Summary
Le présent protocole décrit la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs (exosomes et microvésicules) provenant de CSM humaines en culture. D’autres applications de ces véhicules électriques sont également expliquées dans cet article.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules membranaires hétérogènes libérées par la plupart des types de cellules, et elles sont de plus en plus reconnues comme des régulateurs physiologiques de l’homéostasie de l’organisme et des indicateurs importants de pathologies; Entre-temps, leur immense potentiel pour établir des traitements thérapeutiques accessibles et contrôlables est en train d’émerger. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent libérer de grandes quantités de VE en culture, ce qui s’est révélé prometteur pour relancer une régénération tissulaire efficace et faciliter des applications thérapeutiques étendues avec une bonne évolutivité et reproductibilité. Il existe une demande croissante de protocoles simples et efficaces pour la collecte et l’application des CSM-EV. Ici, un protocole détaillé est fourni basé sur la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs des CSM humains cultivés, des exosomes et des microvésicules pour d’autres applications. L’adaptabilité de cette méthode est démontrée pour une série d’approches en aval, telles que le marquage, la transplantation locale et l’injection systémique. La mise en œuvre de cette procédure permettra de répondre à la nécessité d’une collecte et d’une application simples et fiables des CSM-EV dans la recherche translationnelle.
Introduction
Les cellules souches sont des cellules pluripotentes indifférenciées ayant une capacité d’auto-renouvellement et un potentiel translationnel1. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont facilement isolées, cultivées, dilatées et purifiées en laboratoire, ce qui reste caractéristique des cellules souches après plusieurs passages. Au cours des dernières années, de plus en plus de preuves ont soutenu l’opinion selon laquelle les CSM agissent en mode paracrine à usage thérapeutique 2,3. En particulier, la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE) joue un rôle crucial dans la médiation des fonctions biologiques des CSM. En tant que nanoparticules membraneuses hétérogènes libérées par la plupart des types cellulaires, les VE se composent de sous-catégories appelées exosomes (Exos), microvésicules (MV) et même corps apoptotiquesplus grands 4,5. Parmi eux, Exos est l’EV le plus étudié avec une taille de 40-150 nm, qui est d’origine endosomale et activement sécrété dans des conditions physiologiques. Les MV sont formés par excrétion directement à partir de la surface de la membrane plasmique cellulaire d’un diamètre de 100 à 1 000 nm, caractérisés par une expression élevée de phosphatidylsérine et une expression de marqueurs de surface des cellules donneuses6. Les VE contiennent de l’ARN, des protéines et d’autres molécules bioactives, qui ont des fonctions similaires à celles des cellules mères et jouent un rôle important dans la communication cellulaire, la réponse immunitaire et la réparation des lésions tissulaires7. Les CSM-EV ont été largement étudiés en tant qu’outil thérapeutique acellulaire puissant en médecine régénérative8.
L’isolement et la purification des VE dérivés des CSM sont un problème courant dans le domaine de la recherche et de l’application. À l’heure actuelle, l’ultracentrifugationdifférentielle et à gradient de densité 9, le procédé d’ultrafiltration 10, la séparation immunomagnétique 11, le chromatographe d’exclusion moléculaire12 et la puce microfluidique 13 sont des méthodes largement utilisées dans l’isolement et la purification des véhicules électriques. Avec les avantages et les inconvénients de chaque approche, la quantité, la pureté et l’activité des VE collectés ne peuvent pas être satisfaites en même temps14,15. Dans la présente étude, le protocole de centrifugation différentielle d’isolement et de caractérisation des VE à partir de CSM en culture est présenté en détail, ce qui a favorisé une utilisation thérapeutique efficace 16,17,18,19,20. L’adaptabilité de cette méthode à une série d’approches en aval, telles que le marquage fluorescent, la transplantation locale et l’injection systémique, a également été illustrée. La mise en œuvre de cette procédure permettra de répondre à la nécessité d’une collecte et d’une application simples et fiables des CSM-EV dans la recherche translationnelle.
