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Bioengineering

Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Abstract

Sem dúvida, a microscopia de força atômica (AFM) é atualmente uma das técnicas mais poderosas e úteis para avaliar micro e até mesmo nanopistas no campo biológico. No entanto, como em qualquer outra abordagem microscópica, desafios metodológicos podem surgir. Em particular, as características da amostra, a preparação da amostra, o tipo de instrumento e a sonda de recuo podem levar a artefatos indesejados. Neste protocolo, exemplificamos essas questões emergentes em explantes de cartilagem articular saudável e osteoartrítica. Para isso, primeiramente mostramos, por meio de uma abordagem passo a passo, como gerar, graduar e classificar visualmente discos de cartilagem articular ex vivo de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens de fluorescência em mosaico 2D de todo o tecido explante. A maior força do modelo ex vivo é que ele compreende cartilagem humana envelhecida, nativa, que permite a investigação de alterações relacionadas à osteoartrite desde o início precoce até a progressão. Além disso, armadilhas comuns na preparação tecidual, bem como o procedimento real de AFM juntamente com a análise subsequente dos dados, também são apresentados. Mostramos como etapas básicas, mas cruciais, como preparação e processamento de amostras, características topográficas de amostras causadas por degeneração avançada e interação amostra-ponta podem afetar a aquisição de dados. Também submetemos ao escrutínio os problemas mais comuns no AFM e descrevemos, sempre que possível, como superá-los. O conhecimento dessas limitações é de extrema importância para a correta aquisição, interpretação e, em última análise, incorporação dos achados em um amplo contexto científico.

Introduction

Devido ao tamanho cada vez menor dos dispositivos e sistemas eletrônicos, o rápido desenvolvimento de tecnologia e equipamentos baseados em micro e nano ganhou impulso. Um desses dispositivos é a microscopia de força atômica (AFM), que pode escanear superfícies biológicas e recuperar informações topográficas ou biomecânicas em escalas nano e micrométricas 1,2. Dentre suas vastas características, essa ferramenta pode ser operada tanto como micro quanto como nano-indenter para obter informações sobre as propriedades mecânicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Os dados são coletados pelo contato físico com a superfície através de uma sonda mecânica, que pode ser tão pequena quanto cerca de 1 nm em sua ponta7. A deformação resultante da amostra é então exibida com base na profundidade de indentação da ponta do cantilever e na força aplicada na amostra8.

A osteoartrite (OA) é uma doença crônica degenerativa de longa duração caracterizada pela deterioração da cartilagem articular nas articulações e tecidos circundantes, que pode levar à exposição completa das superfícies ósseas. O peso dos AT é substancial; atualmente, metade das mulheres e um terço de todos os homens com 65 anos ou mais sofrem de OA9. Traumas, obesidade e a consequente alteração biomecânica da articulação10 determinam a degeneração da cartilagem articular, que é vista como um resultado final comum. O estudo pioneiro de Ganz e col. postula que os passos iniciais do processo de OA podem envolver as propriedades biomecânicas da cartilagem11 e, desde então, pesquisadores têm confirmado essa hipótese12. Da mesma forma, é geralmente aceito que as propriedades biomecânicas do tecido são funcionalmente orquestradas pela organização ultraestrutural, bem como pelo crosstalk célula-célula e célula-matriz. Qualquer alteração pode afetar drasticamente o funcionamento biomecânico tecidual como um todo13. Até o momento, o diagnóstico da OA é clínico e baseado em radiografias simples14. Essa abordagem é bilateral: em primeiro lugar, a falta de um limiar de corte degenerativo definido para formular o diagnóstico de OA torna a condição difícil de quantificar e, em segundo lugar, os métodos de imagem carecem de sensibilidade e padronização e não conseguem detectar dano localizado da cartilagem15,16,17. Para tanto, a avaliação das propriedades mecânicas da cartilagem tem a vantagem decisiva de descrever um parâmetro que se modifica durante o curso da OA, independentemente da etiologia da doença, e tem influência direta na funcionalidade tecidual em estágio muito precoce. Os instrumentos de indentação medem a força pela qual o tecido resiste à indentação. Este não é, de facto, um conceito novo; Os primeiros estudos datam das décadas de 1980 e 1990. Nesse período, numerosos estudos sugeriram que instrumentos de indentação projetados para as medidas artroscópicas da cartilagem articular poderiam ser bem adequados para detectar alterações degenerativas na cartilagem. Há 30 anos, alguns estudos conseguiram demonstrar que instrumentos de indentação eram capazes de detectar in vivo alterações na superfície da cartilagem durante a degeneração tecidual, realizando medidas de rigidez compressiva durante a artroscopia18,19,20.

A indentação de AFM (AFM-IT) da cartilagem articular fornece informações sobre uma propriedade mecânica fundamental do tecido, a rigidez. Trata-se de um parâmetro mecânico que descreve a relação entre uma carga aplicada não destrutiva e a deformação resultante da área de tecido recuada21. O AMO-TI mostrou-se capaz de quantificar modificações idade-dependentes na rigidez em redes de colágeno macroscopicamente não afetadas, diferenciando as alterações patológicas associadas ao aparecimento da OA (grau 0 na escala de Outerbridge na cartilagem articular)22. Nós mostramos anteriormente que AFM-ITs, com base na organização espacial dos condrócitos como um biomarcador baseado em imagem para a degeneração precoce da cartilagem, permitem não apenas quantificar, mas também identificar as alterações mecânicas degenerativas mais precoces. Esses achados já foram confirmados por outros23,24. Assim, o AFM-IT atua como uma ferramenta interessante para diagnosticar e identificar alterações degenerativas precoces. Essas alterações já podem ser medidas em nível celular, remodelando a compreensão do processo fisiopatológico da OA.

Neste protocolo, demonstramos um completo procedimento de graduação histológica e biomecânica dos explantes da cartilagem articular, desde o preparo dos explantes da cartilagem nativa até a aquisição e processamento dos dados de MFA. Através de uma abordagem passo a passo, mostramos como gerar, graduar e classificar visualmente o tecido cartilaginoso articular de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens 2D de mosaico grande, seguidas de micro-AFM.

