Summary
Den nuværende protokol beskriver oprettelsen af 3D 'ovenpå ' kulturer af en ikke-transformeret brystepitelcellelinje, MCF10A, der er blevet modificeret til at studere blodpladeaktiveringsfaktor (PAF) induceret transformation. Immunfluorescens er blevet brugt til at vurdere transformationen og diskuteres detaljeret.
Abstract
Flere modeller er blevet udviklet til at studere kræft, såsom gnavermodeller og etablerede cellelinjer. Værdifulde indsigter i carcinogenese er blevet tilvejebragt af undersøgelser ved hjælp af disse modeller. Cellelinjer har givet en forståelse af dereguleringen af molekylær signalering forbundet med brysttumorigenese, mens gnavermodeller i vid udstrækning anvendes til at studere cellulære og molekylære egenskaber ved brystkræft in vivo. Etableringen af 3D-kulturer af brystepitel- og kræftceller hjælper med at bygge bro over kløften mellem in vivo- og in vitro-modeller ved at efterligne in vivo-forholdene in vitro. Denne model kan bruges til at forstå dereguleringen af komplekse molekylære signalhændelser og de cellulære egenskaber under brystcarcinogenese. Her modificeres et 3D-kultursystem til at studere en fosfolipidmediatorinduceret (blodpladeaktiveringsfaktor, PAF) transformation. Immunmodulatorer og andre udskillede molekyler spiller en vigtig rolle i tumorinitiering og progression i brystet. I denne undersøgelse udsættes 3D-acinarkulturer af brystepitelceller for PAF-udviste transformationsegenskaber såsom tab af polaritet og ændrede cellulære egenskaber. Dette 3D-kultursystem vil hjælpe med at kaste lys over genetiske og / eller epigenetiske forstyrrelser induceret af forskellige små molekyleenheder i tumormikromiljøet. Derudover vil dette system også give en platform til identifikation af nye såvel som kendte gener, der kan være involveret i transformationsprocessen.
Introduction
Et utal af modeller er tilgængelige for at studere udviklingen af kræft, hver af dem er unikke og repræsenterer en undertype af denne komplekse sygdom. Hver model giver unik og værdifuld indsigt i kræftbiologi og har forbedret midlerne til at efterligne den faktiske sygdomstilstand. Etablerede cellelinjer dyrket som et monolag har givet værdifuld indsigt i vitale processer in vitro, såsom spredning, invasivitet, migration og apoptose1. Selvom todimensionel (2D) cellekultur har været det traditionelle værktøj til at undersøge pattedyrcellernes reaktion på flere miljøforstyrrelser, synes ekstrapolering af disse fund for at forudsige responser på vævsniveau ikke tilstrækkelig overbevisende. Den største begrænsning ved 2D-kulturerne er, at det skabte mikromiljø adskiller sig stort set fra selve brystvævet2. 2D-kultur mangler cellernes interaktion med den ekstracellulære matrix, hvilket er afgørende for væksten af ethvert væv. Trækkræfter, som cellen oplever i monolagskulturer, hindrer også polariteten af disse celler og ændrer således cellesignalering og adfærd 3,4,5. Tredimensionelle (3D) kultursystemer har åbnet en ny vej inden for kræftforskning med deres evne til at efterligne in vivo-forholdene in vitro. Mange vigtige mikromiljømæssige signaler, der går tabt i 2D-cellekultur, kan genetableres ved hjælp af 3D-kulturer af lamininrig ekstracellulær matrix (lrECM)6.
Forskellige undersøgelser har identificeret betydningen af tumormikromiljøet i carcinogenese 7,8. Inflammationsrelaterede faktorer er en stor del af mikromiljøet. Platelet Activating Factor (PAF) er en phospholipid mediator udskilt af forskellige immunceller, der medierer flere immunresponser 9,10. Høje niveauer af PAF udskilles af forskellige brystkræftcellelinjer og er forbundet med forbedret spredning11. Undersøgelser fra vores laboratorium har vist, at den langvarige tilstedeværelse af PAF i acinarkulturer fører til transformation af brystepitelceller12. PAF aktiverer PAF-receptoren (PAFR) og aktiverer PI3K/Akt-signalaksen13. PAFR rapporteres også at være forbundet med EMT, invasion og metastase14.
