Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لدراسة بروتينات استشعار انحناء الغشاء في المختبر

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64340
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، تم تطوير نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لتوفير غشاء اصطناعي بانحناء محدد يتيح توصيف البروتينات مع القدرة على استشعار الانحناء في المختبر.

Abstract

يلعب انحناء الغشاء أدوارا مهمة في مختلف العمليات الأساسية للخلايا ، مثل هجرة الخلايا وانقسام الخلايا والاتجار بالحويصلات. لا يتم إنشاؤه بشكل سلبي فقط من خلال الأنشطة الخلوية ، ولكن أيضا ينظم بنشاط تفاعلات البروتين ويشارك في العديد من الإشارات داخل الخلايا. وبالتالي ، من المفيد للغاية دراسة دور انحناء الغشاء في تنظيم توزيع وديناميات البروتينات والدهون. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة العلاقة بين الغشاء المنحني والبروتين في المختبر. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية ، توفر الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة بالقضيب النانوي (SLB) المطورة حديثا إنتاجية عالية ودقة أفضل في توليد انحناء الغشاء من خلال تشكيل طبقة ثنائية دهنية مستمرة على صفائف منقوشة من القضبان النانوية مع انحناء غشاء محدد مسبقا وتحكم مسطح محلي. يمكن توصيف كل من سيولة الدهون وحساسية البروتين للأغشية المنحنية كميا باستخدام التصوير المجهري الفلوري. هنا ، يتم تقديم إجراء مفصل حول كيفية تشكيل SLB على الأسطح الزجاجية المصنعة التي تحتوي على صفائف نانوية وتوصيف البروتينات الحساسة للانحناء على SLB هذا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية بروتوكولات إعادة استخدام الرقائق النانوية ومعالجة الصور. بالإضافة إلى nanobar-SLB ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بسهولة على جميع أنواع رقائق الزجاج ذات البنية النانوية لدراسات استشعار الانحناء.

Introduction

انحناء الغشاء هو معلمة فيزيائية حرجة للخلية تحدث في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل التشكل وانقسام الخلايا وهجرة الخلايا1. من المعترف به على نطاق واسع الآن أن انحناء الغشاء يتجاوز نتيجة بسيطة للأحداث الخلوية. بدلا من ذلك ، برز كمنظم فعال لتفاعلات البروتين والإشارات داخل الخلايا. على سبيل المثال ، تم العثور على العديد من البروتينات المشاركة في التداخل الخلوي بوساطة الكلثرين ترتبط بشكل تفضيلي بالغشاء المنحني ، مما يؤدي إلى تكوين نقطة ساخنة للداخل الخلوي2. هناك العديد من الأسباب المختلفة لتشوه الغشاء مثل سحب الغشاء بواسطة قوى الهيكل الخلوي ، ووجود عدم تناسق الدهون مع مجموعات الرأس ذات الأحجام المختلفة ، ووجود بروتينات عبر الغشاء ذات شكل مخروطي ، وتراكم البروتينات المكونة للغشاء مثل بروتينات مجال BAR (سميت على اسم بروتينات Bin و amphiphysin و Rvs) ، وإدخال مجال الحلزونات البرمائية في الغشاء1 . ومن المثير للاهتمام أن هذه البروتينات والدهون لا تشوه الغشاء فحسب ، بل يمكنها أيضا استشعار انحناء الغشاء وإظهار تراكم تفضيلي1. لذلك ، من الأهمية بمكان دراسة ما إذا كانت الأغشية ذات الانحناءات المختلفة تغير توزيع وديناميكيات البروتينات والدهون المرتبطة بها وكيف تغير التأثيرات المحتملة على العمليات داخل الخلايا ذات الصلة.

تم تطوير العديد من التقنيات لتحليل التفاعل بين الغشاء المنحني والبروتينات في كل من الخلايا الحية وأنظمة المختبر. يوفر نظام الخلية الحية بيئة خلية حقيقية مع تنوع غني للدهون وتنظيم إشارات البروتين الديناميكي2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، يصعب دراسة مثل هذا النظام المتطور بسبب عدم اليقين والتقلبات في البيئة داخل الخلايا. ومن ثم ، فإن المقايسات في المختبر باستخدام غشاء اصطناعي يتكون من أنواع الدهون المعروفة والبروتينات النقية أصبحت أنظمة إعادة تكوين قوية لتوصيف العلاقة بين البروتينات والأغشية المنحنية. تقليديا ، يتم إنشاء الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة عن طريق البثق للكشف عن البروتينات الحساسة للانحناء إما عن طريق مقايسة الترسيب المشترك باستخدام قوة الطرد المركزي أو مقايسة التعويم المشترك مع تدرج الكثافة لتجنب تراكم البروتين 8,9. ومع ذلك ، فإن انحناء الجسيمات الشحمية المبثوقة محدود بحجم المسام المتاح لمرشح الغشاء المستخدم في الطارد10. وقد ثبت أن مقايسة انحناء الجسيمات الشحمية المفردة (SLiC) تتغلب على هذا القيد ، حيث يتم تمييز الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة بالتألق وتثبيتها على السطح بحيث يمكن تمييز الانحناء بكثافة الفلورسنت11. ومع ذلك ، فقد لوحظ تباين قوي في تكوين الدهون في الحويصلات الصغيرة ، مما يؤثر على دقة قياس الانحناء12. توفر تجارب سحب الحبل قياسا أكثر دقة للانحناء على الحبل العابر المسحوب من الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) باستخدام ملقط بصري ، حيث يمكن التحكم في الانحناء جيدا بواسطة توتر الغشاء الناتج13,14. هذه الطريقة مناسبة لدراسة بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي أو السلبي ، ولكنها مقيدة بإنتاجية توليد الأنبوب10. يوفر فحص الأنابيب الغشائية المدعومة (SMrT) توليدا متزامنا لأنابيب غشائية متعددة يتم بثقها من نفس خزان الدهون بواسطة تدفقات الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، يختلف انحناء الغشاء جوهريا على طول الأنبوب النانوي ، مما يضر بدقة قياس الانحناء القائم على شدة التألق15,16. وبالمقارنة ، فإن استخدام حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (سيارات الدفع الرباعي ، قطرها <100 نانومتر17) لتشكيل طبقة ثنائية دهنية مدعومة (SLB) على الأسطح التي تحتوي على طبوغرافيات مصممة ولدت غشاء أحادي الطبقة مع انحناءات محددة مسبقا بواسطة التصنيع النانوي أو المواد النانوية بدقة عالية18،19،20.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتشكيل SLB على أسطح رقاقة نانوية مصنعة مع صفائف نانوية وكيف يمكن استخدامه لاستكشاف حساسية انحناء البروتينات في المختبر. كما هو موضح في الشكل 1 ، هناك ستة مكونات أساسية للفحص: أ) تنظيف وتجميع الرقاقة بغرفة الموائع الدقيقة ؛ ب) تحضير سيارات الدفع الرباعي ذات التركيب الدهني المحدد ؛ ج) تشكيل SLB على رقاقة نانوية وملزمة ببروتينات حساسة للانحناء ؛ د) تصوير وتوصيف SLB والبروتينات الحساسة للانحناء تحت المجهر الفلوري ؛ ه) تنظيف الرقاقة لإعادة استخدامها ؛ و) معالجة الصور للتحليل الكمي لقدرة استشعار انحناء البروتين. يتم وصف البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنظيف رقاقة النانو