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Protocol
Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université médicale militaire et effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris C57Bl/6 âgées de huit semaines (aucune préférence pour les femelles ou les mâles) ont été utilisées. Les CSM humaines dérivées du cordon ombilical humain (UCMSC) cryoconservées, utilisées pour la présente étude, ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). L’utilisation de cellules humaines a été approuvée par le Comité d’éthique de la quatrième Université médicale militaire.
1. Culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)
- Préparer les accessoires et les solutions nécessaires aux travaux expérimentaux, y compris les pipettes, les pointes de pipettes, la boîte de Pétri de 10 cm, l’équipement thermostatique (bain-marie), les gants en caoutchouc, l’alcool à 75 %, le milieu de culture (incubé à 37 °C), le sérum bovin mortel (FBS) et la solution 100x de pénicilline-streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux).
- Préparer le milieu essentiel alpha-minimum (α-MEM) disponible dans le commerce en complétant avec 20% FBS et 1% P/S.
NOTE: Diluer toutes les solutions utilisées pour l’isolation et l’analyse des VE dans de l’eau filtrée ultrapure fabriquée par le système de purification d’eau filtrée ultrapure (voir le tableau des matériaux). - Récupérer les CSM humaines dérivées du cordon ombilical humain cryoconservées (UCMSC) de l’azote liquide en les faisant fondre dans un bain-marie à 37 °C.
- Transférer rapidement et délicatement la suspension de cellules fondues dans un tube de 15 mL avec 5 mL de milieu de culture (étape 1.2). Centrifuger à 4 °C, 500 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette stérile et retenir le précipité cellulaire. Ajouter 2 mL de milieu de culture dans le tube centrifuge et remettre doucement les cellules en suspension.
- Ensemencer les cellules dans une boîte de Petri de 10 cm et ajouter 8 mL de milieu de culture pour un total de 10 mL.
- Culture de CSM à 37 °C dans 5% de CO2 dans l’incubateur cellulaire.
2. Centrifugation différentielle pour l’isolation des Exos et des MV
- Lorsque les CSM atteignent >90 % de confluence, remplacer le milieu de culture par du α-MEM complété par 20 % de FBS appauvri en EV et 1 % de P/S pour 8 mL de chaque boîte.
REMARQUE: Centrifuger FBS à 4 °C, 1,50,000 x g pendant la nuit pour éliminer les VE et autres impuretés. - Après 48 h de culture, recueillir le milieu de culture (étape 2.1) dans des tubes à centrifuger de 50 mL.
- Centrifuger le milieu de culture MSC à 4 °C, 800 x g pendant 10 min.
- Retirez les fragments cellulaires et les débris cellulaires en transférant le surnageant pour nettoyer les tubes coniques de 1,5 mL.
REMARQUE: L’utilisation de tubes coniques de 1,5 mL est nécessaire pour augmenter le rendement des véhicules électriques. - Centrifuger le surnageant à 4 °C, 16 000 x g pendant 30 min. Les MV de chaque boîte de cellules ont été remises en suspension avec 50 μL de PBS.
- Transférer le surnageant obtenu par centrifugation à l’étape 2.5 à l’aide d’une pipette pour nettoyer les tubes à ultracentrifugeuses. Centrifuger à 1,50,000 x g pendant 2 h à 4 °C.
- Jetez le surnageant et collectez le résidu, qui est Exos. Resuspendre Exos de sept boîtes de cellules dans 50 μL de PBS.
NOTE: Les UCMS de sixième passage sont utilisés pour l’isolation EV. Pour obtenir suffisamment de MV et d’Exos pour une utilisation expérimentale, 7-8 boîtes de cellules cultivées sont généralement nécessaires. Les échantillons EV sont utilisés immédiatement pour les étapes de caractérisation suivantes ou pour une application thérapeutique, qu’il est préférable de ne pas stocker.
ATTENTION : Évitez le gel et la décongélation répétés des VE, et il est préférable de stocker les VE à 4 °C à court terme et non à -80 °C.
3. Détection du nombre de particules et de la distribution granulométrique des VE des CSM
REMARQUE : Pour l’évaluation de la distribution granulométrique, l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est effectuée par un analyseur de suivi des nanoparticules disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Diluer 1 μL de VE (à partir des étapes 2.5 et 2.7) dans 1 499 μL de PBS et mélanger suffisamment dans un tube de 15 mL.