Den nuværende protokol demonstrerer et modelsystem til at studere PAF-induceret transformation ved hjælp af 3D-kulturer af brystepitelceller, som det tidligere er blevet beskrevet af Chakravarty et al.12. Brystepitelcellerne dyrket på den ekstracellulære matrix (3D-kulturer) har tendens til at danne polariserede vækstarresterede sfæroider. Disse kaldes acini og ligner meget acini af brystvæv, den mindste funktionelle enhed i brystkirtlen, in vivo15. Disse sfæroider (figur 1A, B) består af et monolag af tætpakkede polariserede epitelceller, der omgiver et hult lumen og er fastgjort til kældermembranen (figur 1C). Denne morfogeneseproces er blevet godt beskrevet i litteratur16. Når cellerne sås på lrECM, gennemgår de opdeling og differentiering for at danne en klynge af celler, som derefter polariserer fra dag 4 og fremefter. På dag 8 består acini af en gruppe polariserede celler, der er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrix og en klynge af upolariserede celler indesluttet i de ydre polariserede celler uden kontakt til matrixen. Disse upolariserede celler er kendt for at gennemgå apoptose ved dag 12 af kultur, der danner et hult lumen. På dag 16 dannes væksthæmmede strukturer16.
Figur 1: Kerner af celler i acini farvet med en nuklear plet . (A) 3D-konstruktion af acini. (B) Fasekontrastbillede af MCF10A acini dyrket på Matrigel i 20 dage. (C) Det midterste afsnit viser tilstedeværelsen af et hult lumen. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
I modsætning til 2D-kulturer hjælper acinarkulturer med at skelne mellem normale og transformerede celler gennem tilsyneladende morfologiændringer. Ikke-transformerede brystepitelceller danner acini med et hult lumen, der efterligner den normale menneskelige bryst acini. Disse sfæroider viser ved transformation en forstyrret morfologi karakteriseret ved et stort tab af polaritet (et af kendetegnene ved kræft), fravær af lumen eller forstyrrelse af det hule lumen (på grund af unddragelse af apoptose), der kan induceres på grund af deregulering af forskellige gener17,18,19,20 . Disse transformationer kan studeres ved hjælp af almindeligt anvendte teknikker såsom immunfluorescens. Således kan 3D-cellekulturmodellen fungere som en simpel metode til at undersøge processen med bryst acinarmorfogenese og brystcarcinogenese. Etablering af et 3D-kultursystem for at forstå effekten af en phospholipidmediator, PAF, vil hjælpe med præklinisk lægemiddelscreening med høj kapacitet.
Dette arbejde har tilpasset 3D 'on top' kulturprotokol16,21 til undersøgelse af transformation induceret af PAF22. De fænotypiske ændringer induceret ved eksponering af acini for phospholipidmediatoren blev undersøgt ved anvendelse af immunfluorescens. Forskellige polaritets- og epitel-til-mesenkymale overgangsmarkører (EMT) 12,16 blev anvendt i undersøgelsen. Tabel 1 nævner deres normale lokalisering og deres forventede fænotype ved transformation.
| Antistoffer | Markerer | Normal lokalisering | Transformeret fænotype |
| α6-Integrin | Basolateral | Basal med svag lateral plet | Stærk lateral / apikal plet |
| β-Catenin | Celle-celle-kryds | Basolateral | Unormal / nuklear eller cytoplasmatisk lokalisering |
| Vimentin | Emt | Fraværende / svag tilstedeværelse | Opregulering |
Tabel 1: Markører anvendt i undersøgelsen. Forskellige markører anvendes med deres lokalisering i nærvær og fravær af PAF-behandling.
Denne metode kan bedst bruges til at studere / screene plausible lægemidler og målrette gener for forskellige brystkræftundertyper. Dette kan give data om lægemiddelrespons tættere på in vivo-scenariet og bidrage til hurtigere og mere pålidelig lægemiddeludvikling. Dette system kan også bruges til at studere molekylær signalering forbundet med lægemiddelrespons og lægemiddelresistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Såning af MCF10A-celler i lrECM
- Vedligehold MCF10A-celler (klæbende brystepitelceller) i vækstmediet. Passage cellerne hver 4. dag.
