Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקי קרום הטרוגניים המשוחררים על ידי רוב סוגי התאים, והם מוכרים יותר ויותר כרגולטורים פיזיולוגיים של הומאוסטזיס אורגניזם ואינדיקטורים חשובים לפתולוגיות; בינתיים, הפוטנציאל העצום שלהם לבסס טיפולים נגישים וניתנים לשליטה במחלות הולך וגדל. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים לשחרר כמויות גדולות של כלי רכב חשמליים בתרבית, אשר הראו הבטחה להתניע התחדשות רקמות יעילה ולהקל על יישומים טיפוליים נרחבים עם מדרגיות טובה ויכולת שחזור. קיים ביקוש גובר לפרוטוקולים פשוטים ויעילים לאיסוף ויישום MSC-EVs. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד ולאפיין כלי רכב חשמליים מייצגים מתאי MSC אנושיים מתורבתים, אקסוזומים ומיקרו-שלפוחיות ליישומים נוספים. יכולת ההסתגלות של שיטה זו מוצגת עבור סדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג, השתלה מקומית והזרקה מערכתית. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EVs במחקר תרגומי.
Introduction
תאי גזע הם תאים פלוריפוטנטיים בלתי ממוינים בעלי יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל תרגום1. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבודדים, מתורבתים, מורחבים ומטוהרים בקלות במעבדה, מה שנשאר אופייני לתאי גזע לאחר מעברים מרובים. בשנים האחרונות, עדויות הולכות וגדלות תומכות בדעה כי MSCs לפעול במצב paracrine בשימוש טיפולי 2,3. במיוחד הפרשת שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאת תפקיד מכריע בתיווך הפונקציות הביולוגיות של MSCs. כננו-חלקיקים קרומיים הטרוגניים המשתחררים מרוב סוגי התאים, כלי רכב חשמליים מורכבים מתת-קטגוריות הנקראות אקסוזומים (Exos), מיקרו-שלפוחיות (MVs), וגופים אפופטוטיים גדולים עוד יותר 4,5. ביניהם, Exos הוא EV הנחקר ביותר עם גודל של 40-150 ננומטר, שהוא ממוצא אנדוזומלי מופרש באופן פעיל בתנאים פיזיולוגיים. MVs נוצרים על ידי שפיכה ישירות מפני השטח של קרום פלזמה התא בקוטר של 100-1,000 ננומטר, אשר מאופיינים ביטוי גבוה של פוספטידיל סרין ביטוי של סמנים פני השטח של תאים תורמים6. כלי רכב חשמליים מכילים רנ"א, חלבונים ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, שיש להן תפקידים דומים לתאי האב וממלאות תפקיד משמעותי בתקשורת התא, בתגובה החיסונית ובתיקון נזק לרקמות7. MSC-EVs נחקרו באופן נרחב ככלי טיפולי רב עוצמה ללא תאים ברפואה רגנרטיבית8.
בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC הוא נושא נפוץ בתחום המחקר והיישום. כיום, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וצפיפות שיפוע9, תהליך אולטרה-סינון 10, הפרדה אימונומגנטית 11, כרומטוגרף הדרה מולקולרית12 ושבב מיקרופלואידי13 הן שיטות בשימוש נרחב בבידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים. עם היתרונות והחסרונות של כל גישה, לא ניתן לספק את הכמות, הטוהר והפעילות של כלי רכב חשמליים שנאספו בו זמנית14,15. במחקר הנוכחי מוצג בפירוט פרוטוקול הצנטריפוגה הדיפרנציאלית של בידוד ואפיון של כלי רכב חשמליים מתאי MSC מתורבתים, אשר תמך בשימוש טיפולי יעיל 16,17,18,19,20. יכולת ההסתגלות של שיטה זו לסדרה של גישות במורד הזרם, כגון תיוג פלואורסצנטי, השתלה מקומית והזרקה מערכתית, הוכחה עוד יותר. יישום נוהל זה ייתן מענה לצורך באיסוף ויישום פשוט ואמין של MSC-EV במחקר תרגומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 בני שמונה שבועות (ללא העדפה לנקבות או לזכרים). MSCs שמקורם בחבל הטבור האנושי (UCMSCs), ששימשו למחקר הנוכחי, התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). השימוש בתאים אנושיים אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הצבאית הרביעית לרפואה.