Embora atualmente o AFM-IT seja uma das ferramentas mais sensíveis para mensurar alterações biomecânicas nacartilagem7, como qualquer outra técnica instrumental, apresenta limitações e peculiaridadespráticas25 que podem levar à aquisição errônea de dados. Para tanto, submetemos ao exame os problemas mais comuns que surgem durante as medidas de MFA dos explantes cartilaginosos e descrevemos, sempre que possível, como minimizá-los ou superá-los. Estes incluem aspectos topográficos das amostras e as dificuldades para estabilizá-las em um ambiente compatível com AFM, peculiaridades físicas da superfície do tecido e as dificuldades resultantes na realização de medidas de AFM nessas superfícies. Exemplos de curvas força-distância errôneas também são apresentados, enfatizando as condições que podem ocasioná-las. Limitações adicionais inerentes à geometria da ponta do cantilever e ao uso do modelo de Hertz para a análise dos dados também são discutidas.

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Protocol

Foram utilizados côndilos femorais coletados de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho no Hospital Universitário de Tübingen, Alemanha. Apenas amostras de cartilagem articular de pacientes com patologias articulares degenerativas e pós-traumáticas foram incluídas neste estudo. Antes do início do estudo, foram obtidas aprovações departamentais, institucionais e de comitês de ética locais (Projeto nº 674/2016BO2). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação.

NOTA: Um fluxograma das etapas do experimento em sua ordem cronológica é dado na Figura 1.

1. Processamento tecidual e geração de discos cartilaginosos

  1. Preparo de tecidos
    1. Após a ressecção pós-operatória, colocar as amostras de cartilagem em um recipiente preenchido com meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com penicilina-estreptomicina a 5% (v/v). Certifique-se de que as amostras estão completamente submersas no meio. A duração entre a ressecção cirúrgica e o processamento posterior da cartilagem não deve exceder 24 horas. Certifique-se de que, durante todo o processamento, as amostras estejam totalmente submersas em meios para evitar a secagem das amostras.
    2. Corte a cartilagem longe do osso usando um bisturi.
  2. Geração de disco de cartilagem
    1. Gere discos de cartilagem de 4 mm de diâmetro usando um punch de biópsia.
      OBS: É importante selecionar e ressaltar as áreas do côndilo onde a espessura da camada cartilaginosa excede 1 mm. Isso pode ser problemático, especialmente ao redor de zonas de suporte de carga, onde a camada de cartilagem normalmente perde sua espessura devido a processos de desgaste ou degeneração.
    2. Coloque os discos de cartilagem de 4 mm gerados anteriormente em um dispositivo de corte feito sob medida e fixe e mantenha os discos de cartilagem estáveis por meio de uma espátula. Ao colocar os discos de cartilagem no dispositivo de corte, deve-se tomar cuidado. Posicione as amostras de modo que a camada mais superficial da cartilagem (a zona superficial da cartilagem articular) não fique voltada para a lâmina
    3. Corte os discos de cartilagem com uma lâmina de barbear. Amostras de cartilagem em forma de disco de 4 mm x 1 mm são, assim, geradas. Para evitar o ressecamento da amostra, realize o corte do tecido o mais rápido possível.
    4. Coletar cada disco com a ajuda de uma espátula e colocar os discos de cartilagem gerados em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de DMEM suplementado com 5% (v/v) de penicilina-estreptomicina. Coloque aproximadamente 15 discos em um tubo.
  3. Secção criótomo dos discos de cartilagem (para cortes perpendiculares)
    NOTA: Esta etapa é opcional e pode ser empregada se uma visualização lateral da distribuição do padrão celular dentro dos discos de cartilagem for desejada. Pode ser utilizado como método de verificação, uma vez que a distribuição do padrão celular é uma característica 3D da cartilagemarticular26. Cortes ópticos e reconstruções 3D de todos os discos cartilaginosos com microscópio confocal também podem ser utilizados, afastando-se, assim, a necessidade de seccionar as amostras conforme descrito no protocolo.
    1. Cubra o disco de cartilagem com meio de incorporação solúvel em água e coloque-o em sua borda no botão do criótomo (com a superfície do disco perpendicular à superfície do botão). No dispositivo criótomo, o meio de incorporação congela a baixas temperaturas.
    2. Usando um criótomo padrão, seccione o tecido lateralmente a uma espessura de 60 μm até atingir o meio do disco (ou seja, quando as criossecções atingirem um comprimento de 4 mm) e colete os cortes. Seccionando-se o explante discal perpendicularmente, todas as zonas da cartilagem (superficial, média e profunda) podem ser visualizadas.
    3. Recolher as secções numa lâmina de vidro e remover o meio de incorporação solúvel em água lavando três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).

