Summary
We presenteren een stapsgewijze aanpak om de meest voorkomende problemen in verband met micro-inkepingen met atoomkrachtmicroscopie te identificeren en aan te pakken. We illustreren de opkomende problemen bij inheemse menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten die worden gekenmerkt door verschillende gradaties van door artrose veroorzaakte degeneratie.
Abstract
Zonder twijfel is atoomkrachtmicroscopie (AFM) momenteel een van de krachtigste en nuttigste technieken om micro- en zelfs nanosignalen op biologisch gebied te beoordelen. Zoals bij elke andere microscopische benadering kunnen er echter methodologische uitdagingen ontstaan. Met name de kenmerken van het monster, de monstervoorbereiding, het type instrument en de indruksonde kunnen leiden tot ongewenste artefacten. In dit protocol illustreren we deze opkomende problemen met zowel gezonde als osteoartritische gewrichtskraakbeenexplantaten. Daartoe laten we eerst via een stapsgewijze aanpak zien hoe ex vivo gewrichtskraakbeenschijven kunnen worden gegenereerd, beoordeeld en visueel geclassificeerd volgens verschillende stadia van degeneratie door middel van grote 2D-mozaïekfluorescentiebeeldvorming van de explantaten van het hele weefsel. De belangrijkste kracht van het ex vivo-model is dat het verouderd, inheems, menselijk kraakbeen bevat dat het mogelijk maakt om artrose-gerelateerde veranderingen van vroeg begin tot progressie te onderzoeken. Daarnaast worden ook veelvoorkomende valkuilen bij weefselpreparatie gepresenteerd, evenals de eigenlijke AFM-procedure samen met de daaropvolgende data-analyse. We laten zien hoe basale maar cruciale stappen zoals monstervoorbereiding en -verwerking, topografische monsterkenmerken veroorzaakt door geavanceerde degeneratie en interactie tussen monster en tip van invloed kunnen zijn op het verzamelen van gegevens. Ook nemen we de meest voorkomende problemen in de AFM onder de loep en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze kunnen worden opgelost. Kennis van deze beperkingen is van het grootste belang voor het correct verzamelen, interpreteren en uiteindelijk inbedden van bevindingen in een brede wetenschappelijke context.
Introduction
Door de steeds kleiner wordende omvang van elektronische apparaten en systemen is de snelle ontwikkeling van micro- en nanogebaseerde technologie en apparatuur in een stroomversnelling geraakt. Een van die apparaten is atoomkrachtmicroscopie (AFM), die biologische oppervlakken kan scannen en topografische of biomechanische informatie kan ophalen op zowel nano- als micrometerschaal 1,2. Een van de enorme functies is dat deze tool kan worden gebruikt als een micro- en een nano-indenter om informatie te verkrijgen over de mechanische eigenschappen van verschillende biologische systemen 3,4,5,6. De gegevens worden verzameld door fysiek contact met het oppervlak via een mechanische sonde, die zo klein kan zijn als ongeveer 1 nm aan het uiteinde7. De resulterende vervorming van het monster wordt vervolgens weergegeven op basis van de indrukdiepte van de uitkragende punt en de kracht die op het monsterwordt uitgeoefend 8.
Artrose (OA) is een langdurige degeneratieve chronische ziekte die wordt gekenmerkt door verslechtering van het gewrichtskraakbeen in de gewrichten en omliggende weefsels, wat kan leiden tot volledige blootstelling van de botoppervlakken. De last van artrose is aanzienlijk; Momenteel lijdt de helft van alle vrouwen en een derde van alle mannen van 65 jaar en ouder aan artrose9. Trauma's, obesitas en de daaruit voortvloeiende veranderde biomechanica van het gewricht10 bepalen de gewrichtskraakbeendegeneratie, die wordt gezien als een gemeenschappelijk eindresultaat. De baanbrekende studie van Ganz et al. stelde dat de vroege stappen van het artroseproces de biomechanische eigenschappen van kraakbeen11 kunnen omvatten, en sindsdien hebben onderzoekers deze hypothese bevestigd12. Evenzo wordt algemeen aanvaard dat de biomechanische eigenschappen van het weefsel functioneel worden georkestreerd door de ultrastructurele organisatie en door overspraak tussen cellen en celmatrixen. Elke verandering kan een dramatische invloed hebben op het algehele biomechanische functioneren van het weefsel13. Tot op heden is de diagnose van artrose klinisch en gebaseerd op gewone filmradiografie14. Deze benadering is tweezijdig: ten eerste maakt het ontbreken van een gedefinieerde degeneratieve afkapdrempel om de diagnose artrose te formuleren de aandoening moeilijk te kwantificeren, en ten tweede missen beeldvormingsmethoden gevoeligheid en standaardisatie en kunnen ze geen gelokaliseerde kraakbeenschade detecteren15,16,17. Daartoe heeft de beoordeling van de mechanische eigenschappen van het kraakbeen het doorslaggevende voordeel dat het een parameter beschrijft die in de loop van artrose verandert, ongeacht de etiologie van de ziekte, en die in een zeer vroeg stadium een directe invloed heeft op de weefselfunctionaliteit. Indrukkingsinstrumenten meten de kracht waarmee het weefsel zich tegen de indrukking verzet. Dit is in feite geen nieuw concept; De vroegste studies dateren uit de jaren 1980 en 1990. In deze periode suggereerden talrijke studies dat indrukkingsinstrumenten die zijn ontworpen voor de arthroscopische metingen van gewrichtskraakbeen zeer geschikt zouden kunnen zijn om degeneratieve veranderingen in het kraakbeen te detecteren. Zelfs 30 jaar geleden konden sommige onderzoeken aantonen dat indrukkingsinstrumenten in vivo veranderingen in het kraakbeenoppervlak tijdens weefseldegeneratie konden detecteren door drukstijfheidsmetingen uit te voeren tijdens artroscopie18,19,20.
AFM-inkeping (AFM-IT) van het gewrichtskraakbeen geeft informatie over een cruciale mechanische eigenschap van het weefsel, namelijk stijfheid. Dit is een mechanische parameter die de relatie beschrijft tussen een toegepaste, niet-destructieve belasting en de resulterende vervorming van het ingesprongen weefselgebied21. AFM-IT is in staat gebleken om leeftijdsafhankelijke veranderingen in stijfheid in macroscopisch onaangetaste collageennetwerken te kwantificeren, waardoor onderscheid wordt gemaakt tussen de pathologische veranderingen die verband houden met het begin van artrose (graad 0 op de Outerbridge-schaal in gewrichtskraakbeen)22. We hebben eerder aangetoond dat AFM-IT's, op basis van ruimtelijke chondrocytenorganisatie als een op beelden gebaseerde biomarker voor vroege kraakbeendegeneratie, niet alleen de vroegste degeneratieve mechanische veranderingen kunnen kwantificeren, maar ook daadwerkelijk kunnen lokaliseren. Deze bevindingen zijn al bevestigd door anderen23,24. Daarom fungeert AFM-IT als een interessant instrument om vroege degeneratieve veranderingen te diagnosticeren en te identificeren. Deze veranderingen kunnen al op cellulair niveau worden gemeten, waardoor het begrip van het pathofysiologische proces van artrose opnieuw wordt vormgegeven.