1. תרבית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs)
- הכינו את האביזרים והתמיסות הדרושים לעבודה הניסיונית, כולל פיפטה, קצוות פיפטה, צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, ציוד תרמוסטטי (אמבט מים), כפפות גומי, 75% אלכוהול, מדיום תרבית (מודגר ב-37°C), סרום בקר קטלני (FBS) ותמיסת 100x פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים).
- הכן את תקן אלפא-מינימום חיוני בינוני (α-MEM) הזמין מסחרית על-ידי תוספת של 20% FBS ו-1% P/S.
הערה: יש לדלל את כל הפתרונות המשמשים לבידוד וניתוח של כלי רכב חשמליים במים מסוננים טהורים במיוחד המיוצרים על ידי מערכת טיהור המים המסוננים האולטרה-טהורה (ראה טבלת חומרים). - שחזר את MSCs שמקורם בחבל הטבור האנושי (UCMSCs) מהחנקן הנוזלי על ידי המסתם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- העבר במהירות ובעדינות את תרחיף התא המומס לתוך צינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום תרבית (שלב 1.2). צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 x גרם במשך 5 דקות.
- מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה סטרילית ושומרים על משקע התא. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית לתוך צינור הצנטריפוגה ובעדינות להשהות מחדש את התאים.
- זרעו את התאים בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, והוסיפו 8 מ"ל מדיום תרבית לסך כולל של 10 מ"ל.
- תרבית MSCs ב 37 ° C ב 5% CO2 באינקובטור התא.
2. צנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד Exos ו-MV
- כאשר MSCs גדלים למפגש של >90%, החלף את מדיום התרבית ב- α-MEM בתוספת FBS מדולדל EV ו- 1% P/S עבור 8 מ"ל מכל מנה.
הערה: FBS צנטריפוגה ב 4 ° C, 1,50,000 x גרם לילה כדי להסיר EV וזיהומים אחרים. - לאחר 48 שעות של תרבית, לאסוף את מדיום התרבות (שלב 2.1) לתוך צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל.
- צנטריפוגה את מדיום תרבית MSC ב 4 ° C, 800 x גרם במשך 10 דקות.
- הסר את שברי התא ואת פסולת התא על ידי העברת supernatant לנקות צינורות חרוטי 1.5 מ"ל.
הערה: שימוש בצינורות חרוטיים של 1.5 מ"ל נחוץ כדי להגדיל את תפוקת הרכב החשמלי. - צנטריפוגה את supernatant ב 4 ° C, 16,000 x גרם במשך 30 דקות. הגלולה היא MVs. MVs מכל צלחת של תאים הושעו מחדש עם 50 μL של PBS.
- העבר את הסופרנאטנט המתקבל על ידי צנטריפוגה בשלב 2.5 על ידי פיפטה לניקוי צינורות אולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 1,50,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C.
- השליכו את הסופרנאטנט ואספו את השאריות, שהן אקסוס. Resuspend Exos משבע מנות של תאים ב 50 μL של PBS.
הערה: UCMSCs בעלי המעבר השישי משמשים לבידוד EV. כדי לקבל מספיק MVs ו Exos לשימוש ניסיוני, 7-8 מנות של תאים בתרבית נדרשים בדרך כלל. דגימות EV משמשות באופן מיידי לשלבי האפיון הבאים או ליישום טיפולי, שעדיף לא לאחסן.
זהירות: הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של כלי רכב חשמליים, ועדיף לאחסן רכבים חשמליים בטמפרטורה של 4°C בטווח הקצר ולא בטמפרטורה של -80°C.
