Summary
Het huidige protocol beschrijft het opzetten van 3D 'bovenop' culturen van een niet-getransformeerde borstepitheelcellijn, MCF10A, die is aangepast om door Bloedplaatjes Activerende Factor (PAF) geïnduceerde transformatie te bestuderen. Immunofluorescentie is gebruikt om de transformatie te beoordelen en wordt in detail besproken.
Abstract
Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om kanker te bestuderen, zoals knaagdiermodellen en gevestigde cellijnen. Waardevolle inzichten in carcinogenese zijn verkregen door studies met behulp van deze modellen. Cellijnen hebben inzicht gegeven in de deregulering van moleculaire signalering geassocieerd met borsttumorigenese, terwijl knaagdiermodellen op grote schaal worden gebruikt om cellulaire en moleculaire kenmerken van borstkanker in vivo te bestuderen. De oprichting van 3D-culturen van borstepitheel- en kankercellen helpt bij het overbruggen van de kloof tussen in vivo en in vitro modellen door de in vivo omstandigheden in vitro na te bootsen. Dit model kan worden gebruikt om de deregulering van complexe moleculaire signaleringsgebeurtenissen en de cellulaire kenmerken tijdens de carcinogenese van de borst te begrijpen. Hier wordt een 3D-kweeksysteem aangepast om een door fosfolipide mediator geïnduceerde (Platelet Activating Factor, PAF) transformatie te bestuderen. Immunomodulatoren en andere uitgescheiden moleculen spelen een belangrijke rol bij tumorinitiatie en progressie in de borst. In de huidige studie worden 3D-acinaire culturen van borstepitheelcellen blootgesteld aan PAF vertoonde transformatiekenmerken zoals verlies van polariteit en veranderde cellulaire kenmerken. Dit 3D-kweeksysteem zal helpen bij het werpen van licht op genetische en / of epigenetische verstoringen geïnduceerd door verschillende kleine molecuulentiteiten in de micro-omgeving van de tumor. Bovendien zal dit systeem ook een platform bieden voor de identificatie van zowel nieuwe als bekende genen die betrokken kunnen zijn bij het transformatieproces.
Introduction
Een groot aantal modellen zijn beschikbaar om de progressie van kanker te bestuderen, elk van hen is uniek en vertegenwoordigt een subtype van deze complexe ziekte. Elk model biedt unieke en waardevolle inzichten in de biologie van kanker en heeft de middelen verbeterd om de werkelijke ziektetoestand na te bootsen. Gevestigde cellijnen die als monolaag zijn gegroeid, hebben waardevolle inzichten opgeleverd in vitale processen in vitro, zoals proliferatie, invasiviteit, migratie en apoptose1. Hoewel tweedimensionale (2D) celcultuur het traditionele hulpmiddel is geweest om de reactie van zoogdiercellen op verschillende omgevingsverstoringen te onderzoeken, lijkt extrapolatie van deze bevindingen om reacties op weefselniveau te voorspellen niet overtuigend genoeg. De belangrijkste beperking van de 2D-culturen is dat de gecreëerde micro-omgeving grotendeels verschilt van die van het borstweefsel zelf2. 2D-cultuur mist de interactie van de cellen met de extracellulaire matrix, die van vitaal belang is voor de groei van elk weefsel. Ook belemmeren trekkrachten die de cel in monolaagculturen ervaart de polariteit van deze cellen, waardoor de celsignalering en het gedrag veranderen 3,4,5. Driedimensionale (3D) kweeksystemen hebben een nieuwe weg geopend op het gebied van kankeronderzoek met hun vermogen om de in vivo omstandigheden in vitro na te bootsen. Veel cruciale micro-omgevingssignalen die verloren gaan in 2D-celcultuur kunnen worden hersteld met behulp van 3D-culturen van lamininerijke extracellulaire matrix (lrECM)6.
