Summary
여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.
Abstract
막 곡률은 세포 이동, 세포 분열 및 소포 트래피킹과 같은 세포의 다양한 필수 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 활동에 의해 수동적으로 생성 될뿐만 아니라 단백질 상호 작용을 적극적으로 조절하고 많은 세포 내 신호 전달에 관여합니다. 따라서 단백질과 지질의 분포와 역학을 조절하는 막 곡률의 역할을 조사하는 것은 큰 가치가 있습니다. 최근에는 시험 관 내에서 곡선 막과 단백질 사이의 관계를 연구하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 기존 기술과 비교하여 새로 개발된 나노바 지지 지질 이중층(SLB)은 사전 정의된 막 곡률 및 국소 평면 제어를 통해 패턴화된 나노바 어레이에 연속 지질 이중층을 형성하여 막 곡률 생성에서 높은 처리량과 더 나은 정확도를 모두 제공합니다. 곡면막에 대한 지질 유동성과 단백질 민감도는 형광 현미경 이미징을 사용하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다. 여기에서는 나노바 어레이를 포함하는 제작된 유리 표면에 SLB를 형성하는 방법과 이러한 SLB 상의 곡률 민감성 단백질의 특성 분석에 대한 자세한 절차를 소개합니다. 또한 나노 칩 재사용 및 이미지 처리를위한 프로토콜을 다룹니다. nanobar-SLB 외에도 이 프로토콜은 곡률 감지 연구를 위한 모든 유형의 나노 구조 유리 칩에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
막 곡률은 형태 형성, 세포 분열 및 세포 이동과 같은 다양한 세포 과정에서 발생하는 세포의 중요한 물리적 매개 변수입니다1. 막 곡률이 세포 사건의 단순한 결과를 넘어선다는 것이 이제 널리 인식되고 있습니다. 대신, 단백질 상호 작용 및 세포 내 신호 전달의 효과적인 조절자로 부상했습니다. 예를 들어, 클라 트린 매개 세포 내 이입에 관여하는 여러 단백질이 곡선 막에 우선적으로 결합하여 세포 내 이입2에 대한 핫스팟을 형성하는 것으로 나타났습니다. 세포골격력에 의한 막 당김, 크기가 다른 머리 그룹을 가진 지질 비대칭의 존재, 원뿔 모양의 막 횡단 단백질의 존재, BAR 도메인 단백질(Bin, amphiphysin 및 Rvs 단백질의 이름을 따서 명명됨)과 같은 막 형성 단백질의 축적, 양친매성 나선 도메인을 막1에 삽입하는 것과 같은 막 변형의 다양한 원인이 있습니다. . 흥미롭게도 이러한 단백질과 지질은 막을 변형시킬 뿐만 아니라 막 곡률을 감지하고 우선적인 축적을 나타낼 수있습니다1. 따라서 곡률이 다른 막이 단백질과 지질의 분포와 역학을 변화시키고 관련 세포 내 과정에 대한 잠재적 영향을 변화시키는지 여부와 방법을 연구하는 것이 중요합니다.
살아있는 세포와 시험관 내 시스템 모두에서 곡선 막과 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 살아있는 세포 시스템은 풍부한 지질 다양성과 동적 단백질 신호 조절 2,3,4,5,6,7을 갖춘 실제 세포 환경을 제공합니다. 그러나, 이러한 정교한 시스템은 세포 내 환경의 불확실성 및 변동으로 인해 연구하기가 어렵다. 따라서 알려진 지질 종과 정제된 단백질로 구성된 인공 막을 사용하는 시험관 내 분석은 단백질과 곡선 막 사이의 관계를 특성화하는 강력한 재구성 시스템이 되었습니다. 전통적으로, 다양한 직경의 리포좀은 원심력을 이용한 공동 침강 분석 또는 단백질 응집을 피하기 위한 밀도 구배를 갖는 공동 부유 분석 8,9를 통해 곡률에 민감한 단백질을 검출하기 위해 압출에 의해 생성됩니다. 그러나, 압출된 리포좀의 곡률은 압출기(10)에 사용되는 멤브레인 필터의 사용 가능한 기공 크기에 의해 제한된다. 단일 리포좀 곡률(SLiC) 분석은 이러한 한계를 극복하는 것으로 입증되었으며, 여기서 직경이 다른 리포좀은 형광 표지되고 표면에 고정화되어 곡률이 형광 강도(11)로 표시될 수 있습니다. 그러나, 지질 조성에서의 강한 가변성이 작은 소포에서 관찰되었고, 이는 곡률 측정의 정확도에 영향을 미친다(12). 테더-풀링 실험은 광학 핀셋을 사용하여 거대한 단층 소포(GUV)로부터 당겨진 과도 테더 상의 곡률의 보다 정확한 측정을 제공하며, 여기서 곡률은 생성된 막 장력에 의해 잘 제어될 수 있다(13,14). 이 방법은 포지티브 또는 네거티브 곡률 감지 단백질을 연구하는 데 적합하지만 튜브 생성10의 처리량에 의해 제한됩니다. 지원되는 멤브레인 튜브(SMrT) 분석은 미세유체 흐름에 의해 동일한 지질 저장소에서 압출되는 여러 멤브레인 튜브를 동시에 생성할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 막 곡률은 나노튜브를 따라 본질적으로 변하며, 이는 형광-강도-기반 곡률 측정(15,16)의 정확도를 손상시킨다. 이에 비해, 작은 단층 소포 (SUVs, 직경 <100 nm17)를 사용하여 설계된 지형을 포함하는 표면 상에 지지된 지질 이중층 (SLB)을 형성하여 나노 제조 또는 나노 물질에 의해 미리 결정된 곡률을 갖는 단일 이중층 막을 높은 정확도로 생성하였다18,19,20.
