Summary
Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV's (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC's. Verdere toepassingen van deze EV's worden in dit artikel ook toegelicht.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn heterogene membraannanodeeltjes die door de meeste celtypen worden vrijgegeven en ze worden steeds meer erkend als fysiologische regulatoren van organismale homeostase en belangrijke indicatoren van pathologieën; In de tussentijd ontstaat hun immense potentieel om toegankelijke en controleerbare ziektetherapieën op te zetten. Mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen grote hoeveelheden EV's in cultuur vrijgeven, die veelbelovend zijn gebleken om effectieve weefselregeneratie op gang te brengen en uitgebreide therapeutische toepassingen met goede schaalbaarheid en reproduceerbaarheid mogelijk te maken. Er is een groeiende vraag naar eenvoudige en effectieve protocollen voor het verzamelen en toepassen van MSC-EV's. Hier wordt een gedetailleerd protocol geleverd op basis van differentiële centrifugatie om representatieve EV's te isoleren en te karakteriseren uit gekweekte menselijke MSC's, exosomen en microvesicles voor verdere toepassingen. Het aanpassingsvermogen van deze methode wordt aangetoond voor een reeks downstream-benaderingen, zoals etikettering, lokale transplantatie en systemische injectie. De implementatie van deze procedure zal tegemoetkomen aan de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare MSC-EV's die worden verzameld en toegepast in translationeel onderzoek.
Introduction
Stamcellen zijn ongedifferentieerde pluripotente cellen met zelfvernieuwingsvermogen en translatiepotentieel1. Mesenchymale stamcellen (MSC's) worden gemakkelijk geïsoleerd, gekweekt, uitgebreid en gezuiverd in het laboratorium, wat kenmerkend blijft voor stamcellen na meerdere passages. In de afgelopen jaren is er steeds meer bewijs dat de opvatting ondersteunt dat MSC's in een paracriene modus werken bij therapeutisch gebruik 2,3. Vooral de afscheiding van extracellulaire blaasjes (EV's) speelt een cruciale rol bij het bemiddelen van de biologische functies van MSC's. Als heterogene vliezige nanodeeltjes die vrijkomen uit de meeste celtypen, bestaan EV's uit subcategorieën die exosomen (Exos), microvesicles (MV's) en nog grotere apoptotische lichamenworden genoemd 4,5. Onder hen is Exos de meest bestudeerde EV met een grootte van 40-150 nm, die van endosomale oorsprong is en actief wordt uitgescheiden in fysiologische omstandigheden. MV's worden gevormd door rechtstreeks van het oppervlak van het celplasmamembraan af te stoten met een diameter van 100-1.000 nm, die worden gekenmerkt door een hoge expressie van fosfatidylserine en expressie van oppervlaktemarkers van donorcellen6. EV's bevatten RNA, eiwitten en andere bioactieve moleculen, die vergelijkbare functies hebben als de oudercellen en een belangrijke rol spelen bij celcommunicatie, immuunrespons en herstel van weefselschade7. MSC-EV's zijn op grote schaal onderzocht als een krachtig celvrij therapeutisch hulpmiddel in regeneratieve geneeskunde8.
Isolatie en zuivering van MSC-afgeleide EV's is een veel voorkomend probleem op het gebied van onderzoek en toepassing. Op dit moment zijn differentiële en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie9, ultrafiltratieproces 10, immunomagnetische scheiding11, moleculaire uitsluitingschromatograaf 12 en microfluïdische chip13 veelgebruikte methoden bij de isolatie en zuivering van EV's. Met de voor- en nadelen van elke aanpak kan niet tegelijkertijd worden voldaan aan de hoeveelheid, zuiverheid en activiteit van ingezamelde EV's14,15. In de huidige studie wordt het differentiële centrifugatieprotocol van isolatie en karakterisering van EV's uit gekweekte MSC's in detail getoond, wat efficiënt therapeutisch gebruik heeft ondersteund 16,17,18,19,20. Het aanpassingsvermogen van deze methode voor een reeks downstream-benaderingen, zoals fluorescerende etikettering, lokale transplantatie en systemische injectie, is verder geïllustreerd. De implementatie van deze procedure zal tegemoetkomen aan de behoefte aan eenvoudige en betrouwbare verzameling en toepassing van MSC-EV's in translationeel onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Fourth Military Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Acht weken oude C57Bl/6-muizen (geen voorkeur voor vrouwtjes of mannetjes) werden gebruikt. Gecryopreserveerde mkstreng-afgeleide MSC's (UCMSC's), die voor deze studie werden gebruikt, werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen). Het gebruik van menselijke cellen werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Vierde Militaire Medische Universiteit.