  1. ضع الشريحة النانوية في دورق سعة 10 مل بحيث يكون الجانب المنقوش متجها لأعلى.
    ملاحظة: تم تصنيع رقاقة الكوارتز النانوية هذه عبر الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون كما هو موضح من قبل21. يمكن تصميم هندسة وترتيب البنية النانوية على الرقاقة حسب الطلب. يبلغ طول أحجام القضبان النانوية المتدرجة المستخدمة هنا 2000 نانومتر ، وارتفاعها 600 نانومتر ، وعرضها من 100 إلى 1000 نانومتر (مجموعة خطوات 100 نانومتر).
  2. أضف بعناية 1 مل من 98٪ حمض الكبريتيك إلى الدورق ، وتأكد من أن الحمض يغطي الجزء الأمامي والخلفي من الرقاقة بالكامل.
    ملاحظة: 98٪ حمض الكبريتيك شديد التآكل ويمكن أن يسبب تدميرا سريعا للأنسجة وحروقا كيميائية خطيرة عند ملامسته للجلد أو العينين. استخدمه في غطاء الدخان مع الحماية المناسبة.
  3. قم بتدوير الكأس الزجاجية ببطء وأضف 200 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين قطرة قطرة حتى تصبح الكأس الزجاجية بأكملها ساخنة. تأكد من خلط حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين جيدا لتشكيل محلول سمكة البيرانا لإزالة الجزيئات العضوية من الرقاقة النانوية17. هناك تقنيات بديلة لتوليد SLB على الأسطح النظيفة المحبة للماء ، مثل الأشعة فوق البنفسجية والتعرض للأوزون كما هو موضح سابقا23.
    ملاحظة: التفاعل طارد للحرارة للغاية ويمكن أن يتسبب في غليان المحلول ، لذا أضف بيروكسيد الهيدروجين إلى حمض الكبريتيك قطرة قطرة واستمر في الدوران.
  4. ضع الدورق في وعاء زجاجي ثانوي واحتفظ بالشريحة النانوية مغمورة في محلول سمكة البيرانا طوال الليل لتنظيف الشوائب جيدا.
    ملاحظة: ضع الدورق في غطاء الدخان بدون أي غطاء في حالة ما إذا كان التفاعل يمكن أن يولد الغاز.
  5. أخرج الكأس الزجاجية والصق محلول سمكة البيرانا بعناية في وعاء نفايات حمضية.
  6. حمل 5 مل من الماء منزوع الأيونات في الكأس الزجاجية لتخفيف الحمض المتبقي وتخلص منه في فضلات الحمض. كرر هذه الخطوة خمس مرات واستخدم 5 M NaOH لتحييد النفايات الحمضية.
  7. أمسك الرقاقة بالملاقط واغسلها بتيار مستمر من الماء منزوع الأيونات لإزالة الحمض المتبقي جيدا. جفف الرقاقة بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪ لتشكيل SLB22.

2. توليد الحويصلات الصغيرة أحادية الصفيحة (سيارات الدفع الرباعي)

  1. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى قارورة كهرمانية.
    ملاحظة: الكلوروفورم سائل شديد التقلب وعديم اللون ، ويمكن أن يكون ساما إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه. استخدمه في غطاء الدخان مع ارتداء القناع والقفازات.
  2. حل 500 ميكروغرام من خليط الدهون في الكلوروفورم. تكوين خليط الدهون المستخدم هنا هو 89.5٪ مول٪ من فوسفاتيديل كولين البيض (PC) ، و 10٪ مول٪ من فوسفاتيديل سيرين في الدماغ (PS) ، و 0.5٪ من تكساس ريد 1،2-ديهكساديكانويل-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين ، ملح ثلاثي إيثيل الأمونيوم (تكساس ريد DHPE).
  3. جفف خليط الدهون في القارورة بنسبة 99.9٪ من غاز النيتروجين حتى يتطاير الكلوروفورم ويجف خليط الدهون.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان. تجنب تناثر السوائل عند التجفيف.
  4. ضع خليط الدهون الموجود في قارورة العنبر بدون غطاء في مجفف الفراغ المغطى بورق الألمنيوم. ثم قم بتجفيف العينة بالمكنسة الكهربائية بمضخة لمدة 3 ساعات لتطاير الكلوروفورم تماما.
  5. أضف 250 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى القارورة. دوامة الحل حتى يصبح متجانسا.
    ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت PBS من 150 mM NaCl ، بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر ؛ يتم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 لصنع طبقة الدهون PC و PS.
  6. سونيك خليط الدهون لمدة 30 دقيقة على تردد 50 كيلو هرتز في سونيكاتور الحمام. ثم انقل خليط الدهون إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وأغلقه بالبارافيلم.
  7. تجمد خليط الدهون في النيتروجين السائل لمدة 20 ثانية ثم تذوب عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين في حمام مائي. كرر دورات التجميد والذوبان 30 مرة. بعد ذلك ، يبدو خليط الدهون كسائل صاف.
    تنبيه: النيتروجين السائل لديه نقطة غليان حوالي -195.8 درجة مئوية. يمكن أن يسبب قضمة الصقيع أو الحروق المبردة. استخدمه في الأماكن غير الضيقة مع ارتداء قفازات عازلة للحرارة.
  8. شطف اثنين من المحاقن الزجاجية محكمة الغلق الغاز وموصل الطارد الصغير مع الإيثانول والكلوروفورم والميثانول على التوالي. كرر تسلسل الشطف خمس مرات لتنظيف الجهاز مسبقا. اتركها في غطاء الدخان حتى يتطاير المذيب العضوي تماما.
  9. قم بتجميع جهاز الطارد الصغير وتمرير 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS عبر الموصل لتبليل الجهاز مسبقا ، ثم تخلص من المخزن المؤقت من حقنة أخرى. هذه الخطوة تزيل الشوائب وتسهل البثق.
  10. قم بتجميع جهاز الطارد الصغير بغشاء مرشح بولي كربونات بحجم 100 نانومتر.
    ملاحظة: يحدد حجم المسام لغشاء المرشح قطر الجسيمات الشحمية.
  11. خذ 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS بإحدى المحاقن وادفعه برفق عبر المرشح لملء المحقنة الفارغة الثانية في الطرف الآخر. كرر البثق ذهابا وإيابا ثلاث مرات للتحقق من تسرب الجهاز وتجاهل المخزن المؤقت من المحقنة الثانية.
  12. مرر خليط الدهون عبر الطارد الصغير لاستبدال المخزن المؤقت PBS. ثم قذف ذهابا وإيابا 20 مرة لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. يمكن الاحتفاظ بالطابع متعدد الصفائح للحويصلات مع عدد غير كاف من أوقات البثق ، مما سيؤثر على تكوين SLB23.
  13. اجمع سيارات الدفع الرباعي من المحقنة الثانية لتقليل التلوث بجزيئات أكبر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: قم بإزالة المحقنة مباشرة من الموصل في حالة انقطاع المحقنة.
  14. لف الأنبوب بورق الألمنيوم لمنع تبييض الدهون الموسومة بالفلورسنت وتخزينها في 4 درجات مئوية. عادة ، يمكن تخزين سيارات الدفع الرباعي لمدة تصل إلى 7 أيام.