여기에서는 나노바 어레이가 있는 제작된 나노칩 표면에 SLB를 형성하기 위한 프로토콜과 이를 사용하여 시험관 내 단백질의 곡률 감도를 조사하는 방법을 제시합니다. 도 1에 도시된 바와 같이, 분석의 6가지 필수 성분이 있다: A) 칩을 마이크로유체 챔버로 세척 및 조립하는 단계; B) 정의된 지질 조성을 갖는 SUV의 제조; c) 나노칩 상에 SLB를 형성하고 곡률 민감성 단백질과 결합하는 단계; D) 형광 현미경 하에서 SLB 및 곡률 민감성 단백질의 이미징 및 특성화; E) 재사용을 위해 칩을 청소하는 단계; F) 단백질 곡률 센싱 능력의 정량 분석을 위한 영상 처리. 자세한 프로토콜은 아래에 단계별로 설명되어 있습니다.
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Protocol
1. 나노 칩 청소
- 나노칩을 패턴화된 면이 위를 향하도록 10mL 비커에 넣습니다.
참고 :이 석영 나노 칩은 앞서 설명한 바와 같이 전자빔 리소그래피를 통해 제조되었습니다21. 칩상의 나노 구조의 기하학적 구조와 배열은 맞춤 설계 될 수있다. 여기에 사용 된 그래디언트 나노 바의 크기는 길이 2000nm, 높이 600nm, 너비 100-1000nm (100nm 스텝 세트)입니다. - 비커에 98% 황산 1mL를 조심스럽게 넣고 산이 칩의 앞면과 뒷면을 완전히 덮는지 확인합니다.
알림: 98% 황산은 부식성이 매우 높으며 피부나 눈에 닿으면 빠른 조직 파괴와 심각한 화학적 화상을 유발할 수 있습니다. 적절한 보호 기능을 갖춘 흄 후드에서 사용하십시오. - 비커를 천천히 돌리고 전체 비커가 뜨거워질 때까지 200μL의 30% 과산화수소를 한 방울씩 추가합니다. 황산과 과산화수소가 잘 혼합되어 나노칩(17)으로부터 유기 분자를 제거하기 위한 피라냐 용액을 형성하는지 확인한다. 앞서 설명된 바와 같이 UV 광 및 오존 노출과 같은 깨끗한 친수성 표면 상에 SLB를 생성하기 위한 대안적인 기술이 있다(23).
알림: 반응은 극도로 발열성이며 용액이 끓을 수 있으므로 황산에 과산화수소를 한 방울씩 넣고 계속 회전하십시오. - 비커를 보조 유리 용기에 넣고 나노 칩을 피라냐 용액에 밤새 담그면 불순물이 완전히 청소됩니다.
알림: 반응으로 인해 가스가 발생할 수 있는 경우를 대비하여 덮개 없이 비커를 흄 후드에 넣으십시오. - 비커를 꺼내 피라냐 용액을 산성 폐기물 용기에 조심스럽게 피펫팅합니다.
- 5mL의 탈이온수를 비커에 넣어 잔류 산을 희석하고 산성 폐기물로 버립니다. 이 단계를 5 번 반복하고 5M NaOH를 사용하여 산성 폐기물을 중화하십시오.
- 핀셋으로 칩을 잡고 탈이온수의 연속 흐름으로 세척하여 잔류 산을 완전히 제거합니다. SLB 형성을 위해 칩을 99.9% 질소 가스로 블로우 드라이합니다(22).
2. 작은 단층 소포 (SUV)의 생성
- 호박색 바이알에 클로로포름 100μL를 넣습니다.
알림: 클로로포름은 휘발성이 높고 무색의 액체이며 흡입하거나 삼키면 유독 할 수 있습니다. 마스크와 장갑을 낀 상태에서 흄 후드에 사용하십시오. - 지질 혼합물 500μg을 클로로포름에 녹인다. 여기에 사용 된 지질 혼합물의 조성은 계란 포스파티딜콜린 (PC) 89.5 몰%, 뇌 포스파티딜 세린 (PS) 10 몰%, 텍사스 레드 1,2- 디 헥사 데카 노일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 트리 에틸 암모늄염 (텍사스 레드 DHPE).
- 클로로포름이 휘발되고 지질 혼합물이 건조될 때까지 바이알의 지질 혼합물을 99.9% 질소 가스로 블로우 건조합니다.
알림: 이 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다. 블로우 드라이 시 액체 튀김을 피하십시오. - 뚜껑 없이 호박색 바이알에 있는 지질 혼합물을 알루미늄 호일로 덮인 진공 데시케이터에 놓습니다. 그런 다음 클로로포름을 완전히 휘발시키기 위해 펌프로 샘플을 3시간 동안 진공 건조시킵니다.
- 250μL의 인산염 완충 식염수(PBS) 버퍼를 바이알에 추가합니다. 균질해질 때까지 용액을 소용돌이치십시오.
알림: PBS 버퍼는 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드가없는 150mM NaCl로 구성됩니다. pH는 PC 및 PS 지질 이중층을 만들기 위해 7.2로 조정된다. - 목욕 초음파 처리기에서 50kHz의 주파수로 30분 동안 지질 혼합물을 초음파 처리합니다. 그런 다음 지질 혼합물을 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고 파라필름으로 밀봉합니다.
- 지질 혼합물을 액체 질소에서 20초 동안 동결시킨 다음, 수조에서 42°C에서 2분 동안 해동시킨다. 동결-해동 주기를 30회 반복합니다. 그 후, 지질 혼합물은 투명한 액체처럼 보입니다.
주의 : 액체 질소의 끓는점은 약 -195.8 ° C입니다. 동상이나 극저온 화상을 일으킬 수 있습니다. 단열장갑을 끼고 밀폐되지 않은 공간에서 사용하십시오. - 두 개의 유리 기밀 주사기와 미니 압출기의 커넥터를 각각 에탄올, 클로로포름 및 메탄올로 헹굽니다. 헹굼 순서를 5 회 반복하여 장치를 사전 청소하십시오. 유기 용매가 완전히 휘발 될 때까지 흄 후드에 두십시오.
- 미니 압출기 장치를 조립하고 500μL의 PBS 버퍼를 커넥터를 통과시켜 장치를 미리 습윤시킨 다음 다른 주사기에서 버퍼를 버립니다. 이 단계는 불순물을 제거하고 압출을 용이하게합니다.
- 미니 압출기 장치를 100nm 기공 크기의 폴리카보네이트 필터 멤브레인으로 조립합니다.