3. איתור מספרי חלקיקים והתפלגות גודל של כלי רכב חשמליים מ-MSC
הערה: לצורך הערכת התפלגות גודל, ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA) מבוצע על ידי מנתח מעקב אחר ננו-חלקיקים הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- יש לדלל 1 μL של כלי רכב חשמליים (משלב 2.5 ושלב 2.7) ב-1,499 μL של PBS ולערבב מספיק בצינור של 15 מ"ל.
- הפעל את מנתח המעקב בהתאם להוראות היצרן. ראשית, הפעל את התוכנה התואמת (ראה טבלת חומרים).
- מלא את תא הדגימה במים מזוקקים, ולאחר מכן אפשר למכשיר להתחיל את בדיקת התא.
- כייל את המכשיר עם פתרון סטנדרטי מוכן. ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה הוא בין 50-400 (רצוי בסביבות 200). לחץ על אישור.
הערה: הכן את התמיסה הסטנדרטית על-ידי בנייה מחדש של 1 מיקרוליטר של תמיסת כיול (ראה טבלת חומרים) ב-1 מ"ל מים מזוקקים כדי ליצור תמיסה ראשונית, ולאחר מכן קח 100 מיקרוליטר של התמיסה הראשונית והוסף 25 מ"ל מים מזוקקים להכנת תמיסה סטנדרטית (1:250,000). אחסן מגיב עובד זה ב 4 °C במשך שבוע. - לשטוף את תא הדגימה עם 5 מ"ל של מים מזוקקים.
- לפני ניתוח הדגימה, לשטוף את התעלה עם 1 מ"ל של מים מזוקקים. ודא שמספר החלקיקים המוצג בממשק זיהוי התוכנה קטן מ- 10.
- הזריקו 1 מ"ל של דגימת EV שהוכנה בשלב 3.1. בצע בדיקת שלפוחית בהתאם להוראות ההפעלה של המכשיר.
זהירות: הדגימה והמים המזוקקים מוזרקים עם מזרק 1 מ"ל במהירות קבועה של 0.5 מ"ל/שנייה תחת בקרה ידנית קפדנית.
4. אפיון מורפולוגיית EV במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
- לדלל 1 μL של כלי רכב חשמליים משלב 2.7 ב 199 μL של PBS ולערבב מספיק. הוסיפו 20 מיקרוליטר של טיפות מתלה EV לרשת המרובעת המצופה בפורמבר/פחמן (ראו טבלת חומרים), והשאירו אותה למשך 3 דקות.
- הסר את עודפי הנוזלים על ידי נייר סינון קטן, ותן לו להישאר במשך 15 שניות כדי לייבש מעט את פני השטח.
- דגימות EV מכתימות באופן שלילי עם טיפות חומצה פוספוטונגסטית 1.5% למשך 40 שניות.
- הסר את עודף חומצה phosphotungstic ולאפשר לו לעמוד במשך 15 s כדי לייבש מעט את פני השטח.
- הניחו את הדוגמה המכילה רשת מרובעת מצופה טופס/פחמן בכלי נקי מכוסה בניירות פילטר. התבונן וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
הערה: בתהליך זה, Exos נלקחים כדוגמה.
5. תיוג כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC
- לאחר חילוץ EVs (שלב 2.5), השהה מחדש עם 250 μL של PBS בצינור חרוטי 1.5 מ"ל.
- השתמש עוד 1.5 מ"ל צינור חרוטי להכנת פתרון העבודה של צבע PKH26; השתמש 1 μL של מגיב תיוג PKH26 מדולל עם 250 μL של מדלל C (רכיב של ערכת תיוג EV זמין מסחרית המשמש במחקר הנוכחי, ראה טבלה של חומרים).
הערה: הכן את פתרון העבודה מיד לפני השימוש.