In dit protocol demonstreren we een volledige histologische en biomechanische beoordelingsprocedure van gewrichtskraakbeenexplantaten, van de voorbereiding van het inheemse kraakbeenexplantatie tot AFM-gegevensverzameling en -verwerking. Door middel van een stap-voor-stap aanpak, laten we zien hoe het articulair kraakbeenweefsel volgens verschillende stadia van degeneratie kan worden gegenereerd, gesorteerd en visueel geclassificeerd door middel van 2D grote mozaïekbeeldvorming, gevolgd door micro-AFM inkepingen.
Hoewel AFM-IT momenteel een van de meest gevoelige instrumenten is om biomechanische veranderingen in kraakbeen te meten7, heeft het, net als elke andere instrumentele techniek, beperkingen en praktische eigenaardigheden25 die kunnen leiden tot foutieve gegevensverzameling. Daartoe onderwerpen we de meest voorkomende problemen die zich voordoen tijdens AFM-metingen van de kraakbeenexplantaten en beschrijven we, waar mogelijk, hoe deze te minimaliseren of te overwinnen. Deze omvatten topografische aspecten van de steekproeven en de moeilijkheden om hen in een AFM-compatibele omgeving te stabiliseren, fysieke eigenaardigheden van het oppervlak van het weefsel, en de daaruit voortvloeiende moeilijkheden bij het uitvoeren van AFM-metingen op dergelijke oppervlakten. Er worden ook voorbeelden gegeven van foutieve kracht-afstandscurves, waarbij de nadruk wordt gelegd op de omstandigheden die deze kunnen veroorzaken. Bijkomende beperkingen die inherent zijn aan de geometrie van de cantilevertip en het gebruik van het Hertz-model voor de data-analyse worden ook besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Er werden femurcondylen gebruikt die waren verzameld bij patiënten die een totale knieartroplastiek ondergingen in het Universitair Ziekenhuis van Tübingen, Duitsland. Alleen gewrichtskraakbeenmonsters van patiënten met degeneratieve en posttraumatische gewrichtspathologieën werden in deze studie opgenomen. Vóór de start van het onderzoek werd goedkeuring verkregen van departementale, institutionele en lokale ethische commissies (projectnr. 674/2016BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van alle patiënten vóór deelname.
OPMERKING: Een stroomdiagram van de experimentstappen in chronologische volgorde wordt gegeven in figuur 1.
1. Weefselbewerking en aanmaak van kraakbeenschijven
- Weefsel preparatie
- Plaats de kraakbeenmonsters na postoperatieve resectie in een container gevuld met Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% (v/v) penicilline-streptomycine. Zorg ervoor dat de monsters volledig ondergedompeld zijn in het medium. De duur tussen chirurgische resectie en verdere verwerking van het kraakbeen mag niet langer zijn dan 24 uur. Zorg ervoor dat de monsters tijdens de hele verwerking volledig zijn ondergedompeld in media om uitdroging van het monster te voorkomen.
- Snijd het kraakbeen weg van het bot met behulp van een scalpel.
- Generatie van kraakbeenschijven
- Genereer kraakbeenschijven met een diameter van 4 mm met behulp van een biopsiepons.
OPMERKING: Het is belangrijk om de delen van de condylus te selecteren en te verwijderen waar de dikte van de kraakbeenlaag groter is dan 1 mm. Dit kan problematisch zijn, vooral rond dragende zones, waar de kraakbeenlaag doorgaans zijn dikte verliest als gevolg van slijtageprocessen of degeneratie. - Plaats de eerder gegenereerde kraakbeenschijven van 4 mm op een op maat gemaakte snij-inrichting en zet de kraakbeenschijven vast en houd ze stabiel met behulp van een spatel. Bij het plaatsen van de kraakbeenschijven op de snij-inrichting moet voorzichtig worden gehandeld. Plaats de monsters zo dat de bovenste laag van het kraakbeen (de oppervlakkige zone van het gewrichtskraakbeen) niet naar het mes is gericht
- Snijd de kraakbeenschijven door met een scheermesje. Zo worden schijfvormige kraakbeenmonsters van 4 mm x 1 mm gegenereerd. Om uitdroging van het monster te voorkomen, moet u zo snel mogelijk weefsel snijden.
- Verzamel elke schijf met behulp van een spatel en plaats de gegenereerde kraakbeenschijven in buisjes van 1,5 ml met 1 ml DMEM aangevuld met 5% (v/v) penicilline-streptomycine. Plaats ongeveer 15 schijven in één buis.
- Genereer kraakbeenschijven met een diameter van 4 mm met behulp van een biopsiepons.
- Cryotoomdoorsnede van de kraakbeenschijven (voor loodrechte plakjes)
OPMERKING: Deze stap is optioneel en kan worden gebruikt als een zijaanzichtvisualisatie van de cellulaire patroonverdeling binnen de kraakbeenschijven gewenst is. Het kan worden gebruikt als verificatiemethode, aangezien de verdeling van het cellulaire patroon een 3D-kenmerk is van gewrichtskraakbeen26. Optische doorsnede en 3D-reconstructies van de gehele kraakbeenschijven met behulp van een confocale microscoop kunnen ook worden gebruikt, waardoor het niet meer nodig is om de monsters te doorsnijden zoals beschreven in het protocol.- Bedek de kraakbeenschijf met in water oplosbaar inbeddingsmedium en plaats deze op de rand op de cryotoomknop (met het oppervlak van de schijf loodrecht op het oppervlak van de knop). In het cryotoomapparaat bevriest het inbeddingsmedium bij lage temperaturen.
- Gebruik een standaard cryotoom om het weefsel zijwaarts in te delen met een dikte van 60 μm totdat het midden van de schijf is bereikt (d.w.z. wanneer cryosecties een lengte van 4 mm bereiken) en verzamel de plakjes. Door de schijf loodrecht te doorsnijden, kunnen alle zones van het kraakbeen (oppervlakkig, midden en diep) worden gevisualiseerd.
- Verzamel de secties op een glasplaatje en verwijder het in water oplosbare inbeddingsmedium door drie keer te wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Sorteren van kraakbeenschijven als functie van het cellulaire ruimtelijke patroon
- Kleuring van de schijfvormige kraakbeenmonsters
- Plaats één kraakbeenschijf (sectie 1.2) in elk putje van een plaat met 96 putjes en voeg 130 μL celdoorlatende fluorescentiekleurstof in een verdunning van 1:1.000 toe aan elk putje.
- Inspecteer de hele plaat visueel en zorg ervoor dat er slechts één schijf in elke put wordt geplaatst. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in de standaard celkweekincubator bij 37 °C.
- Kleuring van de 60 μm kraakbeenplakken
- Plaats de kraakbeenschijfsecties (sectie 1.3) voorzichtig met behulp van een pincet op glazen microscoopglaasjes.
- Bedek de kraakbeensecties met montagemedium met nucleaire DAPI-tegenkleuring en plaats voorzichtig dekglaasjes die geschikt zijn voor fluorescentiemicroscopie.
- Verzegel de randen van elk dekglaasje met gewone transparante nagellak en laat 3 minuten drogen.
- Sorteren en afbeelden van kraakbeen van bovenaf en zijaanzicht
OPMERKING: Elke schijf moet onder een fluorescerende microscoop worden onderzocht. Het doel van deze stap is om de schijven te sorteren op basis van hun overheersende cellulaire patroon (enkele strings, dubbele strings, kleine clusters, grote clusters of diffuus).- Plaats de plaat met 96 putjes op de plaathouder van de fluorescentiemicroscoop.