참고: 필터 멤브레인의 기공 크기는 리포좀의 직경을 결정합니다. - 주사기 중 하나로 500μL의 PBS 버퍼를 가져다가 필터를 통해 부드럽게 밀어 다른 쪽 끝에 있는 두 번째 빈 주사기를 채웁니다. 압출을 앞뒤로 세 번 반복하여 장치 누출을 확인하고 두 번째 주사기에서 버퍼를 버립니다.
- 지질 혼합물을 미니 압출기를 통과시켜 PBS 완충액을 대체한다. 그런 다음 앞뒤로 20 번 돌출하여 SUV를 만듭니다. 소포의 다층 특성은 불충분한 압출 횟수로 유지될 수 있으며, 이는 SLB 형성(23)에 영향을 미칠 것이다.
- 두 번째 주사기에서 SUV를 수집하여 더 큰 입자로 인한 오염을 줄이고 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
알림: 주사기가 파손될 경우 커넥터에서 주사기를 똑바로 제거하십시오. - 형광 표지 지질의 표백을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 4 ° C에서 보관하십시오. 일반적으로 SUV는 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.
3. 나노칩 상에 SLB의 형성
- 탈이온수에서 세척된 나노칩을 핀셋으로 조심스럽게 꺼내고 99.9% 질소 가스로 블로우 드라이합니다.
- 1 시간 동안 공기 플라즈마 처리로 나노 칩의 표면 세정을 수행하십시오.
- 나노칩을 폴리디메틸실록산(PDMS) 챔버에 조립하고, 이 챔버는 중간 PDMS 및 상부 PDMS의 두 조각으로 구성된다(도 1A). 중간 PDMS는 얇고 (~ 0.5mm) 중앙에 큰 타원형 개구부가있어 나노 바 패턴에 충분한 노출을 보장합니다. 상단 PDMS는 두껍고(~4.0mm) 액체 처리를 위한 입구와 출구로 큰 타원형 개구부 내에 두 개의 작은 구멍이 있습니다.
- 패턴이 위를 향하도록 깨끗한 표면에 칩을 놓습니다.
- 중간 PDMS를 칩으로 부드럽게 덮고 전체 패턴이 중간 PDMS의 큰 타원형 개구부의 중앙 영역에 노출되는지 확인합니다.
- 상단 PDMS를 중간 PDMS로 덮고 중간 PDMS의 큰 타원형 구멍 영역 내에 두 개의 작은 구멍을 유지하십시오. 그런 다음 PDMS 챔버가 조립됩니다.
참고: PDMS는 가장 널리 사용되는 실리콘 기반 유기 폴리머입니다. 생체 적합성이 있고 투명하며 변형이 가능하여 현미경으로 칩 조립 및 이미징을 위한 맞춤형 모양으로 설계됩니다. 더 중요한 것은 플라즈마 처리 후 다른 PDMS 층이나 유리에 공유 결합되어 단단히 접착 될 수있어 SLB를 준비하는 챔버로 적합하다는 것입니다. 이 단계를 통해 PDMS의 각 레이어가 단단히 고정되어 틈과 누출이 방지됩니다.
- 피펫으로 상단 PDMS의 두 개의 작은 구멍 중 하나에서 SUV를 PDMS 챔버에 넣고 실온에서 15분 동안 배양하여 SLB를 형성합니다.
- 작은 구멍의 한쪽에서 PBS 버퍼를 PDMS 챔버로 부드럽게 피펫팅하고 다른 구멍에서 면봉으로 폐기물을 제거하여 바인딩되지 않은 SUV를 씻어냅니다. 이어서 나노칩 상에 형성된 SLB를 획득한다(SLB의 품질은 단계 4.4에 도시된 바와 같이 광퇴색 후 형광 회복(FRAP)에 의해 시험되고 대표적인 결과 섹션에서 논의됨).
알림: PBS 버퍼를 챔버에 피펫팅할 때 피펫 팁은 버퍼로 가득 차 있어야 하며 기포가 주입되지 않도록 액체 표면과 접촉해야 합니다.
4. SLB와 나노칩 상의 곡률 감지 단백질 결합 이미징
참고: 이 섹션은 실험에 사용할 수 있는 현미경 시스템에 따라 다릅니다. 여기서, 이미징을 수행하는 방법에 대한 전반적인 가이드라인이 설명될 것이다. 세부 설정은 서로 다른 현미경 설정 간에 변경할 수 있습니다.
- 100x(N.A.1.4) 오일 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 설정합니다. ZEN 소프트웨어를 열어 지질과 단백질의 형광을 자극할 수 있는 여기 레이저 출력을 선택합니다. 획득 모드 > 스마트 설정 > 텍사스 레드 DHPE / EGFP를 선택합니다.
- 초점 손잡이로 초점을 조정하여 나노바 가장자리가 지질 채널 아래에서 날카로워질 때까지 칩의 나노바를 찾습니다.
- 단백질을 추가하기 전에 지질 채널의 대조 이미지를 얻기 위해 스캔 파라미터를 아래와 같이 설정하십시오: 프레임 크기 = 512픽셀 x 512픽셀(512픽셀 x 512 픽셀, 픽셀 크기 124nm), 픽셀당 비트 = 16( 16비트 심도), 스캔 속도 = 5, 평균 = 4(평균 모드/라인).
- 형광 표지된 지질 이중층을 임의의 단일 나노바 영역 상에서 표백함으로써 FRAP 분석을 수행한다.
- 실험 영역 및 표백 확인란을 선택합니다. 중앙에 전체 나노 바를 포함 할 수있는 직경 5μm의 원형 영역 (나노 바 크기는 2μm)을 그리고 실험 영역에 추가합니다. 다음 예와 같이 타임랩스 이미징 파라미터를 입력합니다: 스캔 속도 = 9 및 평균 = 1을 선택합니다. 시계열 > 기간 = 100주기 및 간격 = 2초를 선택합니다. 다음 예와 같이 표백 매개 변수 입력: # 이미지 후 시작 확인란을 선택하고 세 개의 이미지를 선택합니다.
- FRAP를 수행하는 레이저 확인란을 선택하고 전원을 100.0%로 변경합니다. FRAP 실험에 대해 실험 시작을 클릭합니다.
