Summary
原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。
Abstract
原子間力顕微鏡(AFM)は、現在、生物学的分野におけるマイクロやナノキューを評価するための最も強力で有用な技術の1つであることは間違いありません。しかし、他の微視的アプローチと同様に、方法論的な課題が生じる可能性があります。特に、サンプルの特性、サンプル調製、装置の種類、およびインデンテーションプローブは、望ましくないアーチファクトにつながる可能性があります。このプロトコルでは、健康な変形性関節軟骨外植片だけでなく、変形性関節症の関節軟骨外植片に関するこれらの新たな問題を例示します。この目的のために、まず、組織外植片全体の大規模な2Dモザイク蛍光イメージングにより、変性のさまざまな段階に応じてex vivo関節軟骨椎間板を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を段階的なアプローチで示します。ex vivoモデルの主な強みは、老化した天然のヒト軟骨で構成されており、変形性関節症の早期発症から進行までの変化を調査できることです。さらに、組織調製における一般的な落とし穴、および実際のAFM手順とその後のデータ解析についても説明します。サンプルの調製と処理、高度な縮性によって引き起こされるトポグラフィーサンプルの特性、サンプルとチップの相互作用など、基本的かつ重要なステップがデータ取得にどのように影響するかを示します。また、AFMの最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを克服する方法を説明します。これらの限界に関する知識は、正しいデータの取得、解釈、そして最終的には幅広い科学的文脈への発見の埋め込みにとって最も重要です。
Introduction
電子機器やシステムの小型化に伴い、マイクロ・ナノベースの技術や機器の急速な発展が加速しています。そのようなデバイスの1つが原子間力顕微鏡(AFM)で、生体表面をスキャンし、ナノメートルスケールとマイクロメートルスケールの両方で地形情報または生体力学的情報を取得できます1,2。その膨大な機能の中で、このツールは、さまざまな生物学的システムの機械的特性に関する情報を取得するためのマイクロおよびナノインデンターとして操作できます3,4,5,6。データは、先端部で約1nmと小さくなり得る機械プローブを介して表面と物理的に接触することによって収集される7。次に、試料の結果として生じる変形は、片持ち梁先端のくぼみの深さと試料8に加えられた力に基づいて表示される。
変形性関節症(OA)は、関節および周辺組織の関節軟骨の劣化を特徴とする長期の変性慢性疾患であり、骨表面の完全な露出につながる可能性があります。オープンアクセスの負担は相当なものです。現在、65歳以上の女性の半数、男性の3分の1がOA9に罹患しています。外傷、肥満、およびその結果生じる関節10の変化した生体力学は、関節軟骨変性を決定し、これは一般的な最終結果と見なされる。Ganzらの先駆的な研究は、OAプロセスの初期段階には軟骨の生体力学的特性が関与している可能性があると仮定し11、それ以来、研究者はこの仮説を確認してきました12。同様に、組織の生体力学的特性は、超微細構造組織、ならびに細胞間および細胞マトリックスのクロストークによって機能的に調整されることが一般的に認められています。いかなる変化も、組織全体の生体力学的機能に劇的な影響を与える可能性がある13。今日まで、OA診断は臨床的であり、プレーンフィルムX線撮影に基づいている14。このアプローチは2つの側面があります:第一に、OAの診断を定式化するための定義された変性カットオフ閾値がないため、状態の定量化が困難になり、第二に、イメージング法は感度と標準化を欠いており、局所的な軟骨損傷を検出できません15,16,17。この目的のために、軟骨の機械的特性の評価は、疾患の病因に関係なくOAの過程で変化するパラメータを記述し、非常に早い段階で組織の機能に直接影響を与えるという決定的な利点を有する。圧痕器具は、組織が圧痕に抵抗する力を測定します。実際、これは新しい概念ではありません。初期の研究は1980年代と1990年代にさかのぼります。この時期、多くの研究により、関節軟骨の関節鏡視下測定用に設計された圧痕器具が軟骨の変性変化を検出するのに適している可能性があることが示唆されました。30年前でさえ、いくつかの研究は、関節鏡検査中に圧縮剛性測定を行うことにより、組織変性中の軟骨表面のin vivo変化をインデンテーション機器が検出できることを実証することができました18,19,20。
関節軟骨のAFMインデンテーション(AFM-IT)は、組織の極めて重要な機械的特性、すなわち硬さに関する情報を提供します。これは、加えられた非破壊荷重と、くぼみのある組織領域21の結果として生じる変形との関係を記述する機械的パラメータである。AFM-ITは、巨視的に影響を受けていないコラーゲンネットワークにおける硬さの加齢による変化を定量化できることが示されており、したがって、OA発症に関連する病理学的変化(関節軟骨のアウターブリッジスケールでグレード0)を区別することができます22。AFM-ITは、軟骨細胞の早期変性を示す画像ベースのバイオマーカーとして、軟骨細胞の空間的組織化に基づいて、定量化だけでなく、最も初期の変性機械的変化を実際に特定できることを示しました。これらの発見は、すでに他の人によって確認されています23,24。したがって、AFM-ITは、初期の変性変化を診断および特定するための興味深いツールとして機能します。これらの変化はすでに細胞レベルで測定されており、OAの病態生理学的プロセスの理解を再構築しています。
このプロトコルでは、天然の軟骨外植片の準備からAFMデータの取得と処理まで、関節軟骨外植片の完全な組織学的および生体力学的等級付け手順を実証します。ステップバイステップのアプローチにより、2D大型モザイクイメージングとそれに続くマイクロAFMインデンテーションにより、変性のさまざまな段階に応じて関節軟骨組織を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を示します。
