Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tekenembryo's. Embryo-injectie is de voorkeurstechniek voor genetische manipulatie om transgene lijnen te genereren.
Abstract
Teken kunnen verschillende virale, bacteriële en protozoaire pathogenen overbrengen en worden daarom beschouwd als vectoren van medisch en veterinair belang. Ondanks de groeiende last van door teken overgedragen ziekten, is het onderzoek naar teken achtergebleven bij insectenziektevectoren als gevolg van uitdagingen bij het toepassen van genetische transformatietools voor functionele studies op de unieke biologie van teken. Genetische interventies hebben aandacht gekregen om door muggen overgedragen ziekten te verminderen. De ontwikkeling van dergelijke interventies vereist echter een stabiele kiembaantransformatie door embryo's te injecteren. Een dergelijke embryo-injectietechniek ontbreekt voor cheliceraten, waaronder teken. Verschillende factoren, zoals een externe dikke waslaag op tekenembryo's, hard chorion en hoge intra-ovale druk, zijn enkele obstakels die eerder de ontwikkeling van embryo-injectieprotocollen bij teken verhinderden. Het huidige werk heeft deze obstakels overwonnen en een embryo-injectietechniek voor de zwartbenige teek, Ixodes scapularis, wordt hier beschreven. Deze techniek kan worden gebruikt om componenten, zoals CRISPR/Cas9, te leveren voor stabiele kiembaantransformaties.
Introduction
Teken zijn vectoren van medisch en veterinair belang, die in staat zijn om een verscheidenheid aan virale, bacteriële, protozoaire pathogenen en nematoden over te brengen 1,2. In het oosten van de Verenigde Staten is de zwartpootteek Ixodes scapularis een belangrijke vector van de ziekte van Lyme (LD), de spirocheet Borrelia burgdorferi. Meer dan 400.000 gevallen van LD worden elk jaar gemeld in de Verenigde Staten, waardoor het de top vector-overgedragen infectieziekte in de VSis 1. Naast B. burgdorferi worden zes andere micro-organismen overgedragen door I. scapularis, waaronder vier bacteriën (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi en Ehrlichia muris eauclarensis), één protozoaire parasiet (Babesia microti) en één virus (Powassan-virus), waardoor deze tekensoort een belangrijk probleem voor de volksgezondheid is3 . Hoewel door teken overgedragen ziekten de afgelopen jaren vaker voorkomen, is onderzoek naar teken achtergebleven bij andere geleedpotige vectoren, zoals muggen, vanwege de unieke biologie van teken en uitdagingen in verband met het toepassen van genetische en functionele genomische hulpmiddelen 4,5.
Genbewerkingstechnieken, met name CRISPR/Cas9, hebben nu functionele genomicastudies mogelijk gemaakt in niet-modelorganismen. Voor het creëren van erfelijke mutaties in een organisme blijft embryo-injectie de voorkeursmethode voor het leveren van constructies voor het veranderen van de kiembaan 6,7,8,9. Tot voor kortwerden tekeneieren echter als te moeilijk of zelfs onmogelijk beschouwd om te injecteren zonder het embryote doden 10,11. Een dikke waslaag op eieren, hard chorion en hoge intra-ovale druk waren enkele van de belangrijkste obstakels die embryo-injectie bij teken verhinderden. Volwassen, met bloed gevoede I. scapularis zetten een enkele koppeling van maximaal 2.000 eieren12 af gedurende 3-4 weken (ongeveer 100 eieren / dag). Eieren worden afzonderlijk gelegd en elk ei is bedekt met was die wordt afgescheiden door uitsteeksels of "hoorns" van het klierorgaan van Gené 13,14,15 van de moeder. Deze was beschermt de eieren tegen uitdroging en bevat antimicrobiële stoffen15. Om tekeneieren met succes te injecteren, is het belangrijk om de waslaag te verwijderen, het chorion te verzachten en de eieren uit te drogen om de intraovaldruk te verlagen, zodat de injectie het ei niet onomkeerbaar beschadigt. Inzicht in het kritieke belang van embryo-injecties voor succesvolle kiembaantransformatie, wordt een protocol voor I. scapularis ontwikkeld, dat kan worden gebruikt om een CRISPR / Cas9-construct af te leveren en stabiele kiembaanmutaties te genereren4. Naast de bijdrage aan het I. scapularis-onderzoek zou dit protocol ook geoptimaliseerd kunnen worden voor andere tekensoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ixodes scapularis volwassenen werden ofwel gekocht van Oklahoma State University (OSU) of grootgebracht aan de Universiteit van Nevada, Reno (UNR) (IACUC protocol #21-001-1118).