BEMÆRK: Sammensætning af vækstmedium: DMEM med høj glukose uden natriumpyruvat indeholdende hesteserum (5%), insulin (10 μg/ml), hydrocortison (0,5 μg/ml), epidermal vækstfaktor, EGF (20 ng/ml), koleratoksin (100 ng/ml) og penicillin-streptomycin (100 enheder/ml) (se materialetabel). - Optøning lrECM (se Materialetabel) på is 20 min før forsøgets start. Dagen for såning af cellerne betragtes generelt som dag 0.
- For at trypsinisere cellerne skal du opsuge mediet og vaske med 2 ml PBS. Tilsæt 900 μL 0,05% Trypsin-EDTA og inkuber ved 37 ° C i ~ 15 minutter eller indtil cellerne er fuldstændigt trypsiniseret.
- Forbered en seng af lrECM i otte brønde i et kammerdækglasglas (se Materialetabel).
- Når cellerne er trypsiniserende, skal du belægge hver brønd med 60 μL lrECM og placere den i en 37 °C CO2 inkubator i maksimalt 15 min.
- Forbered cellesuspensionen ved at følge nedenstående trin.
- Efter fuldstændig løsrivelse af celler tilsættes 5 ml re-suspensionsmedium for at slukke trypsinaktivitet og dreje cellerne ved 112 x g i 10 minutter ved 25 °C.
BEMÆRK: Sammensætning af re-suspension medium: høj glucose DMEM uden natriumpyruvat, suppleret med hesteserum (20%) og penicillin-streptomycin (100 enheder / ml). - Aspirer det brugte medium og suspender cellerne igen i 2 ml analysemedium. Bland suspensionen godt for at sikre dannelsen af en enkeltcellesuspension.
BEMÆRK: Sammensætning af assaymedium: DMEM med høj glucose uden natriumpyruvat, suppleret med hesteserum (2%), hydrocortison (0,5 μg / ml), kolertoksin (100 ng / ml), insulin (10 μg / ml) og penicillin-streptomycin (100 enheder / ml). - Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og beregn mængden af cellesuspension, der er nødvendig for at så 6 x 103 celler i hver brønd.
BEMÆRK: Det foretrækkes generelt at medtage en ekstra brønd i beregningen for at tage højde for eventuelle pipetteringsfejl. - I henhold til antallet af krævede brønde fortyndes cellesuspensionen i overlaymedium.
BEMÆRK: Overlaymediumsammensætningen for en enkelt brønd er som følger: 400 μL assaymedium, 8 μL lrECM (2% endelig) og 0,02 μL 100 μg/ml EGF (5 ng/ml endelig).
- Efter fuldstændig løsrivelse af celler tilsættes 5 ml re-suspensionsmedium for at slukke trypsinaktivitet og dreje cellerne ved 112 x g i 10 minutter ved 25 °C.
- Udfør såning af cellerne.
- Der tilsættes 400 μL af den fortyndede cellesuspension til de forberedte lrECM-senge (trin 1.4), og sørg omhyggeligt for ikke at forstyrre lrECM-sengen. Der inkuberes ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -inkubator.
2. PAF-behandling
- Tilsæt PAF 3 timer efter såning af celler. Forbered en 100 μM bestand af PAF i PBS og tilsæt det krævede volumen på 0,2 μL i hver brønd (hvilket svarer til 200 nM).
- Tilføj den samme koncentration af PAF under hver medieændring.
3. Genfodring med friske medier
- Genopfyld cellerne med frisk medium hver 4. dag (dvs. dag 4, dag 8, dag 12 og dag 16).
4. Immunofluorescensundersøgelse til påvisning af fænotypiske ændringer induceret af langvarig PAF-eksponering
- Efter 20 dages dyrkning pipetteres forsigtigt mediet ud af hver brønd og vaskes med 400 μL forvarmet PBS.
- Fix acinarstrukturerne ved at tilsætte 400 μL 4% paraformaldehyd (frisklavet ved fortynding af 16% paraformaldehyd i 1x PBS) og inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl brøndene én gang med iskold PBS og gennemtræng med PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 i 10 minutter ved 4 °C.
- Efter 10 minutter pipetteres Triton-X 100-opløsningen straks, men forsigtigt, og skylles med 400 μL PBS-glycin (frisklavet ved tilsætning af en knivspids glycin i 1x PBS). Dette gentages tre gange i 15 minutter hver.