現在、AFM-ITは、他の機器技術と同様に、軟骨の生体力学的変化を測定するための最も感度の高いツールの1つですが7、誤ったデータ収集につながる可能性のある制限と実用的な特殊性25があります。そのために、軟骨外植片のAFM測定中に発生する最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを最小化または克服する方法を説明します。これらには、サンプルの地形的側面と、AFM互換環境でサンプルを安定させることの難しさ、組織表面の物理的特性、およびそのような表面でAFM測定を行うことの難しさが含まれます。また、誤った力-距離曲線の例も示され、それらを引き起こす可能性のある条件が強調されています。また、カンチレバー先端の形状に固有の制限や、データ解析にヘルツモデルを使用することについても説明します。
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Protocol
ドイツのテュービンゲン大学病院で人工膝関節全置換術を受けている患者から採取した大腿骨顆が使用されました。この研究には、変性および心的外傷後関節病変のある患者からの関節軟骨サンプルのみが含まれていました。研究の開始前に、部門、機関、および地域の倫理委員会の承認が得られました (プロジェクト番号 674/2016BO2)。参加前にすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが受け取られました。
注:実験ステップのフローチャートを時系列で示したものを 図1に示します。
1. 組織処理と軟骨椎間板の作製
- 組織の準備
- 術後切除後、軟骨サンプルを、5%(v / v)ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)で満たされた容器に入れます。サンプルが培地に完全に浸されていることを確認してください。外科的切除と軟骨のさらなる処理の間の期間は24時間を超えてはなりません。サンプルの乾燥を防ぐために、処理全体を通して、サンプルが培地に完全に浸されていることを確認してください。
- メスを使って軟骨を骨から切り取ります。
- 軟骨椎間板の生成
- 生検パンチを使用して直径4mmの軟骨椎間板を生成します。
注:軟骨層の厚さが1mmを超える顆の領域を選択して切除することが重要です。これは、特に軟骨層が通常、摩耗や損傷プロセスまたは変性のために厚さを失う耐荷重ゾーンの周りで問題になる可能性があります。 - 以前に作成した4mmの軟骨椎間板を特注の切断装置に置き、へらで軟骨椎間板を固定して安定させます。軟骨ディスクを切断装置に置くときは、注意が必要です。軟骨の最上層(関節軟骨の表層部)がブレードに面しないようにサンプルを配置します
- 軟骨椎間板をカミソリの刃で切ります。したがって、4 mm x 1 mmの円盤状の軟骨サンプルが生成されます。サンプルの乾燥を防ぐために、組織切断はできるだけ早く行ってください。
- スパチュラの助けを借りて各椎間板を回収し、生成された軟骨椎間板を、5%(v / v)ペニシリンストレプトマイシンを添加した1mLのDMEMを含む1.5mLのチューブに入れます。1本のチューブに約15枚のディスクを入れます。
- 生検パンチを使用して直径4mmの軟骨椎間板を生成します。
- 軟骨椎間板のクライオトーム切片(垂直スライス用)
注:このステップはオプションであり、軟骨椎間板内の細胞パターン分布を横から視覚化したい場合に使用できます。細胞パターンの分布は関節軟骨26の3D特徴であるため、検証方法として用いることができる。共焦点顕微鏡を用いた軟骨椎間板全体の光学的切片作成および3D再構成も使用でき、したがって、プロトコルに記載されているようにサンプルを切片化する必要がなくなります。- 軟骨椎間板を水溶性包埋剤で覆い、クライオトームノブの端に置きます(椎間板の表面がノブの表面に垂直になるようにします)。クライオトーム装置では、包埋培地は低温で凍結します。
- 標準的なクライオトームを使用して、椎間板の中央に達するまで(つまり、凍結切片の長さが4 mmに達したとき)、組織を60 μmの厚さで横向きに切片し、スライスを回収します。椎間板外植片を垂直に切断することで、軟骨のすべてのゾーン(表在性、中層、深部)を視覚化できます。
- スライドガラスで切片を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄して水溶性包埋剤を除去します。
2. 細胞空間パターンの関数としての軟骨椎間板選別
- 円盤状軟骨サンプルの染色
- 軟骨ディスク(セクション1.2)を96ウェルプレートの各ウェルに1枚ずつ置き、130 μLの細胞透過性蛍光色素を1:1,000の希釈率で各ウェルに添加します。
- プレート全体を目視検査し、各ウェルにディスクが1枚だけ配置されていることを確認します。プレートを標準細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
- 60μm軟骨切片の染色
- 軟骨椎間板切片(セクション1.3)を鉗子の助けを借りてガラス顕微鏡スライドにそっと置きます。
- 核DAPI対比染色を含む封入剤で軟骨切片を覆い、蛍光顕微鏡に適したカバーガラスを静かに配置します。
- 各カバーガラスの端を通常の透明なマニキュアで密封し、3分間乾かします。
- トップダウンおよびサイドビューの軟骨の選別とイメージング
注意: 各ディスクは蛍光顕微鏡で検査する必要があります。このステップの目的は、主要なセルパターン(シングルストリング、ダブルストリング、小さなクラスター、大きなクラスター、または拡散)に基づいてディスクを並べ替えることです。- 96ウェルプレートを蛍光顕微鏡のプレートホルダーに置きます。
- Em 495 nm/Ex 515 nm(セクション2.1で作製した軟骨椎間板のトップダウンイメージング用)またはEm 358 nm/Ex 461 nm(セクション2.2で作製した軟骨切片のサイドビューイメージング用)と10倍対物レンズのいずれかの適切な蛍光フィルターを選択します。