- Selecteer het geschikte fluorescentiefilter van Em 495 nm/Ex 515 nm (voor top-down beeldvorming van de kraakbeenschijven bereid in punt 2.1) of Em 358 nm/Ex 461 nm (voor zijaanzichtbeeldvorming van de kraakbeensecties voorbereid in punt 2.2) en het 10x-objectief.
OPMERKING: Met behulp van het 10x-objectief kan de hele omtrek van de schijf worden geïnspecteerd en kunnen monsters met inhomogene of onjuiste kleuring worden uitgesloten. Het gebruik van alleen het bovenaanzicht kan echter leiden tot de perceptie van veranderingen in de cellulaire organisatie als gevolg van analyse van de diepere weefsellagen die door oppervlakkige erosie zichtbaar zijn gemaakt voor top-down observatie. Een stijgende snaar die de collageenarcades volgt, kan bijvoorbeeld worden waargenomen als een enkele cel of verspreide cellen (diffuus patroon)26. Als gevolg hiervan moeten beide zijden van de schijven worden geïnspecteerd om een goede selectie van het cellulaire patroon te garanderen. - Bepaal visueel het cellulaire patroon dat in elke kraakbeenschijf wordt weergegeven. Het is onwaarschijnlijk dat een schijf slechts één type cellulair patroon zal hebben. Voor het gedeelte van de schijf waar de opstelling van de chondrocyten niet overeenkomt met het patroon van belang, accepteer de monsters alleen als het ongewenste patroon zich aan de uiterste rand bevindt, waar geen AFM-metingen plaatsvinden (d.w.z. tot 0,5 mm van de schijfrand), en zorg ervoor dat dit niet meer dan 10% van het totale oppervlak van de schijf27 bedraagt, 28. okt.
- Beeldacquisitie van de gehele kraakbeenschijven
- Selecteer het 10x objectief van de microscoop en plaats het onder het vooraf geselecteerde putje met daarin een individuele kraakbeenschijf. Focus op de schijf om het cellulaire patroon te zien.
- Selecteer de Navigator-functie om een overzicht van de hele put te krijgen. Gebruik de linkermuisknop en sleep om naar een andere podiumpositie te navigeren. Zoom met het muiswiel in en uit.
OPMERKING: Op dit punt kan een voorbeeld van de put met het volledige monster worden bekeken door achtereenvolgens op elk interessegebied te dubbelklikken. - Selecteer een vierkant dat het interessegebied omvat dat moet worden gescand; Op dit punt worden alle afzonderlijke tegels waaruit het mozaïek bestaat zichtbaar.
- Pas de belichting/lichtintensiteit aan zodat de cellen duidelijk vanaf de achtergrond kunnen worden gevisualiseerd. Op dit punt is de helderheid/het contrast van de afbeelding aangepast voor alle tegels en kan deze niet langer voor elke tegel afzonderlijk worden aangepast.
OPMERKING: Aangezien de cellen aan de rand van de schijf vaak een hoger fluorescentiesignaal uitzenden dan de cellen in het midden, moeten de instellingen voor belichting/lichtintensiteit worden aangepast.- Om te beoordelen of de belichtingstijd geschikt is voor een bepaald kanaal, onderzoekt u de verdeling van het signaal in het histogram. Met behulp van het automatische belichtingsmechanisme in de beeldsoftware van de microscoop kunt u alle cellen in de schijf visualiseren.
- Selecteer de optie Focus Map Point van de software en selecteer vervolgens elke afzonderlijke tegel door met de linkermuisknop in het midden ervan te klikken.
- Selecteer de optie Focus Map. Er wordt een venster weergegeven met alle eerder geselecteerde tegels. Dubbelklik op een tegel in de lijst om deze weer te geven en in de juiste focus te brengen.
- Klik op Z instellen om het focusplan op te slaan en door te gaan naar de volgende tegel. Nadat u het focusplan voor elke afzonderlijke tegel hebt aangepast, begint u met het verzamelen van afbeeldingen door op Scan starten te drukken.
- Als de scan donkerdere horizontale en/of verticale balken weergeeft, kan dit te wijten zijn aan onjuiste en ongelijkmatige verlichting van de afzonderlijke frames. Los dit op door gebruik te maken van de optie Linked Shading die in de software is opgenomen voorafgaand aan de daadwerkelijke scan.
- Bewaar, exporteer en annoteer de afbeeldingen op de juiste manier.
3. Biomechanische benadering van kraakbeenexplantaten
- Monstervoorbereiding voor AFM-metingen
- Bevestig elke vooraf geselecteerde kraakbeenschijf met een cellulair patroon (sectie 2) in petrischaaltjes met behulp van biocompatibele lijm. Breng voldoende voorbeeldlijm aan op de boven-, onder-, linker- en rechterkant van de schijf.
- Bedek de schijven met 2,5 ml L-15 medium van Leibovitz zonder L-glutamine. Voeg het Leibowitz-medium voorzichtig toe aan de monsters om te voorkomen dat het monster loskomt van het oppervlak als gevolg van golven die door het medium worden gecreëerd.
- Laden van de monsters in de AFM
- Plaats de petrischaal in de monsterhouder van het AFM-apparaat en zet de petrischaalverwarmer aan die is ingesteld op 37 °C. Laat het weefselkweekschaaltje de gewenste temperatuur bereiken. Dit wordt gedaan om mogelijke artefacten uit te sluiten die worden veroorzaakt door temperatuurschommelingen.
- AFM-cantilever kalibratie
- Initialiseer de software-installatie zoals eerder beschreven door Danalache et al.29.
- Kies een geschikte cantileverhouder met glazen blok voor vloeistofmetingen en plaats deze voorzichtig op de AFM-kop. Een vergrendelingsmechanisme beveiligt het glasblok in de AFM-kop. Zorg ervoor dat het reflecterende oppervlak van het glasblok recht en evenwijdig is aan de AFM-houder.
- Plaats de draagarm voorzichtig op het oppervlak van de sledehouder met glazen blok. De cantilever zelf moet op het gepolijste optische vlak rusten, in het midden van het glasblok.
- Plaats voorzichtig een siliconen rok (siliconenmembraan) op de basis van de cantileverhouder om gemiddelde condensatie in de AFM-kop te voorkomen.
- Laat de cantilever in stappen van 100 μm met behulp van de stappenmotorfunctie zakken totdat deze volledig in het medium is ondergedompeld.
- Voer een scannerbenadering uit met de naderingsparameters beschreven door Danalache et al.29. Trek de uitkraging 100 μm in zodra de bodem van de petrischaal is bereikt.
- Kalibreer de cantilever met behulp van de exacte stappen en voer de parameters uit die zijn beschreven door Danalache et al.29. Aan het einde van de kalibratie wordt de verticale afbuiging opgeslagen en weergegeven in newton (N) krachteenheden in plaats van volt (V) - de eenheid van de oorspronkelijke registratie door de fotodiodedetector. In de experimenten hier resulteerde een instelpunt van 4,47 nN na kalibratie.
- Trek de cantilever met behulp van de stappenmotorfunctie in tot 1.000 μm.
- Identificeren van de gewenste kraakbeenmeetlocatie onder de AFM
OPMERKING: Vanwege de dikte van 1 mm van de kraakbeenschijven is de cantilever niet zichtbaar in het gezichtsveld tijdens het navigeren over het monster.- Gebruik de CCD-camera van de microscoop om de cantilever te identificeren. De AFM-cantilever moet in een monstervrij gebied van de petrischaal worden geplaatst.
- Start een scannerbenadering met de cantilever op een schoon, monstervrij gebied van de petrischaal, met dezelfde parameters beschreven door Danalache et al.29.