1. Kweek van menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs)
- Bereid de accessoires en oplossingen voor die nodig zijn voor het experimentele werk, waaronder pipetten, pipetpunten, petrischaal van 10 cm, thermostatische apparatuur (waterbad), rubberen handschoenen, 75% alcohol, kweekmedium (geïncubeerd bij 37 °C), fataal runderserum (FBS) en 100x penicilline-streptomycine (P / S) oplossing (zie tabel met materialen).
- Bereid in de handel verkrijgbaar alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) door aan te vullen met 20% FBS en 1% P / S.
OPMERKING: Verdun alle oplossingen die worden gebruikt voor isolatie en analyse van EV's in ultrapuur gefilterd water gemaakt door het ultrazuivere gefilterde waterzuiveringssysteem (zie materiaaltabel). - Recupereer de gecryopreserveerde msc's van de menselijke navelstreng (UCMSC's) uit de vloeibare stikstof door ze te smelten in een waterbad van 37 °C.
- Breng de gesmolten celsuspensie snel en voorzichtig over in een buis van 15 ml met 5 ml kweekmedium (stap 1.2). Centrifugeer bij 4 °C, 500 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant met een steriele pipet en houd het celprecipitaat vast. Voeg 2 ml kweekmedium toe aan de centrifugebuis en resuspensie de cellen voorzichtig.
- Zaai de cellen in een petrischaal van 10 cm en voeg 8 ml kweekmedium toe tot een totaal van 10 ml.
- Kweek MSC's bij 37 °C in 5% CO2 in de celincubator.
2. Differentiële centrifugatie voor isolatie van Exos en MVs
- Wanneer MSC's groeien tot >90% samenvloeiing, vervang dan het kweekmedium door α-MEM aangevuld met 20% EV-uitgeputte FBS en 1% P / S voor 8 ml van elk gerecht.
OPMERKING: Centrifugeer FBS bij 4 °C, 1.50.000 x g 's nachts om EV's en andere onzuiverheden te verwijderen. - Verzamel na 48 uur kweek het kweekmedium (stap 2.1) in centrifugebuizen van 50 ml.
- Centrifugeer het MSC-kweekmedium gedurende 10 minuten bij 4 °C, 800 x g .
- Verwijder de celfragmenten en cellulair afval door het supernatant over te brengen naar schone conische buizen van 1,5 ml.
OPMERKING: Het gebruik van 1,5 ml conische buizen is noodzakelijk om de EV-opbrengst te verhogen. - Centrifugeer het supernatant bij 4 °C, 16.000 x g gedurende 30 minuten. De pellet is MVs. MVs van elke schaal van cellen werden geresuspendeerd met 50 μL PBS.
- Breng het door centrifugeren verkregen supernatant in stap 2.5 met een pipet over in schone ultracentrifugebuizen. Centrifugeer bij 1.50.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en verzamel het residu, dat is Exos. Resuspendie exos uit zeven schotels van cellen in 50 μL PBS.
OPMERKING: De zesde UCMSC's worden gebruikt voor EV-isolatie. Om voldoende MVs en Exos voor experimenteel gebruik te krijgen, zijn meestal 7-8 schotels met gekweekte cellen nodig. De EV-monsters worden onmiddellijk gebruikt voor de volgende karakteriseringsstappen of voor therapeutische toepassing, die beter niet kan worden opgeslagen.
LET OP: Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van EV's, en het is het beste om EV's op korte termijn bij 4 °C te bewaren en niet bij -80 °C.
3. Detectie van deeltjesaantallen en grootteverdeling van EV's van MSC's
OPMERKING: Voor de evaluatie van de grootteverdeling wordt nanodeeltjestrackinganalyse (NTA) uitgevoerd door een in de handel verkrijgbare nanodeeltjestraceringsanalysator (zie materiaaltabel).
- Verdun 1 μL EV's (vanaf stap 2.5 en stap 2.7) in 1.499 μL PBS en meng voldoende in een buis van 15 ml.