注:10倍対物レンズを使用すると、ディスクの全周を検査でき、不均一または不適切な染色を含むサンプルを除外できます。しかし、トップダウンの視点だけでは、表在性侵食によってトップダウン観察で見える深層組織層の解析の結果として、細胞組織の変化が知覚される可能性があります。一例として、コラーゲンアーケードに続く上向きの文字列は、単一の細胞または散乱した細胞(拡散パターン)として知覚される可能性があります26。そのため、ディスクの両面を検査して、適切なセルラーパターンの選択を確認する必要があります。 - 各軟骨椎間板に表示される細胞パターンを視覚的に決定します。椎間板が1種類の細胞パターンしか持たないことはまずありません。軟骨細胞の配列が目的のパターンと一致しない椎間板の部分については、望ましくないパターンがAFM測定が行われていない非常に周辺部(すなわち、椎間板の境界から0.5mmまで)にある場合にのみサンプルを受け入れ、これが椎間板の全表面の10%を超えないようにします27。28。
- 軟骨椎間板全体の画像取得
- 顕微鏡の10倍対物レンズを選択し、個々の軟骨椎間板を含む事前に選択されたウェルの下に配置します。椎間板に焦点を合わせて、細胞のパターンを確認します。
- ナビゲーター機能を選択すると、坑井全体の概要が表示されます。マウスの左ボタンを使用してドラッグし、別のステージ位置に移動します。マウスホイールを使用して、ズームインおよびズームアウトします。
注: この時点で、各関心領域を順番にダブルクリックすると、サンプル全体を含むウェルのプレビューを表示できます。 - スキャンする対象領域を囲む正方形を選択します。この時点で、モザイクを構成するすべての単一タイルが表示されます。
- 露出/光の強さを調整して、セルが背景からはっきりと見えるようにします。この時点で、画像の明るさ/コントラストはすべてのタイルで調整されており、タイルごとに個別にカスタマイズすることはできなくなりました。
注:椎間板の端付近の細胞は、中央の細胞よりも高い蛍光シグナルを発することが多いため、露光量/光強度の設定を調整する必要があります。- 露光時間が特定のチャンネルに適しているかどうかを評価するには、ヒストグラムの信号の分布を調べます。顕微鏡の画像ソフトウェアに搭載されている自動露光機構を使用して、ディスク内に存在するすべての細胞を視覚化します。
- ソフトウェアの [フォーカス マップ ポイント ] オプションを選択し、タイルの中央を左クリックして個々のタイルを選択します。
- 「 フォーカスマップ」オプションを選択します。ウィンドウが開き、以前に選択したすべてのタイルが表示されます。リスト内のタイルをダブルクリックすると、そのタイルが表示され、適切なフォーカスが置かれます。
- 「 Z を設定 」をクリックしてフォーカル・プランを保存し、次のタイルに進みます。個々のタイルのフォーカルプランを調整した後、[ スキャンの開始]を押して画像取得を開始します。
- スキャンで横棒や縦棒が暗くなる場合は、単一フレームの照明が不適切で不均一であることが原因である可能性があります。この問題を解決するには、実際のスキャンの前にソフトウェアに組み込まれている リンク シェーディング オプションを使用します。
- 画像を保存、エクスポートし、正しく注釈を付けます。
3. 軟骨外植片の生体力学的アプローチ
- AFM測定用のサンプル調製
- 細胞パターン(セクション2)を含む事前に選択された各軟骨椎間板を、生体適合性接着剤を使用してペトリ皿に固定します。ディスクの上面、下面、左側面、右側面に十分なサンプル接着剤を追加します。
- L-グルタミンを含まないリーボビッツのL-15培地2.5 mLでディスクを覆います。Leibowitz培地をサンプルにそっと添加し、培地によって発生する波によるサンプルの剥離を防ぎます。
- AFMへのサンプルのロード
- シャーレをAFM装置のサンプルホルダーにセットし、37°Cに設定したシャーレヒーターをオンにします。 組織培養皿を所望の温度に到達させます。これは、温度変化によって引き起こされる可能性のあるアーティファクトを排除するために行われます。
- AFM-カンチレバーキャリブレーション
- Danalache et al.29 で以前に説明したように、ソフトウェアのセットアップを初期化します。
- 液体測定に適したガラスブロックカンチレバーホルダーを選択し、AFMヘッドに慎重に配置します。ロック機構により、ガラスブロックをAFMヘッドに固定します。ガラスブロックの反射面がまっすぐで、AFMホルダーと平行であることを確認してください。
- ガラスブロックカンチレバーホルダーの表面にカンチレバーを注意して置きます。カンチレバー自体は、ガラスブロックの中央にある研磨された光学面に置く必要があります。
- カンチレバーホルダーの底面にシリコンスカート(シリコンメンブレン)を慎重に置き、AFMヘッド内の媒体結露を防ぎます。
- カンチレバーが媒体に完全に沈むまで、ステッピングモーター機能を使用して100μmステップでカンチレバーを下げます。
- Danalache et al.29 によって記述されたアプローチ パラメーターを使用してスキャナー アプローチを実行します。ペトリ皿の底に達したら、カンチレバーを100μm引っ込めます。
- 正確な手順でカンチレバーを校正し、Danalache et al.29 によって記述されたパラメータを実行します。キャリブレーションの最後に、垂直方向のたわみは、ボルト(V)ではなく、ニュートン(N)の力の単位(フォトダイオード検出器による元のレジストレーションの単位)で保存および表示されます。ここでの実験では、キャリブレーション後に4.47 nNの設定値が得られました。
- ステッピングモーター機能を使用して、カンチレバーを1,000μmまで後退させます。
- AFM下での所望の軟骨測定部位の特定
注:軟骨ディスクの厚さが1mmであるため、サンプル上をナビゲートしている間、カンチレバーは視野に見えません。- 顕微鏡のCCDカメラを使用して、カンチレバーを特定します。AFMカンチレバーは、ペトリ皿のサンプルフリーエリアに配置する必要があります。
- Danalache et al.29 によって記述されたのと同じパラメータを使用して、ペトリ皿の清潔でサンプルのない領域にカンチレバーでスキャナーアプローチを開始します。