2. Triagem do disco cartilaginoso em função do padrão espacial celular

  1. Coloração das amostras de cartilagem em forma de disco
    1. Colocar um disco de cartilagem (secção 1.2) em cada poço de uma placa de 96 poços e adicionar 130 μL de corante de fluorescência permeável às células numa diluição de 1:1.000 em cada poço.
    2. Inspecione visualmente toda a placa e certifique-se de que apenas um disco seja colocado em cada poço. Incubar a placa durante 30 minutos na incubadora de cultura celular padrão a 37 °C.
  2. Coloração dos cortes de cartilagem de 60 μm
    1. Coloque suavemente as secções do disco de cartilagem (secção 1.3) em lâminas de microscópio de vidro com a ajuda de pinças.
    2. Cubra as seções de cartilagem com meio de montagem contendo contracoloração nuclear DAPI e coloque suavemente lamínulas adequadas para microscopia de fluorescência.
    3. Sele as bordas de cada lamínula com esmalte transparente regular e deixe secar por 3 min.
  3. Classificação e imagem de cartilagem de cima para baixo e de visão lateral
    NOTA: Cada disco deve ser examinado sob um microscópio fluorescente. O objetivo desta etapa é classificar os discos com base em seu padrão celular predominante (cadeias simples, cordas duplas, pequenos agrupamentos, grandes aglomerados ou difusos).
    1. Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa do microscópio de fluorescência.
    2. Seleccionar o filtro de fluorescência adequado de Em 495 nm/Ex 515 nm (para imagens descendentes dos discos de cartilagem preparadas no ponto 2.1.) ou Em 358 nm/Ex 461 nm (para imagens laterais dos cortes de cartilagem preparados no ponto 2.2) e a objetiva de 10x.
      NOTA: O uso da objetiva 10x permite que toda a circunferência do disco seja inspecionada, e amostras com coloração não homogênea ou inadequada podem ser excluídas. No entanto, o uso apenas da visão top-down pode resultar na percepção de mudanças na organização celular como resultado da análise das camadas teciduais mais profundas tornadas visíveis para observação de cima para baixo por erosão superficial. Como exemplo, uma corda ascendente seguindo as arcadas do colágeno poderia ser percebida como uma única célula ou células dispersas (padrão difuso)26. Como resultado, ambos os lados dos discos devem ser inspecionados para garantir a seleção adequada do padrão celular.
    3. Determinar visualmente o padrão celular exibido em cada disco de cartilagem. É improvável que um disco tenha apenas um tipo de padrão celular. Para a parte do disco em que a disposição dos condrócitos não corresponde ao padrão de interesse, só aceite as amostras se o padrão indesejado estiver na periferia, onde não estão a ser efectuadas medições de AFM (ou seja, até 0,5 mm da borda do disco), e certifique-se de que esta não exceda 10% da superfície total do disco27, 28º.
  4. Aquisição de imagens de todos os discos de cartilagem
    1. Selecionar a objetiva de 10x do microscópio e posicioná-la abaixo do poço pré-selecionado contendo um disco de cartilagem individual. Concentre-se no disco para ver o padrão celular.
    2. Selecione a função Navegador para obter uma visão geral de todo o poço. Use o botão esquerdo do mouse e arraste para navegar até uma posição de palco diferente. Com a roda do mouse, aumente e diminua o zoom.
      NOTA: Neste ponto, uma visualização do poço com toda a amostra pode ser vista clicando duas vezes em cada área de interesse sequencialmente.
    3. Selecione um quadrado que englobe a área de interesse a ser digitalizada; Neste ponto, todos os azulejos individuais que compõem o mosaico se tornarão visíveis.
    4. Ajuste a exposição/intensidade da luz para que as células possam ser claramente visualizadas a partir do fundo. Neste ponto, o brilho/contraste da imagem foi ajustado para todos os blocos e não pode mais ser personalizado individualmente para cada bloco.
      NOTA: Como as células próximas à borda do disco geralmente emitem um sinal de fluorescência mais alto do que as células no centro, as configurações de exposição/intensidade de luz devem ser adaptadas.
      1. Para avaliar se o tempo de exposição é apropriado para um determinado canal, examine a distribuição do sinal no histograma. Usando o mecanismo de exposição automática incluído no software de imagem do microscópio, visualize todas as células que residem dentro do disco.
    5. Selecione a opção Ponto de Mapa de Foco do software e, em seguida, selecione cada bloco individual clicando com o botão esquerdo do mouse no centro dele.
    6. Selecione a opção Mapa de Foco. Uma janela é exibida com todos os blocos selecionados anteriormente. Clique duas vezes em um bloco na lista para exibi-lo e colocá-lo em foco adequado.
    7. Clique em Definir Z para salvar o plano focal e prosseguir para o próximo bloco. Depois de ajustar o plano focal para cada bloco individual, comece a aquisição de imagens pressionando Start Scan.
      1. Se a varredura estiver exibindo barras horizontais e/ou verticais mais escuras, isso pode ser devido à iluminação inadequada e irregular dos quadros individuais. Resolva isso usando a opção Sombreamento vinculado incorporada ao software antes da verificação real.
    8. Salve, exporte e anote corretamente as imagens.