Verschillende studies hebben het belang van de tumor micro-omgeving in carcinogenese geïdentificeerd 7,8. Ontstekingsgerelateerde factoren zijn een belangrijk onderdeel van de micro-omgeving. Platelet Activating Factor (PAF) is een fosfolipidemediator die wordt uitgescheiden door verschillende immuuncellen en die meerdere immuunresponsen bemiddelt 9,10. Hoge niveaus van PAF worden uitgescheiden door verschillende borstkankercellijnen en worden geassocieerd met verhoogde proliferatie11. Studies van ons laboratorium hebben aangetoond dat de langdurige aanwezigheid van PAF in acinaire culturen leidt tot de transformatie van borstepitheelcellen12. PAF activeert de PAF-receptor (PAFR) en activeert de PI3K/Akt-signaleringsas13. PAFR wordt ook geassocieerd met EMT, invasie en metastase14.
Het huidige protocol demonstreert een modelsysteem om PAF-geïnduceerde transformatie te bestuderen, met behulp van 3D-culturen van borstepitheelcellen, zoals eerder is beschreven door Chakravarty et al.12. De borstepitheelcellen die op de extracellulaire matrix (3D-culturen) zijn gegroeid, hebben de neiging om gepolariseerde groei-arresteerde sferoïden te vormen. Deze worden acini genoemd en lijken sterk op de acini van borstweefsel, de kleinste functionele eenheid van de borstklier, in vivo15. Deze sferoïden (figuur 1A,B) bestaan uit een monolaag van dicht opeengepakte gepolariseerde epitheelcellen rond een hol lumen en bevestigd aan het keldermembraan (figuur 1C). Dit proces van morfogenese is goed beschreven in literatuur16. Wanneer ze op lrECM worden gezaaid, ondergaan de cellen deling en differentiatie om een cluster van cellen te vormen, die vervolgens vanaf dag 4 polariseren. Op dag 8 bestaan de acini uit een groep gepolariseerde cellen die in direct contact staan met de extracellulaire matrix en een cluster van niet-gepolariseerde cellen ingesloten in de buitenste gepolariseerde cellen, zonder contact met de matrix. Van deze niet-gepolariseerde cellen is bekend dat ze op dag 12 van de cultuur apoptose ondergaan en een hol lumen vormen. Op dag 16 worden groei-arresteerde structuren gevormd16.
Figuur 1: Kernen van cellen in acini gekleurd met een kernvlek. (A) 3D-constructie van de acini. (B) Fasecontrastbeeld van MCF10A acini gekweekt op Matrigel gedurende 20 dagen. (C) Het middelste gedeelte toont de aanwezigheid van een hol lumen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In tegenstelling tot 2D-culturen helpen acinarculturen bij het onderscheiden van normale en getransformeerde cellen door middel van schijnbare morfologische veranderingen. Niet-getransformeerde borstepitheelcellen vormen acini met een hol lumen, dat de normale menselijke borst acini nabootst. Deze sferoïden vertonen bij transformatie een verstoorde morfologie die wordt gekenmerkt door een groot verlies van polariteit (een van de kenmerken van kanker), afwezigheid van een lumen of verstoring van het holle lumen (als gevolg van ontwijking van apoptose) die kan worden geïnduceerd als gevolg van deregulatie van verschillende genen 17,18,19,20 . Deze transformaties kunnen worden bestudeerd met behulp van veelgebruikte technieken zoals immunofluorescentie. Het 3D-celkweekmodel kan dus functioneren als een eenvoudige methode om het proces van borstacinaire morfogenese en carcinogenese van de borst te onderzoeken. Het opzetten van een 3D-kweeksysteem om het effect van een fosfolipidemediator, PAF, te begrijpen, zal helpen bij preklinische geneesmiddelenscreening met hoge doorvoer.