- さらに、ステッピングモーター制御でカンチレバーをプレートの底から1.5mm引き込みます。このステップは、カンチレバーとサンプルの直接衝突を避けるために重要です。
- 明視野表示から蛍光表示に切り替えて、ディスクの上部を視覚的に識別します。
- AFMサンプルホルダーをディスクの中央に向かって正確に2mm動かします。この点が軟骨椎間板の中心と考えられています。
- スキャナーアプローチを実行し、軟骨椎間板の表面に達したら、カンチレバーを100μm後退させます。
- 力-距離曲線測定
- 目的の測定部位に配置された細胞に焦点を合わせます。Runボタンをクリックして、測定を開始し、目標位置で力-距離曲線を生成します。
- 各測定部位で5つの力-距離曲線を取得します。カンチレバーを500μm後退させ、カンチレバーを次の測定場所に移動します。
注:軟骨椎間板の表面は均質ではなく、不規則性があるため、カンチレバーの収縮は重要なステップです。サンプル表面のヒロックが高いと、劇的な衝突が発生し、望ましくないカンチレバーチップ/サンプルの損傷につながる可能性があります。ディスクの表面に分散した5つの異なる測定部位を少なくとも5つ選択し、各部位で少なくとも5つの力-距離曲線を取得することをお勧めします。 - 力-距離曲線を検査し、保存します。
- ヘルツ近似モデルを用いたヤング率の推定
- 解析する生成した力-距離曲線(.jpkファイル)をデータ解析ソフトウェアでOpen a Batch of Spectroscopy Curves オプションを使用して開きます。
- ヘルツ近似モデルを選択し、弾性近似オプションを選択します。
- 弾性フィットオプションは、選択した力-距離カーブに対して次の計算を自動的に実行します。 ベースラインを計算し、カーブ全体から減算してベースラインオフセットを削除します(ベースラインはY軸上でゼロに戻ります)。力-距離曲線がゼロ力線と交差する点を検出して接触点を決定します(接触点はx軸上でゼロに設定されます)。チップとサンプルの分離を計算します(カンチレバーの曲がりを考慮したピエゾの高さ信号を差し引く)。をクリックし、力-距離曲線を選択したモデルに自動的に適合させます。所望であれば、これらの各ステップを独立して実行することもできる。
- 次のフィットパラメータを使用して適応します:ポアソン比0.5と適切な片持ち梁先端半径。
注意: 球形のカンチレバーチップを備えたカンチレバーを使用する場合は、ヘルツフィットモデルを使用する必要があります。本研究で用いたカンチレバーは、先端が半径5μmの球形であった。最大適用力(設定値)に達するまで、力-距離曲線をフィッティングすることをお勧めします。 - 力と距離の曲線のフィットを目視で確認して、正確であることを確認します。このステップは、解析された力-距離曲線ごとに実行する必要があります。
- くぼみの深さの決定
注: 使用しているデータ分析ツールによっては、このプロセスが異なる場合があります。実験者は、データ解析プログラムに含まれる一連の手順に従うことで、くぼみの深さを簡単に読み取ることができます。- 生成された各力-距離曲線をデータ解析ソフトウェアで開き、解析プロセスとして ヘルツ近似モデル を選択します。
- [ 基線オフセットの減算 ]オプションを適用して垂直方向のたわみ軸(y軸)をゼロにし、[ オフセット+チルト ]機能を選択します。
- 接触点 の検索 機能を使用すると、接触点が自動的に識別され、自動的に x 座標が 0 になります。
- Vertical Tip Position関数を使用して、インデント中の生のピエゾ高さからカンチレバーのたわみのみを考慮した距離を差し引きます。
- [ 弾性フィット ]オプションを選択して、処理された力-距離曲線を表示し、垂直 先端位置軸 (X 軸)上で最も負の値と揃うようにグラフの領域を選択します。
- パラメータタブの[X Min]ボックスからインデントを読み取り、文書化します。結果を保存して文書化します。
4. 統計解析
- 統計ソフトウェアを開きます。ドロップダウンメニューから [ 新しいデータセット ] を選択します。
- DataSetファイルを選択した後、変数ビュータブを開きます。各セルパターンカテゴリの数値変数を定義します:単一文字列 = SS、二重文字列 = DS、小さなクラスター = SC、大きなクラスター = BC、拡散、ヤング率。
- データ表示タブで、対応するセルパターンカテゴリごとに測定されたヤング率データを入力します。メニュー バーから [分析] を選択し、次に [探索的データ分析] を選択して、データ分布を分析します。
- 従属変数として「 ヤング率 」を、因子リストとして 「細胞パターン 」を選択します。結果セクションに使用される箱ひげ図は、出力ファイルの結果の中に表示されます。
- 統計分析を実行するには、分析メニューバータブのノンパラメトリック検定セクションで従属サンプルを選択します。フィールドタブで、テストフィールドとしてヤング率を選択し、グループとしてセルラーパターンを選択します。 [実行]を押します。
注: 結果は出力ファイルに表示されます。統計分析では、フリードマン検定が実行されます。 - ノンパラメトリック検定の p値をステップ4.4で作成した箱ひげ図に組み込みます。メニューバーの 「ファイル 」をクリックし、「 保存」を選択して結果を保存する。
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Representative Results