3. تشكيل SLB على رقاقة نانوية

  1. أخرج الشريحة النانوية النظيفة من الماء منزوع الأيونات بعناية باستخدام ملقط وجففها بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪.
  2. إجراء التنظيف السطحي للرقاقة النانوية مع معالجة بلازما الهواء لمدة 1 ساعة.
  3. قم بتجميع الرقاقة النانوية في غرفة polydimethylsiloxane (PDMS) ، والتي تتكون من قطعتين من PDMS - PDMS الأوسط و PDMS العلوي (الشكل 1 أ). PDMS الأوسط رقيق (~ 0.5 مم) مع فتحة بيضاوية كبيرة في الوسط لضمان التعرض الكافي لنمط nanobar. الجزء العلوي من PDMS سميك (~ 4.0 مم) مع فتحتين صغيرتين داخل الفتحة البيضاوية الكبيرة كمدخل ومخرج لمعالجة السوائل.
    1. ضع الشريحة على سطح نظيف بحيث يكون النمط متجها لأعلى.
    2. قم بتغطية PDMS الأوسط برفق بالشريحة ، وتأكد من تعرض النمط بالكامل للمنطقة المركزية للفتحة الكبيرة ذات الشكل البيضاوي في PDMS الأوسط.
    3. قم بتغطية PDMS العلوي ب PDMS الأوسط واحتفظ بفتحتيه الصغيرتين داخل منطقة الفتحة البيضاوية الكبيرة لنظام PDMS الأوسط. ثم يتم تجميع غرفة PDMS.
      ملاحظة: PDMS هو البوليمر العضوي القائم على السيليكون الأكثر استخداما. إنه متوافق حيويا وشفافا وقابلا للتشوه ليتم تصميمه كشكل مخصص لتجميع الرقائق والتصوير تحت المجهر. والأهم من ذلك ، يمكن أن تكون عالقة تساهميا بطبقة PDMS أخرى أو زجاج بإحكام بعد معالجة البلازما ، مما يجعلها مناسبة كغرفة لإعداد SLB. تضمن هذه الخطوة أن كل طبقة من PDMS مثبتة بإحكام لتجنب الفجوات والتسرب.
  4. قم بتحميل سيارات الدفع الرباعي في غرفة PDMS من أحد الفتحتين الصغيرتين في الجزء العلوي من PDMS باستخدام ماصة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل SLB.
  5. قم بماصة برفق المخزن المؤقت PBS في غرفة PDMS من جانب واحد من الفتحة الصغيرة وقم بإزالة النفايات باستخدام برعم قطني من الفتحة الأخرى لغسل سيارات الدفع الرباعي غير المقيدة. ثم احصل على SLB المتشكل على الرقاقة النانوية (يتم اختبار جودة SLB عن طريق استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) كما هو موضح في الخطوة 4.4 ومناقشته في قسم النتائج التمثيلية).
    ملاحظة: عند سحب المخزن المؤقت PBS في الغرفة ، يجب أن يكون طرف الماصة ممتلئا بالمخزن المؤقت وملامسا لسطح السائل لتجنب حقن أي فقاعات.

4. تصوير SLB وربط بروتين استشعار الانحناء على الرقاقة النانوية

ملاحظة: سيعتمد هذا القسم على نظام المجهر المتاح للتجربة. هنا ، سيتم وصف إرشادات شاملة حول كيفية إجراء التصوير. يمكن تغيير الإعدادات التفصيلية بين إعدادات المجهر المختلفة.

  1. قم بإعداد الفحص المجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام هدف زيت 100x (N.A.1.4). افتح برنامج ZEN لتحديد قوة ليزر الإثارة التي يمكن أن تثير مضان الدهون والبروتين. اختر وضع الاستحواذ > الإعداد الذكي > تكساس الأحمر DHPE / EGFP.
  2. اضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز لتحديد موقع القضبان النانوية على الشريحة حتى تصبح حواف القضيب النانوي حادة أسفل قناة الدهون.
  3. قم بتعيين معلمات المسح على النحو التالي للحصول على صورة تحكم لقناة الدهون قبل إضافة البروتين: حجم الإطار = 512 بكسل × 512 بكسل (512 بكسل × 512 بكسل ، حجم بكسل 124 نانومتر) ، بت لكل بكسل = 16 (عمق 16 بت ) ، سرعة المسح الضوئي = 5 ، والمتوسط = 4 (وضع المتوسط أربع مرات / خط).
  4. قم بإجراء فحص FRAP عن طريق تبييض طبقة الدهون المزدوجة الموسومة بالفلورسنت على منطقة نانوية مفردة عشوائية.
    1. حدد خانتي الاختيار مناطق التجربة والتبييض . ارسم مساحة دائرية بقطر 5 ميكرومتر والتي يمكن أن تشمل الشريط النانوي بأكمله في المركز (حجم القضيب النانوي 2 ميكرومتر) وأضفه إلى مناطق التجربة. إدخال معلمات التصوير بفاصل زمني كمثال على النحو التالي: اختر سرعة المسح الضوئي = 9 والمتوسط = 1. اختر السلاسل الزمنية > المدة = 100 دورة والفاصل الزمني = 2 ثانية. أدخل معلمات التبييض كمثال التالي: حدد خانة الاختيار البدء بعد # الصور واختر ثلاث صور.
    2. حدد مربعات الاختيار بالليزر التي تقوم بإجراء FRAP وقم بتغيير الطاقة إلى 100.0٪. انقر على بدء التجربة لتجربة FRAP.
      ملاحظة: FRAP هي طريقة شائعة لتوصيف حركة الجزيئات الخلوية. إذا كان SLB يتمتع بسيولة جيدة ، فإن التألق في المنطقة المبيضة سوف يتعافى تدريجيا مع انتشار الفلوروفورات المبيضة وانتشار الفلوروفورات غير المبيضة من مناطق أخرى.
  5. قم بتحميل محلول البروتين في غرفة PDMS واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بربط البروتين على SLB.
    ملاحظة: البروتينات المستخدمة في الشكل 2G ، H لتوضيح تكوين الدهون تسهل ارتباط البروتين على SLBs المنحنية النانوية هي 74 μM GFP و 79 μM GFP-His. هذان البروتينان عبارة عن بروتينات مضان خضراء بدون أو مع His-tag. البروتينات المستخدمة لدراسة استشعار الانحناء في الشكل 4 والشكل 5 هي 16 ميكرومتر F-BAR و 16 ميكرومتر IDR FBP17 و 16 ميكرومتر FBAR + IDRFBP17. هذه البروتينات الثلاثة هي المجالات من FBP17 ، وهو بروتين BAR نموذجي يفترض بشكل حدسي أنه مولدات انحناء وأجهزة استشعار. كل حجم البروتين هو 20 ميكرولتر.
  6. أعد تركيز الأشرطة النانوية وكرر الخطوة 4.3 لالتقاط صور لكل من قنوات الدهون والبروتين للكشف عن استشعار انحناء البروتين.
  7. كرر الخطوة 4.4 لإجراء اختبار FRAP على كل من قنوات الدهون والبروتين وإجراء تصوير الفاصل الزمني لتوصيف حركة بروتين استشعار الانحناء.