1. Voorbereiding van vrouwelijke teken voor embryoverzameling
OPMERKING: Om eieren van de juiste leeftijd te verzamelen, is het belangrijk om het leggen van eieren te synchroniseren. Hoewel eierlegsignalen bij teken onduidelijk blijven, beginnen I. scapularis-vrouwtjes onder de standaard insectaire omstandigheden (temperatuur van 27 °C en >90% relatieve vochtigheid (RV)) ongeveer 8 dagen na de onthechting van de gastheer eieren te leggen. Deze tijdlijn kan worden verlengd door hervolle vrouwtjes bij 4 °C op te slaan. We hebben bloedgevoede vrouwtjes tot 8 weken bij 4 °C bewaard zonder enig negatief effect op het leggen van eieren. Deze voorwaarden moeten mogelijk voor elke insectarium worden gewijzigd.
- Bewaar alle volle vrouwtjes bij 4 °C met >90% RV in een plastic doos van 6 kwart bekleed met vochtig filterpapier totdat ze worden gebruikt voor micro-injecties.
- Breng de vrouwtjes een week vóór de injecties over van 4 °C naar een couveuse van 27 °C voor het starten van het leggen van eieren.
- Wanneer de vrouwtjes beginnen met het leggen van eieren (3-4 dagen na het verplaatsen naar 27 ° C), verwijder dan alle eieren met een fijn getipte kwast en bereid de vrouwtjes voor op de ablatie van het orgaan (wasklier) van Gené.
OPMERKING: Het orgaan van de Gené strekt zich uit van het gebied tussen het scutum en het capitulum (dorsale basis van de monddelen), monddelen buigen over het ventrale lichaamsoppervlak (parallel aan het oppervlak) en het orgaan van het verlengde gen bedekt eieren zodra de eieren zijn gelegd (figuur 1). Eieren die worden gelegd voordat het orgaan van de Gené wordt verwijderd of de was wordt geleegd, hebben een waslaag en zijn niet geschikt voor injecties en moeten worden weggegooid. - Om het gegane orgaan van de Gené te verwijderen of te legen, gebruikt u klei om het opgezwollen vrouwtje op een glazen dia onder een microscoop te plaatsen die zo is georiënteerd dat monddelen zichtbaar zijn aan zowel ventrale als dorsale zijden (figuur 1B, C).
- Prik het gebied precies tussen het scutum en de monddelen zorgvuldig met behulp van fijne tangen en wolfraamnaalden die in het laboratorium zijn gemaakt met behulp van wolfraamdraad volgens een eerder gepubliceerd protocol16 (naalden kunnen ook commercieel worden gekocht en bevestigd aan een micro-ontleedsonde, zie Materiaaltabel).
- Werk de weg naar binnen met de wolfraamnaald en trek de wasklier eruit (figuur 1D, E). Het kan enkele minuten duren om de klier te verwijderen. Veeg alle vloeibare wasafscheiding weg met behulp van laboratoriumdoekjes.
OPMERKING: De klier kan ook worden verwijderd van de ventrale kant direct onder de monddelen; door met een naald en tang naar achteren te reiken richting scutum. Toepassing van siliconenlijm rond monddelen blokkeert ook de orgaaneversie van Gene en kan worden gebruikt in plaats van de was te verwijderen of te legen (persoonlijke communicatie met Dr. Ladislav Simo, INRAE, Frankrijk). Gezwollen teken blijven niet op dubbelzijdige tape. Het gebruik van klei om de teek te "inbakeren" helpt ze op hun plaats te houden tijdens manipulatie. Gebruik een tang om de teken- en wolfraamnaald vast te houden voor dissectie. Het ventrale deel is gemakkelijker te doorboren met een naald en heeft de voorkeur van de auteurs.