Dit werk heeft het 3D 'on top' cultuurprotocol16,21 aangepast voor het bestuderen van transformatie geïnduceerd door PAF22. De fenotypische veranderingen veroorzaakt door blootstelling van de acini aan de fosfolipide mediator werden bestudeerd met behulp van immunofluorescentie. Verschillende polariteit en epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) markers12,16 werden gebruikt in de studie. Tabel 1 vermeldt hun normale lokalisatie en hun verwachte fenotype bij transformatie.
| Antilichamen | Merken | Normale lokalisatie | Getransformeerd fenotype |
| α6-Integrin | Basolateraal | Basaal met zwakke laterale vlek | Sterke laterale / apicale vlek |
| β-Catenin | Cel-cel junctie | Basolateraal | Abnormale / nucleaire of cytoplasmatische lokalisatie |
| Vimentin | Emt | Afwezige / zwakke aanwezigheid | Up-regulering |
Tabel 1: Markers gebruikt in het onderzoek. Verschillende markers gebruikt met hun lokalisatie in de aan- en afwezigheid van PAF-behandeling.
Deze methode kan het best worden gebruikt om plausibele geneesmiddelen en doelgenen voor verschillende subtypen borstkanker te bestuderen / screenen. Dit kan een geneesmiddelresponsgegevens opleveren die dichter bij het in vivo scenario liggen, wat helpt bij een snellere en betrouwbaardere ontwikkeling van geneesmiddelen. Dit systeem kan ook worden gebruikt om de moleculaire signalering te bestuderen die verband houdt met medicijnrespons en medicijnresistentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zaaien van MCF10A-cellen in lrECM
- Onderhoud MCF10A-cellen (aanhangende borstepitheelcellen) in het groeimedium. Passeer de cellen om de 4 dagen.
OPMERKING: Samenstelling van groeimedium: hoge glucose DMEM zonder natriumpyruvaat dat paardenserum bevat (5%), insuline (10 μg / ml), hydrocortison (0,5 μg / ml), epidermale groeifactor, EGF (20 ng / ml), van choleratoxine (100 ng / ml) en penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml) (zie materiaaltabel). - Ontdooi lrECM (zie Materiaaltabel) op ijs 20 min voor aanvang van het experiment. De dag van het zaaien van de cellen wordt over het algemeen beschouwd als dag 0.
- Voor het trypsiniseren van de cellen, aspirateer het medium en was met 2 ml PBS. Voeg 900 μL 0,05% Trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende ~15 min of totdat de cellen volledig trypsinized zijn.
- Bereid een bed van lrECM voor in acht putten van een glazen schuif met kamer (zie Materiaaltabel).
- Wanneer de cellen trypsiniseren, bestrijkt u elke put met 60 μL lrECM en plaatst u deze in een CO2-incubator van 37 °C gedurende maximaal 15 minuten.
- Bereid de celsuspensie voor volgens de onderstaande stappen.
- Voeg na het volledig ontwrichten van cellen 5 ml resuspensiemedium toe om de trypsine-activiteit te doven en draai de cellen op 112 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C.
OPMERKING: Samenstelling van re-suspensiemedium: hoge glucose DMEM zonder natriumpyruvaat, aangevuld met paardenserum (20%) en penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml). - Aspirateer het gebruikte medium en suspensieer de cellen opnieuw in 2 ml assaymedium. Meng de suspensie goed om de vorming van een eencellige suspensie te garanderen.
OPMERKING: Samenstelling van het testmedium: dmem met een hoog glucosegehalte zonder natriumpyruvaat, aangevuld met paardenserum (2%), hydrocortison (0,5 μg/ml), choleratoxine (100 ng/ml), insuline (10 μg/ml) en penicilline-streptomycine (100 eenheden/ml). - Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bereken het volume van de celsuspensie dat nodig is om 6 x 103 cellen in elke put te zaaien.
OPMERKING: Het heeft over het algemeen de voorkeur om één extra put in de berekening op te nemen om rekening te houden met eventuele pipetteerfouten. - Volgens het aantal benodigde putten, verdun de celsuspensie in overlay-medium.