참고: FRAP는 세포 분자의 이동성을 특성화하는 일반적인 방법입니다. SLB의 유동성이 좋으면 표백된 형광단이 확산되고 다른 영역의 표백되지 않은 형광단이 확산됨에 따라 표백된 영역의 형광이 점차 회복됩니다.
- 단백질 용액을 PDMS 챔버에 로딩하고 SLB에서 단백질의 결합을 허용하기 위해 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
참고: 나노바 곡선 SLB에서 단백질 결합을 촉진하는 지질 조성을 입증하기 위해 그림 2G, H에서 사용된 단백질은 74μM GFP 및 79μM GFP-His입니다. 이 두 단백질은 His-태그가 없거나 있는 녹색 형광 단백질입니다. 그림 4 및 그림 5에서 곡률 감지 연구에 사용되는 단백질은 16μM F-BAR, 16μM IDR FBP17 및 16μM FBAR+IDRFBP17입니다. 이 세 가지 단백질은 FBP17의 도메인으로, 직관적으로 곡률 발생기와 센서로 가정되는 전형적인 BAR 단백질입니다. 각 단백질 부피는 20 μL입니다. - 나노바의 초점을 다시 맞추고 4.3단계를 반복하여 단백질 곡률 감지 감지를 위해 지질과 단백질 채널의 이미지를 모두 촬영합니다.
- 단계 4.4를 반복하여 지질 및 단백질 채널 모두에서 FRAP 분석을 수행하고 타임 랩스 이미징을 수행하여 곡률 감지 단백질의 이동성을 특성화합니다.
5. 나노 칩의 재사용
- 핀셋으로 나노 칩을 잡고 탈 이온수로 채워진 50mL 비커에서 PDMS 챔버에서 조심스럽게 분리합니다.
참고: 이것은 중요한 단계입니다. 핀셋이 나노 구조에 닿지 않도록하고 균열을 피하기 위해 칩을 강제로 분리하지 마십시오. - 나노 칩을 무수 에탄올로 철저히 씻어 표면에 부착 된 유기 잔류 물을 제거하십시오.
알림: 무수 에탄올로 세척하기 전에 깨끗한 티슈 페이퍼를 사용하여 표면의 물을 제거하십시오.
주의 : 무수 에탄올은 휘발성이 높고 약간 위험한 화학 물질입니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 마스크와 장갑을 낀 상태에서 흄 후드에 사용하십시오. - 잔류 에탄올을 제거하기 위해 많은 양의 탈 이온수로 칩을 철저히 씻으십시오. 그런 다음 99.9% 질소 가스로 칩을 블로우 드라이합니다.
알림: 피라냐 산은 유기 용매와 격렬하게 반응하여 폭발을 일으킬 수 있으므로 다음 단계로 진행하기 전에 칩에 있는 모든 미량의 에탄올을 제거하는 것이 중요합니다. - 패턴면이 위를 향하도록 깨끗한 10mL 비커에 칩을 넣고 '나노칩 세척'과 동일한 단계에 따라 재사용을 위해 피라냐 용액으로 칩을 청소합니다.
6. 이미지 정량화
- 현미경으로 획득한 이미지를 회전하여 나노바 어레이가 피지 소프트웨어에서 후속 분석을 위해 수직 위치에 있도록 합니다.
- 사용자 지정 MATLAB 코드 'c_pillarmask_averaging'를 사용하여 지질 채널과 단백질 채널 모두에서 정사각형 마스크(51픽셀 x 51픽셀)로 개별 나노바를 찾습니다.
참고: 이 MATLAB 코드는 나노칩용으로 특별히 설계되었습니다. GitHub에서 링크를 통해 얻을 수 있습니다 : https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX. - MATLAB 코드 'BarGra_avg'의 meshgrid 함수를 사용하여 영상 모서리에 ROI 3개(5픽셀 x 5픽셀)가 있는 각 영상의 배경 신호를 뺍니다. 이 작업은 현미경 설정 또는 현미경 스테이지의 칩 레벨링으로 인해 발생할 수 있는 고르지 않은 배경 소음을 수정하는 것을 목표로 합니다.
- MATLAB 코드 'BarGra_avg'를 사용하여 동일한 크기의 나노바의 평균 영상을 생성하며, 여기서 각 점은 모든 개별 나노바 사각형 마스크에서 해당 점에 있는 값의 평균입니다. 피지 소프트웨어에서 평균 이미지의 3D 표면도를 생성하여 나노바 주변의 평균 신호 분포를 직관적으로 보여줍니다. > 표면도 분석을 선택하고 다각형 승수에 대해 입력 100> 선택하고 음영, 축 그리기 및 부드럽게 확인란을 선택합니다.
- 각 나노바를 두 개의 나노바 말단 영역과 하나의 나노바 중심 영역을 포함하는 세 개의 영역으로 분할하여 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'로 각각 형광 강도를 추출합니다. 나노바 ROI의 크기는 '위치' 파일을 사용하여 나노바의 치수에 따라 조정됩니다.
- 단백질 강도를 막대 끝 영역의 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'에서 추출한 지질 강도로 나누어 표면적 효과를 제외한 나노바 말단 밀도를 얻습니다.
- 다양한 농도의 나노바 말단 밀도를 GraphPad Prism에 플로팅하여 결합 곡선을 얻습니다. 분석 메뉴를 엽니다. 비선형 회귀(곡선 맞춤) > 결합 - 채도 > 힐 기울기 함수를 사용한 특정 결합 을 선택하여 곡선을 힐 방정식에 맞춘 다음 KD 및 힐 계수 값을 계산합니다.
- 지질과 단백질 강도는 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'를 사용하여 동일한 이미지에서 획득한 600nm 나노바 중심에서 해당 강도로 정규화됩니다.
- 동일한 크기의 나노바로 단백질 곡률 감지를 정량화하기 위해 바 중심 영역으로 나눈 나노바 말단 영역에서 정규화된 단백질 강도의 가장 밝은 9픽셀을 사용하여 값을 "종단 대 중심 비율"이라고 합니다. 표준화 된 단백질 강도의 비율을 사용하여 지질 강도를 정규화하여 다양한 크기의 나노 막대로 단백질 곡률 감지 범위를 정량화하면 값을 "정규화 된 나노 바 말단 밀도"라고합니다. 이 값은 MATLAB 코드 'avg_nanobar_quantification'로 계산됩니다.