- Der tilsættes 400 μL af den primære blokerende opløsning bestående af 10 % gedeserum (se materialetabel) i immunfluorescensbuffer (IF), og der inkuberes ved stuetemperatur i 60 min.
BEMÆRK: Sammensætning af IF-buffer: 0,05% natriumazid, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 og 0,05% Tween (20 i 1 PBS). - Fjern den primære blokeringsopløsning, tilsæt 200 μL 2% sekundært blokerende antistof (F(ab')2 fragment af antistof rejst i ged mod museantigen, se Materialetabel) fremstillet i primær blokeringsopløsning, og lad det stå i 45-60 minutter ved stuetemperatur.
- Det primære antistof (se Materialetabel) fremstilles i 2% sekundær blokerende antistofopløsning i en 1:100 fortynding. Efter fjernelse af den sekundære blokeringsopløsning tilsættes det frisklavede antistof og inkuberes natten over ved 4 °C.
- Det foregående trin kan fremkalde fortætning af kældermembranen. Før du fortsætter med eksperimentet, skal du vente, indtil diaset når stuetemperatur. Den primære antistofopløsning pipetteres forsigtigt, og den vaskes tre gange med 400 μL IF-buffer.
- Under den sidste vask med IF-buffer fremstilles en 1:200 fortynding af det fluorophorekonjugerede sekundære antistof (se Materialetabel) i den primære blokerende opløsning. Inkuber diasene i den sekundære antistofopløsning i 40-60 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl diasene med 400 μL IF-buffer i 20 min, efterfulgt af to vaske med PBS i 10 minutter hver.
- Modpletter kernerne med PBS indeholdende 0,5 ng/ml kerneplet (se Materialetabel) i 5-6 minutter ved stuetemperatur. Vask diasene tre gange med 400 μL PBS for at fjerne overskydende plet.
- Pipetter forsigtigt hele PBS'en ud, og sørg for, at restopløsningen fjernes. Tilsæt en dråbe monteringsreagens (se Materialetabel) i hver brønd, og lad den stå ved stuetemperatur natten over.
- Opbevar diasene ved stuetemperatur, og beskyt diasene så hurtigt som muligt.
- Billede under 40x eller 63x forstørrelse på et konfokalmikroskop (se Materialetabel), der tager optiske Z-sektioner på 0,6 mm trinstørrelse (NA = 1,4).
- Åbn de erhvervede billeder med en billedbehandlingssoftware (se Materialetabel). Demonstrer de morfologiske forskelle ved hjælp af 3D-fremskrivninger.
BEMÆRK: Det midterste optiske Z-snit kan bedst bruges til at vise forskelle i lokaliseringen af polaritetsmarkører. Disse kan kvantificeres manuelt for at repræsentere procentdelen af sfæroider, der viser det specifikke farvningsmønster. - For at illustrere forskelle i ekspressionen af proteiner skal der udføres en semikvantitativ analyse, der måler den gennemsnitlige grå værdi eller beregner korrigeret total cellefluorescens (CTCF)23. Repræsenter dataene som violin- eller prikplot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCF10A-celler danner ved eksponering for PAF-behandling acinarstrukturer med meget forskellige fænotyper. α6-integrin viste sig at være fejllokaliseret med mere apikal farvning. Nogle få acini viste også diskontinuerlig farvning (figur 2A). Begge disse fænotyper indikerer tabet af basal polaritet, som det fremgår af litteratur24,25. Tidligere rapporter tyder på α6-integrins kontroversielle rolle i kræftmetastase. α6-integrin er til stede som en dimer med enten β1- eller β4-integrin. Underenheden α6β4 har vist sig at spille en væsentlig rolle i dannelsen af hemidesmosomer i epitelceller26. Nedreguleringen af dette integrin er fundet i prostata og nogle tilfælde af brystkræft, hvor tab af α6β4-integrin blev fundet i duktalt karcinom i brystet (klasse III). Tabsfænotypen ses i cellerne, der metastaserer til parenchymen og pleurhulen27,28,29. GM130 er et cis-Golgi lokaliseret protein; Golgi-kroppe er apikalt lokaliseret i MCF10A acinarkulturer16,30. PAF-behandling førte til fejllokalisering af GM130, hvilket tyder på apikal polaritetsforstyrrelse (figur 2B). Vimentin er et mellemliggende filament, der er involveret i cellemigration; det opreguleres, når epitelceller gennemgår epitel til mesenkymal overgang (EMT)31. PAF-behandling af MCF10A acinarkulturer førte til forhøjede vimentinniveauer som observeret ved farvningsintensiteten (figur 2C), hvilket tyder på EMT.