OPMERKING: De samenstelling van het overlaymedium voor een enkele put is als volgt: 400 μL testmedium, 8 μL lrECM (2% definitief) en 0,02 μL van 100 μg/ml EGF (5 ng/ml definitief).
- Voeg na het volledig ontwrichten van cellen 5 ml resuspensiemedium toe om de trypsine-activiteit te doven en draai de cellen op 112 x g gedurende 10 minuten bij 25 °C.
- Voer het zaaien van de cellen uit.
- Voeg 400 μL van de verdunde celsuspensie toe aan de voorbereide lrECM-bedden (stap 1.4) en zorg ervoor dat het lrECM-bed niet wordt verstoord. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator .
2. PAF-behandeling
- Voeg PAF 3 uur toe na het zaaien van cellen. Bereid een PAF-voorraad van 100 μM in PBS en voeg het vereiste volume van 0,2 μL toe aan elke put (wat overeenkomt met 200 nM).
- Voeg dezelfde concentratie PAF toe tijdens elke mediawissel.
3. Opnieuw voeden met verse media
- Vul de cellen elke 4 dagen aan met vers medium (d.w.z. dag 4, dag 8, dag 12 en dag 16).
4. Immunofluorescentiestudie om fenotypische veranderingen geïnduceerd door langdurige blootstelling aan PAF te detecteren
- Na 20 dagen kweken, pipetteer voorzichtig het medium uit elke put en was de putten met 400 μL voorverwarmd PBS.
- Fixeer de acinaire structuren door 400 μL 4% paraformaldehyde toe te voegen (vers bereid door 16% paraformaldehyde in 1x PBS te verdunnen) en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te broeden.
- Spoel de putjes eenmaal af met ijskoude PBS en permeabiliseer met PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 min bij 4 °C.
- Pipetteer na 10 min onmiddellijk maar voorzichtig de Triton-X 100 oplossing en spoel af met 400 μL PBS-glycine (vers bereid door toevoeging van een snufje glycine in 1x PBS). Dit wordt driemaal herhaald gedurende 15 minuten per stuk.
- Voeg 400 μL van de primaire blokoplossing bestaande uit 10% geitenserum (zie materiaaltabel) toe aan immunofluorescentiebuffer (IF) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
OPMERKING: Samenstelling van IF-buffer: 0,05% natriumazide, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 en 0,05% Tween (20 in 1 PBS). - Verwijder de primaire blokkeringsoplossing, voeg 200 μL 2% secundair blokkerend antilichaam (F(ab')2 fragment van antilichaam verhoogd in geit tegen muisantigeen toe, zie Materiaaltabel) bereid in primaire blokoplossing en laat het 45-60 minuten bij kamertemperatuur staan.
- Bereid het primaire antilichaam (zie materiaaltabel) in een verdunning van 1:100 in een secundair blokkerende antilichaamoplossing. Voeg na het verwijderen van de secundaire blokoplossing het vers bereide antilichaam toe en incubeer een nacht bij 4 °C.
- De vorige stap kan liquefactie van het keldermembraan veroorzaken. Voordat u doorgaat met het experiment, wacht u tot de dia kamertemperatuur is. Pipetteer de primaire antilichaamoplossing voorzichtig en was deze driemaal met 400 μL IF-buffer.
- Bereid tijdens de laatste wasbeurt met IF-buffer een verdunning van 1:200 van het fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam (zie materiaaltabel) in de primaire blokoplossing. Incubeer de dia's in de secundaire antilichaamoplossing gedurende 40-60 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de glaasjes af met 400 μL IF-buffer gedurende 20 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met PBS gedurende elk 10 minuten.
- Beits de kernen met PBS met 0,5 ng/ml kernvlek (zie Materiaaltabel) gedurende 5-6 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's driemaal met 400 μL PBS om overtollige vlekken te verwijderen.
- Pipetteer voorzichtig de gehele PBS en zorg voor verwijdering van de restoplossing. Voeg één druppel montagereagens (zie materiaaltabel) toe aan elke put en laat het een nacht op kamertemperatuur staan.