- Bedien de trackinganalysator volgens de instructies van de fabrikant. Start eerst de compatibele software (zie Materiaaltabel).
- Vul de monstercel met gedestilleerd water en laat het instrument de celcontrole starten.
- Kalibreer het instrument met een voorbereide standaardoplossing. Zorg ervoor dat het deeltjesaantal dat wordt weergegeven op de softwaredetectie-interface tussen 50-400 ligt (bij voorkeur rond de 200). Klik op OK.
OPMERKING: Bereid de standaardoplossing door 1 μl ijkoplossing (zie materiaaltabel) opnieuw te constitueren in 1 ml gedestilleerd water om een primaire oplossing te genereren, en neem vervolgens 100 μl van de primaire oplossing en voeg 25 ml gedestilleerd water toe om een standaardoplossing (1:250.000) te bereiden. Bewaar dit werkende reagens bij 4 °C gedurende een week. - Spoel de monstercel af met 5 ml gedestilleerd water.
- Spoel vóór de monsteranalyse het kanaal met 1 ml gedestilleerd water. Zorg ervoor dat het deeltjesaantal dat wordt weergegeven op de softwaredetectie-interface kleiner is dan 10.
- Injecteer 1 ml van het in stap 3.1 bereide EV-monster. Voer de blaasjestest uit volgens de gebruiksaanwijzing van het instrument.
LET OP: Het monster en gedestilleerd water worden geïnjecteerd met een spuit van 1 ml met een constante snelheid van 0,5 ml/s onder zorgvuldige handmatige controle.
4. Karakterisering van EV-morfologie door transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)
- Verdun 1 μL EV's uit stap 2.7 in 199 μL PBS en meng voldoende. Voeg 20 μL EV-suspensiedruppels toe aan het formvar/met koolstof beklede vierkante gaas (zie materiaaltabel) en laat het 3 minuten staan.
- Verwijder overtollige vloeistof met een klein filtreerpapier en laat het 15 s staan om het oppervlak enigszins te drogen.
- Negatief kleuren EV-monsters met 1,5% fosfotungstic acid druppels gedurende 40 s.
- Verwijder het overtollige fosfotungstic acid en laat het 15 s staan om het oppervlak enigszins te drogen.
- Doe het monster met formvar/met koolstof gecoat vierkant gaas in een schone schaal bedekt met filtreerpapier. Observeer en leg beelden vast met een transmissie-elektronenmicroscoop.
OPMERKING: In dit proces worden Exo's als voorbeeld genomen.
5. Etikettering van van MSC's afgeleide EV's
- Na ev-extractie (stap 2.5), resuspendien met 250 μl PBS in een conische buis van 1,5 ml.
- Gebruik nog een conische buis van 1,5 ml voor het bereiden van de werkoplossing van de PKH26-kleurstof; gebruik 1 μL PKH26-etiketteringsreagens verdund met 250 μL verdunningsmiddel C (een onderdeel van de in de handel verkrijgbare EV-etiketteringskit die voor dit onderzoek is gebruikt, zie de Materiaaltabel).
OPMERKING: Bereid de werkoplossing onmiddellijk voor gebruik voor.
LET OP: Overmatige PKH26-kleurstof of etikettering zonder voorverdunning loopt het risico de EV's te beschadigen. - Meng de geresuspendeerde EV's met de werkende oplossing. Laat het 5 minuten op kamertemperatuur staan en voeg vervolgens 500 μL EV-uitgeputte FBS toe om de reactie te stoppen.
- Voor MV's, centrifugeer bij 4 °C, 16.000 x g gedurende 30 minuten, en gooi het supernatant weg met een pipet. Voeg 1 ml PBS toe om het residu af te spoelen.
- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 4 °C, 16.000 x g en gooi het supernatant weg om de ongebonden kleurstof te verwijderen.
- Resuspensie van het residu met 200 μL PBS. Laat 20 μL suspensie op de dia vallen en observeer deze onder een fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: In dit proces worden MV's als voorbeeld genomen.
6. Lokale transplantatie en systemische injectie van MSC-EV's
OPMERKING: Voor de volgende procedures plaatst u de EV's op ijs voordat u ze inspuit.