3. Abordagem biomecânica dos explantes cartilaginosos

  1. Preparação de amostras para medições de AFM
    1. Fixar cada disco de cartilagem pré-selecionado contendo um padrão celular (secção 2) em placas de Petri através de cola biocompatível. Adicione cola de amostra suficiente nos lados superior, inferior, esquerdo e direito do disco.
    2. Cobrir os discos com 2,5 mL de meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina. Adicionar o meio de Leibowitz suavemente sobre as amostras para evitar o desprendimento da amostra da superfície devido às ondas criadas pelo meio.
  2. Carregamento das amostras no AFM
    1. Posicione a placa de Petri no porta-amostras do dispositivo AFM e ligue o aquecedor de placa de Petri regulado para 37 °C. Permitir que a placa de cultura de tecidos atinja a temperatura desejada. Isso é feito para excluir possíveis artefatos causados pela variação de temperatura.
  3. Calibração AFM-cantilever
    1. Inicialize a configuração do software conforme descrito anteriormente por Danalache et al.29.
    2. Selecione um suporte de cantilever de bloco de vidro adequado para medições de líquidos e coloque-o cuidadosamente na cabeça do AFM. Um mecanismo de travamento prende o bloco de vidro na cabeça do AFM. Certifique-se de que a superfície refletiva do bloco de vidro esteja reta e paralela ao suporte AFM.
    3. Coloque o cantilever na superfície do suporte de cantilever de bloco de vidro com cuidado. O próprio cantilever deve repousar no plano óptico polido, no centro do bloco de vidro.
    4. Coloque cuidadosamente uma saia de silicone (membrana de silicone) na base do suporte do cantiléver, a fim de evitar a condensação média na cabeça do AFM.
    5. Abaixe o cantilever em passos de 100 μm usando a função do motor de passo até que ele esteja completamente submerso no meio.
    6. Execute uma abordagem de scanner com os parâmetros de abordagem descritos por Danalache et al.29. Retraia o cantilever em 100 μm assim que o fundo da placa de Petri for atingido.
    7. Calibrar o cantilever usando os passos exatos e executar os parâmetros descritos por Danalache et al.29. Ao final da calibração, a deflexão vertical é salva e exibida em unidades de força newton (N) em vez de volts (V) - a unidade do registro original pelo detector de fotodiodo. Nos experimentos aqui apresentados, um set point de 4,47 nN resultou após a calibração.
    8. Usando a função do motor de passo, retraia o cantilever para 1.000 μm.
  4. Identificação do local de mensuração da cartilagem desejada sob o AFM
    NOTA: Devido à espessura de 1 mm dos discos de cartilagem, o cantilever não é visível no campo de visão durante a navegação sobre a amostra.
    1. Use a câmera CCD do microscópio para identificar o cantilever. O cantilever AFM deve ser posicionado em uma área livre de amostras da placa de Petri.
    2. Inicie uma abordagem de scanner com o cantilever em uma área limpa e livre de amostras da placa de Petri, usando os mesmos parâmetros descritos por Danalache et al.29.
    3. Retraia ainda mais o cantilever a 1,5 mm de distância do fundo da placa com o controle do motor de passo. Esta etapa é crucial para evitar uma colisão direta entre o cantilever e a amostra.
    4. Alterne da visualização de campo brilhante para a visualização de fluorescência e identifique visualmente a parte superior do disco.
    5. Mova o suporte de amostra AFM exatamente 2 mm em direção ao meio do disco. Este ponto é considerado o centro do disco cartilaginoso.
    6. Execute uma abordagem de scanner e, uma vez atingida a superfície do disco de cartilagem, retraia o cantilever em 100 μm.
  5. Medidas da curva força-distância
    1. Concentre-se nas células posicionadas no local de medição desejado. Clique no botão Executar para iniciar as medições e a geração de curvas de força-distância na posição de destino.
    2. Adquira cinco curvas força-distância em cada local de medição. Retrair o cantilever em 500 μm e mover o cantilever para o próximo local de medição.
      OBS: A retração do cantilever é um passo crucial, pois a superfície do disco cartilaginoso não é homogênea e apresenta irregularidades. Uma colina alta na superfície da amostra pode resultar em uma colisão dramática, levando a danos indesejados na ponta/amostra do cantiléver. Recomendamos selecionar um mínimo de cinco locais de medição diferentes dispersos pela superfície do disco e adquirir um mínimo de cinco curvas força-distância em cada local.
    3. Inspecione as curvas força-distância e salve-as.
  6. Estimação dos módulos de Young pelo modelo de ajuste de Hertz
    1. Abra as curvas de força-distância geradas a serem analisadas (arquivo .jpk) no software de análise de dados usando a opção Abrir um lote de curvas de espectroscopia .
    2. Selecione o modelo de ajuste Hertz e, em seguida, selecione a opção Ajuste de elasticidade .
      1. A opção de ajuste de elasticidade executa automaticamente os seguintes cálculos na curva de força-distância selecionada: calcula a linha de base e subtrai toda a curva para remover o deslocamento da linha de base (a linha de base é trazida de volta a zero no eixo y); determina o ponto de contacto detectando o ponto onde a curva força-distância cruza a linha de força zero (o ponto de contacto é definido como zero no eixo x); calcula a separação ponta-amostra (o sinal de altura do piezo que representa a flexão do cantilever é subtraído); e ajusta a curva força-distância automaticamente com o modelo selecionado. Se desejar, cada uma dessas etapas também pode ser realizada de forma independente.
    3. Adapte usando os seguintes parâmetros de ajuste: razão de Poisson de 0,5 e o raio apropriado da ponta do cantiléver.
      NOTA: Ao usar um cantilever com uma ponta de cantilever esférico, o modelo de ajuste Hertz deve ser usado. O cantilever utilizado neste estudo possuía ponta esférica com raio de 5 μm. Recomendamos o ajuste da curva força-distância até atingir a força máxima aplicada (setpoint).
    4. Verifique visualmente o ajuste da curva força-distância para garantir a correção. Essa etapa deve ser feita para cada uma das curvas força-distância analisadas.
  7. Determinação da profundidade de recuo
    Observação : dependendo da ferramenta de análise de dados que está sendo usada, esse processo pode ser diferente. O experimentador pode facilmente ler a profundidade de recuo seguindo uma série de etapas incluídas no programa de análise de dados.
    1. Abra cada uma das curvas de força-distância geradas no software de análise de dados e selecione o Modelo de ajuste de Hertz como processo de análise.
    2. Aplique a opção Subtrair Deslocamento da Linha de Base para zerar o eixo de deflexão vertical (eixo y) e selecione a função Deslocamento + Inclinação .
    3. Use a função Localizar ponto de contato para identificar automaticamente o ponto de contato , que é automaticamente levado a uma coordenada x de zero.
    4. Subtraia a distância que representa apenas a deflexão do cantilever da altura bruta do piezo durante o recuo usando a função Posição da Ponta Vertical .
    5. Selecione a opção Ajuste de elasticidade para exibir a curva de força-distância processada e selecione a área do gráfico para que ele se alinhe com o valor mais negativo no Eixo de Posição da Ponta Vertical (eixo x).
    6. Leia e documente o recuo da caixa X Min na guia parâmetro. Salve e documente os resultados.

4. Análise estatística

  1. Abra o software estatístico. Selecione Novo Conjunto de Dados no menu suspenso.
  2. Abra a guia Exibição de variável depois de selecionar o arquivo DataSet . Defina as variáveis numéricas para cada categoria de padrão celular: cadeias simples = SS, cadeias duplas = DS, pequenos clusters = SC, grandes clusters = BC, difusos e os módulos de Young.
  3. Na guia de exibição de dados, insira os dados de módulos de Young medidos para cada uma das categorias de padrão celular correspondentes. Analise a distribuição de dados selecionando Analisar na barra de menus e, em seguida, Análise Exploratória de Dados.
  4. Selecione Módulos de Young como variável dependente e Padrão Celular como a lista de fatores. Um gráfico de caixa usado para a seção de resultados é exibido entre os resultados no arquivo de saída.
  5. Para realizar uma análise estatística, escolha Amostras dependentes na seção de teste não paramétrico da guia da barra de menus de análise. Selecione Módulos de Young como Campos de Teste e Padrão Celular como Grupos na guia Campos.
    Observação : os resultados são exibidos no arquivo de saída. Para a análise estatística, é realizado o teste de Friedman.
  6. Incorpore os valores de p do teste não paramétrico no gráfico de caixa criado na etapa 4.4. Salve os resultados clicando em Arquivo na barra de menus e selecionando Salvar.