אזהרה: צבע או תיוג מוגזם של PKH26 ללא דילול מראש עלולים לגרום נזק לכלי הרכב החשמליים. - ערבבו את כלי הרכב החשמליים המושהים מחדש עם פתרון העבודה. אפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ולאחר מכן הוסף 500 μL של FBS מדולדל EV כדי לעצור את התגובה.
- עבור MVs, צנטריפוגה ב 4 ° C, 16,000 x גרם במשך 30 דקות, ולהשליך את supernatant על ידי פיפטה. הוסף 1 מ"ל של PBS כדי לשטוף את השאריות.
- צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C, 16,000 x גרם למשך 30 דקות, והשליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר את הצבע הלא קשור.
- להשעות מחדש את השאריות עם 200 μL של PBS. זרוק 20 μL של השעיה על המגלשה והתבונן בה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: בתהליך זה, MV נלקחים כדוגמה.
6. השתלה מקומית והזרקה סיסטמית של MSC-EV
הערה: עבור ההליכים הבאים, הניחו את כלי הרכב החשמליים על קרח לפני ההזרקה.
- בצע השתלה מקומית לפי השלבים הבאים.
- מרדימים את העכברים עם איזופלורן 4% (vol/vol). יש להקפיד על הרדמה באיזופלורן של 1%-3% במהלך ההליך.
- לפני הניתוח, יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן (IP) לשיכוך כאבים כדי למזער כאבים לאחר הניתוח.
- לפני כריתת הפצע, יש לגלח את השיער הגבי ולעקר את המשטח הגבי על ידי מריחת 3 סיבובים לסירוגין של 10% פובידון-יוד ו-75% אתנול.
- באמצעות ניקוב ביופסיה (ראו טבלת חומרים) נוצר פצע בעובי מלא של 1 ס"מ על העור הגבי.
- יש להשהות מחדש את כלי הרכב החשמליים שמקורם ב-MSC משתי צלחות ב-100 מיקרוליטר של PBS ולתת את ההזרקה בשכבה התת עורית של מיטת הפצע, סביב כל פצע עם ארבעה אתרים.
הערה: מוזרק בממוצע 100 מיקרוגרם של כלי רכב חשמליים לעכבר (כלי רכב חשמליים משתי צלחות תאים בקוטר 10 ס"מ). עשר צלחות של 10 ס"מ של MSCs דרושות כדי להניב מספיק כלי רכב חשמליים כדי להקים ניסוי של n = 5 במודל מורין. - לאחר הטיפול, עטפו את העכברים בגזה סטרילית והניחו אותם על רפידות בידוד חום (ראו טבלת חומרים) עד שיתעוררו.
- ודא שהעכברים לא יישארו ללא השגחה עד שהם יחזרו להכרה מספקת. אין להחזיר את העכברים לחברתם של בעלי חיים אחרים עד שיחלימו לחלוטין.
- מתן מנות נוספות של שיכוך כאבים ביום 2 וביום 3 לאחר הניתוח לפי הצורך.
- לבצע הזרקה מערכתית.
- השהה מחדש כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC ב-200 מיקרוליטר של PBS, ולאחר מכן ערבב עם תמיסת הפרין ביחס נפח של 10:1.
- הכניסו את העכברים למערכת הדמיית הוורידים הקאודליים (ראו טבלת חומרים). לחץ על המתג כדי להרים את הידית.
- יש לחטא את וריד הזנב באמצעות כרית אלכוהול לפני הזרקת העירוי. לאחר מכן, הזריקו לעכברים באופן שיטתי מתלה שהוכן בשלב 6.2.1 דרך וריד הזנב. ההליך נעזר במאייר ורידים זנב.
הערה: יש להזריק מתלה EV מיד לאחר ערבוב עם הפרין. בממוצע מוזרק 100 מיקרוגרם EV לעכבר (כלי רכב חשמליים משתי צלחות תאים בקוטר 10 ס"מ). עשר צלחות של 10 ס"מ של MSCs דרושות כדי להניב מספיק כלי רכב חשמליים כדי להקים ניסוי של n = 5 במודל מורין.