5. إعادة استخدام رقاقة النانو

  1. احصل على الرقاقة النانوية بملاقط وافصلها بعناية عن غرفة PDMS في دورق سعة 50 مل مملوء بالماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. امنع الملقط من لمس البنية النانوية ، ولا تجبر الشريحة على الانفصال لتجنب التشققات.
  2. اغسل الرقاقة النانوية جيدا بالإيثانول اللامائي لإزالة المخلفات العضوية المرفقة على السطح.
    ملاحظة: استخدم مناديل ورقية نظيفة لإزالة الماء على السطح قبل الغسيل بالإيثانول اللامائي.
    تنبيه: الإيثانول اللامائي مادة كيميائية شديدة التقلب وخطرة قليلا. تجنب ملامسة الجلد والعينين. استخدمه في غطاء الدخان مع ارتداء القناع والقفازات.
  3. اغسل الشريحة جيدا بالكثير من الماء منزوع الأيونات لإزالة الإيثانول المتبقي. ثم جفف الشريحة بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪.
    ملاحظة: من المهم إزالة جميع آثار الإيثانول على الرقاقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لأن حمض سمكة البيرانا يمكن أن يتفاعل بعنف مع المذيبات العضوية وقد يتسبب في حدوث انفجارات.
  4. ضع الشريحة في دورق نظيف سعة 10 مل بحيث يكون جانب النمط متجها لأعلى وقم بتنظيف الشريحة بمحلول سمكة البيرانا لإعادة الاستخدام والذي يتبع نفس خطوات "تنظيف الرقاقة النانوية".

6. تحديد كمية الصورة

  1. قم بتدوير الصور التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر بحيث تكون مصفوفة nanobar في وضع رأسي للتحليل اللاحق في برنامج فيجي.
  2. استخدم رمز MATLAB المكتوب خصيصا "c_pillarmask_averaging" لتحديد موقع الشريط النانوي الفردي بواسطة قناع مربع (51 بكسل × 51 بكسل) في كل من قناة الدهون وقناة البروتين.
    ملاحظة: تم تصميم رمز MATLAB هذا خصيصا للرقاقة النانوية. يمكن الحصول عليها على GitHub عبر الرابط: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. اطرح إشارات الخلفية لكل صورة باستخدام عائد الاستثمار الثلاثة (5 بكسل × 5 بكسل) في زوايا الصورة بواسطة وظيفة الشبكة في رمز MATLAB "BarGra_avg". تهدف هذه العملية إلى تصحيح ضوضاء الخلفية غير المستوية المحتملة الناتجة عن إعداد المجهر أو تسوية الرقاقة على مرحلة المجهر.
  4. قم بإنشاء متوسط صور الأشرطة النانوية ذات الحجم نفسه باستخدام رمز MATLAB "BarGra_avg" ، حيث تكون كل نقطة هي متوسط القيم عند تلك النقطة في جميع الأقنعة المربعة الفردية. توليد مخططات سطح 3D من متوسط الصور في برنامج فيجي لإظهار متوسط توزيع الإشارة حول nanobars بشكل حدسي. اختر تحليل مخطط السطح > > الإدخال 100 لمضاعف المضلع، وحدد مربعات الاختيار الظل ورسم المحور والناعم.
  5. قسم كل شريط نانوي إلى ثلاث مناطق ، والتي تشمل منطقتين نهايتين نانو ومنطقة مركز نانوبار لاستخراج شدة التألق على التوالي بواسطة رمز MATLAB "avg_nanobar_quantification". يتم ضبط أحجام عائد الاستثمار النانوي وفقا لأبعاد الأشرطة النانوية باستخدام ملف "الموضع".
  6. قسم شدة البروتين على كثافة الدهون المستخرجة من كود MATLAB "avg_nanobar_quantification" في منطقة نهاية الشريط للحصول على كثافة نهاية الشريط النانوي التي تستبعد تأثير مساحة السطح.
  7. ارسم كثافة نهاية القضيب النانوي بتركيزات مختلفة في GraphPad Prism للحصول على منحنى الربط. افتح قائمة التحليل . اختر الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) > الربط - التشبع > الربط المحدد مع دالة منحدر التل لتناسب المنحنى مع معادلة هيل ثم احسب قيمة معامل KD و Hill.
  8. يتم تطبيع كثافة الدهون والبروتين إلى شدتها المقابلة في مركز نانوبار 600 نانومتر المكتسبة في نفس الصورة باستخدام رمز MATLAB "avg_nanobar_quantification".
  9. استخدم ألمع تسعة بكسل من كثافة البروتين الطبيعية في منطقة نهاية الشريط النانوي مقسومة على منطقة مركز الشريط لتحديد استشعار انحناء البروتين باستخدام أشرطة نانوية بنفس الحجم ، وتسمى القيمة باسم "نسبة النهاية إلى المركز". استخدم نسبة كثافة البروتين الطبيعية لتطبيع كثافة الدهون لتحديد نطاق استشعار انحناء البروتين باستخدام أشرطة نانوية مختلفة الحجم ، وتسمى القيمة باسم "كثافة نهاية Nanobar الطبيعية". يتم حساب هذه القيم بواسطة رمز MATLAB "avg_nanobar_quantification".
  10. قم بتحميل صورة مكدس FRAP في برنامج فيجي. اختر منطقة FRAP وقم بإنشاء عائد استثمار. اختر وظيفة القياس المتعدد > لقياس شدة منطقة FRAP في كل مرة. ارسم الكثافة في GraphPad Prism لإنشاء منحنى استرداد FRAP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوصى بتصميم Nanobar لفحص بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي ، والتي تحتوي على نصف دائرة في كل طرف مع انحناء محدد بعرض القضيب النانوي وتحكم واحد في الانحناء المسطح / الصفري محليا في المركز (الشكل 2 أ ، ب). ينتج عن التكوين الناجح ل SLB على القضبان النانوية إشارات علامة دهنية موزعة بالتساوي عبر سطح القضيب النانوي بأكمله كما هو موضح في الشكل 2C. يمكن دمج الإشارات من أشرطة نانوية متعددة عن طريق حساب متوسط صور الأشرطة النانوية الفردية (الشكل 2D) بحيث يمكن تقليل الاختلافات العشوائية بين الأشرطة النانوية المختلفة. أظهرت دراسة مجهرية إلكترونية سابقة أن غشاء بلازما الخلية شكل طلاءا مطابقا حول الهياكل النانوية بأكملها24. لذلك ، يعتقد أن طبقة الدهون الاصطناعية المزدوجة تلتصق بإحكام على سطح البنية النانوية أيضا ، مما يعطي خطوطا محدودة الحيود على 200 نانومتر نانوبار كما لوحظ في الشكل 4ه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تمييز سيولة الغشاء على SLB المنحني بشريط نانوي بواسطة فحص FRAP ، حيث يمكن تبييض إشارة الفلورسنت على شريط نانوي واحد بشكل فردي لتوصيف سيولة الغشاء (الشكل 2E ، F).