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Representative Results

Usando um dispositivo de corte de fabricação própria, foi possível explantar e gerar discos de cartilagem pequenos (4 mm x 1 mm) a partir de côndilos humanos frescos contendo um padrão espacial celular único30 de cordas simples (SS, Figura 2A), cordas duplas (DS), pequenos aglomerados (SC), grandes aglomerados (BC; Figura 2A) e difusa (Figura 2B). Um explante representativo da cartilagem está representado na Figura 3A. A seleção dos discos com apenas um tipo de padrão foi feita por meio de imagens de fluorescência de cima para baixo (Figura 2). A variação topográfica do disco de superfície da cartilagem foi ilustrada por imagens laterais de cortes de 60 μm de espessura gerados a partir dos discos cartilaginosos (Figura 2C). Na superfície dos discos de cartilagem osteoartrítica explantados, fibrilação superficial e fissura da matriz estavam presentes (Figura 3B,C). Isso foi particularmente notável nos discos representativos da progressão avançada da OA - representada pela presença de CB (Figura 2A). Após a classificação pós-fluorescência, a rigidez dos discos foi avaliada por micro-indentações de AFM. Para tanto, os discos de cartilagem gerados foram fixados com sucesso na placa de Petri AFM por meio de cola biocompatível (Figura 3D) para evitar a deriva da amostra durante as medidas (Figura 3E). A quantidade de cola utilizada tem de ser ajustada. Uma quantidade insuficiente de cola resultará em instabilidade do disco, enquanto adicionar muita cola pode levar a uma propagação indesejada da cola sob e/ou sobre o disco de cartilagem. Este último leva a artefatos de medição e má identificação do disco ao microscópio de fluorescência. A aplicação inadequada de cola ou movimentos bruscos da amostra durante a fixação são problemas frequentes que fazem com que o tecido se desprenda da placa de Petri e devem ser evitados.

Uma redução gradual representativa da rigidez ao lado do arranjo do padrão celular é mostrada na Figura 4A. Os valores de rigidez foram maiores nos discos contendo SS (mediana de 2,6 kPa) - representativos de áreas de cartilagem não comprometidas. Com o início e progressão da OA, as medidas de MFA mostraram uma forte diminuição gradual da rigidez de 42% no SD (1,5 kPa), 77% no SC (0,6 kPa) e, finalmente, 88% nos estágios avançados representados pelo BC (0,3 kPa; Figura 4A). Os discos contendo padrão difuso apresentaram elevada elasticidade com importante variação dos valores simples do módulo de elasticidade. Para todos os discos de cartilagem com organização do padrão celular predominante, a profundidade de indentação associada ao setpoint empregado (4,477 nN) mostrou-se inversamente proporcional à rigidez (Figura 4B). Uma curva de força-distância gerada representativa é mostrada na Figura 4C, e um ajuste de Hertz, bem como a identificação do ponto de contato é mostrado na Figura 4D.

O ajuste correto depende, entre outros fatores, da determinação correta da linha de base. Se a detecção automática da linha de base estiver errada (por exemplo, devido a uma linha de base turbulenta), o ajuste também pode ser determinado manualmente e permite que o usuário selecione uma linha de base mais representativa para as medições. No entanto, se a curva força-distância gerada não permitir um ajuste adequado, ela deve ser descartada. A Figura 5 mostra exemplos de curvas força-distância incorretas. A geração de curvas força-distância adequadas em explantes osteoartríticos de cartilagem articular pode ser difícil devido à superfície irregular do tecido, por um lado (exemplos são mostrados na Figura 5A,B), e à instabilidade da amostra causada pela fixação inadequada da amostra (exemplos mostrados na Figura 5C,D). Os artefatos podem ser causados por múltiplos pontos de contato sonda-amostra (devido à superfície irregular da cartilagem degenerada) ou movimento tecidual indesejado (visível através de alterações no plano focal). Esses artefatos podem ser vistos nas curvas de força-distância geradas e são indicativos de um contato subótimo entre o cantilever AFM e a superfície da cartilagem ou fixação inadequada da amostra na placa de Petri (ver Figura 5A-D).