- Utilisez l’analyseur de suivi en suivant les instructions du fabricant. Tout d’abord, démarrez le logiciel compatible (voir Tableau des matériaux).
- Remplissez la cellule d’échantillon avec de l’eau distillée, puis laissez l’instrument démarrer la vérification de la cellule.
- Calibrer l’instrument avec une solution étalon préparée. Assurez-vous que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection du logiciel est compris entre 50 et 400 (de préférence autour de 200). Cliquez sur OK.
REMARQUE : Préparer la solution étalon en reconstituant 1 μL de solution d’étalonnage (voir le tableau des matières) dans 1 mL d’eau distillée pour produire une solution primaire, puis prélever 100 μL de la solution primaire et ajouter 25 mL d’eau distillée pour préparer une solution étalon (1:250 000). Conservez ce réactif fonctionnel à 4 °C pendant une semaine. - Rincer la cellule d’échantillon avec 5 mL d’eau distillée.
- Avant l’analyse de l’échantillon, rincer le canal avec 1 mL d’eau distillée. Assurez-vous que le nombre de particules affiché sur l’interface de détection du logiciel est inférieur à 10.
- Injecter 1 mL de l’échantillon de VE préparé à l’étape 3.1. Effectuer le test des vésicules conformément au mode d’emploi de l’instrument.
ATTENTION : L’échantillon et l’eau distillée sont injectés avec une seringue de 1 mL à une vitesse constante de 0,5 mL/s sous contrôle manuel minutieux.
4. Caractérisation de la morphologie des VE au microscope électronique à transmission (MET)
- Diluer 1 μL de VE de l’étape 2,7 dans 199 μL de PBS et mélanger suffisamment. Ajouter 20 μL de gouttes de suspension EV à la maille carrée revêtue de formvar / carbone (voir le tableau des matériaux) et laisser reposer pendant 3 minutes.
- Retirer l’excès de liquide à l’aide d’un petit papier filtre et le laisser reposer pendant 15 s pour sécher légèrement la surface.
- Colorer négativement les échantillons EV avec des gouttelettes d’acide phosphotungstique à 1,5% pendant 40 s.
- Retirez l’excès d’acide phosphotungstique et laissez-le reposer pendant 15 s pour sécher légèrement la surface.
- Placer l’échantillon contenant un filet carré enduit de formvar / carbone dans un plat propre recouvert de papiers filtres. Observez et capturez des images avec un microscope électronique à transmission.
REMARQUE: Dans ce processus, les Exos sont pris comme exemple.
5. Étiquetage des véhicules électriques dérivés des CSM
- Après extraction des VE (étape 2.5), remettre en suspension avec 250 μL de PBS dans un tube conique de 1,5 mL.
- Utiliser un autre tube conique de 1,5 mL pour préparer la solution de travail du colorant PKH26; utiliser 1 μL de réactif de marquage PKH26 dilué avec 250 μL de Diluant C (un composant de la trousse d’étiquetage EV disponible dans le commerce utilisée pour la présente étude, voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Préparez la solution de travail immédiatement avant utilisation.
ATTENTION : Un colorant PKH26 excessif ou un étiquetage sans pré-dilution risque d’endommager les véhicules électriques. - Mélangez les véhicules électriques remis en suspension avec la solution de travail. Laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 minutes, puis ajoutez 500 μL de FBS appauvri en EV pour arrêter la réaction.
- Pour les MV, centrifuger à 4 °C, 16 000 x g pendant 30 min, et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de PBS pour rincer le résidu.
- Centrifuger à 4 °C, 16 000 x g pendant 30 min, et jeter le surnageant pour enlever le colorant non lié.
- Remettez le résidu en suspension avec 200 μL de PBS. Déposez 20 μL de suspension sur la lame et observez-la au microscope à fluorescence.
REMARQUE: Dans ce processus, les MV sont pris comme exemple.
6. Transplantation locale et injection systémique de CSM-VE
REMARQUE: Pour les procédures suivantes, placez les VE sur la glace avant l’injection.
- Effectuez une transplantation locale en suivant les étapes ci-dessous.