- 피지 소프트웨어에서 FRAP 스택 이미지를 로드합니다. FRAP 영역을 선택하고 ROI를 생성합니다. 추가 > 다중 측정 기능을 선택하여 각 시간에 대한 FRAP 영역의 강도를 측정합니다. 그래프패드 프리즘에 강도를 플로팅하여 FRAP 회복 곡선을 생성합니다.
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Representative Results
나노바 설계는 포지티브 곡률 감지 단백질을 프로빙하는 데 권장되며, 각 끝에는 나노바 너비로 정의된 곡률이 있는 반원이 있고 중앙에 국부적으로 하나의 평면/제로 곡률 제어가 포함됩니다(그림 2A,B). 나노바에 SLB를 성공적으로 형성하면 그림 2C와 같이 전체 나노바 표면에 걸쳐 지질 마커 신호가 고르게 분포됩니다. 개별 나노바 이미지(그림 2D)를 평균화하여 여러 나노바의 신호를 결합할 수 있으므로 서로 다른 나노바 간의 무작위 변동을 최소화할 수 있습니다. 이전의 전자 현미경 연구는 세포 원형질막이 전체 나노구조물 주위에 컨포멀 코팅을 형성한다는 것을 보여주었다(24). 따라서, 합성 지질 이중층은 나노구조물 표면에도 단단히 부착되는 것으로 여겨지며, 이는 도 4E에서 관찰된 바와 같이 200 nm 나노바 상에 회절 제한 라인을 부여한다. 또한, 나노바 곡선형 SLB 상의 막 유동성은 FRAP 분석에 의해 특성화될 수 있으며, 여기서 단일 나노바 상의 형광 신호는 막 유동성 특성화를 위해 개별적으로 표백될 수 있다(그림 2E,F).
나노바 상의 SLB의 형성은 앞서 보고된 바와 같이 평평한 표면에서의 SLB 형성과 유사하게 SUV의 생성을 필요로 한다17. SUV의 지질 조성은 막 표지 및 다양한 단백질 결합 메커니즘을 위해 변경 될 수있는 나노 바 곡선 SLB의 표면 화학을 결정합니다. 예를 들어, Texas Red DHPE는 SUV에 ~0.5mol%를 첨가하여 나노바의 막 표면적을 형광 현미경으로 쉽게 이미징할 수 있습니다(그림 2C). 시각화 외에도 지질 조성을 변경하여 나노바 곡선 SLB에서 단백질 결합을 촉진할 수 있습니다. 예를 들어, His- 태그 된 단백질의 고정을 용이하게하기 위해, 니켈 - 니트릴로 트리 아세트산 (Ni-NTA)은 1,2- 디올 레오 일 -sn- 글리세로 -3- [(N- (5- 아미노 -1- 카르복시 펜틸) 이미 노이 디아세트산) 숙시 닐] (니켈 염) (18 : 1 DGS-NTA (Ni))를 SUV (~ 1 mol %) 25. 지질에 이 작용기가 없으면 녹색 형광 단백질(GFP)이 음전하를 띤 PS로 SLB에 결합할 수 없으므로 용액 내 GFP 신호의 체적 고갈로 인해 각 나노바 위치에 더 어두운 막대 모양의 구멍이 생깁니다(그림 2G). 이에 비해 SLB에 1 mol% 18:1 DGS-NTA(Ni)를 추가하면 His-tag 라벨이 부착된 GFP가 멤브레인에 강하게 고정되어 나노바로 구부러진 SLB 모양을 명확하게 따를 수 있습니다(그림 2H). 지질 확산은 FRAP 분석에 의해 프로빙된 바와 같이 단백질 결합에 대해 검출가능한 차이를 나타내지 않았다(보충 그림 1). FRAP 측정은 SLB에서 0.5 mol % Texas Red DHPE의 강도만을 기반으로하며, 이는 His- 태그 단백질의 결합에 사용 된 1 mol % DGS-NTA (Ni)를 나타내지 않을 수 있습니다. 또한, PS와 같은 하전 지질은 정전기적 상호작용(26)을 통해 단백질 결합을 향상시킬 수 있는 반면, 포스파티딜이노시톨(4,5)-비스포스페이트(PIP2)와 같은 신호 전달 지질은 특정 단백질 결합을 촉진하기 위해 SUV에 통합될 수도 있다(예를 들어, PIP2가 그의 막 곡률 감지(27)에 필수적인 것으로 밝혀진 FCHo2).
표면 균일성 및 막 유동성 측면에서 SLB 형성의 품질은 나노바에서 단백질 곡률 감지 능력을 조사하는 데 중요합니다. SLB 균일성과 유동성을 손상시킬 수 있는 세 가지 일반적인 문제가 있습니다. 하나는 나노바와 나노바 사이의 평평한 막 모두에서 반점을 생성하는 비효율적인 세척으로 인해 SLB에 과도한 SUV가 결합하는 것입니다(그림 3A,B). 이는 곡률 감지 평가를 위해 나노바의 곡면 또는 평평한 표면에서 단백질 결합의 정량화에 상당한 영향을 미칩니다. 또 다른 문제는 세척 단계에서 PDMS 챔버 내부에 예기치 않은 기포가 유입되어 공기-액체 계면의 궤적을 따라 SLB가 파괴되고 나노바 표면에 매우 낮은 지질 신호로 쉽게 식별할 수 있는 스크래치와 같은 특징을 남길 수 있다는 것입니다(그림 3C, D). 또한, 부적절하게 세척 된 나노 바 기질은 SLB 형성을위한 지질 흡착을 방지하는 표면에 무작위로 분포 된 화학 잔류 물을 남깁니다. 이는 현미경 시각화를 위한 광학 해상도보다 높거나 높지 않을 수 있는 멤브레인 결함의 생성으로 이어집니다(그림 3E). 그러나, 막 유동성은 막 결함 형성(28)에 의해 민감하게 영향을 받을 것이며, 따라서 FRAP 분석은 표면 청결도를 검증하기 위해 사용될 수 있다(도 3F,G).