- Voer lokale transplantatie uit volgens de onderstaande stappen.
- Verdoof de muizen met 4% (vol/vol) isofluraan. Handhaaf de anesthesie op 1% -3% isofluraan tijdens de procedure.
- Dien vóór de operatie 5 mg / kg carprofen (IP) toe voor analgesie om postprocedurele pijn te minimaliseren.
- Scheer vóór de wondexcisie het dorsale haar en steriliseer het dorsale oppervlak door 3 afwisselende rondes van 10% povidon-jodium en 75% ethanol aan te brengen.
- Maak met behulp van een biopsiepons (zie materiaaltabel) een wond van volledige dikte met een diameter van 1 cm op de dorsale huid.
- Resuspendeer de van MSC afgeleide EV's uit twee schotels in 100 μL PBS en dien de injectie toe in de onderhuidse laag van het wondbed, rond elke wond met vier plaatsen.
OPMERKING: Er wordt gemiddeld 100 μg EV's per muis (EV's van twee 10 cm schotels met cellen) geïnjecteerd. Tien schotels van 10 cm MSC's zijn nodig om voldoende EV's op te leveren om een experiment van n = 5 in een muizenmodel op te zetten. - Wikkel de muizen na de behandeling in met steriel gaas en plaats ze op warmte-isolatiepads (zie materiaaltabel) totdat ze wakker worden.
- Zorg ervoor dat de muizen niet onbeheerd worden achtergelaten totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben. Breng de muizen niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig zijn hersteld.
- Dien indien nodig extra doses analgesie toe op dag 2 en dag 3 na de operatie.
- Voer systemische injectie uit.
- Resuspendeerde MSC-afgeleide EV's in 200 μL PBS en meng vervolgens met heparine-oplossing met een volumeverhouding van 10:1.
- Plaats de muizen in het caudale aderbeeldvormingssysteem (zie tabel met materialen). Druk op de schakelaar om de hendel op te tillen.
- Desinfecteer de staartader met een alcoholkussentje vóór de IV-injectie. Injecteer de muizen vervolgens systematisch met suspensie voorbereid in stap 6.2.1 door de staartader. De procedure wordt geholpen door een staartaderillustrator.
OPMERKING: Injecteer EV-suspensie onmiddellijk na het mengen met heparine. Gemiddeld wordt 100 μg EV's per muis (EV's van twee 10 cm schotels met cellen) geïnjecteerd. Tien schotels van 10 cm MSC's zijn nodig om voldoende EV's op te leveren om een experiment van n = 5 in een muizenmodel op te zetten.
LET OP: Muizenstaartaderinjectie is meestal beperkt tot 200 μl volume. De injectie moet langzaam gaan en stoppen als u een bult of weerstand ziet, wat suggereert dat de naald uit de ader is. Als de muizen nadelige klinische symptomen vertonen zoals krullen en trillen, kan dit een schokreactie zijn op grootschalige injectie, snelle injectie of toxiciteit / anafylaxie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MV's en Exo's van gekweekte menselijke UCMSC's worden geïsoleerd volgens de experimentele workflow (figuur 1). De NTA-resultaten tonen aan dat de grootte van Exos van menselijke MSC's varieert van 40 nm tot 335 nm met een piekgrootte van ongeveer 100 nm, en de grootte van MV's varieert van 50 nm tot 445 nm met een piekgrootte van 150 nm (figuur 2). Morfologische karakterisering van MSC-afgeleide Exo's vertonen een typische bekervorm (figuur 3). EV's worden efficiënt gelabeld door PKH26, wat zowel wordt waargenomen door de bruto weergave als gelabelde pellets als door fluorescerende microscopie (figuur 4). Lokale en systemische injecties van MSC-afgeleide EV's worden uitgevoerd rond de huidwond of via de caudale ader (figuur 5). Zo worden de Exos en MVs met succes geïsoleerd en toegepast voor latere experimenten.