自作の切断装置を用いて、単一糸(SS、図2A)、二重糸(DS)、小クラスター(SC)、大クラスター(BC;図2A)、および拡散(図2B)です。代表的な軟骨外植片を図3Aに示します。1種類のパターンのみを表示するディスクの選択は、トップダウン蛍光イメージングを使用して行われました(図2)。軟骨表面円板のトポグラフィー的変化は、軟骨円板から生成された厚さ60μmの切片の側面画像によってさらに示されました(図2C)。摘出された変形性関節症軟骨椎間板の表面には、表在性細動とマトリックスの裂け目が見られました(図3B、C)。これは、BCの存在によって表される進行したOA進行を代表する椎間板で特に顕著でした(図2A)。蛍光選別後、ディスクの剛性をAFMマイクロインデンテーションで評価しました。この目的のために、生成された軟骨ディスクは、測定中のサンプルの漂流を避けるために、生体適合性接着剤(図3D)を使用してAFMペトリ皿に正常に固定されました(図3E)。使用する接着剤の量を調整する必要があります。接着剤の量が不十分な場合、椎間板が不安定になり、接着剤を入れすぎると、軟骨椎間板の下や上に接着剤が不必要に広がる可能性があります。後者は、測定アーチファクトと蛍光顕微鏡下での椎間板の識別不良につながります。固定中の接着剤の塗布が不十分であったり、サンプルが突然動いたりすることは、組織がペトリ皿から剥離する原因となる頻繁な問題であり、避けるべきです。
セルパターンの配置に沿った代表的な漸進的な剛性低下を 図4Aに示します。剛性値は、SS(中央値2.6 kPa)を含む椎間板で高く、損なわれていないヒース軟骨領域を代表しています。OAの開始と進行に伴い、AFM測定では、DS(1.5 kPa)で42%、SC(0.6 kPa)で77%、最終的にBC(0.3 kPa; 図4A)。拡散パターンを含むディスクは、ヤング率の単一値の重要な変動を伴う高い弾性を示しました。主要な細胞パターン構成が割り当てられたすべての軟骨椎間板について、採用された設定値(4.477 nN)に関連するくぼみの深さは、硬さに反比例することがわかりました(図4B)。代表的な力-距離曲線を図 4Cに示し、ヘルツ近似と接触点の同定を 図4Dに示します。
正しい適合は、他の要因の中でも特に、ベースラインの正しい決定に依存します。自動ベースライン検出がエラーの場合(たとえば、ベースラインの乱流が原因で)、フィットを手動で決定することもでき、ユーザーは測定に対してより代表的なベースラインを選択できます。ただし、生成された力-距離曲線が適切なフィットを許さない場合は、破棄する必要があります。図 5 は、不正確な力-距離曲線の例を示しています。変形性関節症の関節軟骨外植片で適切な力-距離曲線を生成することは、一方では組織の不規則な表面(例は図5A、Bに示されています)と、不適切なサンプル固定によって引き起こされるサンプルの不安定性(図5C、Dに示されている例)のために困難な場合があります。アーチファクトは、複数のプローブとサンプルの接触点(変性した軟骨の不均一な表面による)または不要な組織の動き(焦点面の変化によって見える)によって引き起こされる可能性があります。これらのアーチファクトは、生成された力-距離曲線に見られ、AFMカンチレバーと軟骨表面の接触が最適でないか、サンプルがペトリ皿に不適切に固定されていることを示しています(図5A-Dを参照)。
図1:実験手順のフローチャート。 術中の軟骨サンプルの切除から始まり、4 mm x 1 mmの軟骨ディスクの作製、トップダウンおよびサイドビューイメージングによる細胞パターン構成に基づくディスクの蛍光染色と選別、そして最終的には原子間力測定による弾性評価までの実験ステップを時系列でまとめています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:代表的な軟骨椎間板の蛍光イメージング 。 (A)モザイク2D画像および100倍倍の倍率で細胞膜透過性色素で染色された軟骨椎間板のズームされた例示的なフィールド。上のディスクには代表的なシングルストリングディスクが表示され、下のディスクは大きなクラスターディスク(下)の代表です。(B)表面から見た拡散パターンの円盤(上)と、同じ円盤を下側から見たモザイク写真(下)。(C)軟骨椎間板の60μmスライスの核染色の側面図。白いスケールバーは、モザイク写真(広い視野、A[左パネル]、B、C)が500μm、ズームインして焦点が合った写真(A[右パネル])が100μmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:移植された関節軟骨椎間板。 (A)新鮮なヒト関節軟骨から作製した4mm×1mmの軟骨椎間板外植片の代表画像。白で示したスケールバーは2mmを表しています。 (B)組織表面に肉眼的に見える表在性細動と裂け目を示す天然変形性関節軟骨の代表画像。白で示したスケールバーは1,000mmを表しています。 (C)細動軟骨表面の模式図。(D)AFM測定に先立ち、(E)に示すように、実際の圧痕測定中にサンプルが漂うことによるアーチファクトを避けるために、各軟骨椎間板外植片を生体適合性サンプル接着剤を使用してAFMシャーレの表面に適切に固定しました。白いスケールバーは 4 mm を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:関節軟骨椎間板の原子間力顕微鏡測定の代表的な結果 。 (A)1人の患者に由来する5つの椎間板(細胞パターンごとに1つずつ)のヤング率を計算した中央値を示す箱ひげ図。各ディスクで合計 25 回の測定を行いました (5 つの異なる測定部位に対して 5 回の測定)。四角形の内側の黒い線は中央値を表し、四角形の下端と上端はそれぞれ第 1 四分位数と第 3 四分位数を表し、エラーバーは各グループの最小値と最大値を表します。(B)各セルパターンの125個の圧痕深さポイントを描いた点プロット。(C)ヤング率0.4kPaの計算値でAFMで取得した例示的な力-距離曲線。(D)(C)に示す力-距離曲線の代表的なヘルツ近似と接触点の決定。X 軸には、垂直方向の先端位置(ピエゾが交差する距離で、力-距離曲線の接触部分からカンチレバーの曲げを考慮した長さが自動的に差し引かれます)が表示されます。※p <0.05。統計分析には、フリードマン検定が用いられた。略語: SS = 単一文字列。DS = double 文字列;SC = 小さなクラスター。BC = 大きなクラスター。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:誤った力-距離曲線の例 。 (A)力-距離曲線は、表面の連続的なくぼみが観察される前に、大きな偏差を示し、その後、ベースラインレベル近くで回復します。この現象は、比較的大きな障害物(例えば、軟骨の最上層から突き出た大きな表面裂け目)に起因する可能性があります。(B)拡張された力-距離曲線は、複数の小さなピークを示しています。これらの曲線は、軟骨表面のミクロスケールの凹凸(細動など)によって引き起こされると考えられています。(C)と(D)はどちらも、二相性コースの力-距離曲線を表示します。どちらの力-距離曲線も、サンプルの固定とサンプルドリフトが不十分であることを表しています。また、このような場合、焦点面に急激な変化が見られることも非常に一般的です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