- Trek de cantilever verder 1.5 mm weg van de onderkant van de plaat met de stappenmotorbediening. Deze stap is cruciaal om een directe botsing tussen de cantilever en het monster te voorkomen.
- Schakel over van helderveld- naar fluorescentieweergave en identificeer visueel de bovenkant van de schijf.
- Verplaats de AFM-monsterhouder precies 2 mm naar het midden van de schijf. Dit punt wordt beschouwd als het centrum van de kraakbeenschijf.
- Voer een scannerbenadering uit en zodra het oppervlak van de kraakbeenschijf is bereikt, trekt u de cantilever 100 μm in.
- Kracht-afstandscurve-metingen
- Focus op de cellen die zich op de gewenste meetplaats bevinden. Klik op de knop Uitvoeren om de metingen en het genereren van kracht-afstandscurven in de beoogde positie te starten.
- Verkrijg vijf kracht-afstandscurven op elke meetplaats. Trek de uitkraging 500 μm in en verplaats de uitkraging naar de volgende meetplaats.
OPMERKING: Het terugtrekken van de cantilever is een cruciale stap, aangezien het oppervlak van de kraakbeenschijf niet homogeen is en onregelmatigheden vertoont. Een hoge heuvel op het oppervlak van het monster kan leiden tot een dramatische botsing, wat kan leiden tot ongewenste schade aan de uitkragingspunt/monster. We raden aan om minimaal vijf verschillende meetlocaties verspreid over het oppervlak van de schijf te selecteren en op elke locatie minimaal vijf kracht-afstandscurven te verkrijgen. - Inspecteer de kracht-afstandscurven en sla ze op.
- Schatting van Young's moduli met behulp van het Hertz fit-model
- Open de gegenereerde kracht-afstandscurven die moeten worden geanalyseerd (.jpk-bestand) in de gegevensanalysesoftware met behulp van de optie Een batch spectroscopiecurven openen .
- Selecteer het Hertz fit-model en selecteer vervolgens de optie Elasticiteitspasvorm .
- De optie elasticiteitsaanpassing voert automatisch de volgende berekeningen uit op de geselecteerde kracht-afstandscurve: berekent de basislijn en trekt deze af van de hele curve om de basislijnverschuiving te verwijderen (de basislijn wordt teruggebracht naar nul op de y-as); bepaalt het contactpunt door het punt te detecteren waar de kracht-afstandscurve de nul-krachtlijn kruist (het contactpunt wordt op nul gezet op de x-as); berekent de scheiding tussen de punt en het monster (het hoogtesignaal van de piëzo dat rekening houdt met de buiging van de cantilever wordt afgetrokken); en past de kracht-afstandscurve automatisch aan het geselecteerde model aan. Indien gewenst kan elk van deze stappen ook onafhankelijk worden uitgevoerd.
- Aanpassen met behulp van de volgende pasvormparameters: Poisson-verhouding van 0,5 en de juiste vrijdragende tipradius.
NOTITIE: Bij gebruik van een cantilever met een bolvormige cantilever-tip moet het Hertz fit-model worden gebruikt. De cantilever die in dit onderzoek werd gebruikt, had een bolvormige punt met een straal van 5 μm. We raden aan om de kracht-afstandscurve aan te passen totdat de maximaal uitgeoefende kracht is bereikt (setpoint). - Controleer visueel de pasvorm van de kracht-afstandscurve om de juistheid te garanderen. Deze stap moet worden uitgevoerd voor elk van de geanalyseerde kracht-afstandscurven.
- Bepaling van de indrukdiepte
OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte data-analysetool kan dit proces verschillen. De onderzoeker kan de indrukdiepte eenvoudig aflezen door een reeks stappen te volgen die zijn opgenomen in het data-analyseprogramma.- Open elk van de gegenereerde kracht-afstandscurven in de data-analysesoftware en selecteer het Hertz fit-model als het analyseproces.
- Pas de optie Basislijnverschuiving aftrekken toe om de verticale afbuigingsas (y-as) op nul te zetten en selecteer de functie Verschuiving + kantelen .
- Gebruik de functie Contactpunt zoeken om het contactpunt automatisch te identificeren, dat automatisch naar een x-coördinaat van nul wordt gebracht.
- Trek de afstand die uitsluitend rekening houdt met de vrijdragende doorbuiging af van de ruwe piëzohoogte tijdens de inkeping met behulp van de functie Verticale tippositie .
- Selecteer de optie Elasticiteit aanpassen om de verwerkte kracht-afstandscurve weer te geven en selecteer het gebied van de grafiek zodat het wordt uitgelijnd met de meest negatieve waarde op de verticale tippositie-as (x-as ).
- Lees en documenteer de inspringing in het vak X Min op het tabblad Parameter. Sla de resultaten op en documenteer ze.
4. Statistische analyse
- Open de statistische software. Selecteer Nieuwe gegevensset in het vervolgkeuzemenu.
- Open het tabblad Variabele weergave nadat u het gegevenssetbestand hebt geselecteerd. Definieer de numerieke variabelen voor elke categorie van cellulaire patronen: enkele strings = SS, dubbele strings = DS, kleine clusters = SC, grote clusters = BC, diffuus en de Young's moduli.
- Voer op het tabblad Gegevensweergave de gemeten Young's moduli-gegevens in voor elk van de overeenkomstige cellulaire patrooncategorieën. Analyseer de gegevensdistributie door Analyseren te selecteren in de menubalk en vervolgens Verkennende gegevensanalyse.
- Selecteer Young's Moduli als de afhankelijke variabele en Cellulair Patroon als de factorlijst. Een boxplot dat wordt gebruikt voor de resultatensectie wordt weergegeven tussen de resultaten in het uitvoerbestand.
- Als u een statistische analyse wilt uitvoeren, kiest u Afhankelijke steekproeven in de sectie Niet-parametrische test van het tabblad Analyseren in de menubalk. Selecteer Young's Moduli als Testvelden en Cellulair Patroon als Groepen onder het tabblad Velden. Druk op Uitvoeren.
OPMERKING: De resultaten worden weergegeven in het uitvoerbestand. Voor de statistische analyse wordt een Friedman-test uitgevoerd. - Neem de p-waarden van de niet-parametrische test op in de boxplot die in stap 4.4 is gemaakt. Sla de resultaten op door in de menubalk op Bestand te klikken en Opslaan te selecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van een zelfgemaakt snijapparaat waren we in staat om kleine (4 mm x 1 mm) kraakbeenschijven te explanteren en te genereren uit verse menselijke condylen met een enkel cellulair ruimtelijk patroon30 van enkele snaren (SS, Figuur 2A), dubbele snaren (DS), kleine clusters (SC), grote clusters (BC; Figuur 2A) en diffuus (Figuur 2B). Een representatieve kraakbeenexplantatie is afgebeeld in figuur 3A. De selectie van schijven die slechts één type patroon vertonen, werd gedaan met behulp van top-down fluorescentiebeeldvorming (figuur 2). De topografische variatie van de kraakbeenoppervlakteschijf werd verder geïllustreerd door zijdelingse beeldvorming van 60 μm dikke secties gegenereerd uit de kraakbeenschijven (Figuur 2C). Op het oppervlak van de geëxplanteerde artrosekraakbeenschijven waren oppervlakkige fibrillatie en matrixspleet aanwezig (Figuur 3B,C). Dit was vooral opmerkelijk in de schijven die representatief zijn voor gevorderde artroseprogressie, vertegenwoordigd door de aanwezigheid van BC (Figuur 2A). Na post-fluorescentie sortering, werd de stijfheid van de schijven beoordeeld door AFM micro-indentaties. Daartoe werden de gegenereerde kraakbeenschijven met succes gefixeerd in de AFM-petrischaal door middel van biocompatibele lijm (Figuur 3D) om te voorkomen dat het monster tijdens de metingen afdrijft (Figuur 3E). De hoeveelheid lijm die wordt gebruikt, moet worden aangepast. Een onvoldoende hoeveelheid lijm zal resulteren in instabiliteit van de schijf, terwijl het toevoegen van te veel lijm kan leiden tot een ongewenste verspreiding van de lijm onder en/of over de kraakbeenschijf. Dit laatste leidt tot meetartefacten en een slechte identificatie van de schijf onder de fluorescentiemicroscoop. Onvoldoende lijmtoepassing of plotselinge bewegingen van het monster tijdens fixatie zijn veelvoorkomende problemen die ervoor zorgen dat het weefsel loskomt van de petrischaal en moeten worden vermeden.