- Anesthésier les souris avec de l’isoflurane à 4 % (vol/vol). Maintenir l’anesthésie à 1% -3% isoflurane pendant la procédure.
- Avant la chirurgie, administrer 5 mg / kg de carprofène (IP) pour l’analgésie afin de minimiser la douleur post-opératoire.
- Avant l’excision de la plaie, rasez les poils dorsaux et stérilisez la surface dorsale en appliquant 3 cycles alternés de 10% de povidone iodée et d’éthanol à 75%.
- À l’aide d’un coup de biopsie (voir le tableau des matériaux), créer une plaie de pleine épaisseur de 1 cm de diamètre sur la peau dorsale.
- Resuspendre les VE dérivés du CSM à partir de deux boîtes dans 100 μL de PBS et administrer l’injection dans la couche sous-cutanée du lit de la plaie, autour de chaque plaie à quatre sites.
REMARQUE: Une moyenne de 100 μg de VE par souris (EV de deux boîtes de cellules de 10 cm) est injectée. Dix antennes de 10 cm de CSM sont nécessaires pour produire suffisamment de VE pour mettre en place une expérience de n = 5 dans un modèle murin. - Après le traitement, enveloppez les souris avec de la gaze stérile et placez-les sur des tampons d’isolation thermique (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce qu’elles se réveillent.
- Assurez-vous que les souris ne sont pas laissées sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience. Ne remettez pas les souris en compagnie d’autres animaux avant qu’elles ne soient complètement rétablies.
- Administrer des doses supplémentaires d’analgésie le jour 2 et le jour 3 après la chirurgie, au besoin.
- Effectuer une injection systémique.
- Resuspendre les VE dérivés du MSC dans 200 μL de PBS, puis mélanger avec une solution d’héparine à un rapport volumique de 10:1.
- Placer les souris dans le système d’imagerie de la veine caudale (voir le tableau des matériaux). Appuyez sur l’interrupteur pour soulever le levier.
- Désinfectez la veine de la queue à l’aide d’un tampon d’alcool avant l’injection intraveineuse. Ensuite, injecter systématiquement les souris avec la suspension préparée à l’étape 6.2.1 par la veine de la queue. La procédure est aidée par un illustrateur de veine de queue.
REMARQUE: Injecter la suspension EV immédiatement après le mélange avec l’héparine. Une moyenne de 100 μg de VE par souris (EV provenant de deux boîtes de cellules de 10 cm) est injectée. Dix antennes de 10 cm de CSM sont nécessaires pour produire suffisamment de VE pour mettre en place une expérience de n = 5 dans un modèle murin.
ATTENTION : L’injection de la veine de la queue de souris est habituellement limitée à 200 μl de volume. L’injection doit aller lentement et s’arrêter si vous voyez une bosse ou une résistance, ce qui suggère que l’aiguille est hors de la veine. Si les souris présentent des signes cliniques indésirables tels que des courbements et des tremblements, il pourrait s’agir d’une réaction de choc à une injection à volume élevé, à une injection rapide ou à une toxicité / anaphylaxie.
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Representative Results
Les MV et les Exos provenant d’UCMS humains cultivés sont isolés après le flux de travail expérimental (Figure 1). Les résultats de la NTA démontrent que la taille des Exos des CSM humaines varie de 40 nm à 335 nm avec une taille de pic d’environ 100 nm, et la taille des MV varie de 50 nm à 445 nm avec une taille de pic de 150 nm (Figure 2). La caractérisation morphologique des Exos dérivés du MSC présente une forme de coupe typique (Figure 3). Les véhicules électriques sont efficacement marqués par PKH26, ce qui est observé à la fois par la vue brute sous forme de pastilles marquées et par microscopie fluorescente (Figure 4). Des injections locales et systémiques de VE dérivés de la CSM sont effectuées autour de la plaie cutanée ou à travers la veine caudale (Figure 5). Ainsi, les Exos et les MV sont isolés avec succès et appliqués pour des expériences ultérieures.