進行性および多因子性疾患として、OAは関節軟骨の構造的および機能的変化を引き起こします。OAの過程を通じて、機械的特徴の障害は、関節軟骨の表面における構造的および生化学的変化を伴う27,31。OAで発生する最も初期の病理学的事象は、コラーゲンネットワークの破壊と組み合わされたプロテオグリカンの枯渇である32,33,34。このような初期の微妙な表面変化は、機械的挙動が組織全体の深さにわたって平均化されるため、バルク試験で特定して特定することは困難です。さらに、臓器や組織レベルでの機能的変化が、ミクロまたはナノスケールの構造的および機能的変化に関連しているかどうかという問題もまだ解決されていません。このため、AFMは最も感度の高い方法の1つであり、OA発症に伴って発生する最も初期の生体力学的変化を検出できると考えられています7。天然サンプルのマイクロメートルスケールとナノメートルスケールの両方で剛性測定が可能になり、関節軟骨の機械的特性に関する情報を提供します35,36。このプロトコルでは、マイクロAFMインデンテーションを使用して、健康な変形性関節軟骨ヒト外植片の弾性特性を測定しました。その結果、軟骨外植片は初期の局所OAイベントを非常に代表しており、パターン特異的な軟骨外植片で剛性の顕著な緩やかな低下が見られることが示されました。さらに、この結果は、細胞パターン組織23,24,27,37とともに顕著な剛性の低下を示した以前に発表された研究と一致しています。
現在、トランスレーショナルリサーチの不足やin vitroデータを臨床現場に翻訳する際の課題に対処するために、OAの病因と進行のさまざまな側面を模倣する裏付けのあるネイティブヒトモデルが必要です。今日まで、複雑な天然のヒト軟骨区画を正確に表現できるモデルはなく、ましてや、疾患開始刺激に反応してOAになりやすい加齢性関節組織は言うまでもない38。これまでで最も一般的に使用された外植体ベースのモデルは、ウシまたはウシ由来のものであり、強力な炎症性サイトカイン処理または機械的負荷のいずれかを適用しました39,40,41。一方、このプロトコルでは、特定のOAイベントの個々の段階を示す小さな(4 mm x 1 mm)外植された円盤状のヒト軟骨サンプルを生成する方法を示します。軟骨外植片は、画像ベースのバイオマーカー30,42として細胞空間構成を使用して分類され、段階が割り当てられます。軟骨表面がまだ肉眼的に無傷に見える段階で、二重ストリングが発生し始めるとすぐに、生体力学的特性の初期の変化をすでに特定および定量化できるため23,27、この外植片ベースのモデルは、局所的な天然軟骨区画の調査を可能にし、早期OAに関する洞察に満ちた情報を提供する可能性があります。さらに、この軟骨モデルは、3Dネイティブの局所生息地における機械的および炎症性変化に対する細胞およびマトリックスの応答を調査するのに役立つ可能性があります38,39。これらの軟骨外植片は、比較的単純で生成が容易であるため、疾患修飾OA薬の開発および試験における制限要因であるOAの不均一性の研究にも使用できる43。また、拡張性と関節置換手術を受ける患者への依存性が、このモデルの2つの欠点であることにも注意する必要があります。
関節軟骨は、検査するスケールレベルに応じて特異な挙動を示すことはよく知られています。Loparic et al.によって示されているように、ミクロスケールでは、軟骨は非構造化された均一な材料として振る舞い35、そのようなアプローチは局所的な全体的な軟骨の硬さの近似を与える。マイクロインデンテーションとナノインデンテーションのどちらが適しているかについては、Stolzらによる2004年の研究では、関節軟骨の構造力学的特性を評価する際に、マイクロスケールとナノスケールの両方のインデンテーションを比較しました。著者らは、関節軟骨のミクロスケールの球状のくぼみでは、ナノスケールの微細構造成分(すなわち、個々のコラーゲン繊維とプロテオグリカン)が一般的に荷重を支える役割を分担することを強調しました。そのため、凝集体の機械的特性は、個々のナノコンポーネントの機械的特性とは著しく異なります。同じ著者らは、マイクロインデンテーションとナノインデンテーションの組み合わせを使用して、関節軟骨の全体的な局所剛性プロファイル、および微細構造コンポーネントに関連する剛性を評価できることを提案しました44。
多くのAFMベースの圧痕実験では、軟骨力学を評価するために鋭いピラミッド型のカンチレバーチップ(半径= 15-20 nm)22,36,44が使用されています。鋭いカンチレバーを備えたナノインデントは、現在、最も優れた機械的特性を評価するのに適していると見なされていますが、球状のカンチレバーチップは、柔らかい生物学的サンプルをテストするときに、より一貫性があり、モデル化と解釈が容易な結果を生成します44,45。さらに、Stolzらは、酵素的に(すなわち、エラスターゼ)分解された関節軟骨のAFMナノインデンテーションは、組織が非常に粘着性になり、先端とサンプルの接着が力-距離曲線を支配し、データを実行不可能にするため、不可能であることを実証しました44。
本AFM測定では、球状の片持ち梁先端が半径5μmのカンチレバーを用いた。カンチレバーの選択は、軟骨表面に与える損傷を最小限に抑えながら、かなり大きな表面で組織の機械的特性を平均化する意図によって動機付けられました。カンチレバーが加わった力と結果として生じるサンプルのくぼみとの関係は、ヘルツフィットモデルで適合しました。球面圧子を使用する場合、カンチレバー先端と試料表面との間に作用する引力を無視して、ヘルツフィットモデルが推奨される46。ヘルツ模型の方程式を Eq.1 と Eq.2 に示します。