Een representatieve geleidelijke vermindering van de stijfheid naast de rangschikking van het cellulaire patroon wordt weergegeven in figuur 4A. De stijfheidswaarden waren hoger in de schijven met SS (mediaan van 2,6 kPa) - representatief voor niet-aangetaste heide kraakbeengebieden. Met het begin en de progressie van artrose toonden de AFM-metingen een sterke stapsgewijze afname van de stijfheid van 42% in DS (1,5 kPa), 77% in SC (0,6 kPa) en uiteindelijk 88% in gevorderde stadia vertegenwoordigd door BC (0,3 kPa; Figuur 4A). De schijven met een diffuus patroon vertoonden een verhoogde elasticiteit met een belangrijke variatie van de enkelvoudige moduluswaarden van de Young. Voor alle kraakbeenschijven met een toegewezen overheersende cellulaire patroonorganisatie bleek de indrukdiepte geassocieerd met het gebruikte setpoint (4.477 nN) omgekeerd evenredig te zijn met de stijfheid (Figuur 4B). Een representatieve gegenereerde kracht-afstandscurve wordt weergegeven in figuur 4C, en een Hertz-fit en de identificatie van het contactpunt worden weergegeven in figuur 4D.
De juiste pasvorm hangt onder andere af van de juiste bepaling van de baseline. Als de automatische basislijndetectie onjuist is (bijvoorbeeld vanwege een turbulente basislijn), kan de pasvorm ook handmatig worden bepaald en kan de gebruiker een meer representatieve basislijn voor de metingen selecteren. Als de gegenereerde kracht-afstandscurve echter geen goede pasvorm mogelijk maakt, moet deze worden weggegooid. Figuur 5 toont voorbeelden van onjuiste kracht-afstandscurves. Het genereren van geschikte kracht-afstandscurven op explantaten van artrosevormig gewrichtskraakbeen kan moeilijk zijn vanwege enerzijds het onregelmatige oppervlak van het weefsel (voorbeelden worden weergegeven in figuur 5A,B) en de instabiliteit van het monster veroorzaakt door onjuiste monsterfixatie (voorbeelden weergegeven in figuur 5C,D). Artefacten kunnen worden veroorzaakt door meerdere contactpunten tussen sonde en monster (vanwege het oneffen oppervlak van gedegenereerd kraakbeen) of ongewenste weefselbeweging (zichtbaar door veranderingen in het brandpuntsvlak). Deze artefacten zijn te zien in de gegenereerde kracht-afstandscurven en wijzen op een suboptimaal contact tussen de AFM-cantilever en het kraakbeenoppervlak of een onjuiste monsterfixatie op de petrischaal (zie figuur 5A-D).
Figuur 1: Stroomschema van de experimentele procedure. Samenvatting van de experimentele stappen in chronologische volgorde, beginnend bij intraoperatief gereseceerde kraakbeenmonsters tot het genereren van kraakbeenschijven van 4 mm x 1 mm, fluorescentiekleuring en sortering van de schijven op basis van de organisatie van het cellulaire patroon door middel van top-down en zijaanzichtbeeldvorming, en uiteindelijk elasticiteitsbeoordeling door middel van atoomkrachtmetingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentiebeeldvorming van representatieve kraakbeenschijven . (A) Mozaïek 2D-beelden en een ingezoomd voorbeeldig veld van kraakbeenschijven gekleurd met celmembraanpermeabele kleurstof bij een vergroting van 100x. De bovenste schijf geeft een representatieve schijf met één snaren weer, terwijl de onderste schijf representatief is voor een grote clusterschijf (onderste). (B) Mozaïekafbeelding van een schijf met diffuus patroon, gezien vanaf het oppervlak (boven), en dezelfde schijf afgebeeld vanaf de onderkant (onder). (C) Zijaanzicht van nucleaire kleuring van 60 μm plakjes kraakbeenschijf. De witte schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm voor de mozaïekfoto's (groter gezichtsveld, A [linkerpaneel], B, C) en 100 μm voor de ingezoomde, gefocuste foto's (A [rechterpaneel]). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geëxplanteerde gewrichtskraakbeenschijven. (A) Representatief beeld van een gegenereerde kraakbeenschijf van 4 mm x 1 mm explantatie uit vers menselijk gewrichtskraakbeen. De in wit afgebeelde schaalbalk vertegenwoordigt 2 mm. (B) Representatief beeld van inheems osteoartritisch kraakbeen waarbij het weefseloppervlak macroscopisch zichtbare oppervlakkige fibrillatie en schisis vertoont. De wit afgebeelde schaalbalk vertegenwoordigt 1.000 mm. (C) Schematische weergave van het gefibrilleerde kraakbeenoppervlak. (D) Voorafgaand aan de AFM-metingen, werd elk van de explantaten van de kraakbeenschijf correct bevestigd door middel van bio-compatibele monsterlijm aan het oppervlak van de AFM-petrischaal om artefacten te vermijden die te wijten zijn aan het drijven van het monster tijdens de daadwerkelijke indrukkingsmetingen zoals getoond in (E). De witte schaalbalk staat voor 4 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van metingen met atoomkrachtmicroscopie van gewrichtskraakbeenschijven gesorteerd op basis van hun overheersende cellulaire patroonorganisatie . (A) Boxplot met de mediaan van de berekende Young's moduli van vijf schijven, één voor elk cellulair patroon, afkomstig van één patiënt. Op elke schijf werden in totaal 25 metingen uitgevoerd (vijf metingen voor vijf verschillende meetplaatsen). De zwarte lijn binnen de rechthoek vertegenwoordigt de mediaanwaarde, de onderste en bovenste uiteinden van de rechthoek vertegenwoordigen respectievelijk het eerste en derde kwartiel en de foutbalken vertegenwoordigen de laagste en hoogste waarden voor elke groep. (B) Puntgrafiek met de 125 indrukdieptepunten voor elk cellulair patroon. (C) Voorbeeldige kracht-afstandscurven verkregen met de AFM met een berekende Young's modulus van 0,4 kPa. (D) Een representatieve bepaling van de Hertz-fit en het contactpunt voor de kracht-afstandscurve zoals weergegeven in (C). De x-as geeft de verticale puntpositie weer (dat is de afstand die door de piëzo wordt doorkruist, waarbij de lengte die rekening houdt met de cantileverbuiging automatisch wordt afgetrokken van het contactgedeelte van de kracht-afstandscurve). *P < 0,05. Voor statistische analyse werd de Friedman-test gebruikt. Afkortingen: SS = enkele strings; DS = dubbele snaren; SC = kleine clusters; BC = grote clusters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van foutieve kracht-afstandscurves . (A) De kracht-afstandscurve vertoont een enorme afwijking, gevolgd door herstel in de buurt van het basisniveau voordat een continue inkeping van het oppervlak wordt waargenomen. Dit fenomeen kan worden toegeschreven aan een relatief groot obstakel (bijv. grote oppervlaktespleten die uit de bovenste laag van het kraakbeen steken). (B) De uitgebreide