- Om de klier te legen, rangschikt u de gravid tick zoals vermeld in stap 1.4. Prik het gebied achter de monddelen aan de dorsale kant voorzichtig door en oefen druk uit op de ventrale kant met behulp van een tang.
OPMERKING: Als alternatief is het niet nodig om de wasklier te verwijderen; het legen van de klier van was zal enkele dagen duren. Eierleggende vrouwtjes hebben een wit gebied rond de monddelen dat de locatie van de wasklier aangeeft en kan als referentie worden gebruikt.- Plaats de rand van een pluisvrij laboratoriumdoekje en verwijder de vloeibare was die uit de punctieplaats komt. Zorg ervoor dat hemolymferecretie wordt voorkomen, wat een heldere vloeistof is in vergelijking met licht gelige viskeuze was. Het kan 5-10 minuten duren voordat het grootste deel van de was is verwijderd.
- Plaats na manipulatie de vrouwtjes in een couveuse bij 27 °C (>90% RV) en laat ze 1-2 dagen herstellen.
OPMERKING: Behandelde vrouwtjes hebben meestal 1-2 dagen nodig om te herstellen en opnieuw eieren te leggen. - Wanneer de vrouwtjes weer eieren beginnen te leggen, gebruik dan een fijne verfkwast om vers gedeponeerde eieren te verzamelen (0-18 uur na het leggen van de eieren) en plaats ze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Als u eieren van hetzelfde vrouwtje in de loop van de tijd gebruikt, moet deze procedure worden herhaald na 4-5 dagen eieren leggen als de klieren niet zijn verwijderd.
2. Embryobehandeling voor micro-injecties
- Voeg ~200 μL (of voldoende volume om de eieren te bedekken, afhankelijk van het aantal eieren) van 5% (gewicht/volume) benzalkoniumchloride/water (zie materiaaltabel) toe aan de buis met 0-18 uur oude eieren. Draai de eieren voorzichtig met de kwast gedurende 5 minuten om te voorkomen dat de eieren zich in de bodem van de buis nestelen (voor details, zie Sharma et al.4). Verwijder het supernatant met behulp van een micropipette en laat de eieren achter in de tube.
LET OP: Benzalkoniumchloride is corrosief voor huid en ogen, draag handschoenen en oogbescherming. - Voeg ~200 μL gedestilleerd (DI) water toe aan de buis met eieren, draai met een penseel en verwijder het water uit de microcentrifugebuis met behulp van een micropipette. Herhaal het wassen met DI-water nog een keer.
- Voeg na het wassen met DI-water ~200 μL van 5% (w/v) natriumchloride (NaCl) toe en draai voorzichtig met een kwast gedurende 5 min. Haal de oplossing na 5 min uit de tube en was de eieren twee keer met DI water.
- Voeg ~100 μL 1% (g/v) NaCl-oplossing toe aan de microcentrifugebuis met eieren. Bewaar de eieren in 1% (w/v) NaCl-oplossing totdat ze worden gebruikt voor injecties.
- Start micro-injecties na ongeveer een uur. Deze tijdlijn helpt bij een goede uitdroging van de eieren en voorkomt dat ze barsten.
OPMERKING: Eieren kunnen gedurende 7-8 uur in 1% (w/v) NaCl-oplossing worden bewaard zonder de overleving aanzienlijk te beïnvloeden. Als de eieren moeilijk te injecteren of barsten zijn, zijn de eieren niet voldoende uitgedroogd en kunnen ze verder worden behandeld met 5% (w / v) NaCl gedurende nog eens 5 minuten.
3. Bereiding van injectienaalden
- Steek een aluminosilicaat capillair glas (met filament, zie Materiaaltabel) in de naaldtrekker volgens de instructies van de fabrikant.
- Stel de naaldtrekker in op de volgende instellingen: Warmte: 575, Trekkracht: 20, Snelheid: 50, tijd: 200 en Druk: 700.
- Activeer de trekfunctie van de naaldtrekker en herhaal het proces voor extra naalden.
- Bewaar de getrokken naalden door ze in lijnen van modelleerklei in een schone petrischaal te steken.
- Laad de naald met het injectiemengsel met behulp van een microladerpunt (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De vergelijking van naalden die worden gebruikt voor de injectie van teken- en muggenembryo's is weergegeven in figuur 2.