式1
式2
ここで、 F = 力; E =ヤング率; v = ポアソン比;δ = インデント; a =接触円の半径; Rs = 球の半径。
このモデルは、最終的に、正式にはヤング率(E)として表される細胞/組織の弾性47を計算する。ヘルツフィットモデルでは、先端の形状とサイズ、圧痕、サンプルの変形性など、いくつかの特性が考慮されます。これらの要件が理想的に満たされていない場合、モデルはヤング率46の不正確な推定値を提供する可能性があります。
ヘルツフィットモデルは、ひずみと弾性応力が弾性率に線形的に依存すると仮定しており、これは、サンプルのくぼみがサンプルの厚さ自体よりもはるかに小さいままであることを意味します46。この仮定は、軟骨外植片の厚さが数マイクロメートルの圧痕と比較して1mmであるこのセットアップで容易に満たされました。
関節軟骨は、多孔質粘弾性材料としてモデル化することができる48,49。粘弾性挙動は、分子、細胞小器官、コラーゲン-プロテオグリカンネットワークなどの細胞内/細胞質またはマトリックス成分との間の摩擦から生じる50,51。名前が示すように、粘弾性材料は2つの異なる特性を兼ね備えています:粘性(外部荷重を受けると材料はゆっくりと変形します)と弾性(加えられた荷重が取り除かれると材料は初期状態に戻ります52,53)。粘弾性挙動は、この研究で得られたものと同様に、力-距離曲線46,52のアプローチ(伸長)曲線と後退曲線の間のヒステリシスとして現れます(図4C)。さらに、粘弾性材料の特徴は、その機械的特性が変形速度に依存し、材料の剛性は荷重が加えられる速度(圧痕速度)とともに増加することです54。したがって、異なる負荷率を選択することによって、力−距離曲線のファミリーが生成され、その各々は、各負荷率52における試験試料の機械的特性を表す。したがって、さまざまな作業の結果を比較しようとするときは、すべてのインデントパラメータを考慮することが重要です。全体として、マイクロメートルスケールで測定する場合(5μmの球状片持ち梁先端を用いたこの研究のように)、関節軟骨は非構造化された均一な材料として振る舞い、組織の多孔質粘弾性特性による剛性への弾性および粘性の両方の寄与を含む累積弾性率を生成する35。
ヘルツモデルの別の仮定は、くぼみの深さが球状片持ち梁先端55の半径よりも小さいことである。くぼみの深さは、サンプルとの最初の接触後のカンチレバー先端の最大変位を表します。最大荷重では、最大くぼみの深さは、サンプルと片持ち梁の先端の全体的な変位です。Bueckleのガイドラインでは、56全体を通して同じ構造を持つサンプルの全体の厚さの10%の最大圧痕深さが示されていますが、それ以外の場合、結果は深さと厚さの比率によって異なります。片持ち梁先端半径が5μmの場合、本研究の軟骨外植片は平均1.1μmでインデントされ、特に高度に変性した軟骨外植片では、3μmのピークが数回見られました。この場合、実験設定では、変性軟骨の表面凹凸を中和するために、大きなくぼみに関連する比較的高い力が必要であるため、妥協点が模索されました。より穏やかなくぼみは、高度に変性した軟骨の一般的な特徴である表在性細動とコラーゲン亀裂の検査をもたらします57。
ヘルツフィットモデルにとって重要なのは、カンチレバーの先端がサンプルに直接接触するポイント(一般的に接触ポイントと呼ばれる)を正確に識別することです。しかしながら、これは、多すぎるプローブ−サンプル接触点58,59をもたらす可能性があるため、あまりにも粘着性のある、または柔らかすぎるサンプルをインデントする場合に問題となる可能性がある。実際、A-Hassanらがうまく強調しているように、軟部生体組織の場合、接触点の正確な決定は最も厄介な問題の1つである60。この効果は、変性の段階に応じて、組織表面が本来の機械的特性を失い、しばしば不均一になり、表在性細動と裂け目を示すため、天然の変形性関節症軟骨外植片でも観察されました(図3B、C)。この現象は、主要な細胞パターンが大きなクラスターである軟骨外植片で特に顕著でした(図2C)。軟骨表面のこれらの不均一性は、複数のプローブとサンプルの接触点につながり、その結果、誤った結果につながる可能性があります。いくつかのケースでは大きなたわみが観察され、その後、力-距離曲線の最終ストレッチの前にベースラインが急速に回復しました(図5A)。これは、カンチレバー先端の経路に大きな障害物(例えば、軟骨のほつれや裂け目を伴う進行した細動領域)に起因する可能性があります。他の例では、力-距離曲線の最終的な傾きが小さな不規則性で散乱しており(図5B)、連続して小さな障害(組織の微小細動など)との接触を示しています。このような場合、データの信頼性と再現性を確保するために、測定部位を再測定したり、変更したりする必要があります。そのためには、AFMの力-距離曲線の出力を注意深く検査し、接触点を正しく識別することも重要です。接触点を50 nmで正しく識別すると、Eの値が61桁不正確に推定されることが示されているため、これは注意すべき重要なポイントです。いくつかの研究は、目視検査によって接触点を推定する際に主観的なユーザー入力をバイパスし、精度を向上させることを目的として、力-距離曲線の接触点を決定するために自動化されたアプローチを使用し始めています。これは、セル力学測定47,62で生成されるような多数の力-変位曲線を扱う場合にさらに重要になります。接触点決定を自動化するためにいくつかの戦略が提案されているが47、63、64、65、最適な戦略は、実験条件およびデータの分析に使用されるモデル、プローブの形状、カンチレバー先端と試料との間の(非)接着力の機械的相互作用、ならびに試料63の(非)ヘルツ挙動などの要因に大きく依存する。