kracht-afstandscurve toont meerdere kleine pieken. Aangenomen wordt dat deze krommingen worden veroorzaakt door onregelmatigheden op microschaal op het kraakbeenoppervlak (bijv. fibrillatie). Zowel (C) als (D) geven kracht-afstandscurven weer met bifasische koersen. Beide kracht-afstandscurven zijn representatief voor slechte monsterfixatie en monsterdrift. Het is in deze gevallen ook vrij gebruikelijk om een plotselinge verandering in het brandpuntsvlak te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als progressieve en multifactoriële ziekte veroorzaakt artrose structurele en functionele veranderingen in het gewrichtskraakbeen. In de loop van artrose gaan stoornissen in mechanische kenmerken gepaard met structurele en biochemische veranderingen aan het oppervlak van het gewrichtskraakbeen27,31. De vroegste pathologische gebeurtenissen die optreden bij artrose zijn proteoglycaandepletie in combinatie met verstoring van het collageennetwerk32,33,34. Dergelijke vroege subtiele veranderingen aan het oppervlak zijn moeilijk te lokaliseren en te identificeren met bulktesten, omdat het mechanische gedrag wordt gemiddeld over de hele weefseldiepte. Bovendien is een nog steeds niet beantwoorde vraag of functionele veranderingen op orgaan- en weefselniveau verband houden met structurele en functionele veranderingen op micro- of nanoschaal. Daartoe wordt AFM beschouwd als een van de meest gevoelige methoden, die in staat zijn om de vroegste biomechanische veranderingen te detecteren die zich voordoen bij het begin van artrose7. Het maakt stijfheidsmetingen mogelijk op zowel micro- als nanometerschaal in native monsters, wat informatie oplevert over de mechanische eigenschappen van gewrichtskraakbeen35,36. In dit protocol hebben we, met behulp van micro-AFM-inkepingen, de elastische eigenschappen van gezonde en osteoartritische gewrichtskraakbeen menselijke explantaten gemeten. De resultaten toonden aan dat de kraakbeenexplantaten zeer representatief zijn voor vroege lokale artrose-gebeurtenissen, met een opmerkelijke geleidelijke afname van stijfheid die optreedt bij patroonspecifieke kraakbeenexplantaten. Bovendien zijn de resultaten in lijn met eerder gepubliceerd onderzoek dat een opmerkelijke afname van de stijfheid liet zien naast de cellulaire patroonorganisatie23,24,27,37.
Bevestigde inheemse menselijke modellen die verschillende aspecten van de pathogenese en progressie van artrose nabootsen, zijn momenteel nodig om de tekortkomingen van translationeel onderzoek en de uitdagingen van het vertalen van in-vitrogegevens naar een klinische setting aan te pakken. Tot op heden kan geen enkel model het complexe inheemse menselijke kraakbeencompartiment nauwkeurig weergeven, laat staan de leeftijdsgebonden gewrichtsweefsels die vatbaar zijn voor artrose als reactie op ziekte-initiërende stimuli38. De meest gebruikte explantatiemodellen tot nu toe waren van runderen of runderen en pasten ofwel een sterke inflammatoire cytokinebehandeling of mechanische belasting toe 39,40,41. Dit protocol, aan de andere kant, laat zien hoe kleine (4 mm x 1 mm) geëxplanteerde schijfvormige menselijke kraakbeenmonsters kunnen worden gegenereerd, die indicatief zijn voor de individuele stadia van specifieke artrose-gebeurtenissen. De kraakbeenexplantaten worden gesorteerd en in een stadium toegewezen met behulp van de cellulaire ruimtelijke organisatie als een op afbeeldingen gebaseerde biomarker30,42. Aangezien vroege veranderingen in biomechanische eigenschappen al kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zodra dubbele snaren beginnen te ontstaan23,27, in een stadium waarin het kraakbeenoppervlak nog steeds macroscopisch intact lijkt26, maakt dit op explantatie gebaseerde model het mogelijk om een lokaal inheems kraakbeencompartiment te onderzoeken en kan het inzichtelijke informatie verschaffen over vroege artrose. Bovendien zou dit kraakbeenmodel nuttig kunnen zijn bij het onderzoeken van de cellen en matrixrespons op mechanische en inflammatoire veranderingen in een 3D inheemse lokale habitat38,39. Omdat ze relatief eenvoudig en gemakkelijk te genereren zijn, kunnen deze kraakbeenexplantaten ook worden gebruikt om de heterogeniteit van artrose te bestuderen, wat een beperkende factor is bij het ontwikkelen en testen van ziektemodificerende artrosemedicijnen43. Er moet ook worden opgemerkt dat schaalbaarheid en afhankelijkheid van patiënten die een gewrichtsvervangende operatie ondergaan twee van de tekortkomingen van het model zijn.
Het is bekend dat gewrichtskraakbeen een eigenaardig gedrag vertoont, afhankelijk van het schaalniveau dat wordt getest. Zoals Loparic et al. aangeven, gedraagt het kraakbeen zich op microschaal als een niet-gestructureerd en uniform materiaal35, en een dergelijke benadering geeft een benadering van de gelokaliseerde algehele kraakbeenstijfheid. Met betrekking tot de vraag of micro- of nano-inkepingen beter geschikt zijn, vergeleek een studie uit 2004 van Stolz et al.44 zowel micro- als nanoschaalinkepingen bij het beoordelen van de structuurmechanische eigenschappen van gewrichtskraakbeen. De auteurs benadrukten dat voor sferische inkeping op microschaal van het gewrichtskraakbeen, de fijne structurele componenten op nanoschaal (d.w.z. individuele collageenvezels en proteoglycanen) gewoonlijk de taak van het dragen van belasting delen. Daarbij verschillen de geaggregeerde mechanische eigenschappen aanzienlijk van die van de afzonderlijke nanocomponenten. Dezelfde auteurs stelden voor dat een combinatie van micro- en nano-inkepingen zou kunnen worden gebruikt om de algehele lokale stijfheidsprofielen van gewrichtskraakbeen te beoordelen, evenals de stijfheid met betrekking tot de fijne structurele componenten44.
Talrijke AFM-gebaseerde indentatieexperimenten hebben scherpe piramidale cantileveruiteinden (straal = 15-20 nm)22,36,44 gebruikt voor het beoordelen van kraakbeenmechanica. Hoewel de nano-inkepingen met scherpe cantilevers momenteel geschikter worden geacht voor het beoordelen van de fijnste mechanische eigenschappen, produceren sferische cantilever-uiteinden resultaten die consistenter en gemakkelijker te modelleren en te interpreteren zijn bij het testen van zachte biologische monsters44,45. Verder toonden Stolz et al. aan dat AFM nano-inkepingen van enzymatisch (d.w.z. elastase) afgebroken gewrichtskraakbeen niet mogelijk zijn omdat het weefsel zo kleverig wordt dat tip-sample adhesie de kracht-afstandscurven domineert, waardoor de gegevens onhaalbaar worden44.