זהירות: הזרקת ורידים בזנב העכבר מוגבלת בדרך כלל לנפח של 200 מיקרוליטר. הזריקה צריכה ללכת לאט ולהפסיק אם אתה רואה בליטה או התנגדות, מה שמרמז על המחט היא מחוץ לווריד. אם העכברים מראים סימנים קליניים שליליים כמו סלסול ורעד, זו יכולה להיות תגובת הלם להזרקה בנפח גבוה, הזרקה מהירה או רעילות/אנפילקסיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MVs ו-Exos מ-UCMSCs אנושיים מתורבתים מבודדים בעקבות זרימת העבודה הניסויית (איור 1). תוצאות נת"ע מראות כי גודל Exos מ-MSCs אנושיים נע בין 40 ננומטר ל-335 ננומטר עם גודל שיא של כ-100 ננומטר, וגודל ה-MV נע בין 50 ננומטר ל-445 ננומטר עם גודל שיא של 150 ננומטר (איור 2). אפיון מורפולוגי של Exos שמקורו ב-MSC מציג צורת טיפוסית (איור 3). כלי רכב חשמליים מסומנים ביעילות על-ידי PKH26, אשר נצפה הן על-ידי התצוגה הגסה ככדוריות מסומנות והן על-ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4). הזרקות מקומיות וסיסטמיות של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC מבוצעות סביב פצע העור, או דרך הווריד הקאודלי (איור 5). לפיכך, Exos ו- MVs מבודדים בהצלחה ומיושמים לניסויים הבאים.
איור 1: בידוד של MV ו-Exos מתאי MSC אנושיים מתורבתים. מדיה תרבותית נאספת ומבוצעת צנטריפוגה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 2: ניתוח נת"ע של Exos ו-MV מ-MSC. חלוקת גודל חלקיקים עם תמונות מייצגות מתוארת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון מורפולוגיה של Exos מ-MSCs על-ידי TEM. Exos בצורת גביע מוצגים. פסי קנה מידה: 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תיוג MV שמקורו ב-MSC על-ידי PKH26. כדורי MV המסומנים בתווית PKH26 נצפים באופן גס ונצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניהול כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC. (A) השתלה מקומית סביב פצע העור ו-(B) הזרקה סיסטמית דרך הווריד הקאודלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כלי רכב חשמליים ממלאים תפקיד חשוב בפעילויות ביולוגיות מגוונות, כולל הצגת אנטיגן, הובלת חומרים גנטיים, שינוי מיקרו-סביבה של תאים ועוד. יתר על כן, היישום הרחב שלהם מביא גישות חדשות והזדמנויות לאבחון וטיפול במחלות21. יישום יישומים טיפוליים של כלי רכב חשמליים מבוסס על בידוד ואפיון מוצלחים. עם זאת, בשל היעדר שיטות בידוד וטיהור סטנדרטיות ויעילות המיצוי הנמוכה, מחקר הרכב החשמלי נפגע. מאמר זה מציג בעיקר פרוטוקול מיצוי ואפיון קל ליישום של כלי רכב חשמליים מתאי MSC אנושיים מתורבתים ויישומים נוספים, שניתן לתייג ולהשתמש בהם לקידום תיקון רקמות באמצעות הזרקה מקומית ולטיפול במחלות סיסטמיות על ידי הזרקה תוך ורידית. יכולת השחזור של MSCs לבידוד EV נשמרת על ידי שימוש במקור היילוד של UCMSCs, תרבית תאים סטנדרטית, וללא מעברים מאוחרים. למרות שהמונח Exos ו-MVs משמשים בהתאמה בכתב יד זה כדי להתייחס לכלי רכב חשמליים שנאספו ממהירויות צנטריפוגה דיפרנציאליות, יהיה צורך במחקרים נוספים במחקרים עתידיים כדי להבחין במקורותיהם, כפי שהומלץ על ידי ההנחיה Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV2018)22 , כגון על ידי הדמיה של תאים חיים לתצפית על תהליך הייצור ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים אימונו-אלקטרונים לגילוי הסמנים הספציפיים. בסך הכל, השיטה היא פשוטה ולכן ניתנת להרחבה ושחזור בקלות, אשר יהיה שימושי לתחום.