나노바 어레이를 사용하여 곡률 감지 단백질의 특성화를 입증하기 위해 일반적인 F-BAR 도메인을 FBP17(IDRFBP17)에서 최근에 확인된 내재적 장애 영역과 비교합니다. F-BAR는 Alexa Fluor 488 테트라플루오로페닐 에스테르 염료로 형광 표지되어 있고 IDRFBP17 은 Alexa Fluor 647 C2 말레이미드로 표지됩니다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 두 단백질 도메인은 300 nm 폭의 SLB-코팅된 개별 나노바 상에서 증가된 축적을 보여준다. 여기서, SLB는 단백질 결합을 정전기적으로 향상시키기 위해 10% PS를 함유한다. 단백질의 곡률 감지 능력은 평평한 나노바 중심의 신호보다 더 높은 형광 강도를 갖는 곡선형 나노바 말단의 우선 농축으로 식별할 수 있으며, 이는 100개 이상의 나노바에서 이미지 평균을 낸 후 더 명확하게 나타납니다(그림 4B). 곡률 감지 능력은 각 나노바 상의 종단 대 중심 비율(즉, 나노바 말단 대 나노바 중심에서의 형광 강도)을 계산함으로써 정량적으로 반사될 수 있다. 도 4C에 도시된 바와 같이, 두 단백질 모두 지질보다 더 높은 말단 대 중심 비율을 가지며, 이는 약 1이다. IDR FBP17과 F-BAR을 비교할 때 IDRFBP17 의 높은 엔드 투 센터 비율(1.385 ±0.011, 평균 ± SEM)이 F-BAR(1.144 ± 0.004, 평균 ± SEM)보다 더 강한 곡률 감지를 나타낸다는 것을 알 수 있습니다.
단백질이 감지할 수 있는 곡률 범위를 조사하기 위해 SLB는 200nm에서 600nm까지의 그래디언트 폭을 가진 나노바 어레이에서 생성되며(그림 4D), 여기서 지질은 다양한 크기의 나노바에 균일한 코팅을 보였습니다(그림 4E). 3 개의 단백질 (IDR FBP17, F-BAR 및 F-BAR + IDRFBP17)이 그래디언트 나노 바 어레이에서 배양되었으며, 곡률이 직경 400nm 미만으로 감소했을 때 나노 바 말단 곡선 막 부위에서 모두 우선적으로 축적되었습니다 (그림 4E, F). 이 세 가지 단백질 도메인 중에서 IDRFBP17은 가장 높은 나노바 말단 밀도를 제공하여 가장 강한 곡률 감지 능력을 나타내는 반면 F-BAR은 가장 낮은 값을 나타냅니다(그림 4F). 또한, 곡률 감지 단백질의 결합 곡선은 단백질 농도를 점진적으로 증가시킴으로써 플롯 될 수 있으며(그림 4G), 이는 IDRFBP17이 강력한 협력 곡률 감지 능력을 가지고 있음을 보여준다. 결합 곡선을 힐 방정식에 맞출 때 KD는 μM 범위 (0.6 ± 0.1 μM)에서 발견되고 힐 계수 (H)는 2와 3 사이이며, 이는 IDRFBP17이 나노 바 유도 막 곡률에 대한 초고감도 결합을 시사합니다. 곡률이 날카로울수록 평형에서 결합 능력이 높아집니다.
나노바 모양의 SLB 부위 주변의 곡률 감지 단백질의 동적 막 확산 및 막 결합도 FRAP에 의해 연구할 수 있습니다. 나노바에서 지질 신호의 빠른 회복(그림 5A,E)과 비교하여 F-BAR는 2분 이내에 회복할 수 없었으며(그림 5B,E), 이는 곡선형 막 부위에서 막 이동성 및 결합 역학이 크게 감소했음을 시사합니다. 놀랍게도 F-BAR의 거동과 달리 IDR FBP17 신호는 동일한 시간 프레임 내에서 명백한 회복을 보였으며 (그림 5C, E) 이는 곡선 멤브레인에 축적 된 IDRFBP17의 동적 특성을 나타냅니다. 그러나 용액에서 결합되지 않은 IDR FBP17을 씻어낸 후 IDRFBP17 채널에서 이전과 동일한 회복을 관찰할 수 없었습니다(그림 5D,E). 이는 회수가 용액 함유FBP17 분자와의 교환에 의해 지배되고 덜 막 결합 분자의 측방향 확산에 의해 지배된다는 것을 나타낸다.
전반적으로, 이러한 결과는 이 나노바-SLB 시스템이 시험관 내에서 막 곡률 감지 단백질을 특성화하는 강력한 도구임을 입증합니다.