Figuur 1: Isolatie van MVs en Exos uit gekweekte menselijke MSC's. Kweekmedia worden verzameld en differentiële centrifugatie wordt uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: NTA-analyse van Exo's en MV's van MSC's. De deeltjesgrootteverdeling met representatieve afbeeldingen wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologische karakterisering van Exos uit MSC's door TEM. Bekervormige Exo's worden weergegeven. Schaalbalken: 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Labeling van MSC-afgeleide MV's door PKH26. PKH26-gelabelde MV-pellets worden grof waargenomen en bekeken onder een fluorescerende microscoop. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beheer van MSC-afgeleide EV's. (A) Lokale transplantatie rond de huidwond en (B) Systemische injectie via de caudale ader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV's zijn in opkomst om een belangrijke rol te spelen in diverse biologische activiteiten, waaronder antigeenpresentatie, genetisch materiaaltransport, celmicro-omgevingsmodificatie en andere. Bovendien brengt hun brede toepassing nieuwe benaderingen en mogelijkheden voor het diagnosticeren en behandelen van ziekten21. Implementatie van therapeutische toepassingen van EV's is gebaseerd op succesvolle isolatie en karakterisering. Vanwege het gebrek aan gestandaardiseerde isolatie- en zuiveringsmethoden en de lage extractie-efficiëntie is EV-onderzoek echter belemmerd. Dit artikel introduceert voornamelijk een gemakkelijk haalbaar extractie- en karakteriseringsprotocol van EV's uit gekweekte menselijke MSC's en verdere toepassingen, die kunnen worden geëtiketteerd en gebruikt om weefselherstel via lokale injectie te bevorderen en systemische ziekten te behandelen door intraveneuze injectie. De reproduceerbaarheid van MSC's voor EV-isolatie blijft behouden door gebruik te maken van de neonatale oorsprong van UCMSC's, standaardkweek van cellen en geen late passages. Hoewel de term Exos en MVs in dit manuscript respectievelijk worden gebruikt om te verwijzen naar EV's die zijn verzameld uit differentiële centrifugatiesnelheden, zullen er in de toekomstige studies meer testen nodig zijn om hun oorsprong te onderscheiden, zoals aanbevolen door de richtlijn Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV2018)22 , zoals door live-cell imaging voor het observeren van het productieproces en door immuno-elektronenmicroscoop voor het detecteren van de specifieke markers. Over het algemeen is de methode eenvoudig en dus gemakkelijk schaalbaar en reproduceerbaar, wat nuttig zal zijn voor het veld.
In deze studie worden fysiologische EV's van MSC's geleidelijk gescheiden in MV's en Exo's door differentiële centrifugatie en ultracentrifugatie. Hier wordt het belang benadrukt van het vervangen van α-MEM aangevuld met 20% EV-uitgeputte FBS voor het verzamelen van het kweekmedium. Deze stap zorgt ervoor dat de geëxtraheerde EV's alleen afkomstig zijn van MSC's, waarbij de mogelijkheid wordt uitgesloten dat EV's afkomstig kunnen zijn van andere storende stoffen. Het is ook van cruciaal belang om 10% heparine-oplossing in de EV-oplossing te mengen vóór systemische injectie. In de afgelopen jaren hebben verschillende studies aangetoond dat EV's een procoagulant effect hebben, dus het toevoegen van heparine tijdens systemische injectie is noodzakelijk om de vorming van trombus na injectie te voorkomen, wat anders leidt tot acute letaliteit van muizen23. Er kunnen enkele problemen zijn tijdens deze protocolimplementatie die moeten worden opgelost. Voor een prominent voorbeeld, als de extractiehoeveelheid EV's niet genoeg is, moeten onderzoekers het terugvoeren naar de verzamelstap van de celsupernatant. Tijdens het verzamelen van supernatanten moeten cellen gelijkmatig worden geblazen om de vrijgegeven EV's die in de extracellulaire matrix van MSC's worden vastgehouden, volledig te verzamelen. Een andere potentiële storing treedt op wanneer muizen kort na de injectie van EV's sterven. Naast het toevoegen van heparine vóór injectie, zoals hierboven vermeld, moet de concentratie van geïnjecteerde EV's (gemiddeld 100 μg EV's per muis) worden aangepast. Om het succes van de injectie te verifiëren, kan in vivo beeldvorming van biodistributie van fluorescentie-gelabelde EV's of bevroren secties van specifieke weefselplaatsen van transplantatie (de lever, de milt, enz.) worden uitgevoerd, wat eerder werd gemeld24. Ook worden EV's aanbevolen om zo snel mogelijk na isolatie te worden gebruikt, en bevriezing van opslag zal deeltjesverlies, zuiverheidsvermindering en fusieverschijnselen veroorzaken die leiden tot artefactuele deeltjes25. Bovendien zal de algemeen aanvaarde PKH26-etikettering de EV-grootte26 vergroten en kunnen andere etiketteringsmethoden worden gebruikt voor vergelijking.