Bij de huidige AFM-metingen werd een cantilever met een bolvormige cantilevertip met een straal van 5 μm gebruikt. De cantileverkeuze werd ingegeven door de intentie om de mechanische eigenschappen van het weefsel over een vrij groot oppervlak te gemiddelden en tegelijkertijd de toegebrachte schade aan het kraakbeenoppervlak te minimaliseren. De relatie tussen de cantilever-uitgeoefende kracht en de resulterende monsterinkeping werd aangepast met het Hertz fit-model. Bij het gebruik van bolvormige indringers wordt het Hertz fit-model aanbevolen, waarbij de aantrekkingskrachten tussen de uitkragende punt en het monsteroppervlak worden verwaarloosd46. De vergelijkingen voor het Hertz-model worden weergegeven in Eq.1 en Eq.2.
Eq.1
Eq.2
Waarbij F = kracht; E = Young's modulus; v = Poisson's ratio; δ = inkeping; a = straal van de contactcirkel; en Rs = straal van de bol.
Het model berekent uiteindelijk de cellulaire/weefselelasticiteit47, formeel uitgedrukt als de Young's modulus (E). Het Hertz fit-model houdt rekening met verschillende kenmerken, zoals de vorm en grootte van de tip, inkeping en vervormbaarheid van het monster. Als niet ideaal aan deze vereisten wordt voldaan, kan het model een onnauwkeurige schatting geven van de Young's modulus46.
Het Hertz fit-model gaat ervan uit dat de rek en elastische spanning lineair afhankelijk zijn van de elasticiteitsmodulus, wat impliceert dat de inkeping in het monster veel kleiner blijft dan de monsterdikte zelf46. Aan deze veronderstelling werd gemakkelijk voldaan in deze opstelling, waarbij de kraakbeenexplantaten een dikte van 1 mm hadden in vergelijking met inkepingen van enkele micrometers.
Gewrichtskraakbeen kan worden gemodelleerd als een poreus visco-elastisch materiaal48,49. Het visco-elastische gedrag is het gevolg van wrijving tussen de intracellulaire/cytoplasmatische of matrixbestanddelen zoals moleculen, organellen en het collageen-proteoglycaannetwerk50,51. Zoals de naam al aangeeft, combineren visco-elastische materialen twee verschillende eigenschappen: stroperig - het materiaal vervormt langzaam wanneer het wordt blootgesteld aan een externe belasting - en elastisch - het materiaal keert terug naar zijn oorspronkelijke configuratie zodra de uitgeoefende belasting is verwijderd52,53. Het visco-elastisch gedrag manifesteert zich als een hysterese tussen de naderings- (verlengde) en retractiecurven in de kracht-afstandscurven 46,52, vergelijkbaar met die verkregen in deze studie (Figuur 4C). Bovendien is een kenmerk van visco-elastische materialen dat hun mechanische eigenschappen afhangen van de vervormingssnelheid, waarbij de stijfheid van het materiaal toeneemt met de snelheid waarmee belasting wordt uitgeoefend (indruksnelheid)54. Door verschillende belastingssnelheden te selecteren, wordt dus een familie van kracht-afstandscurven gegenereerd, die elk de mechanische eigenschappen van het geteste monster bij elke belastingssnelheid vertegenwoordigen52. Bij het vergelijken van de resultaten van verschillende werken is het dus van cruciaal belang om rekening te houden met alle inspringparameters. Over het algemeen gedraagt gewrichtskraakbeen zich bij het meten op micrometerschaal (zoals in deze studie met een bolvormige vrijdragende punt van 5 μm) als een niet-gestructureerd en uniform materiaal, waardoor een cumulatieve elastische modulus wordt gegenereerd die zowel elastische als viskeuze bijdragen aan stijfheid omvat als gevolg van de porovisco-elastische aard van het weefsel35.
Een andere aanname van het Hertz-model is dat de indrukdiepte kleiner is dan de straal van de bolvormige uitkragende punt55. De indrukdiepte vertegenwoordigt de maximale verplaatsing van de vrijdragende punt na het eerste contact met het monster. Bij maximale belasting is de maximale indrukdiepte de totale verplaatsing van het monster en de vrijdragende punt. De richtlijn van Bueckle stelt een maximale indrukdiepte van 10% van de totale dikte van een monster met dezelfde structuur gedurende56, anders variëren de resultaten afhankelijk van de diepte-dikteverhouding. Voor een vrijdragende tipradius van 5 μm waren de kraakbeenexplantaten in deze studie gemiddeld ingesprongen op 1,1 μm, met enkele pieken van 3 μm in enkele gevallen, met name voor de sterk gedegenereerde kraakbeenexplantaten. In dit geval werd naar een compromis gezocht, omdat in de experimentele setting relatief hoge krachten nodig zijn die gepaard gaan met grote inkepingen om de onregelmatigheden in het oppervlak van gedegenereerd kraakbeen te neutraliseren. Een mildere inkeping zou resulteren in het onderzoek van oppervlakkig fibrillatie- en collageenkscheuren, beide gemeenschappelijke kenmerken van sterk gedegenereerd kraakbeen57.
Cruciaal voor het Hertz fit-model is ook de juiste identificatie van het punt waarop de cantilevertip in direct contact komt met het monster, in het algemeen het contactpunt genoemd. Dit kan echter problematisch blijken te zijn bij het inspringen van te kleverige of te zachte monsters, omdat dit kan resulteren in meerdere contactpunten tussen sonde en monster58,59. In feite, zoals mooi benadrukt door A-Hassan et al., is voor zachte biologische weefsels de nauwkeurige bepaling van het contactpunt een van de meest vervelende problemen60. Dit effect werd ook waargenomen bij de oorspronkelijke explantaten van artrosekraakbeen, omdat, afhankelijk van het stadium van degeneratie, het weefseloppervlak zijn oorspronkelijke mechanische eigenschappen verliest en vaak ongelijk is, met oppervlakkige fibrillatie en schisis (Figuur 3B,C). Dit fenomeen werd vooral opgemerkt bij de kraakbeenexplantaten waar het dominante cellulaire patroon grote clusters was (Figuur 2C). Deze inhomogeniteiten in het kraakbeenoppervlak kunnen leiden tot meerdere contactpunten tussen sonde en monster en dus tot foutieve resultaten. In sommige gevallen werden grote doorbuigingen waargenomen, gevolgd door een snel herstel van de basislijn vóór het laatste stuk van de kracht-afstandscurve (figuur 5A). Dit kan worden toegeschreven aan een groot obstakel op het pad van de cantilevertip (bijv. geavanceerde fibrillatiegebieden met rafelen en splijten van kraakbeen). In andere gevallen was de uiteindelijke helling van de kracht-afstandscurve bezaaid met kleinere onregelmatigheden (figuur 5B), wat wijst op contact met achtereenvolgens kleinere hindernissen (bijv. microfibrillatie van het weefsel). In dergelijke gevallen moet de meetlocatie opnieuw worden gemeten of zelfs worden gewijzigd om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de gegevens te garanderen. Daartoe is het ook belangrijk om de kracht-afstandscurve-uitgang van de AFM zorgvuldig te inspecteren voor de juiste identificatie van het contactpunt. Dit is een cruciaal punt om op te letten, aangezien is aangetoond dat een onjuiste identificatie van het contactpunt door 50 nm resulteert in een onjuiste schatting van de waarde van E met een orde van grootte61. Verschillende studies zijn begonnen met het gebruik van geautomatiseerde benaderingen om het contactpunt van kracht-afstandscurven te bepalen, met als doel subjectieve gebruikersinput te omzeilen bij het schatten van het contactpunt door visuele inspectie en de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit wordt nog belangrijker wanneer het gaat om een groot aantal kracht-verplaatsingscurves, zoals die worden gegenereerd in celmechanica-metingen47,62. Hoewel er verschillende strategieën zijn voorgesteld om de bepaling van het contactpunt te automatiseren 47,63,64,65, is de optimale strategie sterk afhankelijk van experimentele omstandigheden en factoren zoals het model dat wordt gebruikt om de gegevens te analyseren, de vorm van de sonde, de (niet-)klevende mechanische interactie tussen de cantilevertip en het monster, evenals het (niet-)Hertziaanse gedrag van het monster 63.