그림 1: 나노바-SLB 시스템의 그림. (A) PDMS 챔버는 세척 된 나노 칩이 조립 된 상단 및 중간 층으로 구성됩니다. (B) 텍사스 레드 DHPE는 확대 된 세부 사항으로 SUV에 라벨을 붙였습니다. (c) 나노바-SLB 시스템의 온전한 모델과 확대 영역은 SLB가 지질 이중층의 균일한 단일 층을 갖는 나노바 상에 형성됨을 보여준다. (D) 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 통한 이미징 및 특성화 프로세스. (E) 추가 재사용을 위해 나노 칩을 청소하는 단계. (F) 단백질 곡률 감지 정량화를 위한 이미징 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단백질 결합이 있는 나노바 상의 곡선형 SLB 형성 . (A) 개별 나노바의 SEM 이미지. (B) 나노바-SLB 시스템의 개략도. (c) 나노칩 상에 텍사스 레드 DHPE로 표지된 SLB의 형광 이미지. (D) 나노바 상의 SLB 분포의 평균 이미지(위)와 평균 이미지의 3D 표면도(아래). 이 수치는 Su et al.22 에서 수정되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. (e) 나노바 상의 SLB FRAP의 타임랩스 이미징. 표백 영역은 노란색 점선으로 표시됩니다. (F) FRAP 측정에 의한 정규화된 나노바 강도 플롯. (G) GFP의 개략적인 묘사는 10 mol % 음의 전하를 띤 PS (왼쪽)와 오른쪽에 해당 대표 이미지로 SLB에 결합 할 수 없습니다. (H) 1 mol% DGS-NTA(Ni)로 SLB에 결합된 His-tag 라벨링된 GFP의 개략적인 묘사(왼쪽)와 오른쪽의 해당 대표 이미지. 스케일 바: 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SLB 품질을 저하시키는 일반적인 문제. (A) 효율적인 세척 없이 SLB 준비의 개략도. (B) SLB의 대표 이미지는 초과 SUV와 결합합니다. 노란색 화살표는 SLB 표면의 과도한 SUV인 반점을 나타냅니다. (C) 기포가 주입된 SLB 제제의 개략도. (D) 공기-액체 계면의 궤적에 의해 파괴된 SLB의 대표 이미지. 노란색 화살표는 기판의 불완전한 SLB를 나타냅니다. (E) 세척되지 않은 나노 바 기판을 사용한 SLB 준비의 개략도. 확대 영역은 지질 흡착을 방지하는 표면 잔류물로 인한 불연속적인 지질 이중층을 나타낸다. (F) 세척되지 않은 나노바 기판에 대한 SLB FRAP 분석의 타임랩스 이미징. 표백 영역은 노란색 점선으로 표시됩니다. (G) FRAP 측정에 의한 정규화된 나노바 강도 플롯. 스케일 바: 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: nanobar-SLB 시스템에 의한 단백질 곡률 감지 특성화. (A) F-BAR (왼쪽) 및 IDRFBP17 (오른쪽)의 형광 이미지가 SLB 코팅 나노 바 (10 % PS 및 90 % PC)에 축적됩니다. 스케일 바 : 2 μm. (B) F-BAR (왼쪽 상단) 및 IDRFBP17 (왼쪽 하단)의 평균 이미지는 나노 바 및 해당 3D 표면 플롯 (각각 오른쪽 상단 및 오른쪽 하단)에 누적됩니다. 스케일 바: 2 μm. (C) 지질 이중층의 말단 대 중심 비율, F-BAR 및 IDRFBP17 형광 강도 300 nm 너비 나노바. 통계 분석을 위해 웰치의 t-검정을 수행하였다. p < 0.0001. (n = 3) (D) 폭이 200 nm에서 600 nm 인 그래디언트 나노 바 어레이의 SEM 이미지. 스케일 바: 5 μm. (E) 단백질 컨스트럭트의 주석(상단), 지질 이중층의 평균 이미지, IDR FBP17, F-BAR 및 F-BAR+IDRFBP17 분포 너비가 200nm에서 600nm 범위인 그래디언트 나노바(가운데) 및 각 평균 이미지의 나노바를 따른 강도 프로파일(하단). 스케일 바 : 2 μm. (F) IDR FBP17, F-BAR 및 F-BAR + IDRFBP17은 각각 다른 너비의 나노 바로 정량화 된 나노 바 말단 밀도를 표준화했습니다. 각 데이터는 평균± SEM으로 나타내었다(n≥ 60). (G) 힐 방정식에 맞는 IDRFBP17의 결합 곡선. 각 데이터는 평균± SEM으로 나타내었다(n=3). 이 수치는 Su et al.22에서 수정되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 나노바 주변의 곡률 감지 단백질의 막 결합 역학. (주후) 나노바 상에서 FRAP 분석한 지질 이중층(A), F-BAR(B), IDRFBP17(C), 및 IDRFBP17(D)의 타임랩스 이미징. 표백 영역은 빨간색 점선으로 표시됩니다. 스케일 바: 5 μm. (E) FRAP 측정에 의한 정규화된 나노바 강도 플롯. 이 수치는 Su et al.22에서 수정되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 단백질 첨가 전후의 막 확산. (A) GFP-His 단백질을 첨가하기 전(위)과 후(아래) 나노바 주위에 1몰% 18:1 DGS-NTA(Ni) 및 0.5몰% 텍사스 레드 DHPE를 사용하여 POPC 지질 이중층에 대한 FRAP 테스트의 타임랩스 이미징. 표백 영역은 노란색 점선으로 표시됩니다. (B) FRAP 측정에 의한 정규화된 나노바 강도 플롯. 스케일 바: 2 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 나노바-SLB 시스템은 기존의 여러 시험관 분석에서 장점의 고유한 조합을 제공합니다. 리포솜 부유 또는 침강 분석과 같이 고도로 구부러진 막에 대한 단백질의 우선적 결합을 효율적으로 나타내지만 훨씬 적은 수의 샘플이 필요하며 개별 나노바 8,29에서 보다 정확하게 정의된 곡률을 제공합니다. 또한 SLiC 분석법과 동시 비교를 위해 정밀하게 제어된 광범위한 곡률을 제공하며, SLB가 이동성이 있고 모든 크기의 나노바를 지속적으로 커버하기 때문에 다양한 곡률의 지질 조성 변화와 빛의 회절 한계 미만의 크기로 감지할 수 없는 형태학적 또는 곡률 변화에 대한 우려가 적습니다.30 . Nanobar-SLB는 또한 테더 당김 분석법으로 곡면에서 단백질의 동적 거동을 관찰할 수 있지만 튜브 생성의 처리량과 광학 트래핑 조작 경험에 의해 제한되지 않습니다13. SMrT 분석은 높은 처리량으로 막 튜브를 생성하지만 막 곡률은 나노 튜브를 따라 변하므로 단백질16의 곡률 감도를 연구하기가 더 어려워집니다. 더욱 흥미롭게도, 패턴화된 기판(18,19,20,27) 상의 다른 SLB-기반 시스템과 비교하여, 나노바-SLB는 바 단부에서 정의된 곡률 옆에 플랫 바 중심을 제공하며, 이는 정량적 분석에 대한 표면 밀도 변화의 영향을 최소화하기 위해 제로 곡률의 국부적 제어로서 효과적으로 기능한다. 고해상도 전자빔 리소그래피를 사용하여 곡률 조합을 사용자 정의하는 기능은 로컬 제로 곡률 제어뿐만 아니라 라이브 셀 연구2의 앞부분에서 입증 된 것처럼 양의 곡률과 음의 곡률도 생성 할 수 있습니다.