Figure 1
Figura 1: Fluxograma do procedimento experimental. Resumo das etapas experimentais em ordem cronológica, desde amostras de cartilagem ressecadas no intraoperatório até a geração de discos cartilaginosos de 4 mm x 1 mm, coloração por fluorescência e classificação dos discos com base na organização do padrão celular por meio de imagens top-down e side-view e, finalmente, avaliação da elasticidade por meio de medidas de força atômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem de fluorescência dos discos representativos da cartilagem. (A) Imagens em mosaico 2D e um campo exemplar ampliado de discos de cartilagem corados com corante permeável à membrana celular em aumento de 100x. O disco superior exibe um disco de cadeias de caracteres simples representativo, enquanto o inferior é representativo de um grande disco de cluster (inferior). (B) Imagem em mosaico de um disco de padrão difuso visto da superfície (acima), e o mesmo disco fotografado da parte inferior (inferior). (C) Vista lateral da coloração nuclear de cortes de 60 μm de discos cartilaginosos. A barra de escala branca representa 500 μm para as figuras em mosaico (campo de visão maior, A [painel esquerdo], B, C) e 100 μm para as imagens ampliadas e focadas (A [painel direito]). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Discos de cartilagem articular explantados. (A) Imagem representativa de um explante de disco de cartilagem 4mm x 1mm gerado a partir de cartilagem articular humana fresca. A barra de escala representada em branco representa 2mm. (B) Imagem representativa da cartilagem osteoartrítica nativa onde a superfície do tecido apresenta fibrilação superficial e fenda macroscopicamente visíveis. A barra de escala representada em branco representa 1.000 mm. (C) Representação esquemática da superfície da cartilagem fibrilada. (D) Antes das medições do AFM, cada um dos explantes do disco de cartilagem foi devidamente fixado por meio de cola de amostra biocompatível na superfície da placa de Petri do AFM para evitar artefatos devido à deriva da amostra durante as medições reais de indentação, conforme mostrado em (E). A barra de escala branca representa 4 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos das medidas de microscopia de força atômica dos discos de cartilagem articular classificados com base em sua organização predominante do padrão celular. (A) Boxplot mostrando a mediana dos módulos de Young computados de cinco discos, um para cada padrão celular, originados de um paciente. Um total de 25 medidas foram realizadas em cada disco (cinco medidas para cinco locais de medição distintos). A linha preta dentro do retângulo representa o valor mediano, os membros inferiores e superiores do retângulo representam o primeiro e terceiro quartis, respectivamente, e as barras de erro representam os menores e maiores valores para cada grupo. (B) Gráfico de pontos representando os 125 pontos de profundidade de recuo para cada padrão celular. (C) Curvas de força-distância exemplares adquiridas com o AFM com módulo de Young calculado de 0,4 kPa. (D) Determinação representativa do ajuste de Hertz e do ponto de contato para a curva força-distância mostrada em (C). O eixo x exibe a posição vertical da ponta (que é a distância cruzada pelo piezo, com o comprimento representando a flexão do cantiléver sendo subtraído automaticamente da parte de contato da curva força-distância). *p < 0,05. Para análise estatística, foi utilizado o teste de Friedman. Abreviações: SS = cadeias simples; DS = cordas duplas; CS = pequenos aglomerados; BC = grandes aglomerados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Exemplos de curvas de força-distância errôneas . (A) A curva força-distância mostra um desvio maciço seguido de recuperação próximo ao nível basal antes que um recuo contínuo da superfície seja observado. Esse fenômeno pode ser atribuído a um obstáculo relativamente grande (por exemplo, grandes fendas superficiais que se projetam da camada mais superficial da cartilagem). (B) A curva força-distância estendida mostra múltiplos pequenos picos. Acredita-se que essas curvas sejam causadas por irregularidades em microescala na superfície da cartilagem (por exemplo, fibrilação). Tanto (C) quanto (D) apresentam curvas força-distância com trajetos bifásicos. Ambas as curvas força-distância são representativas da má fixação da amostra e da deriva da amostra. Também é bastante comum nesses casos ver uma mudança repentina no plano focal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Como doença progressiva e multifatorial, a OA desencadeia alterações estruturais e funcionais da cartilagem articular. Ao longo do curso da OA, o comprometimento das características mecânicas é acompanhado por alterações estruturais e bioquímicas na superfície da cartilagem articular 27,31. Os eventos patológicos mais precoces que ocorrem na OA são a depleção de proteoglicanos associada à ruptura da rede de colágeno32,33,34. Essas mudanças iniciais sutis na superfície são difíceis de identificar e identificar com testes em massa, porque o comportamento mecânico é medido em toda a profundidade do tecido. Além disso, uma questão ainda não abordada é se as alterações funcionais em nível de órgão e tecido estão relacionadas a mudanças estruturais e funcionais em micro ou nanoescala. Para tanto, a MFA é considerada um dos métodos mais sensíveis, capaz de detectar as alterações biomecânicas mais precoces que ocorrem com o aparecimento da OA7. Permite medidas de rigidez em escala micro e nanométrica em amostras nativas, fornecendo informações sobre as propriedades mecânicas da cartilagem articular35,36. Neste protocolo, utilizando micro-AFM, medimos as propriedades elásticas de explantes humanos de cartilagem articular sã e osteoartrítica. Os resultados mostraram que os explantes de cartilagem são altamente representativos de eventos locais precoces de OA, com uma notável diminuição gradual da rigidez ocorrendo em explantes de cartilagem padrão-específicos. Além disso, os resultados estão de acordo com pesquisas publicadas anteriormente que mostraram uma notável diminuição da rigidez ao lado da organização do padrão celular23,24,27,37.

Modelos humanos nativos corroborados que mimetizam vários aspectos da patogênese e progressão da OA são atualmente necessários para abordar as deficiências da pesquisa translacional e os desafios de traduzir dados in vitro para um ambiente clínico. Até o momento, nenhum modelo pode representar com precisão o complexo compartimento cartilaginoso humano nativo, muito menos os tecidos articulares relacionados à idade que são propensos à OA em resposta a estímulos de iniciação da doença38. Os modelos baseados em explantes mais utilizados até o momento eram de origem bovina ou bovina e aplicavam um forte tratamento com citocinas inflamatórias ou carga mecânica 39,40,41. Este protocolo, por outro lado, demonstra como gerar pequenas amostras de cartilagem humana explantada em forma de disco (4 mm x 1 mm), que são indicativas dos estágios individuais de eventos específicos de OA. Os explantes cartilaginosos são classificados e atribuídos de estágio utilizando a organização espacial celular como biomarcador baseado em imagem30,42. Uma vez que alterações precoces nas propriedades biomecânicas já podem ser identificadas e quantificadas assim que as cordas duplas começam asurgir23,27, em uma fase em que a superfície da cartilagem ainda aparece macroscopicamente intacta26, este modelo baseado em explantes permite a investigação de um compartimento cartilaginoso nativo local e pode fornecer informações perspicazes sobre a OA precoce. Além disso, este modelo de cartilagem pode ser útil na investigação da resposta das células e da matriz a alterações mecânicas e inflamatórias em um habitat local nativo3D 38,39. Por serem relativamente simples e fáceis de gerar, esses explantes cartilaginosos também podem ser usados para estudar a heterogeneidade dos AO, que é um fator limitante no desenvolvimento e teste de drogas modificadoras de doença43. Também é preciso notar que a escalabilidade e a dependência de pacientes submetidos à cirurgia de substituição articular são duas das deficiências do modelo.

Sabe-se que a cartilagem articular apresenta um comportamento peculiar dependendo do nível de escala testado. Como indicado por Loparic et al., na microescala, a cartilagem comporta-se como um material não estruturado euniforme35, e tal abordagem dá uma aproximação da rigidez global da cartilagem localizada. Com relação a se as micro ou nano-indentações são mais adequadas, um estudo de 2004 de Stolz et al.44 comparou reentrâncias em micro e nanoescala na avaliação das propriedades estrutura-mecânicas da cartilagem articular. Os autores enfatizaram que, para a indentação esférica em microescala da cartilagem articular, os componentes estruturais finos em nanoescala (isto é, fibras colágenas individuais e proteoglicanos) comumente compartilham a tarefa de suporte de carga. De modo geral, as propriedades mecânicas dos agregados diferem marcadamente daquelas dos nanocomponentes individuais. Os mesmos autores propuseram que uma combinação de micro e nano-indentações poderia ser usada para avaliar os perfis globais de rigidez local da cartilagem articular, bem como a rigidez relacionada aos componentes estruturais finos44.