Monsterdrift is een ander veelvoorkomend probleem dat artefacten en foutieve bepaling van het contactpunt kan veroorzaken (Figuur 3E). Het betekent in feite dat de steekproef niet goed in de steekproefhouder (petrischaal) wordt gemonteerd en de steekproef tijdens de AFM-metingen beweegt. Het effect is vooral uitgesproken bij het verplaatsen van de AFM-cantilever naar een nieuwe meetlocatie. Dit aspect kan tijdens de eigenlijke metingen gemakkelijk worden waargenomen door een plotselinge verandering in het brandpuntsvlak. De resulterende kracht-afstandscurven hebben doorgaans een bifasische verlengde helling, met aanvankelijk een lichte stijging, die overeenkomt met de vernauwing van de lege ruimte tussen de onderkant van de schijf en de petrischaal wanneer de schijf door de cantilever naar beneden wordt geduwd (zie figuur 3E), gevolgd door een stevigere helling in het tweede deel van de helling; wat aangeeft dat de schijf verder wordt ingedeukt nu deze in direct contact staat met de bodem van de petrischaal (figuur 5C,D). Om de vervormingen te ondervangen, kan men proberen de monsters beter te fixeren door een geschikte monsterlijm te gebruiken (Figuur 3D), de temperatuur constant te houden door externe warmtebronnen (lampen) uit te schakelen om thermische drift te voorkomen, en snelle scanmetingen uit te voeren. In de experimenten hier hebben we een cantilever-afbuigingsdrift waargenomen die optrad binnen de eerste 15 minuten van de onderdompeling van de cantilever in media (als gevolg van plotselinge temperatuurschommelingen). Na dit tijdsverloop is de drift meestal te verwaarlozen. Als gevolg hiervan adviseren we de onderzoeker om de basislijn zorgvuldig te onderzoeken na vrijdragende onderdompeling en om te beginnen met meten zodra deze is gestabiliseerd. De duur van dit proces kan sterk variëren, afhankelijk van de gebruikte cantilever.
Een andere kritische parameter voor elke AFM-meting is het instelpunt, dat, simplistisch gezegd, een maat is voor de kracht die door de cantilever op het monster wordt uitgeoefend. Voor de contactmodus (zoals gebruikt in deze studie) vertegenwoordigt het instelpunt een bepaalde doorbuiging van de cantilever. Bij het uitvoeren van meerdere scans of meerdere herhalingen op de plaats, zoals in het protocol hier, kan de cantilever-tip deeltjes van het monsteroppervlak adsorberen, waardoor het soms nodig is om de cantilever te verwijderen, goed schoon te maken66 en vervolgens opnieuw te kalibreren voordat u doorgaat met de metingen.
Hoewel AFM-micro-inkepingen nieuwe en interessante mogelijkheden bieden voor het verzamelen van gegevens, met name in de context van artrosekraakbeen, zijn de consistentie en reproduceerbaarheid van de geproduceerde gegevens sterk afhankelijk van verschillende parameters, zoals hierboven beschreven. Bij het gebruik van deze aanpak om de mechanische veranderingen veroorzaakt door degeneratie van kraakbeenweefsel te beoordelen, moeten eerst enkele pilotmetingen aan verschillende ruimtelijke patronen worden uitgevoerd om de resultaten op te schalen naar het specifieke experimentele ontwerp. Pilot AFM-metingen moeten worden uitgevoerd met de meest standaardiseerbare procedure waarbij voldoende monsters (bijv. vijf schijven) van hetzelfde patroon worden genomen om een indicatie te geven van de omvang van de gegevensvariabiliteit. Dit is met name van belang bij het kwantificeren en beoordelen van de vroegste relevante veranderingen in de OA-stijfheid (d.w.z. tussen enkele snaren en dubbele snaren, figuur 4A). In feite toonden we in een eerdere studie, met behulp van een vergelijkbare benadering, aan dat een steekproefomvang van 30 menselijke monsters nodig was om biomechanische veranderingen in de matrix te beoordelen als functie van de ruimtelijke organisatie van de cellen37.
Bovendien zijn veel van de stappen die in dit protocol worden gepresenteerd gevoelig voor menselijke fouten en zijn ze sterk afhankelijk van de ervaring van de operator. Gezien alle factoren die de werkelijke AFM-resultaten kunnen beïnvloeden, zijn de absolute E-waarden die in deze studie worden gerapporteerd niet generaliseerbaar en zijn ze vrij specifiek voor deze experimentele opzet. De hier gepresenteerde relatie tussen de verschillende moduli van Young en de cellulaire patroongebaseerde kraakbeenexplantaten (hoe pathologischer het ruimtelijke patroon, hoe lager de elastische modulus [EM] van het kraakbeen) wordt echter niet beïnvloed, aangezien de bevindingen consistent zijn met eerdere studies die stijfheidsveranderingen laten zien als een functie van cellulaire patroonorganisatie23,37.
Over het algemeen demonstreert dit stapsgewijze protocol de functionaliteit van gestandaardiseerde 3D-native gewrichtskraakbeenexplantaten, die niet alleen representatief zijn voor door artrose veroorzaakte cellulaire reorganisatiegebeurtenissen, variërend van begin tot gevorderde progressie, maar ook geassocieerd zijn met een geleidelijke afname van stijfheid. De explantaten kunnen een betrouwbaar biomimetisch model weerspiegelen voor het bestuderen van het begin en de progressie van artrose, waardoor verschillende behandelingsmodaliteiten ex vivo kunnen worden getest en ontwikkeld. Het gebruik van een dergelijk menselijk explantatiemodel in combinatie met een op AFM gebaseerde biomechanische beoordeling zou kunnen resulteren in een paradigmaverschuiving voor biomedisch onderzoek en de farmaceutische industrie, die de weg vrijmaakt voor nieuwe manieren om de broodnodige effectieve OA-geneesmiddelen te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de orthopedisch chirurgen van de afdeling Orthopedische Chirurgie van het Universitair Ziekenhuis van Tübingen voor het ter beschikking stellen van de weefselmonsters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
| Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
| Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
| Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
| Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
| CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
| CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
| Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
| Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
| Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
| Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
| Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
| Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
| Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
| Statistical program - SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
References
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
- Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
- Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
- Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
- Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C.
- Felson, D. T.
- Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H.
- Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
- Braun, H. J., Gold, G. E.
- Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
- Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
- Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
- Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
- Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
- Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
- Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
- Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
- Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
- Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
- Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
- Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
- Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
- Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
- Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
- Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
- Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
- Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
- Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
- Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
- Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
- Krieg, M., et al.
- Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
- Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
- Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
- Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
- Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
- Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
- Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
- Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
- Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
- Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
- Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
- Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
- Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).