De bestaande protocollen voor het isoleren van EV's worden voornamelijk als volgt gerapporteerd: differentiële en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie9, ultrafiltratieproces 10, immunomagnetische scheiding11, moleculaire exclusiechromatograaf 12, microfluïdische chip 13 en op polymeren gebaseerde precipitatietechnologie27. In vergelijking met ultracentrifugatie is het ultrafiltratieproces een handige extractiemethode en bevorderlijk voor de verrijking van EV's in monsters met een groter volume 9,10, terwijl het nadeel is dat er membraanvervuiling is, wat gemakkelijk is om monsterverlies te veroorzaken. Immunomagnetische scheiding is geschikt voor het scheiden van verschillende subtypen EV's en de verkregen EV's hebben een hoge zuiverheid. Het nadeel van deze methode is de hoge kosten met een lage opbrengst11. De EV's gescheiden door moleculaire exclusiechromatograaf hebben een hoge zuiverheid en een hoog rendement. Het nadeel is dat speciale apparatuur vereist is en niet voor meerdere monsters tegelijk kan worden gebruikt12. Microfluïdische chips stellen hoge eisen aan materialen en technologie, met hoge kosten, en het is moeilijk om grote monsters te verwerken13. De EV's gescheiden door op polymeren gebaseerde neerslagtechnologie bevatten niet-EV-verontreinigingen die de EV-activiteit14 beïnvloeden. Onder hen is differentiële centrifugatie en ultracentrifugatie nog steeds de meest gebruikte methode voor scheiding en zuivering van EV's en wordt beschouwd als de gouden standaard voor MSC-EV-extractie. Scheiding en verrijking van EV's van MSC-cultuurmedia worden stap voor stap bereikt door de combinatie van verschillende tijd en snelheid van centrifugeren, wat een geoptimaliseerde methode vertegenwoordigt. Het is opmerkelijk dat Exo's en MV's die in dit manuscript zijn geïsoleerd, vergelijkbare grootteverdelingen hebben, hoewel MV's meestal groter zijn, wat te wijten kan zijn aan differentiële centrifugatie die de neiging heeft om aggregatie van nanodeeltjes te induceren. Hoewel aangepaste methoden beter kunnen presteren bij het onderhoud van de grootte van EV's, is differentiële centrifugatie voordelig bij een hoge efficiëntie voor EV-scheiding28. Hoewel deze methode voor grootschalige productie van EV's en GMP-productie wordt beperkt door de hoeveelheid media die in één isolatierun kan worden verwerkt, is het technische systeem eenvoudig in te stellen en is het toegepast door translationele projecten op grote dieren29,30. Hoe dan ook, de bovenstaande scheidingsmethoden hebben hun voor- en nadelen, en onderzoekers kunnen de juiste methode kiezen op basis van de verschillende bronnen van EV's en het onderzoeksdoel.
In de afgelopen jaren hebben EV's een groot potentieel getoond in klinische toepassingen, zoals ziektediagnose31, behandeling en als dragers van medicijnafgifte32,33. Op basis van hun voordelige eigenschappen hebben verschillende landen EV's op grote schaal bestudeerd als therapeutische middelen. In dit verband zijn studies toegezegd aan EV's bij de behandeling van ziekten en het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de rol van EV's in de pathogenese van de ziekte. Het huidige protocol van isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van EV's uit gekweekte MSC's is goed toegepast. Lokale toediening van MSC-Exos in huidwonden bevordert bijvoorbeeld de genezing door ontstekingsmodulatie en staartaderinjectie van MSC-afgeleide EV's kan de insulineresistentie en steatose van de lever bij diabetes mellitus type 2 verbeteren24. Bovendien zijn therapeutische toepassingen met een verhoogde opbrengst en zuiverheid van MSC-EV's aan de horizon om haalbare translationele strategieën te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 en 82170988) en de China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 en BX20190380). We zijn dankbaar voor de hulp van het National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) en het Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center van de Air Force Medical University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al.
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F.
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