Numerosos experimentos de indentação baseados em AFM têm utilizado pontas de cantiléver piramidais afiadas (raio = 15-20 nm)22,36,44 para avaliar a mecânica da cartilagem. Embora as nanoindentações com cantilés afiados sejam atualmente consideradas mais adequadas para avaliar as melhores propriedades mecânicas, as pontas esféricas de cantiléver produzem resultados mais consistentes e fáceis de modelar e interpretar ao testar amostras biológicas moles44,45. Além disso, Stolz e col. demonstraram que nano-indentações de MFA da cartilagem articular degradada enzimaticamente (isto é, elastase) não são possíveis porque o tecido se torna tão pegajoso que a adesão ponta-amostra domina as curvas força-distância, tornando os dados inviáveis44.

Nas presentes medidas de MFA, foi utilizado um cantilever com ponta esférica de 5 μm de raio. A escolha do cantilever foi motivada pela intenção de medir as propriedades mecânicas do tecido sobre uma superfície bastante grande, minimizando os danos infligidos na superfície da cartilagem. A relação entre a força aplicada em cantilever e o recuo da amostra resultante foi ajustada com o modelo de ajuste de Hertz. Quando se utilizam dentadores esféricos, recomenda-se o modelo de ajuste de Hertz, negligenciando-se as forças atrativas atuantes entre a ponta do cantilever e a superfície da amostra46. As equações para o modelo hertziano são mostradas em Eq.1 e Eq.2.

Equation 1Eq.1

Equation 2Eq.2

Onde F = força; E = módulo de elasticidade; v = razão de Poisson; δ = recuo; a = raio do círculo de contato; e Rs = raio da esfera.

O modelo calcula, em última instância, a elasticidade celular/tecidual47, formalmente expressa como módulo de Young (E). O modelo de ajuste Hertz leva em consideração várias características, como a forma e o tamanho da ponta, o recuo e a deformabilidade da amostra. Se esses requisitos não forem idealmente atendidos, o modelo pode fornecer uma estimativa imprecisa do módulo de Young46.

O modelo de ajuste de Hertz assume que a deformação e a tensão elástica dependem linearmente do módulo de elasticidade, o que implica que o recuo na amostra permanece muito menor do que a própria espessura da amostra46. Essa suposição foi facilmente atendida nessa montagem, onde os explantes de cartilagem tinham espessura de 1 mm em relação a recuos de poucos micrômetros.

A cartilagem articular pode ser modelada como um material viscoelástico poroso48,49. O comportamento viscoelástico resulta do atrito entre os constituintes intracelulares/citoplasmáticos ou da matriz, como moléculas, organelas e a rede colágeno-proteoglicana50,51. Como o próprio nome já diz, os materiais viscoelásticos combinam duas propriedades distintas: viscosos - o material deforma lentamente quando submetido a uma carga externa - e elásticos - o material retorna à sua configuração inicial uma vez removida a carga aplicada52,53. O comportamento viscoelástico manifesta-se como histerese entre as curvas de abordagem (estendida) e de retração nas curvas força-distância46,52, semelhantes às obtidas neste estudo (Figura 4C). Além disso, uma característica dos materiais viscoelásticos é que suas propriedades mecânicas dependem da taxa de deformação, com a rigidez do material aumentando com a taxa de carregamento (velocidade de indentação)54. Assim, através da seleção de diferentes taxas de carregamento, é gerada uma família de curvas força-distância, cada uma das quais representa as propriedades mecânicas da amostra ensaiada em cada taxa de carregamento52. Assim, ao tentar comparar os resultados de vários trabalhos, é fundamental levar em conta todos os parâmetros de recuo. De modo geral, ao ser medida em escala micrométrica (como neste estudo com uma ponta de cantilever esférico de 5 μm), a cartilagem articular comporta-se como um material não estruturado e uniforme, gerando um módulo de elasticidade cumulativo que inclui contribuições elásticas e viscosas para a rigidez devido à natureza poroviscoelástica do tecido35.

Outra suposição do modelo hertziano é que a profundidade de indentação é menor que o raio da ponta esférica do cantiléver55. A profundidade de indentação representa o deslocamento máximo da ponta do cantilever após o primeiro contato com a amostra. Na carga máxima, a profundidade máxima de recuo é o deslocamento total da amostra e da ponta do cantiléver. A diretriz de Bueckle estabelece uma profundidade máxima de indentação de 10% da espessura total de uma amostra com a mesma estrutura ao longo de56, caso contrário, os resultados variam de acordo com a relação profundidade/espessura. Para um raio de ponta de cantiléver de 5 μm, os explantes de cartilagem neste estudo foram recuados a 1,1 μm em média, com alguns picos de 3 μm em alguns casos, particularmente para os explantes de cartilagem altamente degenerados. Neste caso, buscou-se um compromisso, pois, no ambiente experimental, forças relativamente altas associadas a grandes reentrâncias são necessárias para neutralizar as irregularidades superficiais da cartilagem degenerada. Um recuo mais discreto resultaria no exame de fibrilação superficial e fissura do colágeno, características comuns da cartilagem altamente degenerada57.