이 방법을 사용할 때 주목할 만한 잠재적인 제한 사항이 있습니다. 첫째, 칩의 나노 제조는 클린 룸 시설과 특수 장비 (특히 E- 빔 라이터)가 필요한 비교적 복잡한 절차입니다. 이 높은 비용으로 인해 칩을 재사용하게되었습니다. 이로 인해 일회성 사용에 비해 칩 표면을 청소하고 PDMS로 칩을 조립하는 데 더 오랜 시간이 소요됩니다. 나노칩의 가용성은 또 다른 유형의 제한이다. 표면을 벤치쪽으로 향하게하는 것과 같이 칩을 사용할 때 부적절한 작동은 특히 높은 종횡비 구조의 경우 나노 구조 마모를 유발할 수 있습니다. 또한, 상기 기재 상에 형성된 지질 이중층은 연속막; 긴장은 모든 곳에서 쉽게 전파 될 수 있습니다. 막 장력의 조작을 필요로 하는 연구의 경우, 부착된 마이크로피펫 시스템을 통해 GUV로부터 당겨지는 밧줄과 같은 기술이 보다 편리한 솔루션을 제공한다10.
최적의 결과를 얻으려면 다음 단계도 중요합니다. (i) 소포 크기는 SLB 형성31,32에 중요합니다. 이전 문헌은 소산 (QCM-D) 테스트32를 사용하여 더 큰 크기의 결정 마이크로 저울을 사용하여 더 큰 크기에 비해 더 작은 크기의 소포 (< 90 nm)에 대한 더 높은 융합 성향을 보여줍니다. 따라서 300nm의 LUV와 비교하여 ~ 50nm의 직경은 SLB 형성에 더 쉽습니다. 이 문제를 고려할 때 SLB 형성을 위한 균질한 SUV를 형성하기 위해 동결-해동 및 압출 단계 모두에서 최소 20회가 필요합니다. FRAP 테스트는 멤브레인 이동성을 검증하기 위해 모든 실험에서 필요합니다. (ii) SUV를 준비하는 동안 먼지와 같은 작은 입자의 오염을 피하기 위해 모든 장비를 깨끗하게 유지해야합니다. 특히 미니 압출기의 경우 바늘이 더러운 환경에서 쉽게 막힙니다. (iii) 양질의 SUV를 제조하려면 지질 소포가 파괴되지 않도록 지질 혼합물의 클로로포름을 완전히 제거해야합니다. (iv) 연속 이중층을 형성하기 위해 효율적인 SUV 파손을 위해 높은 친수성 표면을 보장하기 위해 SLB 형성 전에 칩의 플라즈마 세정을 새로 수행해야 합니다. 플라즈마 처리 후 환경에 장기간 노출되면 먼지 입자 또는 유기 잔류 물이 칩 표면에 비특이적으로 결합하여 표면의 친수성을 손상시킬 수 있습니다. (v) SLB 형성 및 단백질 배양을 위해 PDMS 챔버를 조립하려면 유체 채널의 우수한 밀봉을 보장하기 위해 각 PDMS 조각의 청결성과 평탄도가 중요합니다. 챔버가 누출되면 SLB가 건조되거나 단백질 농도가 변할 수 있습니다. (vi) 나노바(600nm)의 높이가 z축(33)에서 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 초점 깊이와 비슷하기 때문에 일관된 강도 측정을 보장하기 위해 이미징 초점 조정이 중요합니다. 어레이가 수평으로 이동할 때마다 초점을 다시 조정하여 이미지에서 나노 바 가장자리의 선명도를 유지해야합니다.
무엇보다도 여기에 소개된 나노바-SLB 시스템은 막 곡률 감지 단백질을 연구하는 강력한 방법을 제공합니다. 곡곡 막과의 단백질 상호작용에 영향을 미치는 다양한 파라미터는 단백질의 곡률 민감성 도메인 (예를 들어, BAR 도메인 및 양친매성 나선)8,30, 막의 지질 조성 (예를 들어, PS 및 PIP2)27,34, pH, 이온 강도 및 환경의 온도35,36과 같은 곡률의 범위에 걸쳐 정량적으로 연구될 수 있다. , 복합체 형성을 위한 단백질-단백질 상호작용(예: CHMP2B 및 CHMP2A는 ESCRT-III-촉매 막 리모델링 공정에 다르게 기여할 수 있음)37,38. 동적 연구는 또한 나노 바 -SLB 시스템을 사용하여 막 결합 동역학 (11), 막 단백질 확산 또는 조립 (39), 효소 반응 (40) 또는 상 분리 행동(13,41,42)을 프로브하기 위해 수행 될 수있다. 또한, 인공 지질 이중층은 일반적으로 동일한 지질 조성을 함유하는 각각의 지질 단층과 대칭으로 간주되며, 이는 생세포막(43)과는 상당히 상이하다. 원형질막을 더 잘 모방하기 위해 비대칭 이중층을 유도하는 것은 표면의 물질, 완충액 조건, 지질 조성, 또는 온도44,45,46,47을 변경함으로써 얻을 수 있다. 곡선 막의 단백질 거동을 연구하기 위해 나노바-SLB 시스템에 비대칭 이중층을 형성할 수 있는지 여부를 확인하는 것은 매우 가치가 있으며, 이는 추가 연구가 필요합니다.
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Disclosures
저자는이 작업에 대해 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
나노 구조 제조 및 SEM 이미징을 지원하는 난양 기술 대학교 (NTU)의 난양 나노 제조 센터 (N2FC)와 파괴 광자 기술 센터 (CDPT), 단백질 정제를위한 생명 과학 학교 NTU의 단백질 생산 플랫폼 (PPP), 컨포칼 현미경을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU에 감사드립니다. 이 연구는 싱가포르 교육부(MOE)(W. Zhao, RG112/20, RG95/21 및 MOE-T2EP30220-0009), 디지털 분자 분석 및 과학 연구소(IDMxS)가 자금을 지원합니다. 우수 연구 센터 제도(W. Zhao), 휴먼 프론티어 과학 프로그램 재단(W. Zhao, RGY0088/2021), NTU 스타트업 보조금(W. Zhao), 연구 장학금을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU (X. Miao), 연구 장학금을위한 중국 장학금위원회 (J. Wu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
References
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- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
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