- Bewaar de dia's bij kamertemperatuur en beeld de dia's zo snel mogelijk af.
- Afbeelding onder 40x of 63x vergroting op een confocale microscoop (zie Tabel van materialen), waarbij optische Z-secties van 0,6 mm stapgrootte (NA = 1,4) worden genomen.
- Open de verkregen afbeeldingen met een beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel). Demonstreer de morfologische verschillen met behulp van 3D-projecties.
OPMERKING: De middelste optische Z-sectie kan het beste worden gebruikt om verschillen in de lokalisatie van polariteitsmarkers weer te geven. Deze kunnen handmatig worden gekwantificeerd om het percentage sferoïden weer te geven dat dat specifieke kleuringspatroon laat zien. - Om verschillen in de expressie van eiwitten te illustreren, voert u een semikwantitatieve analyse uit waarbij de gemiddelde grijswaarde wordt gemeten of gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF)23 wordt berekend. Geef de gegevens weer als viool- of puntplots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCF10A-cellen vormen bij blootstelling aan PAF-behandeling acinaire structuren met zeer verschillende fenotypen. α6-integrine bleek verkeerd gelokaliseerd te zijn met meer apicale kleuring. Enkele acini vertoonden ook discontinue kleuring (figuur 2A). Beide fenotypen wijzen op het verlies van basale polariteit, zoals blijkt uit literatuur24,25. Eerdere rapporten wijzen op de controversiële rol van α6-integrine bij kankermetastase. α6-integrine is aanwezig als een dimeer met β1- of β4-integrine. De α6β4-subeenheid blijkt een belangrijke rol te spelen bij de vorming van hemidesmosomen in epitheelcellen26. De downregulatie van dit integrine is gevonden in de prostaat en sommige gevallen van borstkanker, waarbij verlies van α6β4-integrine werd gevonden in ductaal carcinoom van de borst (graad III). Het verliesfenotype wordt gezien in de cellen die uitzaaien naar het parenchym en de pleuraholte 27,28,29. GM130 is een cis-Golgi gelokaliseerd eiwit; Golgi-lichamen zijn apisch gelokaliseerd in MCF10A-acinarculturen16,30. PAF-behandeling leidde tot de mislokalisatie van GM130, wat wijst op verstoring van de apicale polariteit (figuur 2B). Vimentine is een intermediair filament dat betrokken is bij celmigratie; het wordt geupreguleerd wanneer epitheelcellen een epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT)31 ondergaan. PAF-behandeling van MCF10A-acinaire culturen leidde tot verhoogde vimentinespiegels zoals waargenomen door de kleuringsintensiteit (figuur 2C), wat WIJST OP EMT.
Figuur 2: PAF verstoort de polariteit en induceert EMT-achtige veranderingen in MCF10A borst-acini. MCF10A-cellen werden gekweekt als 3D 'on top' culturen in lrECM. De culturen werden behandeld met PAF op dag 0, 4, 8, 12 en 16. De culturen werden gedurende 20 dagen gehandhaafd en vervolgens immuun gekleurd voor α6-integrine (groen) en nucleaire vlek (blauw) (A), (B) GM130 (groen), een marker voor apicale polariteit, en (C) Vimentin (rood), een EMT-marker. De middelste stapel van de respectievelijke acini is getoond. De representatieve gegevens zijn voor 40-50 acini uit drie biologisch onafhankelijke experimenten. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gevestigde op cellijn gebaseerde modellen worden veel gebruikt om het proces van carcinogenese te bestuderen. Monolaagculturen van cellen blijven inzicht geven in de verschillende moleculaire signaalroutes die karakteristieke veranderingen in kankercellen bemiddelen32. Studies naar de rol van bekende oncogenen zoals Ras, Myc en gemuteerde p53 werden voor het eerst gerapporteerd met behulp van monolaagculturen als het modelsysteem 33,34,35,36. Het 2D-cultuurmodel mist echter veel belangrijke structurele en functionele parameters die in vivo aanwezig zijn. Geneesmiddelenscreeningstudies in 2D-culturen tonen vaak een significante respons (celdood of doelremming), zelfs bij lagere concentraties, terwijl ze geen significant effect laten zien bij muizen37. Een belangrijke reden hiervoor is de variërende beschikbaarheid en opname van geneesmiddelen in een 2D-monolaagcultuur versus. 3D-cultuur38.
