Summary
Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV'ler), çoğu hücre tipi tarafından salınan heterojen membran nanopartikülleridir ve organizma homeostazının fizyolojik düzenleyicileri ve patolojilerin önemli göstergeleri olarak giderek daha fazla tanınmaktadır; Bu arada, erişilebilir ve kontrol edilebilir hastalık terapötikleri oluşturmak için muazzam potansiyelleri ortaya çıkmaktadır. Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), etkili doku rejenerasyonunu hızlandırma ve iyi ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik ile kapsamlı terapötik uygulamaları kolaylaştırma sözü veren kültürde büyük miktarda EV'yi serbest bırakabilir. MSC-EV'lerin toplanması ve uygulanması için basit ve etkili protokollere yönelik artan bir talep vardır. Burada, temsili EV'leri kültürlü insan MSC'lerinden, eksozomlardan ve mikro-parçacıklardan izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntemin uyarlanabilirliği, etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımı için gösterilmiştir. Bu prosedürün uygulanması, translasyonel araştırmalarda basit ve güvenilir MSC-EV'lerin toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.
Introduction
Kök hücreler kendini yenileme yeteneğine ve translasyonel potansiyele sahip farklılaşmamış pluripotent hücrelerdir1. Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) laboratuvarda kolayca izole edilir, kültürlenir, genişletilir ve saflaştırılır, bu da çoklu geçişlerden sonra kök hücrelerin karakteristiği olarak kalır. Son yıllarda, artan kanıtlar, MSC'lerin terapötik kullanımda parakrin modda hareket ettiği görüşünü desteklemektedir 2,3. Özellikle hücre dışı veziküllerin (EV) salgılanması, MSC'lerin biyolojik fonksiyonlarına aracılık etmede çok önemli bir rol oynamaktadır. Çoğu hücre tipinden salınan heterojen membranöz nanopartiküller olarak, EV'ler eksozomlar (Exos), mikro-parçacıklar (MV'ler) ve hatta daha büyük apoptotik cisimler 4,5 olarak adlandırılan alt kategorilerden oluşur. Bunlar arasında Exos, endozomal kökenli ve fizyolojik koşullarda aktif olarak salgılanan 40-150 nm büyüklüğünde en çok çalışılan EV'dir. MV'ler, yüksek fosfatidilserin ekspresyonu ve donör hücrelerin yüzey belirteçlerinin ekspresyonu ile karakterize edilen 100-1.000 nm çapında hücre plazma zarının yüzeyinden doğrudan dökülerek oluşturulur6. EV'ler, ana hücrelere benzer işlevlere sahip olan ve hücre iletişimi, bağışıklık tepkisi ve doku hasarı onarımında önemli bir rol oynayan RNA, proteinler ve diğer biyoaktif molekülleri içerir7. MSC-EV'ler, rejeneratif tıpta güçlü bir hücresiz terapötik araç olarak geniş çapta araştırılmıştır8.