Figure 1 : Isolement des MV et des Exos à partir de CSM humaines cultivées. Les milieux de culture sont collectés et une centrifugation différentielle est effectuée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse NTA des Exos et des MV des CSM. La distribution granulométrique avec des images représentatives est représentée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation morphologique des exos des CSM par MET. Des Exos en forme de coupe sont affichés. Barres d’échelle: 200 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Étiquetage des MV dérivés du MSC par PKH26. Les pastilles MV marquées PKH26 sont grossièrement observées et vues au microscope fluorescent. Barre d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Administration de VE dérivés du MSC. (A) Transplantation locale autour de la plaie cutanée et (B) Injection systémique par la veine caudale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les VE émergent pour jouer un rôle important dans diverses activités biologiques, y compris la présentation de l’antigène, le transport du matériel génétique, la modification du microenvironnement cellulaire et autres. En outre, leur large application apporte de nouvelles approches et opportunités pour le diagnostic et le traitement des maladies21. La mise en œuvre des applications thérapeutiques des VE repose sur une isolation et une caractérisation réussies. Cependant, en raison du manque de méthodes d’isolation et de purification normalisées et de la faible efficacité d’extraction, la recherche sur les véhicules électriques a été entravée. Cet article présente principalement un protocole d’extraction et de caractérisation facilement réalisable des VE à partir de CSM humaines en culture et d’autres applications, qui peuvent être étiquetés et utilisés pour favoriser la réparation tissulaire par injection locale et traiter les maladies systémiques par injection intraveineuse. La reproductibilité des CSM pour l’isolement des VE est préservée en utilisant l’origine néonatale des UCMSC, la culture standard de cellules et l’absence de passages tardifs. Bien que les termes Exos et MV soient respectivement utilisés dans ce manuscrit pour désigner les VE collectés à partir de vitesses de centrifugation différentielles, d’autres tests seront nécessaires dans les études futures pour distinguer leurs origines, comme le recommande la ligne directrice MISEV2018)22 sur les informations minimales pour les études des vésicules extracellulaires, par exemple par imagerie de cellules vivantes pour observer le processus de production et par microscope immunoélectronique pour détecter les marqueurs spécifiques. Dans l’ensemble, la méthode est simple et donc facilement évolutive et reproductible, ce qui sera utile au terrain.
Dans la présente étude, les VE physiologiques des CSM sont progressivement séparés en MV et Exos par centrifugation différentielle et ultracentrifugation. Ici, l’importance de remplacer α-MEM complété par 20% de FBS appauvri en EV pour la collecte du milieu de culture est soulignée. Cette étape garantit que les VE extraits ne proviennent que de CSM, ce qui exclut la possibilité que les VE proviennent d’autres substances interférentes. Il est également essentiel de mélanger une solution d’héparine à 10% dans la solution EV avant l’injection systémique. Au cours des dernières années, plusieurs études ont montré que les VE ont un effet procoagulant, de sorte que l’ajout d’héparine pendant l’injection systémique est nécessaire pour éviter la formation de thrombus après l’injection, ce qui conduit autrement à une létalité aiguë des souris23. Certains problèmes peuvent survenir lors de l’implémentation de ce protocole qui nécessitent un dépannage. Par exemple, si la quantité d’extraction de VE n’est pas suffisante, les chercheurs devraient la retracer jusqu’à l’étape de collecte du surnageant cellulaire. Pendant la collecte du surnageant, les cellules doivent être soufflées uniformément pour recueillir complètement les VE libérés retenus dans la matrice extracellulaire des CSM. Un autre échec potentiel se produit lorsque les souris meurent peu de temps après l’injection de VE. Outre l’ajout d’héparine avant injection, comme mentionné ci-dessus, la concentration de VE injectés (une moyenne de 100 μg de VE par souris) doit être ajustée. Pour vérifier le succès de l’injection, il est possible d’effectuer une imagerie in vivo de la biodistribution de VE marqués par fluorescence ou de sections congelées de sites tissulaires spécifiques de greffe (le foie, la rate, etc.), ce qui a déjà été rapporté24. En outre, il est recommandé d’utiliser les véhicules électriques dès que possible après l’isolement, et le stockage par congélation entraînera une perte de particules, une réduction de la pureté et des phénomènes de fusion conduisant à des particules artéfactuelles25. En outre, l’étiquetage PKH26 couramment adopté augmentera la taille EV26, et d’autres méthodes d’étiquetage peuvent être utilisées à des fins de comparaison.