4. Dia-instelling voor de micro-injecties
- Plak met dubbelzijdige tape twee glazen microscoopglaasjes aan elkaar, waardoor een opening van ongeveer 0,5 cm overblijft om het uitlijnen van eieren te ondersteunen en te voorkomen dat ze tijdens injecties omrollen (figuur 3A).
- Breng een stuk transparant filmverband (zie Materiaaltabel) aan op de dubbelzijdige tape in de opening tussen de dia's. Zorg ervoor dat de film perfect op de opening wordt afgestemd.
5. Micro-injecties van embryo's
- Lijn 8-10 eieren tegelijk uit op de dia-opstelling (hierboven) met behulp van een eenharige kwast.
OPMERKING: Eieren die zijn uitgelijnd met de langere as loodrecht (figuur 3B) op de schuifrand zijn gemakkelijker te injecteren dan eieren waarvan de lengteas evenwijdig aan de rand is uitgelijnd (figuur 3C). Eieren in de loodrechte oriëntatie (figuur 3B) kunnen beter tegen injectie, wat resulteert in een hogere overleving. - Plaats de dia met uitgelijnde eieren op het podium van een samengestelde microscoop. Gebruik een stukje pluisvrij doekje om de 1% NaCl-oplossing waarin ze zijn opgeslagen te verwijderen.
- Bevestig de gevulde injectienaald aan een micro-injector die is aangesloten op een micromanipulator (zie materiaaltabel).
- Open de naald door deze voorzichtig tegen het eioppervlak te wrijven met een hogedrukinstelling op de micro-injector (>5.000 hPa).
- Nadat de naald is geopend, verlaagt u de druk (1.000-2.500 hPa) van de micro-injector, afhankelijk van de opening van de naald.
OPMERKING: Een kleine opening vereist een relatief hogere druk, terwijl een grotere opening een lagere druk vereist. Dit is om het volume van het geïnjecteerde construct te regelen. Afhankelijk van de grootte van de naaldopening, zal het injectievolume variëren van 1-5 ml. - Injecteer alle eieren zo snel mogelijk in een hoek van 10°-15° op de glijbaan en verplaats de glijbaan onmiddellijk naar omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid in een petrischaaltje bekleed met vochtig papier. Zodra de eieren worden geïnjecteerd, beginnen ze uit te drogen.
OPMERKING: Het injecteren van een klein aantal eieren per keer verhoogt het injectiesucces en de overlevingskans. Naalden raken verstopt door embryoreflux. Als de punt nog steeds scherp is, om verstopte naalden te verwijderen, verplaatst u de naald in een kleine druppel van 1% NaCl die aan de rand van de dia is toegevoegd. De capillaire werking zal de kleine klomp verdrijven. Als de naald al stomp is, vervang deze dan.
6. Verzorging van embryo's na injectie
- Plaats de dia met geïnjecteerde embryo's in een grote petrischaal bekleed met vochtig filterpapier.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de eieren gedurende ten minste 5-6 uur niet te verstoren. Hierdoor kan de injectiewond goed worden afgesloten. De injectiewond kan zich openen wanneer het wordt geagiteerd en cytoplasma kan beginnen uit te sijpelen, wat resulteert in eisterfte. - Voeg na 5-6 uur een kleine druppel DI-water toe aan het transparante filmverband met geïnjecteerde embryo's eraan. Verplaats met een penseel voorzichtig de eieren. Breng de eieren over in een kleine petrischaal (10 cm) en dompel ze onder in DI-water.
OPMERKING: Het filmverband maakt het gemakkelijk om eieren na injecties te verwijderen. Op het moment dat een waterdruppel aan het filmdressing wordt toegevoegd, beginnen de eieren mee te bewegen met het water. - Houd de eieren ondergedompeld in water en plaats de petrischaal in een plastic doos van 6 kwart in een broedmachine bij 27 °C en >90% RV.
- Controleer de eieren regelmatig, dagelijks gedurende de eerste paar dagen en vervolgens om de 3-4 dagen totdat de larven beginnen uit te komen.