MSC kaynaklı EV'lerin izolasyonu ve saflaştırılması, araştırma ve uygulama alanında yaygın bir konudur. Günümüzde, diferansiyel ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme9, ultrafiltrasyon işlemi 10, immünomanyetik ayırma 11, moleküler dışlama kromatografı12 ve mikroakışkan çip13, EV'lerin izolasyonunda ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Her yaklaşımın avantajları ve dezavantajları ile, toplanan EV'lerin miktarı, saflığı ve aktivitesi aynı anda karşılanamaz14,15. Bu çalışmada, EV'lerin kültürlü MSC'lerden izolasyonu ve karakterizasyonunun diferansiyel santrifüjleme protokolü ayrıntılı olarak gösterilmiş olup, etkin terapötik kullanımı desteklemiştir 16,17,18,19,20. Bu yöntemin floresan etiketleme, lokal transplantasyon ve sistemik enjeksiyon gibi bir dizi aşağı akış yaklaşımına uyarlanabilirliği daha da örneklenmiştir. Bu prosedürün uygulanması, MSC-EV'lerin çeviri araştırmalarında basit ve güvenilir bir şekilde toplanması ve uygulanması ihtiyacını ele alacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sekiz haftalık C57Bl / 6 fareler (dişi veya erkek tercihi yok) kullanıldı. Bu çalışma için kullanılan kriyokorunmuş insan göbek kordonu türevli MSC'ler (UCMSC'ler), ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. İnsan hücrelerinin kullanımı Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. İnsan mezenkimal kök hücrelerinin kültürü (hMSC'ler)
- Pipetler, pipet uçları, 10 cm Petri kabı, termostatik ekipman (su banyosu), lastik eldivenler, %75 alkol, kültür ortamı (37 °C'de inkübe edilmiş), ölümcül sığır serumu (FBS) ve 100x penisilin-streptomisin (P/S) çözeltisi dahil olmak üzere deneysel çalışma için gerekli aksesuarları ve çözeltileri hazırlayın (bkz.
- %20 FBS ve %1 P/S ile takviye ederek piyasada satılan alfa-Minimum Temel Ortamı (α-MEM) hazırlayın.
NOT: EV'lerin izolasyonu ve analizi için kullanılan tüm çözeltileri, ultra saf filtrelenmiş su arıtma sistemi tarafından yapılan ultra saf filtrelenmiş suda seyreltin ( bkz. - Kriyokorunmuş insan göbek kordonu türevli MSC'leri (UCMSC'ler) sıvı azottan 37 ° C'lik bir su banyosunda eriterek geri kazanın.
- Erimiş hücre süspansiyonunu hızlı ve nazik bir şekilde 5 mL kültür ortamına sahip 15 mL'lik bir tüpe aktarın (adım 1.2). 4 °C'de santrifüj, 5 dakika boyunca 500 x g .
- Supernatantı steril bir pipetle çıkarın ve hücre çökeltisini koruyun. Santrifüj tüpüne 2 mL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden askıya alın.
- Hücreleri 10 cm'lik bir Petri kabına ekin ve toplam 10 mL'ye 8 mL kültür ortamı ekleyin.
- Hücre inkübatöründe %5 CO2'de 37 °C'de kültür MSC'leri.
2. Exos ve MV'lerin izolasyonu için diferansiyel santrifüjleme
- MSC'ler% >90 birleşime ulaştığında, kültür ortamını, her bir yemeğin 8 mL'si için% 20 EV tükenmiş FBS ve% 1 P / S ile desteklenmiş α-MEM ile değiştirin.
NOT: EV'leri ve diğer safsızlıkları gidermek için FBS'yi 4 ° C'de, gece boyunca 1.50.000 x g'de santrifüj edin. - 48 saatlik kültürden sonra, kültür ortamını (adım 2.1) 50 mL santrifüj tüplerine toplayın.
- MSC kültür ortamını 4 ° C'de, 800 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- 1.5 mL konik tüpleri temizlemek için süpernatantı aktararak hücre parçalarını ve hücresel kalıntıları çıkarın.
NOT: EV verimini artırmak için 1,5 mL konik tüpler kullanmak gereklidir. - Süpernatantı 4 ° C'de, 16.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Pelet MV'lerdir. Her hücre kabından MV'ler 50 μL PBS ile yeniden askıya alındı.
- Santrifüjleme ile elde edilen süpernatantı adım 2.5'te pipetle ultrasantrifüj tüplerini temizlemek için aktarın. 4 °C'de 2 saat boyunca 1.50.000 x g'de santrifüj.
- Supernatant'ı atın ve Exos olan kalıntıyı toplayın. Exos'u 50 μL PBS'deki yedi hücre kabından yeniden askıya alın.