Les protocoles existants pour isoler les VE sont principalement rapportés comme suit : ultracentrifugationdifférentielle et gradient de densité 9, procédé d’ultrafiltration 10, séparation immunomagnétique11, chromatographe d’exclusion moléculaire 12, puce microfluidique13 et technologie de précipitation à base de polymères27. Par rapport à l’ultracentrifugation, le procédé d’ultrafiltration est une méthode d’extraction pratique et propice à l’enrichissement des VE dans des échantillons de plus grand volume 9,10, tandis que l’inconvénient est qu’il y a une pollution membranaire, ce qui est facile à causer la perte d’échantillon. La séparation immunomagnétique convient à la séparation de différents sous-types de VE et les VE obtenus ont une grande pureté. L’inconvénient de cette méthode est le coût élevé avec un faible rendement11. Les VE séparés par chromatographe d’exclusion moléculaire ont une pureté élevée et un rendement élevé. L’inconvénient est qu’un équipement spécial est nécessaire et ne peut pas être utilisé pour plusieurs échantillons en même temps12. Les puces microfluidiques ont des exigences élevées en matière de matériaux et de technologie, avec un coût élevé, et il est difficile de traiter de grands échantillons13. Les VE séparés par une technologie de précipitation à base de polymères contiennent des contaminants non VE qui affecteront l’activité des VE14. Parmi elles, la centrifugation différentielle et l’ultracentrifugation restent la méthode la plus largement utilisée pour la séparation et la purification des véhicules électriques et sont considérées comme l’étalon-or pour l’extraction MSC-EV. La séparation et l’enrichissement des VE à partir des milieux de culture MSC sont réalisés étape par étape grâce à la combinaison de différents temps et vitesses de centrifugation, ce qui représente une méthode optimisée. Il est à noter que les Exos et les MV isolés dans ce manuscrit ont des distributions de taille similaires, bien que les MV aient tendance à être plus grandes, ce qui pourrait être dû à la centrifugation différentielle qui tend à induire l’agrégation de nanoparticules. Bien que les méthodes modifiées puissent être plus efficaces dans le maintien de la taille des véhicules électriques, la centrifugation différentielle est avantageuse pour une efficacité élevée pour la séparation des véhicules électriques28. Bien que pour la production à grande échelle de véhicules électriques et la production de BPF, cette méthode soit limitée par la quantité de milieux pouvant être traités en un seul cycle d’isolement, le système technique est facile à mettre en place et a été appliqué par des projets translationnels sur de grands animaux29,30. Quoi qu’il en soit, les méthodes de séparation ci-dessus ont leurs avantages et leurs inconvénients, et les chercheurs peuvent choisir la méthode appropriée en fonction des différentes sources de VE et de l’objectif de la recherche.
Au cours des dernières années, les véhicules électriques ont montré un grand potentiel dans des applications cliniques, telles que le diagnostic de maladies31, le traitement et en tant que vecteurs de l’administration de médicaments32,33. Sur la base de leurs propriétés avantageuses, divers pays ont largement étudié les VE en tant qu’agents thérapeutiques. À cet égard, des études ont été menées sur les VE dans le traitement de la maladie et le mécanisme sous-jacent au rôle des VE dans la pathogenèse de la maladie. Le protocole actuel d’isolement, de caractérisation et d’application thérapeutique des VE provenant de CSM en culture a été bien appliqué. Par exemple, l’administration locale de MSC-Exos dans les plaies cutanées favorise la cicatrisation par modulation inflammatoire et l’injection par veine arrière de VE dérivés de MSC peut améliorer la résistance hépatique à l’insuline et la stéatose dans le diabète sucréde type 24. En outre, des applications thérapeutiques impliquant un rendement et une pureté accrus des CSM-EV sont à l’horizon pour fournir des stratégies translationnelles réalisables.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81930025 et 82170988) et de la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national de démonstration de l’enseignement expérimental pour la médecine de base (AMFU) et du Laboratoire central d’analyse et d’essais du Centre d’innovation médicale militaire de l’Université médicale de l’armée de l’air.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
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