Figur 2: PAF forstyrrer polariteten og inducerer EMT-lignende ændringer i MCF10A bryst acini. MCF10A-celler blev dyrket som 3D-'ovenpå' kulturer i lrECM. Kulturerne blev behandlet med PAF på dag 0, 4, 8, 12 og 16. Kulturerne blev opretholdt i 20 dage og derefter immunfarvet for α6-integrin (grøn) og nuklear plet (blå) (A), (B) GM130 (grøn), en markør for apikal polaritet, og (C) Vimentin (rød), en EMT-markør. Den midterste stak af den respektive acini er blevet vist. De repræsentative data er for 40-50 acini fra tre biologisk uafhængige eksperimenter. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etablerede cellelinjebaserede modeller bruges i vid udstrækning til at studere processen med carcinogenese. Monolagskulturer af celler fortsætter med at give indsigt i de forskellige molekylære signalveje, der formidler karakteristiske ændringer i kræftceller32. Undersøgelser af rollen som velkendte onkogener som Ras, Myc og muteret p53 blev først rapporteret ved hjælp af monolagskulturer som modelsystem33,34,35,36. 2D-kulturmodellen mangler imidlertid mange vigtige strukturelle og funktionelle parametre, der er til stede in vivo. Lægemiddelscreeningsundersøgelser i 2D-kulturer viser ofte et signifikant respons (celledød eller målhæmning), selv ved lavere koncentrationer, mens de ikke viser nogen signifikant effekt, når de administreres hos mus37. En væsentlig årsag til dette er den varierende lægemiddeltilgængelighed og optagelse i en 2D-monolagskultur vs. 3D kultur38.
Begrebet 3D-kulturer er opstået som et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingen af kræft i det sidste årti. 3D-kulturer involverer voksende celler på en ekstracellulær matrix, hvilket resulterer i dannelsen af strukturer, der ligner funktionelle enheder, der er til stede i vævet in vivo16. 3D-kulturer efterligner i vid udstrækning in vivo-mikromiljøet og overvinder dermed begrænsningerne i 2D-kulturer39. Da cellerne dyrket i 3D er af menneskelig oprindelse, og systemet er mere modtageligt for at studere tidlige begivenheder, er det enklere og mere elegant end gnavermodellerne.
Ved hjælp af denne platform demonstreres en model til at studere transformationsprocessen efter eksponering for en phospholipidmediator som PAF. Undersøgelser fra vores laboratorium har identificeret, at PAF-behandling kan transformere den ikke-tumorfremkaldende brystepitelcellelinje, MCF10A12. Denne metode er optimeret til kontinuerligt at udsætte cellerne for PAF, svarende til in vivo-scenariet , hvor PAF er til stede i mikromiljøet.
MCF10A-celler, når de dyrkes i 2D, skal passeres hver 4. dag. Hvis de ikke opretholdes i henhold til protokollen, opfører de sig meget anderledes, hvilket kun er synligt, når de dyrkes på ECM16. Cellernes passagenummer skal holdes så lavt som muligt. Denne metode har også begrænsninger på grund af variationen i proteinkoncentration i forskellige batcher af lrECM. Dette kan overvindes ved at teste de forskellige partier ved blot at plettere celler på en lrECM-seng og observere størrelsesfordelingen af acini. Hvis der ikke er nogen stor variation i størrelse, kan lrECM-batchen betragtes som egnet til forsøg.
Vurdering af transformationen sker generelt ved immunfluorescens, hvilket er demonstreret i videoen. Under udførelse af immunfluorescens er trinene, der involverer inkubation ved 4 °C, kritiske; pipettering af opløsningen, når lrECM-laget er i flydende tilstand, gør laget ujævnt, hvilket fører til tab af acinarstrukturer. En af måderne at tackle ujævnhedsproblemet på er at gemme diasene ved 4 ° C på en jævn platform natten over eller ændre forstørrelsen, hvor billeddannelsen udføres. For at undgå at pipettere acinarstrukturerne skal kammeret forsigtigt fjernes fra 4 °C-lageret og tre fjerdedele af det volumen, der oprindeligt er tilsat, og derefter tages resten ud under de efterfølgende vaske.