במחקר הנוכחי, כלי רכב חשמליים פיזיולוגיים מ-MSC מופרדים בהדרגה ל-MV ו-Exos על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-צנטריפוגה. כאן מודגשת המשמעות של החלפת α-MEM בתוספת FBS של 20% EV לאיסוף מדיום התרבית. שלב זה מבטיח שכלי הרכב החשמליים המופקים מופקים רק מ-MSC, למעט האפשרות שכלי רכב חשמליים עשויים להיות מחומרים מפריעים אחרים. כמו כן, חשוב לערבב תמיסת הפרין 10% בתמיסת הרכב החשמלי לפני הזרקה מערכתית. בשנים האחרונות, מספר מחקרים הראו כי לרכבים חשמליים יש השפעה מקרישה, ולכן הוספת הפרין במהלך הזרקה סיסטמית נחוצה כדי למנוע היווצרות פקקת לאחר ההזרקה, מה שמוביל אחרת לקטלניות חריפה של עכברים23. ייתכנו כמה בעיות במהלך יישום פרוטוקול זה הדורשות פתרון בעיות. לדוגמה בולטת אחת, אם כמות המיצוי של כלי רכב חשמליים אינה מספיקה, החוקרים צריכים להתחקות אחריה עד לשלב איסוף הסופרנאטנט של התא. במהלך איסוף סופרנאטנטים, יש לפוצץ תאים באופן שווה כדי לאסוף באופן מלא את כלי הרכב החשמליים המשתחררים השמורים במטריצה החוץ תאית של MSC. כשל פוטנציאלי נוסף מתרחש כאשר עכברים מתים זמן קצר לאחר הזרקת כלי רכב חשמליים. מלבד הוספת הפרין לפני ההזרקה, כאמור, יש להתאים את ריכוז כלי הרכב החשמליים המוזרקים (ממוצע של 100 מיקרוגרם EV לעכבר). כדי לאמת את הצלחת ההזרקה, ניתן לבצע הדמיה in vivo של הפצה ביולוגית של EV המסומנים בפלואורסצנטיות או מקטעים קפואים של אתרי רקמה ספציפיים של השתלה (הכבד, הטחול וכו '), אשר דווח בעבר24. כמו כן, מומלץ להשתמש ברכב חשמלי בהקדם האפשרי לאחר הבידוד, והקפאת האחסון תגרום לאובדן חלקיקים, הפחתת טוהר ותופעות איחוי שיובילו לחלקיקים ארטעובדתיים25. חוץ מזה, התיוג הנפוץ PKH26 יגדיל את גודל הרכב החשמלי26, וניתן להשתמש בשיטות תיוג אחרות להשוואה.