OPMERKING: Als een groot aantal eieren wordt beschadigd tijdens micro-injecties, zal het voorzichtig afvoeren van het DI-water na een week schimmelgroei op de dode eieren voorkomen. - Wanneer de larven beginnen uit te komen uit de geïnjecteerde embryo's (21-25 dagen na injectie voor de huidige laboratoriumopstelling), controleert u ze dagelijks en brengt u eventuele uitgekomen larven over naar glazen injectieflacons met een scherm erop. Larven kunnen onder water uitkomen en ~ 1-2 weken overleven.
- Screen de larven4 als de eieren zijn geïnjecteerd met een constructie die kan resulteren in een zichtbaar fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvol embryo-injectieprotocol voor I. scapularis wordt in dit artikel beschreven. Eierleggende vrouwtjes werden op een hoge luchtvochtigheid gehouden om uitdroging van gedeeltelijk gewaxte eieren te voorkomen. De waslaag werd verwijderd om tekenembryo's te injecteren door het orgaan van het gen (wasklier) van het gravid vrouwtje te aborteren (figuur 1A-E). We gebruikten aluminosilicaatglasnaalden met een kortere hals (figuur 2). Deze vorm was ideaal voor tekeneiereninjectie omdat het de druk beter kon verdragen dan de lange hals (taps toelopende) naald die wordt gebruikt voor injecties met insecteneieren. De bolvormige vorm van tekeneieren vereist een schuifplatform backstage (figuur 3A) om te voorkomen dat het ei van de glijbaan rolt tijdens het inbrengen van de naald. De vroege embryonale ontwikkeling van I. scapularis is onbekend, dus de timing en locatie van kiemcelvorming zijn ook onbekend. Daarom kozen we ervoor om eieren vroeg in de ontwikkeling te injecteren (12-18 uur oud) en ontdekten dat het uitlijnen van de langere as van het ei loodrecht op de rand van de dia resulteert in een hogere overleving (figuur 3B, C). Met behulp van dit protocol werden enkele duizenden eieren geïnjecteerd. Van deze geïnjecteerde eieren overleefde tot 8,5% en kwamen larven uit (tabel 1). Behandelde maar niet-geïnjecteerde eieren hadden een veel hogere overleving (tot 70%), wat suggereert dat verbetering van injecties (hetzij door timing, injectieplaats of naald) de overleving van eieren kan verbeteren. Dit protocol is ontwikkeld voor het injecteren van eieren vroeg in de embryogenese (12-18 uur oud); dit kan echter worden gebruikt voor eieren tot 10 dagen oud met een langere behandeling met NaCl en benzalkoniumchloride.
Figuur 1: Manipulatie van het orgaan van I. scapularis Gené. (A) Diagram van het orgaan van Gene. Boven: Het orgaan van Gene onder het scutum. Bodem: everted klier en monddelen neergeklapt. (B) Een vol vrouwtje onder de microscoop, beveiligd met klei. (C) Een vrouwtje beweegt haar monddelen op het ventrale oppervlak tijdens het leggen van eieren om het orgaan van Gene uit te breiden. Gele pijlen tonen witte vlekken en kunnen worden gebruikt als referentie voor de orgaanlocatie van Gene. Deze gebieden zijn zichtbaar bij vrouwtjes die gedurende 2-3 weken eieren leggen. (D,E) Het orgaan van het gen (een kleine bubbel in D en verlengd in E) is zichtbaar tussen het scutum en het capitulum. De hoorns van het genéorgel strekken zich uit als de monddelen naar beneden buigen (E). De blauwe pijl toont de locatie om een wolfraamnaald in te brengen om de klier te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van de vorm van glazen injectienaalden. De middelste wordt gebruikt voor tekenembryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ei-uitlijning voor injecties. (A) Glazen schuifopstelling die wordt gebruikt voor embryo-injecties. Microscoopglasglaasjes worden bevestigd, waardoor een opening achterblijft met dubbelzijdige tape, en het transparante filmverband wordt op de tape geplaatst. De eieren zijn uitgelijnd op de rand van de glijbaan. (B) Optimale uitlijning van eieren met een lange as loodrecht op de rand van de glijbaan. (C) Minder effectieve uitlijning van eieren met de lange as evenwijdig aan de rand van de dia-opstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Construct geïnjecteerd | Tijd na het leggen van eieren | Aantal geïnjecteerde eieren | Aantal uitgekomen larven | Overlevingspercentage |
| SGRNA + Cas9 | ≤12 u | 2,396 | 147 | 6.14 |
| Gen 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 u | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| Gen 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 u | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| Gen 3 | ||||
| Wolbachia | ≥ 24 u (24-36 u) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| SGRNA + Cas9 | 48-60 u | 191 | 5 | 2.62 |
| Gen 2 |
Tabel 1: Succesvolle ei-injectie en het uitkomen van larven in Ixodes scapularis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit is het eerste protocol dat is ontwikkeld om vroege tekenembryo's met succes te injecteren. Een overlevingspercentage van ~ 4% -8% is bereikt, wat vergelijkbaar is met embryo-injectie in andere gevestigde insectenmodellen5.