يتطلب تشكيل SLB على القضبان النانوية توليد سيارات الدفع الرباعي بشكل مشابه لتشكيل SLB على الأسطح المستوية كما ورد سابقا17. يحدد التركيب الدهني لسيارات الدفع الرباعي كيمياء سطح SLB المنحني النانوي الذي يمكن تغييره لوضع العلامات الغشائية وآليات ربط البروتين المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن إضافة Texas Red DHPE في ~ 0.5٪ mol٪ في سيارات الدفع الرباعي بحيث يمكن تصوير إثراء مساحة سطح الغشاء على القضبان النانوية بسهولة بواسطة الفحص المجهري الفلوري (الشكل 2C). إلى جانب التصور ، يمكن أيضا تغيير تركيبة الدهون لتسهيل ربط البروتين على SLBs المنحنية النانوية. على سبيل المثال ، لتسهيل تثبيت البروتينات الموسومة ب His، يمكن إحضار حمض النيكل والنيتريلوتريسيتيك (Ni-NTA) إلى SLB على القضبان النانوية من خلال دمج 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N- (5-amino-1-carboxypentyl) حمض إيمينودياسيتيك) succinyl] (ملح النيكل) (18: 1 DGS-NTA (Ni)) في سيارات الدفع الرباعي (~ 1 مول٪)25. بدون هذه المجموعة الوظيفية على الدهون ، لا يمكن للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) الارتباط ب SLB مع PS سالبة الشحنة ، مما يؤدي إلى ثقب أغمق على شكل شريط في كل موقع نانوي بسبب النضوب الحجمي لإشارات GFP في المحلول (الشكل 2G). بالمقارنة ، بإضافة 1 mol٪ 18: 1 DGS-NTA (Ni) في SLB ، يمكن لعلامة His-tag GFP أن تثبت بقوة على الغشاء لتتبع بوضوح شكل SLB المنحني بواسطة قضبان نانوية (الشكل 2H). لم يظهر انتشار الدهون فرقا يمكن اكتشافه عند ارتباط البروتين كما تم فحصه بواسطة اختبار FRAP (الشكل التكميلي 1). تجدر الإشارة إلى أن قياس FRAP يعتمد فقط على شدة 0.5٪ mol٪ Texas Red DHPE في SLB ، والتي قد لا تمثل 1 mol٪ DGS-NTA (Ni) المستخدمة لربط بروتين His-tag. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للدهون المشحونة مثل PS أن تعزز ارتباط البروتين من خلال التفاعل الكهروستاتيكي26 ، بينما يمكن أيضا دمج الدهون الإرشادية مثل فوسفاتيديلينوسيتول (4،5) -ثنائي الفوسفات (PIP2) في سيارات الدفع الرباعي لتسهيل ارتباط بروتين معين (على سبيل المثال ، FCHo2 ، حيث وجد PIP2 ضروريا لاستشعار انحناء الغشاء27).

تعد جودة تكوين SLB من حيث توحيد السطح وسيولة الغشاء أمرا بالغ الأهمية لفحص قدرة استشعار انحناء البروتين على القضبان النانوية. هناك ثلاث مشكلات نموذجية قد تعرض SLB للسلامة والسيولة للخطر. الأول هو ربط سيارات الدفع الرباعي الزائدة على SLB بسبب الغسيل غير الفعال الذي يولد نقاطا على كل من القضبان النانوية وعلى الغشاء المسطح بين القضبان النانوية (الشكل 3 أ ، ب). يؤثر بشكل كبير على القياس الكمي لارتباط البروتين على الأسطح المنحنية أو المسطحة على القضبان النانوية لتقييم استشعار الانحناء. هناك مشكلة أخرى تتمثل في الإدخال غير المتوقع لفقاعات الهواء داخل غرفة PDMS أثناء خطوة الغسيل ، والتي قد تدمر SLB على طول مسار واجهة الهواء السائل وتترك ميزات تشبه الخدش يمكن التعرف عليها بسهولة مع إشارات دهنية منخفضة للغاية على سطح القضيب النانوي (الشكل 3C ، D). علاوة على ذلك ، تترك ركائز القضبان النانوية التي تم تنظيفها بشكل غير صحيح بقايا كيميائية موزعة عشوائيا على السطح تمنع امتصاص الدهون لتشكيل SLB. يؤدي إلى توليد عيوب غشائية قد تكون أو لا تكون أعلى من الدقة البصرية للتصور المجهري (الشكل 3E). ومع ذلك ، ستتأثر سيولة الغشاء بحساسية بتكوين عيب الغشاء28 بحيث يمكن استخدام اختبار FRAP للتحقق من نظافة السطح (الشكل 3F ، G).