הפרוטוקולים הקיימים לבידוד כלי רכב חשמליים מדווחים בעיקר כדלקמן: אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וצפיפות שיפוע9, תהליך אולטרה-סינון10, הפרדה אימונומגנטית 11, כרומטוגרף הדרה מולקולרית 12, שבב מיקרופלואידי 13 וטכנולוגיית משקעים מבוססת פולימר27. בהשוואה לאולטרה-צנטריפוגה, תהליך האולטרה-סינון הוא שיטת מיצוי נוחה ותורמת להעשרת כלי רכב חשמליים בדגימות בנפח גדול יותר 9,10, כאשר החיסרון הוא שיש זיהום בממברנה, שקל לגרום לאיבוד דגימה. הפרדה אימונומגנטית מתאימה להפרדת תת-סוגים שונים של כלי רכב חשמליים, ולרכבים החשמליים המתקבלים יש טוהר גבוה. החיסרון של שיטה זו הוא עלות גבוהה עם תשואה נמוכה11. כלי הרכב החשמליים המופרדים על ידי כרומטוגרף הרחקה מולקולרית הם בעלי טוהר גבוה ותשואה גבוהה. החיסרון הוא שנדרש ציוד מיוחד ולא ניתן להשתמש בו למספר דגימות בו זמנית12. לשבבים מיקרופלואידים יש דרישות גבוהות לחומרים וטכנולוגיה, בעלות גבוהה, וקשה לעבד דגימות גדולות13. כלי הרכב החשמליים המופרדים בטכנולוגיית משקעים מבוססת פולימר מכילים מזהמים שאינם EV שישפיעו על פעילות הרכב החשמלי14. ביניהם, צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-צנטריפוגה היא עדיין השיטה הנפוצה ביותר להפרדה וטיהור של כלי רכב חשמליים ונחשבת לתקן הזהב למיצוי MSC-EV. הפרדה והעשרה של כלי רכב חשמליים ממדיית התרבות של MSC מושגות צעד אחר צעד באמצעות שילוב של זמן ומהירות שונים של צנטריפוגה, המייצג שיטה אופטימלית. ראוי לציין כי Exos ו-MVs שבודדו בכתב יד זה הם בעלי התפלגות גודל דומה, אם כי MVs נוטים להיות גדולים יותר, מה שעשוי לנבוע מצנטריפוגה דיפרנציאלית הנוטה לגרום לצבירה של ננו-חלקיקים. למרות ששיטות משופרות עשויות להשיג ביצועים טובים יותר בתחזוקת גודל של כלי רכב חשמליים, צנטריפוגה דיפרנציאלית היא יתרון ביעילות גבוהה עבור הפרדת EV28. למרות שעבור ייצור בקנה מידה גדול של כלי רכב חשמליים וייצור GMP, שיטה זו מוגבלת על ידי כמות המדיה שניתן לעבד בריצת בידוד אחת, המערכת הטכנית קלה להתקנה ויושמה על ידי פרויקטים תרגומיים על בעלי חיים גדולים29,30. בכל מקרה, לשיטות ההפרדה הנ"ל יש יתרונות וחסרונות, והחוקרים יכולים לבחור את השיטה המתאימה בהתאם למקורות השונים של כלי הרכב החשמליים ומטרת המחקר.
בשנים האחרונות, כלי רכב חשמליים הראו פוטנציאל גדול ביישומים קליניים, כגון אבחון מחלה31, טיפול, וכנשאים של מתן תרופות32,33. בהתבסס על תכונותיהם המועילות, מדינות שונות חקרו באופן נרחב כלי רכב חשמליים כסוכנים טיפוליים. בהקשר זה, מחקרים נעשו על EVs בטיפול במחלות ואת המנגנון העומד בבסיס התפקיד של EVs בפתוגנזה של המחלה. הפרוטוקול הנוכחי של בידוד, אפיון ויישום טיפולי של כלי רכב חשמליים מתאי MSC מתורבתים יושם היטב. לדוגמה, אספקה מקומית של MSC-Exos בפצעים בעור מקדמת ריפוי על ידי אפנון דלקתי והזרקת ורידים בזנב של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC יכולה לשפר את התנגודת לאינסולין בכבד וסטאטוזיס בסוכרת מסוג 2 מליטוס24. יתר על כן, יישומים טיפוליים הכוללים תפוקה מוגברת וטוהר של MSC-EV נמצאים באופק כדי לספק אסטרטגיות תרגום אפשריות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81930025 ו-82170988) ומהקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (2019M663986 ו-BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU) והמעבדה המרכזית לניתוח ובדיקות של המרכז לחדשנות רפואית צבאית של האוניברסיטה הרפואית של חיל האוויר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al.
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F.
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