Het concept van 3D-culturen is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de progressie van kanker in het afgelopen decennium. 3D-culturen omvatten het kweken van cellen op een extracellulaire matrix, wat resulteert in de vorming van structuren die lijken op functionele eenheden die in vivo in het weefsel aanwezig zijn 16. 3D-culturen bootsen de in vivo micro-omgeving voor een groot deel na en overwinnen zo de beperkingen van 2D-culturen39. Bovendien, omdat de cellen die in 3D worden gekweekt van menselijke oorsprong zijn en het systeem meer vatbaar is voor het bestuderen van vroege gebeurtenissen, is het eenvoudiger en eleganter dan de knaagdiermodellen.
Met behulp van dit platform wordt een model gedemonstreerd om het transformatieproces na blootstelling aan een fosfolipidemediator zoals PAF te bestuderen. Studies van ons laboratorium hebben aangetoond dat PAF-behandeling de niet-tumorogene borstepitheelcellijn, MCF10A12, kan transformeren. Deze methode is geoptimaliseerd om de cellen continu bloot te stellen aan PAF, vergelijkbaar met het in vivo scenario, waarbij PAF aanwezig is in de micro-omgeving.
MCF10A-cellen, wanneer gekweekt in 2D, moeten om de 4 dagen worden gepasseerd. Als ze niet volgens het protocol worden onderhouden, gedragen ze zich heel anders, wat alleen zichtbaar is wanneer ze op ECM16 worden gekweekt. Het doorgangsnummer van de cellen moet zo laag mogelijk worden gehouden. Deze methode heeft ook beperkingen vanwege de variatie in eiwitconcentratie in verschillende batches lrECM. Dit kan worden ondervangen door de verschillende batches te testen door simpelweg cellen op een lrECM-bed te leggen en de grootteverdeling van de acini te observeren. Als er geen grote variabiliteit in grootte is, kan de lrECM-batch geschikt worden geacht voor experimenten.
Beoordeling van de transformatie wordt over het algemeen gedaan door immunofluorescentie, wat wordt aangetoond in de video. Bij het uitvoeren van immunofluorescentie zijn de stappen met incubatie bij 4 °C van cruciaal belang; Pipetteren van de oplossing wanneer de lrECM-laag zich in een vloeibare toestand bevindt, maakt de laag ongelijk, wat leidt tot een verlies van acinaire structuren. Een van de manieren om het oneffenheidsprobleem aan te pakken, is door de dia's 's nachts bij 4 °C op een gelijkmatig platform op te slaan of de vergroting te wijzigen waarbij beeldvorming wordt gedaan. Om te voorkomen dat de acinarstructuren worden gepipetteerd, verwijdert u voorzichtig de kamer uit de opslag van 4 °C en verwijdert u driekwart van het volume dat in eerste instantie is toegevoegd en verwijdert u de rest tijdens de daaropvolgende wasbeurten.
Een ander groot probleem is de hoge achtergrond als gevolg van lrECM. Om dit probleem te overwinnen kan men een 2% secundair blokkerend antilichaam gebruiken in plaats van 1%. Het verhogen van secundaire blokkering dient echter niet het doel van het kleuren van apicale markers en E-cadherine. In dergelijke gevallen is het raadzaam om het kamerdekglas na dag 20 gedurende 15 minuten bij 4 °C aan PBS-EDTA te onderwerpen en vervolgens de acini te fixeren volgens hetzelfde protocol als in de video. PBS-EDTA lost de lrECM gedeeltelijk op, waardoor de achtergrond wordt verminderd. Als de incubatietijd echter wordt overschreden, kan deze behandeling resulteren in een verlies van structuren tijdens het pipetteren van de oplossing. Daarom moet de grootst mogelijke zorgvuldigheid worden betracht bij het uitvoeren van deze procedure. Er is ook waargenomen dat het opslaan van de dia's voor langere perioden kan leiden tot een toename van het achtergrondsignaal. Daarom moet beeldvorming zo snel mogelijk worden gedaan. Het is raadzaam om minimaal 15 acini per experiment in beeld te brengen om een verandering in fenotype te bepalen.