Aangezien dit het initiële protocol is, wordt verwacht dat dit protocol verder zal worden verfijnd en gespecialiseerd voor individuele tekensoorten. In het bijzonder zal de injectietiming variëren van soort tot soort, afhankelijk van embryogenese, met name de timing van cellularisatie. De voorlopige gegevens suggereren dat I. scapularis-eieren niet door een snelle nucleaire deling gaan in de eerste 24 uur na het leggen en dat cellularisatie een paar dagen later plaatsvindt (ongepubliceerde gegevens). We hebben dit protocol al gebruikt voor plasmideafgifte4, CRISPR-gemedieerde gen knock-out4 en afgifte van bacteriën (Wolbachia) (tabel 1). Verwacht wordt dat dit embryo-injectieprotocol mogelijkheden zal bieden om transgene teken te genereren en gen knock-out en knock-in studies haalbaar zal maken in elk laboratorium. Dit zal waardevol blijken voor het versnellen van studies die de biologie van teken en de interfaces tussen teken en pathogene gastheer onderzoeken.
Kritieke stappen binnen het protocol
Het is belangrijk om eieren te verzamelen binnen 24 uur na het leggen, omdat dit protocol is gestandaardiseerd voor vroege embryo's. Als eieren na deze tijd worden verzameld, is een langere behandeling van benzalkoniumchloride en NaCl nodig en is de overleving lager bij oudere eieren (tabel 1). Het chorion verhardt na verloop van tijd, waardoor het moeilijk is om gecontroleerde uitdroging uit te voeren voor micro-injecties in eieren ouder dan 24 uur. Het viel op dat het injecteren van minder eieren per keer helpt bij het overleven, omdat de behandelde eieren de neiging hebben om snel uit te drogen wanneer ze uit de 1% NaCl-oplossing worden verwijderd. Als de eieren te veel uitdrogen, zullen ze sterven, maar ze zullen barsten tijdens micro-injectie als ze niet op de juiste manier worden uitgedroogd. Daarom is het optimaliseren van de juiste uitdrogingstijd noodzakelijk voor verschillende tekensoorten of stammen. Bovendien is het van cruciaal belang om de eieren ongestoord te houden na micro-injecties in omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid.
Beperkingen en toekomstige richtingen
Zodra de embryo's zijn ontwast, hebben ze de neiging om snel uit te drogen, dus het proces om ze op de dia uit te lijnen en te injecteren moet snel worden uitgevoerd. De snelle verbetering in snelheid en nauwkeurigheid kan alleen worden bereikt door constante oefening en geduld. Ons toekomstige werk zal gericht zijn op het verbeteren van het overlevingspercentage van embryo's na injectie en het identificeren van de timing van kiemcelvorming om erfelijke mutaties te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Channa Aluvihare en Yonus Gebermicale, ITF, UMD, voor inzicht en ondersteuning tijdens de beginfase van protocolontwikkeling. Wolfraamnaalden waren een gulle gift van David O'Brochta, ITF, UMD. We zijn Dr. Ladislav Simo dankbaar voor het testen van dit protocol in I. ricinus en voor inzichtelijke discussies. Dit project werd gefinancierd door NIH-NIAID R21AI128393 en Plymouth Hill Foundation, NY naar MG-N, startup-fondsen van de Universiteit van Nevada tot AN, de National Science Foundation Grant No. 2019609 tot MG-N en AN, en een Peer-to-Peer Grant van IGTRCN tot AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