Crucial para o modelo de ajuste de Hertz é também a identificação correta do ponto em que a ponta do cantilever entra em contato direto com a amostra, genericamente denominado ponto de contato. No entanto, isso pode ser problemático ao recuar amostras muito pegajosas ou muito moles, pois pode resultar em múltiplos pontos de contato entre amostras de sonda58,59. De fato, como bem enfatizado por A-Hassan et al., para tecidos biológicos moles, a determinação precisa do ponto de contato é um dos problemas mais vexatórios60. Esse efeito também foi observado nos explantes de cartilagem osteoartrítica nativa, pois, dependendo do estágio de degeneração, a superfície tecidual perde suas características mecânicas nativas e muitas vezes é irregular, apresentando fibrilação superficial e fissura (Figura 3B,C). Este fenômeno foi particularmente observado nos explantes cartilaginosos onde o padrão celular dominante foi de grandes aglomerados (Figura 2C). Essas inhomogeneidades na superfície da cartilagem podem levar a múltiplos pontos de contato sonda-amostra e, portanto, resultados errôneos. Grandes deflexões foram observadas em alguns casos, seguidas de rápida recuperação da linha de base antes do trecho final da curva força-distância (Figura 5A). Isso pode ser atribuído a um grande obstáculo no caminho da ponta do cantilever (por exemplo, áreas avançadas de fibrilação com cartilagem desgastada e dividida). Em outros casos, a inclinação final da curva força-distância foi dispersada com irregularidades menores (Figura 5B), indicando contato com obstáculos sucessivamente menores (por exemplo, microfibrilação do tecido). Nesses casos, o local de medição deve ser remedido ou mesmo alterado para garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados. Para este fim, também é importante inspecionar cuidadosamente a saída da curva força-distância do AFM para a identificação correta do ponto de contato. Este é um ponto crucial a ter em conta, uma vez que foi demonstrado que uma identificação incorrecta do ponto de contacto por 50 nm resulta numa estimativa incorrecta do valor de E numa ordem de grandeza61. Vários estudos começaram a usar abordagens automatizadas para determinar o ponto de contato de curvas força-distância, com o objetivo de ignorar a entrada subjetiva do usuário ao estimar o ponto de contato por inspeção visual e melhorar a precisão. Isso se torna ainda mais crucial quando se trata de um grande número de curvas de deslocamento de força, como as geradas em medidas de mecânica celular 47,62. Embora várias estratégias tenham sido propostas para automatizar a determinação do ponto de contato 47,63,64,65, a estratégia ótima é altamente dependente das condições experimentais e de fatores como o modelo utilizado para analisar os dados, a forma da sonda, a interação mecânica (não-)adesiva entre a ponta do cantilever e a amostra, bem como o comportamento (não-)hertziano da amostra 63.

A deriva da amostra é outro problema comum que pode causar artefatos e determinação errônea do ponto de contato (Figura 3E). Isso significa basicamente que a amostra não está montada corretamente no porta-amostras (placa de Petri) e a amostra está se movendo durante as medições de AFM. O efeito é particularmente pronunciado ao mover o cantilever AFM para um novo local de medição. Esse aspecto pode ser facilmente observado durante as medidas reais por uma mudança brusca no plano focal. As curvas força-distância resultantes têm tipicamente uma inclinação bifásica estendida, com uma ligeira subida no início, correspondendo ao estreitamento do espaço vazio entre o fundo do disco e a placa de Petri à medida que o disco é empurrado para baixo pelo cantilever (ver Figura 3E), seguido por uma inclinação mais firme na segunda secção do declive, indicando que o disco está sendo recuado agora que está em contato direto com o fundo da placa de Petri (Figura 5C,D). Para superar as distorções, pode-se tentar fixar melhor as amostras usando um adesivo de amostra adequado (Figura 3D), mantendo a temperatura constante desligando fontes externas de calor (luzes) para evitar deriva térmica e realizando medições rápidas de varredura. Nos experimentos aqui, observamos uma deriva de deflexão do cantilever que ocorreu nos primeiros 15 min da imersão do cantilever no meio (devido a mudanças bruscas de temperatura). Após esse lapso de tempo, a deriva geralmente é insignificante. Como resultado, aconselhamos o experimentador a examinar cuidadosamente a linha de base após a imersão do cantilever e começar a medir uma vez estabilizada. A duração deste processo pode variar muito dependendo do cantilever utilizado.

Outro parâmetro crítico para qualquer medida de AFM é o set point, que é, de forma simplista, uma medida da força aplicada pelo cantilever à amostra. Para o modo de contato (utilizado neste estudo), o set point representa uma certa deflexão do cantilever. Ao realizar várias varreduras ou várias repetições no local, como no protocolo aqui, a ponta do cantilever pode adsorver partículas da superfície da amostra, tornando às vezes necessário remover o cantilever, limpá-lo adequadamente66 e, em seguida, recalibrar antes de prosseguir com as medições.

Embora as micro-indentações de AFM proporcionem novas e interessantes oportunidades de coleta de dados, em particular no contexto da cartilagem osteoartrítica, a consistência e a reprodutibilidade dos dados produzidos são fortemente dependentes de vários parâmetros, como descrito acima. Ao usar esta abordagem para avaliar as alterações mecânicas causadas pela degeneração do tecido cartilaginoso, algumas medidas-piloto em vários padrões espaciais devem ser primeiramente realizadas a fim de escalar os resultados para o desenho experimental específico. As medições piloto de AFM devem ser realizadas com o procedimento mais padronizável, coletando amostras suficientes (por exemplo, cinco discos) do mesmo padrão para fornecer uma indicação da extensão da variabilidade dos dados. Isso é particularmente importante quando se tenta quantificar e avaliar as primeiras mudanças relevantes de rigidez da OA (isto é, entre cordas simples e cordas duplas, Figura 4A). De fato, em um estudo anterior, usando uma abordagem semelhante, mostramos que um tamanho de amostra de 30 espécimes humanos foi necessário para avaliar as mudanças biomecânicas na matriz em função da organização espacial das células37.

Além disso, muitas das etapas apresentadas neste protocolo são suscetíveis a erros humanos e dependem fortemente da experiência do operador. Considerando todos os fatores que podem influenciar os resultados reais do AFM, os valores absolutos de E relatados neste estudo não são generalizáveis e são bastante específicos para este arranjo experimental. Entretanto, a relação aqui apresentada entre os diversos módulos de Young e os explantes cartilaginosos baseados no padrão celular (quanto mais patológico o padrão espacial, menor o módulo elástico [ME] da cartilagem) não é afetada, pois os achados são consistentes com estudos anteriores que mostram alterações de rigidez em função da organização do padrão celular23,37.

Em geral, este protocolo passo-a-passo demonstra a funcionalidade de explantes padronizados de cartilagem articular nativa 3D, que não são apenas representativos de eventos de reorganização celular impulsionados por OA, desde o início até a progressão avançada, mas também estão associados a uma diminuição gradual da rigidez. Os explantes podem refletir um modelo biomimético confiável para o estudo do início e progressão dos AO, permitindo o teste e o desenvolvimento de diferentes modalidades de tratamento ex vivo. O uso de tal modelo de explante humano em combinação com a avaliação biomecânica baseada em AFM poderia resultar em uma mudança de paradigma para a pesquisa biomédica e a indústria farmacêutica, abrindo caminho para novas maneiras de identificar medicamentos eficazes para OA extremamente necessários.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos aos cirurgiões ortopédicos do Departamento de Cirurgia Ortopédica do Hospital Universitário de Tuebingen pelo fornecimento das amostras de tecido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

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Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

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