3D-acinaire culturen hebben bepaalde beperkingen, zoals problemen bij het volgen van afzonderlijke cellen tijdens live-cell imaging. Bepaalde studies, zoals effecten op de celcyclus, moeten worden uitgevoerd met behulp van live-cell imaging om ruimtelijke en temporele informatie te behouden. Vanwege constante veranderingen in structuur is het echter moeilijk om dergelijke parameters in 3D-acinaire culturen te volgen met behulp van reguliere confocale microscopen. Dit rechtvaardigt het gebruik van geavanceerde microscopische technieken zoals superresolutiemicroscopie of Airyscan-microscopie. Het zou ook het ontwrichten van de acinaire structuren vereisen voor bepaalde transformatietests zoals wondgenezing, verankeringsonafhankelijke groei en in vivo tumorigeniciteitstests. Deze ontwrichting zou resulteren in het verlies van belangrijke ruimtelijke en temporele informatie. Eiwitlysaten verzameld uit de culturen worden vaak verdund als gevolg van de aanwezigheid van IrECM, wat problemen oplevert met het laden van voldoende hoeveelheid lysaten. Dit kan echter in grotere mate worden ondervangen door de acini-structuren te ontwrichten en ze vóór lysis te verzamelen.
Hier is een modelsysteem aangetoond om fosfolipidemediator / immuun-geassocieerde factor-geïnduceerde transformatie te bestuderen. Dit model kan genetische en/of epigenetische route(s) ophelderen die gedereguleerd kunnen worden, wat leidt tot drastische veranderingen in de morfologie. Deze methode kan ook worden gebruikt om potentiële therapieën te screenen. Dergelijke screeningstudies naar geneesmiddelen zullen een beter succes opleveren dan screenings die worden uitgevoerd in 2D-culturen38. Een belangrijk hoogtepunt van deze methode is de adaptiviteit volgens de vereiste van de studie. Het behandelingsregime en de analysemethoden kunnen indien nodig worden aangepast. Bovendien kan deze methode inzicht geven in de moleculaire signalering die wordt beïnvloed bij behandeling40. De techniek zal ook helpen om het mogelijke optreden van medicijnresistentie te voorspellen. Bovendien zal het ook helpen bij het ophelderen van het mechanisme dat betrokken is bij medicijnresistentie en het identificeren van plausibele doelen om hetzelfde te overwinnen. Studies hebben mogelijkheden vastgesteld om meerdere celtypen in 3D samen te kweken, die verder kunnen worden aangepast aan het behandelingsregime41. Dergelijke mogelijkheden zullen meer inzicht geven in de kenmerken en moleculaire veranderingen die in vivo plaatsvinden tijdens de initiatie en progressie van borstkanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten.
Acknowledgments
We bedanken de IISER Pune Microscopy Facility voor de toegang tot apparatuur en infrastructuur en ondersteuning voor de experimenten. Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het Department of Biotechnology (DBT), Govt. of India (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Govt. of India (EMR/2016/001974) en deels door IISER, Pune Core funding. A. K. werd gefinancierd door CSIR-SRF fellowship, L.A. werd gefinancierd door DST-INSPIRE fellowship, V.C werd gefinancierd door DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
- Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
- Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
- Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
- Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
- Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
- Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
- Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
- Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
- Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
- Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
- Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
- Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
- Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
- Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
- Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
- Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
- Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
- McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
- Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
- Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).