NOT: Altıncı pasajlı UCMSC'ler EV izolasyonu için kullanılır. Deneysel kullanım için yeterli MV ve Exos elde etmek için, genellikle 7-8 çeşit kültürlü hücreye ihtiyaç vardır. EV numuneleri, aşağıdaki karakterizasyon adımları için veya depolanmaması daha iyi olan terapötik uygulama için hemen kullanılır.
DİKKAT: EV'lerin tekrar tekrar donmasını ve çözülmesini önleyin ve EV'leri -80 ° C'de değil, kısa vadede 4 ° C'de saklamak en iyisidir.
3. MSC'lerden EV'lerin partikül sayılarının ve boyut dağılımının tespiti
NOT: Boyut dağılımı değerlendirmesi için, nanopartikül izleme analizi (NTA), ticari olarak temin edilebilen bir nanopartikül izleme analizörü tarafından gerçekleştirilir (bakınız Malzeme Tablosu).
- 1.499 μL PBS'de 1 μL EV'yi (adım 2.5 ve adım 2.7'den) seyreltin ve 15 mL'lik bir tüpte yeterince karıştırın.
- İzleme analizörünü üreticinin talimatlarını izleyerek çalıştırın. İlk olarak, uyumlu yazılımı başlatın (bkz.
- Numune hücresini damıtılmış suyla doldurun ve ardından cihazın hücre kontrolünü başlatmasına izin verin.
- Cihazı hazırlanmış bir standart çözelti ile kalibre edin. Yazılım algılama arayüzünde görüntülenen partikül numarasının 50-400 arasında (tercihen 200 civarında) olduğundan emin olun. Tamam'ı tıklatın.
NOT: Birincil çözelti oluşturmak için 1 mL damıtılmış suda 1 μL kalibrasyon çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden oluşturarak standart çözeltiyi hazırlayın ve ardından birincil çözeltiden 100 μL alın ve standart bir çözelti hazırlamak için 25 mL damıtılmış su ekleyin (1:250.000). Bu çalışan reaktifi bir hafta boyunca 4 ° C'de saklayın. - Numune hücresini 5 mL damıtılmış su ile durulayın.
- Numune analizinden önce, kanalı 1 mL damıtılmış su ile yıkayın. Yazılım algılama arabiriminde görüntülenen parçacık numarasının 10'dan az olduğundan emin olun.
- Adım 3.1'de hazırlanan EV numunesinin 1 mL'sini enjekte edin. Vezikül testini cihazın kullanım talimatlarına göre yapın.
DİKKAT: Numune ve damıtılmış su, dikkatli manuel kontrol altında 0,5 mL/sn sabit hızda 1 mL'lik bir şırınga ile enjekte edilir.
4. EV morfolojisinin transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile karakterizasyonu
- Adım 2.7'den itibaren 1 μL EV'yi 199 μL PBS'de seyreltin ve yeterince karıştırın. Formvar/karbon kaplı kare ağa 20 μL EV süspansiyon damlası ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 3 dakika bekletin.
- Fazla sıvıyı küçük bir filtre kağıdıyla çıkarın ve yüzeyi hafifçe kurutması için 15 saniye bekletin.
- EV numunelerini 40 sn boyunca% 1.5 fosfotungstik asit damlacıkları ile negatif olarak lekeleyin.
- Fazla fosfotungstik asidi çıkarın ve yüzeyi hafifçe kurutmak için 15 saniye bekletin.
- Formvar/karbon kaplı kare örgü içeren numuneyi filtre kağıtlarıyla kaplı temiz bir kaba koyun. İletim elektron mikroskobu ile görüntüleri gözlemleyin ve yakalayın.
NOT: Bu süreçte örnek olarak Exos alınmıştır.
5. MSC'lerden türetilmiş EV'lerin etiketlenmesi
- EV'lerin ekstraksiyonundan sonra (adım 2.5), 1.5 mL'lik bir konik tüpte 250 μL PBS ile yeniden askıya alın.