Et andet stort problem er den høje baggrund på grund af lrECM. For at overvinde dette problem kan man bruge et 2% sekundært blokerende antistof i stedet for 1%. Øget sekundær blokering tjener imidlertid ikke formålet med farvning af apikale markører og E-cadherin. I sådanne tilfælde anbefales det at udsætte kammerdækselglasset efter dag 20 for PBS-EDTA i 15 minutter ved 4 °C og derefter fastgøre acini efter den samme protokol som vist i videoen. PBS-EDTA opløser delvist lrECM og reducerer dermed baggrunden. Men hvis inkubationstiden overskrides, kan denne behandling resultere i tab af strukturer, mens opløsningen pipetteres. Derfor skal der udvises den største omhu under udførelsen af denne procedure. Det er også blevet observeret, at lagring af dias i længere perioder kan føre til en stigning i baggrundssignalet. Derfor skal billeddannelse udføres så hurtigt som muligt. Det tilrådes at afbilde mindst 15 acini pr. eksperiment for at bestemme en ændring i fænotype.
3D acinarkulturer har visse begrænsninger, såsom vanskeligheder med at spore enkeltceller under levende cellebilleddannelse. Visse undersøgelser, såsom virkninger på cellecyklus, skal udføres ved hjælp af levende cellebilleddannelse for at opretholde rumlig og tidsmæssig information. På grund af konstante ændringer i strukturen er det imidlertid vanskeligt at spore sådanne parametre i 3D-acinarkulturer ved hjælp af regelmæssige konfokale mikroskoper. Dette berettiger til brug af avancerede mikroskopiske teknikker såsom superopløsningsmikroskopi eller Airyscan-mikroskopi. Det ville også kræve fjernelse af acinarstrukturerne til visse transformationsassays såsom sårheling, forankring-uafhængig vækst og in vivo tumorigenicitetsassays. Denne forskydning ville resultere i tab af vigtige rumlige og tidsmæssige oplysninger. Proteinlysater indsamlet fra kulturerne fortyndes ofte på grund af tilstedeværelsen af IrECM, hvilket udgør problemer med belastningen af tilstrækkelig mængde lysater. Dette kan dog i højere grad overvindes ved at løsne acinistrukturerne og samle dem inden lysis.
Her er et modelsystem blevet demonstreret til at studere phospholipidmediator / immunassocieret faktorinduceret transformation. Denne model kan belyse genetiske og/eller epigenetiske veje, der kan blive dereguleret, hvilket fører til drastiske ændringer i morfologien. Denne metode kan også bruges til at screene potentielle terapier. Sådanne lægemiddelscreeningsundersøgelser vil give bedre succes end screeninger udført i 2D-kulturer38. Et vigtigt højdepunkt i denne metode er tilpasningsevnen i henhold til undersøgelsens krav. Behandlingsregimen og analysemetoderne kan ændres efter behov. Desuden kan denne metode give indsigt i den molekylære signalering, der påvirkes ved behandling40. Teknikken vil også hjælpe med at forudsige den mulige forekomst af lægemiddelresistens. Desuden vil det også hjælpe med at belyse den mekanisme, der er involveret i lægemiddelresistens, og identificere plausible mål for at overvinde det samme. Undersøgelser har etableret muligheder for samdyrkning af flere celletyper i 3D, som yderligere kan ændres for at imødekomme behandlingsregimen41. Sådanne muligheder vil give større indsigt i de egenskaber og molekylære ændringer, der sker in vivo under initiering og progression af brystkræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker IISER Pune Microscopy Facility for adgang til udstyr og infrastruktur og støtte til eksperimenterne. Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra Institut for Bioteknologi (DBT), Indiens regering (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Indiens regering (EMR / 2016 / 001974) og delvist af IISER, Pune Core-finansiering. A. K. blev finansieret af CSIR-SRF-stipendium, LA blev finansieret gennem DST-INSPIRE-stipendium, V.C blev finansieret af DBT (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
- Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
- Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
- Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
- Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
- Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
- Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
- Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
- Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
- Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
- Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
- Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
- Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
- Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
- Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
- Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
- Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
- Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
- McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
- Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
- Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).