サンプルのドリフトは、アーチファクトや誤った接触点の決定を引き起こす可能性のある別の一般的な問題です(図3E)。これは基本的に、サンプルがサンプルホルダー(シャーレ)に正しく取り付けられておらず、AFM測定中にサンプルが動いていることを意味します。この効果は、AFMカンチレバーを新しい測定部位に移動する場合に特に顕著です。この側面は、実際の測定中に焦点面の急激な変化によって容易に観察できます。結果として得られる力-距離曲線は、典型的には二相性の延長勾配を有し、最初は緩やかな上昇があり、これは、椎間板がカンチレバーによって押し下げられるにつれて、椎間板の底部とペトリ皿の間の空の空間が狭くなり( 図3Eを参照)、続いて斜面の2番目の部分でより硬い傾斜が続きます。 ディスクがペトリ皿の底に直接接触しているため、ディスクがさらにへこんでいることを示しています(図5C、D)。歪みを克服するには、適切なサンプル接着剤を使用し(図3D)、外部の熱源(ライト)をオフにして熱ドリフトを回避し、高速スキャン測定を行うことで、サンプルをより適切に固定することができます。ここでの実験では、カンチレバーが媒体に浸かってから最初の15分以内に(急激な温度変化による)カンチレバーのたわみドリフトが観察されました。このタイムラプスの後、ドリフトは通常無視できます。そのため、カンチレバー浸漬後のベースラインを注意深く調べ、安定してから測定を開始することをお勧めします。このプロセスの持続時間は、使用するカンチレバーによって大きく異なります。
AFM測定のもう一つの重要なパラメータは、カンチレバーがサンプルに加える力の尺度であるセットポイントです。接触モード(このスタディで使用)では、設定値はカンチレバーの特定のたわみを表します。ここでのプロトコルのように、数回のスキャンまたは数回の部位の繰り返しを行う場合、カンチレバーの先端はサンプル表面から粒子を吸着する可能性があるため、カンチレバーを取り外し、適切に洗浄し66、測定を進める前に再校正する必要がある場合があります。
AFMマイクロインデンテーションは、特に変形性関節症の軟骨において、新しく興味深いデータ収集の機会を提供しますが、生成されるデータの一貫性と再現性は、上記で概説したように、いくつかのパラメータに大きく依存します。このアプローチを使用して軟骨組織の変性によって引き起こされる機械的変化を評価する場合、結果を特定の実験計画にスケールアップするために、さまざまな空間パターンのパイロット測定を最初に実行する必要があります。パイロットAFM測定は、データのばらつきの程度を示すために、同じパターンの十分なサンプル(例えば、5枚のディスク)を採取する、最も標準化された手順で実施する必要があります。これは、最も初期の関連するOA剛性の変化(つまり、シングルストリングとダブルストリングの間、 図4A)を定量化して評価しようとする場合に特に重要です。実際、以前の研究では、同様のアプローチを使用して、細胞の空間構成の関数としてマトリックスの生体力学的変化を評価するには、30のヒト標本のサンプルサイズが必要であることを示しました37。
さらに、このプロトコルで提示されているステップの多くは、人為的ミスの影響を受けやすく、オペレーターの経験に大きく依存しています。実際のAFM結果に影響を与える可能性のあるすべての要因を考慮すると、この研究で報告された絶対E値は一般化できず、この実験設定に特化しています。しかし、ここで提示された様々なヤング率と細胞パターンに基づく軟骨外植片との関係(空間パターンが病理学的であるほど、軟骨の弾性率[EM]は低くなる)は、細胞パターン構成の関数として剛性変化を示す以前の研究と一致しているため、影響を受けない23,37。
全体として、このステップ・ツー・ステップのプロトコルは、標準化された3Dネイティブ関節軟骨外植片の機能性を実証しており、これは、発症から進行までのOA駆動の細胞再編成イベントを代表するだけでなく、硬さの漸進的な減少にも関連しています。外植片は、OAの発症と進行を研究するための信頼性の高い生体模倣モデルを反映している可能性があり、 ex vivoでさまざまな治療法の試験と開発を可能にします。このようなヒト外植片モデルをAFMベースの生体力学的評価と組み合わせて使用することで、生物医学研究と製薬業界にパラダイムシフトをもたらし、非常に必要とされている効果的なOA薬を特定する新しい方法への道が開かれる可能性があります。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
組織サンプルを提供してくださったテュービンゲン大学病院整形外科の整形外科医に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
| Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
| Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
| Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
| Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
| CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
| CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
| Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
| Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
| Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
| Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
| Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
| Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
| Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
| Statistical program - SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
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