- PKH26 boyasının çalışma çözeltisini hazırlamak için başka bir 1,5 mL konik tüp kullanın; 250 μL Seyreltici C ile seyreltilmiş 1 μL PKH26 etiketleme reaktifi kullanın (bu çalışma için kullanılan ticari olarak temin edilebilen EV etiketleme kitinin bir bileşeni, bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: Kullanmadan hemen önce çalışma solüsyonunu hazırlayın.
DİKKAT: Ön seyreltme olmadan aşırı PKH26 boya veya etiketleme, EV'lere zarar verme riski altındadır. - Askıya alınmış EV'leri çalışma çözeltisiyle karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 500 μL EV tükenmiş FBS ekleyin.
- MV'ler için, 4 ° C'de, 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle atın. Kalıntıyı durulamak için 1 mL PBS ekleyin.
- 4 ° C'de, 30 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın ve bağlanmamış boyayı çıkarmak için süpernatantı atın.
- Kalıntıyı 200 μL PBS ile tekrar askıya alın. Slaytın üzerine 20 μL süspansiyon bırakın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: Bu süreçte örnek olarak MV'ler alınmıştır.
6. MSC-EV'lerin lokal transplantasyonu ve sistemik enjeksiyonu
NOT: Aşağıdaki prosedürler için, enjeksiyondan önce EV'leri buz üzerine yerleştirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek lokal transplantasyon gerçekleştirin.
- Fareleri %4 (vol/vol) izofluran ile uyuşturun. İşlem sırasında anesteziyi% 1-3 izofluranda tutun.
- Ameliyattan önce, işlem sonrası ağrıyı en aza indirmek için analjezi için 5 mg / kg karprofen (IP) uygulayın.
- Yara eksizyonundan önce, sırt saçlarını tıraş edin ve% 10 povidon-iyot ve% 75 etanolden oluşan 3 alternatif tur uygulayarak dorsal yüzeyi sterilize edin.
- Bir biyopsi zımba kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), sırt derisinde 1 cm çapında tam kalınlıkta bir yara oluşturun.
- MSC'den türetilmiş EV'leri 100 μL PBS'deki iki çanaktan tekrar askıya alın ve enjeksiyonu yara yatağının deri altı tabakasında, her bir yaranın etrafında dört bölgeyle uygulayın.
NOT: Fare başına ortalama 100 μg EV (iki adet 10 cm'lik hücre kabından EV'ler) enjekte edilir. Bir murin modelinde n = 5'lik bir deney yapmak için yeterli EV'yi üretmek için on adet 10 cm'lik MSC kabına ihtiyaç vardır. - İşlemden sonra, fareleri steril gazlı bezle sarın ve uyanana kadar ısı yalıtım pedlerine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Farelerin yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmadığından emin olun. Tamamen iyileşene kadar fareleri diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.
- Gerektiğinde ameliyat sonrası 2. ve 3. günde ek dozlarda analjezi uygulayın.
- Sistemik enjeksiyon yapın.
- MSC türevi EV'leri 200 μL PBS'de yeniden askıya alın ve ardından 10: 1 hacim oranında heparin çözeltisi ile karıştırın.
- Fareleri kaudal ven görüntüleme sistemine yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu). Kolu kaldırmak için düğmeye basın.
- IV enjeksiyonundan önce kuyruk damarını bir alkol pedi kullanarak dezenfekte edin. Daha sonra, fareleri sistematik olarak adım 6.2.1'de hazırlanan süspansiyonla kuyruk damarından enjekte edin. Prosedüre bir kuyruk damarı illüstratör yardımcı olur.
NOT: Heparin ile karıştırdıktan hemen sonra EV süspansiyonunu enjekte edin. Fare başına ortalama 100 μg EV (iki adet 10 cm'lik hücre kabından EV'ler) enjekte edilir. Bir murin modelinde n = 5'lik bir deney yapmak için yeterli EV'yi üretmek için on adet 10 cm'lik MSC kabına ihtiyaç vardır.