لإثبات توصيف بروتين استشعار الانحناء باستخدام مصفوفة نانوبار ، تتم مقارنة مجال F-BAR النموذجي مع منطقة مضطربة جوهريا تم تحديدها مؤخرا في FBP17 (IDRFBP17). تم تصنيف F-BAR بالفلورسنت بأصباغ إستر رباعي فلورو فينيل Alexa Fluor 488 بينما تم تمييز IDRFBP17 ب Alexa Fluor 647 C2 Maleimide. كما هو موضح في الشكل 4A ، يظهر كلا المجالين البروتينيين تراكما متزايدا على قضبان نانوية فردية مغلفة ب SLB بعرض 300 نانومتر. هنا ، يحتوي SLB على 10٪ PS لتعزيز ارتباط البروتين كهروستاتيكيا. يمكن تحديد قدرة استشعار انحناء البروتين من خلال التخصيب التفضيلي في نهايات القضيب النانوي المنحني بكثافة فلورية أعلى من الإشارات في مراكز القضبان النانوية المسطحة ، والتي تظهر بشكل أكثر وضوحا بعد متوسط الصورة من أكثر من 100 نانوبار (الشكل 4 ب). يمكن أن تنعكس قدرة استشعار الانحناء كميا عن طريق حساب نسبة النهاية إلى المركز على كل نانوبار (أي شدة التألق في نهاية القضيب النانوي مقابل مركز القضيب النانوي). كما هو موضح في الشكل 4C، فإن نسبة نهاية إلى مركز كلا البروتينين أعلى من الليبيدات، وهي حوالي 1. عند مقارنة IDR FBP17 و F-BAR ، يمكن ملاحظة أن النسبة الأعلى من الطرف إلى المركز ل IDRFBP17 (1.385 ±0.011 ، متوسط ± SEM) تشير إلى استشعار انحناء أقوى من F-BAR (1.144 ± 0.004 ، متوسط ± SEM).

لفحص نطاق الانحناءات التي يمكن استشعارها بواسطة البروتينات ، يتم إنشاء SLB على صفائف نانوية بعرض تدرج من 200 نانومتر إلى 600 نانومتر (الشكل 4D) حيث أظهرت الدهون طلاءا متجانسا على قضبان نانوية مختلفة الحجم (الشكل 4E). يتم تحضين ثلاثة بروتينات (IDR FBP17 و F-BAR و F-BAR + IDRFBP17) على صفيف القضيب النانوي المتدرج ، وأظهرت جميعها تراكما تفضيليا في مواقع الغشاء المنحني ذو النهاية النانوية عندما انخفض الانحناء إلى أقل من 400 نانومتر في القطر (الشكل 4E ، F). من بين مجالات البروتين الثلاثة هذه ، يعطي IDRFBP17 أعلى كثافة نانوية ، مما يشير إلى أقوى قدرة على استشعار الانحناء ، بينما يظهر F-BAR أقل قيمة (الشكل 4F). علاوة على ذلك ، يمكن أيضا رسم منحنى الربط لبروتين استشعار الانحناء عن طريق زيادة تركيز البروتين تدريجيا (الشكل 4G) ، مما يدل على أن IDRFBP17 لديه قدرة قوية على استشعار الانحناء التعاوني. عند تركيب منحنيات الربط الخاصة به مع معادلة Hill ، تم العثور على KD في نطاق μM (0.6 ± 0.1 μM) ومعامل Hill (H) بين 2 و 3 ، مما يشير إلى ارتباط فائق الحساسية ل IDRFBP17 بانحناءات الغشاء المستحثة بالنانو. كلما كان الانحناء أكثر حدة ، زادت قدرة الربط عند التوازن.

يمكن أيضا دراسة انتشار الغشاء الديناميكي والارتباط الغشائي لبروتينات استشعار الانحناء حول مواقع SLB على شكل شريط نانوي بواسطة FRAP. بالمقارنة مع الاسترداد السريع للإشارات الدهنية على القضبان النانوية (الشكل 5A ، E) ، لم يتمكن F-BAR من التعافي في غضون 2 دقيقة (الشكل 5B ، E) ، مما يشير إلى انخفاض كبير في حركة الغشاء وديناميكية الارتباط في مواقع الغشاء المنحني. والمثير للدهشة ، بخلاف سلوك F-BAR ، أظهرت إشارة IDR FBP17 انتعاشا واضحا في نفس الإطار الزمني (الشكل 5C ، E) ، مما يشير إلى الطبيعة الديناميكية ل IDRFBP17 المتراكمة في الأغشية المنحنية. ومع ذلك ، بعد غسل IDR FBP17 غير المنضم في المحلول ، لا يمكن ملاحظة نفس الاسترداد في قناة IDRFBP17 كما كان من قبل (الشكل 5D ، E). ويشير إلى أن الانتعاش يهيمن عليه التبادل مع جزيئات IDRFBP17 المحتوية على المحلول وأقل عن طريق الانتشار الجانبي للجزيئات المرتبطة بالغشاء.

بشكل عام ، توضح هذه النتائج أن نظام nanobar-SLB هذا هو أداة قوية لتوصيف بروتينات استشعار انحناء الغشاء في المختبر.

