिशील फोकसिंग को प्रकाश-शीट पर अनुचित रूप से सेट किया जाता है और इसके परिणामस्वरूप छवियों में वैकल्पिक इन-फेज / आउट-ऑफ-फेज पैटर्न हो सकते हैं (चित्रा 4 बी, सी)। अतिरिक्त त्रुटियां उत्पन्न हो सकती हैं यदि नमूना कसकर सुरक्षित नहीं था, और अधिग्रहण के दौरान महत्वपूर्ण नमूना आंदोलन हुआ। इन मामलों में, आसन्न टाइलों के बीच जोड़ीवार पत्राचार की कमी के कारण सटीक सिलाई संभव नहीं हो सकती है। अन्य संभावित त्रुटियां स्टिच स्टार्ट साइट से उपजी हो सकती हैं। न्यूमोर्फ स्टैक के बीच में मोटे तौर पर सिलाई स्टार्ट साइट को निर्धारित करता है। हालांकि, जब शुरुआती स्लाइस साइट में महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि होती है, तो छवि टाइलों में जोड़ीवार तुलना में त्रुटियां हो सकती हैं। यहां एक स्टार्ट साइट चुनने की सिफारिश की जाती है जिसमें उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है।

यहां वर्णित छवि विश्लेषण में उच्च रिज़ॉल्यूशन (0.75 x 0.75 x 4 μm3/voxel) से 25 μm3/voxel के कम आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन तक सिले हुए चित्रों का इमेज रीसैंपलिंग शामिल है। हम अगले चरण34 में एलन डेवलपमेंटल माउस ब्रेन एटलस में सिले गए चित्रों को पंजीकृत करने के लिए परमाणु चैनल से सिले गए चित्रों को फिर से नमूना लेते हैं। फिर एक प्रशिक्षित 3 डी-यूनेट मॉडल19 का उपयोग करके एटलस के संदर्भ में छवियों के एनोटेट क्षेत्रों में कोशिकाओं की गणना की जाती है। इस विधि का उपयोग ब्लॉब वस्तुओं का पता लगाने और गिनने के लिए भी किया जा सकता है। न्यूमोर्फ विकसित करते समय, हमने प्रशिक्षण के दौरान कभी नहीं देखी गई पूरी तरह से नई छवियों के सापेक्ष विभाजन सटीकता का परीक्षण किया जो एक ही ऊतक समाशोधन प्रक्रिया, एक ही माइक्रोस्कोप और एक ही परमाणु लेबल से 0.99 की सटीकता और 0.9419 को याद करते थे। न्यूमोर्फ सटीकता का अभी तक विभिन्न ऊतक समाशोधन प्रक्रियाओं, माइक्रोस्कोप या मार्करों पर परीक्षण नहीं किया गया है; इसलिए, अन्य प्रयोगात्मक डिजाइनों में विभाजन की सटीकता अज्ञात है। NM_setup.एम में डिफ़ॉल्ट एटलस वयस्क निस्सल-सना हुआ एलन संदर्भ एटलस39 है जिसमें कस्टम एनोटेशन के रूप में एलन माउस ब्रेन कॉमन कोऑर्डिनेट फ्रेमवर्क (सीसीएफवी 3) का तीसरा पुनरावृत्ति है।

यद्यपि न्यूमोर्फ प्रभावी रूप से ऊतकों का विश्लेषण करता है, जो तुलनात्मक रूप से घने होते हैं, जैसे कि वयस्क माउस कॉर्टेक्स, अधिक चुनौतीपूर्ण प्रयोगात्मक डिजाइन (जैसे भ्रूण माउस दिमाग या सेरिबैलम जैसी अत्यधिक घनी संरचनाएं) को अतिरिक्त कम्प्यूटेशनल टूल के विकास की आवश्यकता हो सकती है। वर्तमान समुदाय-आधारित प्रयास इन अधिककठिन मामलों को विभाजित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले गहन शिक्षण मॉडल के प्रशिक्षण के लिए पर्याप्त एनोटेशन डेटा का उत्पादन करने का प्रयास कर रहे हैं। लाइट-शीट इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति उपकोशिकीय संरचनाओं की उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक जांच की अनुमति देती है, जिसमें दोहरे-दृश्य उल्टे चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (डीआईएसपीआईएम) जैसे नए दृष्टिकोण होते हैं जिससे सेलुलर-घने मस्तिष्कक्षेत्रों में रिज़ॉल्यूशन और सटीकता में वृद्धि होती है। जैसा कि इस शोध में शामिल ऊतक समाशोधन, इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल टूल में प्रगति विकसित होती है, हम आशा करते हैं कि वे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ऊतक समाशोधन विधियों के व्यापक उपयोग का नेतृत्व करेंगे कि आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोखिम कारकों द्वारा प्रेरित मस्तिष्क संरचना में परिवर्तन से न्यूरोसाइकिएट्रिक विकार कैसे हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच (R01MH121433, R01MH118349, और R01MH120125 से JLS और R01NS110791 से GW) और फाउंडेशन ऑफ होप द्वारा समर्थित किया गया था। हम नमूना इमेजिंग में सहायता के लिए माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला के पाब्लो एरियल को धन्यवाद देते हैं। पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग में माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय (यूएनसी) लाइनबर्गर कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर को कैंसर सेंटर कोर सपोर्ट ग्रांट पी 30 सीए 016086 द्वारा समर्थित है। न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर अनुदान पी 30 एनएस 045892 द्वारा समर्थित है। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को उत्तरी कैरोलिना बायोटेक सेंटर इंस्टीट्यूशनल सपोर्ट ग्रांट 2016-आईडीजी -1016 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

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References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 186
एमआरआई, ऊतक समाशोधन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क एकल-कोशिका इमेजिंग और बरकरार नवजात माउस दिमाग का विश्लेषण
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