DİKKAT: Fare kuyruğu damarı enjeksiyonu genellikle 200 μl hacimle sınırlıdır. Enjeksiyon yavaşça gitmeli ve iğnenin damardan çıktığını gösteren bir yumru veya direnç görürseniz durmalıdır. Fareler kıvrılma ve titreme gibi olumsuz klinik belirtiler gösteriyorsa, bu yüksek hacimli enjeksiyona, hızlı enjeksiyona veya toksisiteye / anafilaksiye şok yanıtı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültürlü insan KMLSC'lerinden MV'ler ve Exo'lar, deneysel iş akışını takiben izole edilir (Şekil 1). NTA sonuçları, insan MSC'lerinden Exos'un boyutunun yaklaşık 100 nm'lik bir tepe boyutuyla 40 nm ila 335 nm arasında değiştiğini ve MV'lerin boyutunun 150 nm'lik bir tepe boyutuyla 50 nm ila 445 nm arasında değiştiğini göstermektedir (Şekil 2). MSC kaynaklı Exos'un morfolojik karakterizasyonu tipik bir fincan şekli sergiler (Şekil 3). EV'ler, hem etiketli peletler olarak brüt görünüm hem de floresan mikroskopi ile gözlemlenen PKH26 ile verimli bir şekilde etiketlenir (Şekil 4). MSC kaynaklı EV'lerin lokal ve sistemik enjeksiyonları cilt yarasının etrafında veya kaudal ven yoluyla yapılır (Şekil 5). Böylece, Exos ve MV'ler başarılı bir şekilde izole edilir ve sonraki deneyler için uygulanır.
Şekil 1: MV'lerin ve Exo'ların kültürlü insan MSC'lerinden izolasyonu. Kültür ortamı toplanır ve diferansiyel santrifüjleme yapılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MSC'lerden Exos ve MV'lerin NTA analizi. Temsili görüntülerle parçacık boyutu dağılımı tasvir edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MSC'lerden Exos'un TEM ile morfoloji karakterizasyonu. Kupa şeklindeki Exo'lar görüntülenir. Ölçek çubukları: 200 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MSC türevi MV'lerin PKH26 ile etiketlenmesi. PKH26 etiketli MV peletleri floresan mikroskop altında büyük ölçüde gözlemlenir ve görüntülenir. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MSC türevi EV'lerin yönetimi. (A) Deri yarası çevresinde lokal transplantasyon ve (B) Kaudal ven yoluyla sistemik enjeksiyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV'ler, antijen sunumu, genetik materyal taşınması, hücre mikroçevre modifikasyonu ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktivitelerde önemli bir rol oynamak için ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, geniş uygulamaları hastalıkların teşhisi ve tedavisi için yeni yaklaşımlar ve fırsatlar getirmektedir21. EV'lerin terapötik uygulamalarının uygulanması, başarılı izolasyon ve karakterizasyona dayanmaktadır. Bununla birlikte, standartlaştırılmış izolasyon ve saflaştırma yöntemlerinin eksikliği ve düşük ekstraksiyon verimliliği nedeniyle, EV araştırmaları engellenmiştir. Bu makale temel olarak, kültürlenmiş insan MSC'lerinden EV'lerin kolayca uygulanabilir bir ekstraksiyon ve karakterizasyon protokolünü ve lokal enjeksiyon yoluyla doku onarımını teşvik etmek ve sistemik hastalıkları intravenöz enjeksiyonla tedavi etmek için etiketlenebilen ve kullanılabilen diğer uygulamaları tanıtmaktadır. MSC'lerin EV izolasyonu için tekrarlanabilirliği, KMSC'lerin yenidoğan kökeni, hücrelerin standart kültürü ve geç pasajlar kullanılmadan korunur. Her ne kadar bu makalede Exos ve MV'ler terimi sırasıyla diferansiyel santrifüjleme hızlarından toplanan EV'lere atıfta bulunmak için kullanılsa da, üretim sürecini gözlemlemek için canlı hücre görüntüleme ve spesifik belirteçleri tespit etmek için immüno-elektron mikroskobu gibi Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi (MISEV2018)22 kılavuzunda önerildiği gibi, kökenlerini ayırt etmek için gelecekteki çalışmalarda daha fazla tahlile ihtiyaç duyulacaktır. Genel olarak, yöntem basittir ve bu nedenle kolayca ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, bu da alan için yararlı olacaktır.
Bu çalışmada, MSC'lerden fizyolojik EV'ler, diferansiyel santrifüjleme ve ultrasantrifüjleme ile aşamalı olarak MV'lere ve Exos'lara ayrılmıştır. Burada, kültür ortamını toplamak için% 20 EV tükenmiş FBS ile desteklenen α-MEM'in değiştirilmesinin önemi vurgulanmaktadır. Bu adım, çıkarılan EV'lerin yalnızca MSC'lerden türetilmesini sağlar, EV'lerin diğer müdahale eden maddelerden olabileceği ihtimalini hariç tutar. Sistemik enjeksiyondan önce% 10 heparin çözeltisinin EV çözeltisine karıştırılması da kritik öneme sahiptir. Son yıllarda, birkaç çalışma EV'lerin prokoagülan bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir, bu nedenle enjeksiyondan sonra trombüs oluşumunu önlemek için sistemik enjeksiyon sırasında heparin eklenmesi gereklidir, aksi takdirde farelerin akut ölümcüllüğüne yol açar23. Bu protokol uygulaması sırasında sorun giderme gerektiren bazı sorunlar olabilir. Öne çıkan bir örnek için, EV'lerin ekstraksiyon miktarı yeterli değilse, araştırmacılar bunu hücre süpernatant toplama adımına kadar izlemelidir. Süpernatant toplama sırasında, MSC'lerin hücre dışı matrisinde tutulan salınan EV'leri tamamen toplamak için hücreler eşit şekilde üflenmelidir. Başka bir potansiyel başarısızlık, fareler EV'lerin enjeksiyonundan kısa bir süre sonra öldüğünde ortaya çıkar. Enjeksiyondan önce heparin eklenmesinin yanı sıra, yukarıda belirtildiği gibi, enjekte edilen EV'lerin konsantrasyonu (fare başına ortalama 100 μg EV) ayarlanmalıdır. Enjeksiyonun başarısını doğrulamak için, floresan etiketli EV'lerin biyodağılımının in vivo görüntülemesi veya engraftmanın spesifik doku bölgelerinin (karaciğer, dalak, vb.) dondurulmuş kesitleri yapılabilir, ki bu daha önce bildirilmiştir24. Ayrıca, EV'lerin izolasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede kullanılması tavsiye edilir ve dondurucu depolama, partikül kaybına, saflığın azalmasına ve artefaktüel parçacıklara yol açan füzyon olaylarına neden olur25. Ayrıca, yaygın olarak benimsenen PKH26 etiketlemesi, EV boyutu26'yı artıracaktır ve karşılaştırma için diğer etiketleme yöntemleri kullanılabilir.
EV'lerin izole edilmesi için mevcut protokoller temel olarak şu şekilde bildirilmiştir: diferansiyel ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme9, ultrafiltrasyon işlemi 10, immünomanyetik ayırma11, moleküler dışlama kromatografı 12, mikroakışkan çip 13 ve polimer bazlı çökeltme teknolojisi27. Ultrasantrifüjleme ile karşılaştırıldığında, ultrafiltrasyon işlemi uygun bir ekstraksiyon yöntemidir ve EV'lerin daha büyük hacimli numunelerdezenginleştirilmesine elverişlidir 9,10, dezavantajı ise numune kaybına neden olması kolay olan membran kirliliğinin olmasıdır. İmmünomanyetik ayırma, EV'lerin farklı alt tiplerini ayırmak için uygundur ve elde edilen EV'ler yüksek saflığa sahiptir. Bu yöntemin dezavantajı, düşük verim11 ile yüksek maliyettir. Moleküler dışlama kromatografı ile ayrılan EV'ler yüksek saflığa ve yüksek verime sahiptir. Dezavantajı, özel ekipmanın gerekli olması ve aynı anda birden fazla numune için kullanılamamasıdır12. Mikroakışkan çipler, yüksek maliyetle malzeme ve teknoloji için yüksek gereksinimlere sahiptir ve büyük numuneleri işlemek zordur13. Polimer bazlı çökeltme teknolojisi ile ayrılan EV'ler, EV aktivitesini etkileyecek EV olmayan kirleticiler içerir14. Bunlar arasında, diferansiyel santrifüjleme ve ultrasantrifüjleme, EV'lerin ayrılması ve saflaştırılması için hala en yaygın kullanılan yöntemdir ve MSC-EV ekstraksiyonu için altın standart olarak kabul edilmektedir. EV'lerin MSC kültür ortamından ayrılması ve zenginleştirilmesi, optimize edilmiş bir yöntemi temsil eden farklı zaman ve santrifüj hızının kombinasyonu ile adım adım gerçekleştirilir. Bu makalede izole edilen Exos ve MV'lerin benzer boyut dağılımlarına sahip olması dikkat çekicidir, ancak MV'ler daha büyük olma eğilimindedir, bu da nanopartiküllerin toplanmasına neden olma eğiliminde olan diferansiyel santrifüjlemeden kaynaklanıyor olabilir. Modifiye yöntemler EV'lerin boyut bakımında daha iyi performans gösterebilse de, diferansiyel santrifüjleme EV ayırma28 için yüksek verimlilikte avantajlıdır. EV'lerin büyük ölçekli üretimi ve GMP üretimi için, bu yöntem tek bir izolasyon çalışmasında işlenebilecek ortam miktarı ile sınırlı olmasına rağmen, teknik sistemin kurulumu kolaydır ve büyük hayvanlar üzerinde çeviri projeleri tarafından uygulanmıştır29,30. Her neyse, yukarıdaki ayırma yöntemlerinin avantajları ve dezavantajları vardır ve araştırmacılar farklı EV'lerin kaynaklarına ve araştırma amacına göre uygun yöntemi seçebilirler.
Son yıllarda, EV'ler hastalık teşhisi31, tedavi ve ilaç dağıtımının taşıyıcıları olarak32,33 gibi klinik uygulamalarda büyük potansiyel göstermiştir. Avantajlı özelliklerine dayanarak, çeşitli ülkeler EV'leri terapötik ajanlar olarak yaygın olarak incelemiştir. Bu bağlamda, hastalık tedavisinde EV'lere ve EV'lerin hastalığın patogenezindeki rolünün altında yatan mekanizmaya yönelik çalışmalar yapılmıştır. EV'lerin kültürlü MSC'lerden izolasyonu, karakterizasyonu ve terapötik uygulaması ile ilgili mevcut protokol iyi uygulanmıştır. Örneğin, cilt yaralarında MSC-Exos'un lokal olarak verilmesi, enflamatuar modülasyon ile iyileşmeyi teşvik eder ve MSC kaynaklı EV'lerin kuyruk damarı enjeksiyonu, tip 2 diabetes mellitus24'te hepatik insülin direncini ve steatozu artırabilir. Ayrıca, MSC-EV'lerin artan verimini ve saflığını içeren terapötik uygulamalar, uygulanabilir çeviri stratejileri sağlamak için ufukta görünmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81930025 ve 82170988) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi (AMFU) ve Hava Kuvvetleri Tıp Üniversitesi Askeri Tıbbi İnovasyon Merkezi Analitik ve Test Merkez Laboratuvarı'nın yardımları için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al.
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F.
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