Figure 1
الشكل 1: رسم توضيحي لنظام nanobar-SLB . (أ) تتكون غرفة PDMS من الطبقات العليا والمتوسطة مع تجميع الشريحة النانوية النظيفة عليها. (ب) سيارات الدفع الرباعي التي تحمل علامة DHPE الحمراء في تكساس بتفاصيل مكبرة. (ج) يوضح النموذج السليم لنظام nanobar-SLB ومنطقة التكبير أن SLB يتشكل على قضبان نانوية بطبقة واحدة موحدة من طبقة الدهون المزدوجة. (د) عملية التصوير والتوصيف تحت المجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر. (ه) تنظيف الرقاقة النانوية لإعادة استخدامها. (و) معالجة التصوير من أجل القياس الكمي لاستشعار انحناء البروتين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تكوين SLB المنحني على قضبان نانوية مع ارتباط بالبروتين . (أ) صورة SEM لشريط نانوي فردي. (ب) تصوير تخطيطي لنظام nanobar-SLB. (ج) صور فلورية ل SLB تحمل علامة Texas Red DHPE على الرقاقة النانوية. (د) متوسط صورة توزيع SLB على القضبان النانوية (أعلى) ومخطط سطح 3D للصورة المتوسطة (أسفل). تم تعديل هذا الرقم من Su et al.22 واستنسخه بإذن. (ه) التصوير بفاصل زمني ل SLB FRAP على القضيب النانوي. يشار إلى منطقة التبييض بدائرة صفراء متقطعة. (F) مخطط كثافة نانوي طبيعي عن طريق قياس FRAP. (G) لا يمكن أن يرتبط التصوير التخطيطي ل GFP ب SLB مع PS مشحون سلبي بنسبة 10٪ مول٪ (يسار) وصورة تمثيلية مقابلة على اليمين. (H) تصوير تخطيطي لعلامة His-tag المسمى GFP مرتبطة ب SLB مع 1 mol٪ DGS-NTA (Ni) (يسار) وصورة تمثيلية مقابلة على اليمين. قضبان المقياس: 2 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: المشكلات النموذجية التي تعرض جودة SLB للخطر. (أ) رسم تخطيطي لإعداد SLB بدون غسيل فعال. (ب) صورة تمثيلية لربط SLB بسيارات الدفع الرباعي الزائدة. تظهر الأسهم الصفراء النقاط التي هي سيارات الدفع الرباعي الزائدة على سطح SLB. (ج) رسم تخطيطي لإعداد SLB مع حقن فقاعات الهواء. (د) صورة تمثيلية ل SLB تم تدميرها بواسطة مسار السطح البيني للهواء والسائل. يظهر السهم الأصفر SLB غير المكتمل على الركيزة. (ه) رسم تخطيطي لإعداد SLB مع ركائز نانوية غير نظيفة. تظهر منطقة التكبير طبقة ثنائية دهنية متقطعة بسبب بقايا السطح تمنع امتزاز الدهون. (و) التصوير بفاصل زمني لتحليل SLB FRAP على ركائز نانوية غير نظيفة. يشار إلى منطقة التبييض بدائرة صفراء متقطعة. (ز) مخطط كثافة نانوي طبيعي عن طريق قياس FRAP. قضبان المقياس: 2 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: توصيف استشعار انحناء البروتين بواسطة نظام nanobar-SLB. (A) تتراكم الصور الفلورية ل F-BAR (يسار) و IDRFBP17 (يمين) على قضبان نانوية مغلفة ب SLB (10٪ PS و 90٪ PC). شريط المقياس: 2 ميكرومتر. (B) تتراكم الصور المتوسطة ل F-BAR (أعلى اليسار) و IDRFBP17 (أسفل اليسار) على القضبان النانوية ومخططات السطح ثلاثية الأبعاد المقابلة (أعلى اليمين والأسفل الأيمن ، على التوالي). شريط المقياس: 2 ميكرومتر. (C) نسبة النهاية إلى المركز لطبقة الدهون المزدوجة وكثافة مضان F-BAR و IDRFBP17 حول شريط نانوي بعرض 300 نانومتر. تم إجراء اختبار Welch t للتحليل الإحصائي. ص < 0.0001. (ن = 3) (د) صورة SEM لمصفوفات نانوية متدرجة بعرض من 200 نانومتر إلى 600 نانومتر. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. (E) شرح بناء البروتين (أعلى) ، متوسط صور طبقة الدهون المزدوجة ، توزيع IDR FBP17 و F-BAR و F-BAR + IDRFBP17 على قضبان نانوية متدرجة بعرض يتراوح من 200 نانومتر إلى 600 نانومتر (وسط) وملامح الكثافة على طول الأشرطة النانوية لكل صورة متوسطة (أسفل). شريط المقياس: 2 ميكرومتر. (F) IDR FBP17 و F-BAR و F-BAR + IDRFBP17 كثافة نهاية نانوية طبيعية كميا بعرض مختلف من القضبان النانوية على التوالي. يتم عرض كل بيانات كمتوسط ± SEM (رقم ≥ 60). (G) منحنى الربط ل IDRFBP17 المزود بمعادلة هيل. يتم عرض كل بيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تعديل هذا الرقم من Su et al.22 واستنسخه بإذن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: ديناميكيات الارتباط الغشائي لبروتينات استشعار الانحناء حول الشريط النانوي. (أ - د) التصوير بفاصل زمني للطبقة الثنائية الدهنية (A) و F-BAR (B) و IDR FBP17 (C) و IDRFBP17 تم غسلها (D) تحليل FRAP على الشريط النانوي. يشار إلى منطقة التبييض بدائرة حمراء متقطعة. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. (ه) مخطط كثافة نانوي طبيعي عن طريق قياس FRAP. تم تعديل هذا الرقم من Su et al.22 واستنسخه بإذن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: انتشار الغشاء قبل إضافة البروتين وبعده. (أ) التصوير بفاصل زمني لاختبار FRAP على طبقة الدهون المزدوجة POPC مع 1 مول٪ 18: 1 DGS-NTA (Ni) و 0.5٪ مول٪ تكساس الأحمر DHPE حول النانوبار قبل (أعلى) وبعد (أسفل) إضافة بروتين GFP-His . يشار إلى منطقة التبييض بدائرة صفراء متقطعة. (ب) مخطط شدة نانوي طبيعي عن طريق قياس FRAP. قضبان المقياس: 2 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم نظام nanobar-SLB الموصوف هنا مزيجا فريدا من المزايا في العديد من المقايسات الموجودة في المختبر. يكشف بكفاءة عن الارتباط التفضيلي للبروتينات بالأغشية المنحنية للغاية مثل مقايسة تعويم الجسيمات الشحمية أو الترسيب ولكنه يتطلب عينات أقل بكثير ويوفر انحناءا محددا بدقة أكبر على قضبان نانوية فردية 8,29. كما أنه يوفر مجموعة واسعة من الانحناءات التي يتم التحكم فيها بدقة للمقارنة المتزامنة مثل فحص SLiC ، مع قلق أقل بشأن تغير تكوين الدهون في الانحناءات المختلفة والتغيرات المورفولوجية أو الانحناءية غير القابلة للكشف بأحجام أقل من حد حيود الضوء ، حيث أن SLB متحرك ويغطي باستمرار جميع أحجام القضبان النانوية بإحكام30 . يسمح Nanobar-SLB أيضا بمراقبة السلوكيات الديناميكية للبروتين على الغشاء المنحني مثل مقايسات سحب الحبل ، ولكن لا يقتصر على إنتاجية توليد الأنبوب والخبرة في معالجة الاصطياد البصري13. على الرغم من أن مقايسة SMrT تولد أنابيب غشائية ذات إنتاجية عالية ، إلا أن انحناء الغشاء يختلف على طول الأنبوب النانوي مما يجعل من الصعب دراسة حساسية انحناء البروتينات16. والأكثر إثارة للاهتمام ، بالمقارنة مع الأنظمة الأخرى القائمة على SLB على الركيزة المنقوشة18،19،20،27 ، يوفر nanobar-SLB مركز شريط مسطح بجوار الانحناء المحدد في نهاية الشريط ، والذي يعمل بشكل فعال كتحكم محلي في الانحناء الصفري لتقليل تأثير تغيرات كثافة السطح على التحليل الكمي. إن القدرة على تخصيص مجموعات الانحناء باستخدام الطباعة الحجرية عالية الدقة لحزمة الإلكترون لا يمكن أن تولد فقط عناصر تحكم محلية في الانحناء الصفري ، ولكن أيضا انحناءات إيجابية وسالبة كما هو موضح سابقا في دراسات الخلايا الحية2.

هناك قيود محتملة جديرة بالملاحظة عند استخدام هذه الطريقة. أولا ، يعد التصنيع النانوي على الرقاقة إجراء معقدا نسبيا ، مع الحاجة إلى مرافق غرف الأبحاث والمعدات المتخصصة (على وجه الخصوص ، كاتب E-beam). قادتنا هذه التكلفة العالية إلى إعادة استخدام الشريحة. ينتج عن هذا قضاء وقت أطول في تنظيف سطح الرقاقة وتجميع الشريحة باستخدام PDMS مقارنة بالاستخدام لمرة واحدة. توافر رقاقة النانو هو نوع آخر من القيود. قد يؤدي التشغيل غير السليم عند استخدام الشريحة مثل مواجهة السطح نحو المقعد إلى استنزاف البنية النانوية ، خاصة بالنسبة للهياكل ذات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية. علاوة على ذلك ، فإن الطبقة المزدوجة الدهنية التي تشكلت على الركيزة هي غشاء مستمر. يمكن أن ينتشر التوتر بسهولة في كل مكان. بالنسبة للدراسات التي تتطلب معالجة توتر الغشاء ، توفر تقنيات مثل الحبل المسحوب من GUVs عبر نظام micropipette المرفق حلولا أكثر ملاءمة10.

للحصول على أفضل النتائج ، تعتبر الخطوات التالية حاسمة أيضا. (ط) حجم الحويصلة أمر بالغ الأهمية لتشكيل SLB31,32. تظهر الأدبيات السابقة ميلا أعلى للاندماج للحويصلات الأصغر حجما (< 90 نانومتر) مقارنة بالحجم الأكبر باستخدام اختبار التوازن الدقيق لبلورات الكوارتز مع التبديد (QCM-D)32. وبالتالي ، بالمقارنة مع LUVs من 300 نانومتر ، فإن أقطار ~ 50 نانومتر ستكون أسهل لتشكيل SLB. بالنظر إلى هذه المشكلة ، هناك حاجة إلى 20 مرة على الأقل في كل من خطوات التجميد والذوبان والبثق لتشكيل سيارات دفع رباعي متجانسة لتشكيل SLB. اختبار FRAP ضروري أيضا في كل تجربة للتحقق من صحة حركة الغشاء. (ii) أثناء إعداد سيارات الدفع الرباعي ، يجب الحفاظ على نظافة جميع المعدات لتجنب تلوث الجسيمات الصغيرة الشبيهة بالغبار. خاصة بالنسبة للطارد الصغير ، يتم انسداد الإبر بسهولة في بيئة قذرة. (iii) لتحضير سيارات الدفع الرباعي بجودة جيدة ، يجب إزالة الكلوروفورم الموجود في خليط الدهون تماما لتجنب تدمير الحويصلات الدهنية. (iv) يجب إجراء تنظيف البلازما للرقاقة حديثا قبل تكوين SLB لضمان سطح شديد المحبة للماء لكسر سيارات الدفع الرباعي بكفاءة لتشكيل طبقة ثنائية مستمرة. قد يؤدي التعرض لفترة طويلة في البيئة بعد معالجة البلازما إلى ارتباط غير محدد لجزيئات الغبار أو المخلفات العضوية بسطح الرقاقة ، مما يعرض للخطر مقاومة السطح للماء. (v) لتجميع غرفة PDMS لتشكيل SLB وحضانة البروتين ، فإن نظافة وتسطيح كل قطعة PDMS مهمة لضمان ختم جيد للقناة السائلة. قد يتسبب أي تسرب للغرفة في جفاف SLB أو تغيير تركيز البروتين. (vi) يعد ضبط تركيز التصوير أمرا بالغ الأهمية لضمان قياس كثافة متسق ، نظرا لأن ارتفاع القضيب النانوي (600 نانومتر) يمكن مقارنته بالعمق البؤري للفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر في المحور z33. يجب إعادة ضبط التركيز في كل مرة يتحرك فيها الصفيف أفقيا للحفاظ على حدة حواف الشريط النانوي في الصور.

قبل كل شيء ، يوفر نظام nanobar-SLB الذي تم تقديمه هنا طريقة قوية لدراسة بروتينات استشعار انحناء الغشاء. يمكن دراسة المعلمات المختلفة التي تؤثر على تفاعل البروتين مع الغشاء المنحني كميا عبر مجموعة من الانحناءات ، مثل المجالات الحساسة للانحناء (على سبيل المثال ، مجال BAR واللولب البرمائي) للبروتين8,30 ، تكوين الدهون (على سبيل المثال ، PS و PIP2) للغشاء27,34 ، درجة الحموضة ، القوة الأيونية ودرجة حرارة البيئة35,36 ، وكذلك تفاعل البروتين والبروتين للتكوين المعقد (على سبيل المثال، قد يساهم CHMP2B وCHMP2A بشكل مختلف في عمليات إعادة تشكيل الغشاء المحفز ESCRT-III)37,38. يمكن أيضا إجراء دراسات ديناميكية باستخدام نظام nanobar-SLB لفحص حركية ربط الغشاء 11 ، أو نشر أو تجميع بروتين الغشاء39 ، بالإضافة إلى التفاعلات الأنزيمية40 أو سلوك فصل الطور13،41،42. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر طبقة الدهون المزدوجة الاصطناعية بشكل عام متماثلة مع كل طبقة أحادية دهنية تحتوي على نفس تركيبة الدهون ، والتي تختلف تماما عن غشاء الخلية الحية43. يمكن الحصول على طبقة ثنائية غير متماثلة لتقليد غشاء البلازما بشكل أفضل عن طريق تغيير مادة السطح أو حالة المخزن المؤقت أو تكوين الدهون أو درجة الحرارة44،45،46،47. من المفيد للغاية التحقق مما إذا كان يمكن تشكيل طبقة ثنائية غير متماثلة على نظام nanobar-SLB لدراسة سلوك البروتين على الغشاء المنحني ، والذي يستحق المزيد من الدراسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية منافسة في هذا العمل.

Acknowledgments

نشكر مركز نانيانغ للتصنيع النانوي (N2FC) ومركز التقنيات الضوئية التخريبية (CDPT) في جامعة نانيانغ التكنولوجية (NTU) لدعم تصنيع البنية النانوية والتصوير SEM ، ومنصة إنتاج البروتين (PPP) في كلية العلوم البيولوجية NTU لتنقية البروتين ، وكلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمجهر متحد البؤر. يتم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التعليم السنغافورية (MOE) (W. Zhao و RG112/20 و RG95/21 و MOE-T2EP30220-0009) ، ومعهد التحليلات الجزيئية الرقمية والعلوم (IDMxS) بدعم من تمويل وزارة التربية والتعليم في إطار مخطط مراكز التميز البحثية (W. Zhao) ، ومؤسسة برنامج علوم الحدود البشرية (W. Zhao ، RGY0088/2021) ، ومنحة NTU Start-up Grant (W. Zhao) ، كلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمنحة البحثية (X. Miao) ، ومجلس المنح الدراسية الصيني للمنحة البحثية (J. Wu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 189 ، مجموعة نانوبار ، انحناء الغشاء ، بروتين استشعار الانحناء ، طبقة ثنائية الدهون المدعومة ، مقايسة في المختبر
نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لدراسة بروتينات استشعار انحناء الغشاء <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A… More

Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter