Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

Het vermogen van bacteriofaag om DNA tussen bacteriële cellen te verplaatsen, maakt ze effectieve hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van hun bacteriële gastheren. Hier wordt een methodologie gepresenteerd voor het induceren, herstellen en gebruiken van φBB-1, een bacteriofaag van Borrelia burgdorferi, om heterologe DNA te transduceren tussen verschillende stammen van de ziekte van Lyme spirocheet.

Abstract

Het introduceren van vreemd DNA in de spirocheet Borrelia burgdorferi is bijna uitsluitend bereikt door transformatie met behulp van elektroporatie. Dit proces heeft aanzienlijk lagere efficiënties in de ziekte van Lyme spirocheet in vergelijking met andere, beter gekarakteriseerde Gram-negatieve bacteriën. De mate van succes van transformatie is sterk afhankelijk van het hebben van geconcentreerde hoeveelheden hoogwaardig DNA uit specifieke achtergronden en is onderhevig aan significante variabiliteit tussen stammen. Alternatieve middelen voor het introduceren van vreemd DNA (d.w.z. shuttlevectoren, fluorescerende verslaggevers en antibioticaresistentiemarkers) in B. burgdorferi kunnen een belangrijke aanvulling zijn op het armamentarium van nuttige hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Bacteriofaag is goed erkend als natuurlijke mechanismen voor de beweging van DNA tussen bacteriën in een proces dat transductie wordt genoemd. In deze studie is een methode ontwikkeld voor het gebruik van de alomtegenwoordige borrelfaag φBB-1 om DNA te transduceren tussen B. burgdorferi-cellen van zowel dezelfde als verschillende genetische achtergronden. Het getransduceerde DNA omvat zowel borreliaal DNA als heterologe DNA in de vorm van kleine shuttlevectoren. Deze demonstratie suggereert een potentieel gebruik van faag-gemedieerde transductie als aanvulling op elektroporatie voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Dit rapport beschrijft methoden voor de inductie en zuivering van faag φBB-1 van B. burgdorferi, het gebruik van deze faag in transductietests en de selectie en screening van potentiële transductanten.

Introduction

De ontwikkeling van hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de spirochetale bacterie Borrelia burgdorferi heeft een onmetelijke waarde toegevoegd aan het begrip van de aard van de ziekte van Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi heeft een ongewoon complex genoom dat bestaat uit een klein lineair chromosoom en zowel lineaire als circulaire plasmiden 5,6. Spontaan plasmideverlies, intragene herschikking (beweging van genen van het ene plasmide naar het andere binnen hetzelfde organisme) en horizontale genoverdracht (HGT, de beweging van DNA tussen twee organismen) hebben geleid tot een duizelingwekkende hoeveelheid genetische heterogeniteit bij B. burgdorferi (zie bijvoorbeeld Schutzer et al.7). De resulterende genotypen (of "stammen") zijn allemaal leden van dezelfde soort, maar hebben genetische verschillen die hun vermogen om over te dragen op en infecteren van verschillende zoogdiergastherenbeïnvloeden 8,9,10,11. In dit rapport zal de term "stam" worden gebruikt om te verwijzen naar B. burgdorferi met een bepaalde natuurlijk afgeleide genetische achtergrond; de term "kloon" zal worden gebruikt om te verwijzen naar een stam die genetisch is gemodificeerd voor een bepaald doel of als gevolg van experimentele manipulatie.

De moleculaire toolbox die beschikbaar is voor gebruik in B. burgdorferi omvat selecteerbare markers, genreporters, shuttlevectoren, transposonmutagenese, induceerbare promotors en counter-selectable markers (voor een overzicht, zie Drektrah en Samuels12). Het effectieve gebruik van deze methodologieën vereist de kunstmatige introductie van heterologe (vreemde) DNA in een B. burgdorferi-belangenstam. In B. burgdorferi wordt de introductie van heterologe DNA bijna uitsluitend bereikt via elektroporatie, een methode die een puls elektriciteit gebruikt om een bacterieel membraan tijdelijk doorlaatbaar te maken voor kleine stukjes DNA die in de media worden geïntroduceerd1. De meerderheid van de cellen (geschat op ≥99,5%) worden gedood door de pols, maar de resterende cellen hebben een hoge frequentie van het behoud van het heterologe DNA13. Hoewel beschouwd als een van de meest efficiënte methoden om DNA in bacteriën te introduceren, is de frequentie van elektroporatie in B. burgdorferi zeer laag (variërend van 1 transformator in 5 × 104 tot 5 × 106 cellen)13. De barrières voor het bereiken van hogere frequenties van transformatie lijken zowel technisch als biologisch te zijn. Technische barrières voor de succesvolle elektroporatie van B. burgdorferi omvatten zowel de hoeveelheid DNA (>10 μg) die nodig is als de vereiste dat de spirocheten zich in precies de juiste groeifase bevinden (mid-log, tussen 2 × 107 cellen·ml−1 en 7 × 107 cellen·ml−1) bij het bereiden van elektrocompetente cellen12,13. Deze technische barrières kunnen echter gemakkelijker te overwinnen zijn dan de biologische barrières.

Onderzoekers van de ziekte van Lyme erkennen dat B. burgdorferi-klonen kunnen worden onderverdeeld in twee brede categorieën met betrekking tot hun vermogen om genetisch te worden gemanipuleerd13,14. Hoge passage, lab-aangepaste isolaten worden vaak gemakkelijk getransformeerd, maar hebben meestal de plasmiden verloren die essentieel zijn voor infectiviteit, gedragen zich op een fysiologisch afwijkende manier en zijn niet in staat om een zoogdiergastheer te infecteren of te volharden in een tekenvector12,13. Hoewel deze klonen nuttig zijn geweest voor het ontleden van de moleculaire biologie van de spirocheet binnen het laboratorium, zijn ze van weinig waarde voor het bestuderen van de spirocheet binnen de biologische context van de enzoötische cyclus. Infectieuze isolaten met een lage doorgang daarentegen gedragen zich op een fysiologische manier die een infectieuze toestand weerspiegelt en kunnen de infectiecyclus voltooien, maar zijn meestal recalcitrant voor de introductie van heterologe DNA en zijn daarom moeilijk te manipuleren voor onderzoek12,13. De moeilijkheid bij het transformeren van isolaten met een lage doorgang houdt verband met ten minste twee verschillende factoren: (i) isolaten met een lage doorgang klonteren vaak strak samen, vooral onder de omstandigheden met hoge dichtheid die nodig zijn voor elektroporatie, waardoor veel cellen worden geblokkeerd voor de volledige toepassing van de elektrische lading of de toegang tot het DNA in de media13,15; en (ii) B. burgdorferi codeert ten minste twee verschillende plasmide-borne restriction-modification (R-M) systemen die verloren kunnen gaan in high-passage isolaten14,16. R-M-systemen zijn geëvolueerd om bacteriën in staat te stellen vreemd DNA te herkennen ente elimineren 17. Inderdaad, verschillende studies in B. burgdorferi hebben aangetoond dat transformatie-efficiënties toenemen wanneer de bron van het DNA B. burgdorferi is in plaats van Escherichia coli13,16. Helaas is het verkrijgen van de vereiste hoge concentratie DNA voor elektroporatie van B. burgdorferi een duur en tijdrovend vooruitzicht. Een andere mogelijke zorg bij het elektropoderen en selecteren van isolaten met een lage doorgang is dat het proces de voorkeur lijkt te geven aan transformatoren die het kritische virulentie-geassocieerde plasmide, lp25 14,18,19, hebben verloren; dus, de handeling van het genetisch manipuleren van low-passage B. burgdorferi isolaten via elektroporatie kan selecteren op klonen die niet geschikt zijn voor biologisch relevante analyse binnen de enzoötische cyclus20. Gezien deze problemen zou een systeem waarin heterologe DNA kan worden geëlektrotransformeerd in B. burgdorferi-klonen met hoge passage en vervolgens kan worden overgebracht in infectieuze isolaten met een lage passage via een andere methode dan elektroporatie, een welkome aanvulling kunnen zijn op de groeiende verzameling moleculaire hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor gebruik in de spirocheet van de ziekte van Lyme.

Naast transformatie (de opname van naakt DNA) zijn er nog twee andere mechanismen waarmee bacteriën regelmatig heterologe DNA opnemen: conjugatie, de uitwisseling van DNA tussen bacteriën in direct fysiek contact met elkaar, en transductie, wat de uitwisseling van DNA is gemedieerd door een bacteriofaag21. Inderdaad, het vermogen van bacteriofaag om HGT te bemiddelen is gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor het ontleden van de moleculaire processen binnen een aantal bacteriële systemen 22,23,24. B. burgdorferi is van nature niet bekwaam voor de opname van naakt DNA, en er is weinig bewijs dat B. burgdorferi codeert voor het apparaat dat nodig is om succesvolle conjugatie te bevorderen. Eerdere rapporten hebben echter de identificatie en voorlopige karakterisering beschreven van φBB-1, een gematigde bacteriofaag van B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 pakketten een familie van 30 kb plasmiden gevonden in B. burgdorferi25; de leden van deze familie zijn aangewezen als cp32's. Consistent met een rol voor φBB-1 bij deelname aan HGT onder B. burgdorferi-stammen, rapporteerden Stevenson et al. een identieke cp32 gevonden in twee stammen met anders ongelijksoortige cp32's, wat een recente verdeling van deze cp32 tussen deze twee stammen suggereert, waarschijnlijk via transductie29. Er zijn ook aanwijzingen voor significante recombinatie via HGT bij de cp32's in een verder relatief stabiel genoom 30,31,32,33. Ten slotte is het vermogen van φBB-1 om zowel cp32's als heterologous shuttle vector DNA te transduceren tussen cellen van dezelfde stam en tussen cellen van twee verschillende stammen eerder aangetoond27,28. Gezien deze bevindingen is φBB-1 voorgesteld als een ander te ontwikkelen instrument voor de dissectie van de moleculaire biologie van B. burgdorferi.

Het doel van dit rapport is om een methode te beschrijven voor het induceren en zuiveren van faag φBB-1 van B. burgdorferi, evenals een protocol voor het uitvoeren van een transductietest tussen B. burgdorferi-klonen en het selecteren en screenen van potentiële transductanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten met recombinant DNA en BSL-2 organismen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.

1. Bereiding van de B. burgdorferi-cultuur voor de productie van φBB-1

  1. Bereid Barbour-Stoenner-Kelly medium aangevuld met 6,6% warmte-geïnactiveerd normaal konijnenserum (BSK)15. Combineer voor 1 l 1x BSK de in tabel 1 vermelde componenten in 900 ml water, stel de pH in op 7,6 met 1 N natriumhydroxide en meng langzaam bij 4 °C gedurende 2-4 uur. Nadat het mengen is voltooid, controleert u en past u de pH indien nodig aan op 7,6 en verhoogt u het volume tot 1 l met water. Steriliseer het medium door een filter van 0,22 μM te passeren (zie Materiaaltabel) en gebruik vers of bewaar het bij 4 °C gedurende ≤2 maanden.
  2. Ent drie tot vijf dagen voor aanvang van het transductieprotocol 150 μL van de juiste B. burgdorferi-kloon (s) in 15 ml 1x BSK in goed afgedekte steriele conische centrifugebuizen (zie Materiaaltabel). Vul het medium aan met de juiste concentratie antibiotica of combinatie van antibiotica voor de selectie en het onderhoud van heterologe DNA binnen de B. burgdorferi-kloon (s) (tabel 2).
    OPMERKING: B. burgdorferi is een bioveiligheidsniveau 2 organisme. Neem alle passende voorzorgsmaatregelen tijdens het werken met dit organisme. Voer alle werkzaamheden uit met levende culturen van B. burgdorferi in een gecertificeerde en goed gedesinfecteerde klasse II bioveiligheidskast. Gooi al het materiaal dat in contact komt met B. burgdorferi en de organismen zelf op de juiste manier weg op basis van CDC-richtlijnen34.
  3. Incubeer de culturen bij 33 °C zonder te schudden totdat de culturen een dichtheid van ≥5 × 107 spirocheten·ml−1 bereiken, wat ongeveer 3-5 dagen duurt.

2. Bepaal de dichtheid van de B. burgdorferi cultuur(en) (gewijzigd van Samuels)15

  1. Voor dichtheden die naar verwachting hoger zijn dan 5 × 106 cellen·ml−1, bepaalt u de celdichtheid met behulp van spectroscopie.
    1. Breng 1 ml cultuur over naar een microcentrifugebuis van 1,7 ml en centrifugeer op 8.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4). Breng de volledige celsuspensie over in een semi-micro UV transparant cuvette.
    3. Bepaal de optische dichtheid van het geresuspendeerde monster bij een golflengte van 600 nm (A600). Nul de spectrofotometer (zie Tabel van materialen) tegen PBS.
    4. Om de concentratie spirocheten·ml−1 in de oorspronkelijke cultuur te berekenen, vermenigvuldigt u de optische dichtheid op A600 met 1,4 × 109.
  2. Voor dichtheden die naar verwachting tussen 5 × 104 cellen·ml−1 en 5 × 106 cellen·ml−1 liggen, bepaalt u de celdichtheid met behulp van een Petroff-Hausser-telkamer (zie materiaaltabel) om het aantal spirocheten direct te tellen. Deze methode kan ook worden gebruikt voor hogere dichtheden na passende verdunning.
    OPMERKING: De visualisatie van levende spirocheten vereist een microscoop die is aangepast met een darkfield-condensor.
    1. Breng 10 μL monster aan op de telkamer en dek af met het juiste afdekglas. Voor dichtheden hoger dan 1 × 107 verdunt u het monster in PBS tot 50-100 spirocheten per veld.
    2. Tel de cellen met behulp van een darkfield microscoop bij een vergroting van 200x-400x. Tel het hele veld van 25 groepen van 16 kleine vierkantjes in alle vlakken.
    3. Vermenigvuldig het aantal geteld met de verdunningsfactor (indien aanwezig) en 5 × 104 om cellen·ml−1 van de oorspronkelijke cultuur op te leveren.

3. Inductie van B. burgdorferi faag φBB-1

OPMERKING: Steriliseer al het glaswerk en plasticgoed door autoclaveren; steriliseer alle oplossingen door autoclaveren of filteren door een filter van 0,22 μM. De onderstaande stappen worden weergegeven op basis van volumes van 15 ml, maar de methode is schaalbaar naar kleinere of grotere volumes, afhankelijk van de individuele behoeften van het experiment.

  1. Gebruik voor de B. burgdorferi-cultuur waaruit faag zal worden geproduceerd (de donor), de concentratie berekend volgens een van beide methoden in stap 2 om het volume van de startercultuur te bepalen dat nodig is om 4 ml van 2 × 108 spirocheten·ml−1 op te leveren. Dit levert een eindconcentratie op van 5 × 107 spirocheten·ml−1 in 15 ml tijdens de herstelfase (stap 3.6 hieronder).
  2. Centrifugeer het in stap 3.1 berekende cultuurvolume bij 6.000 x g gedurende 10 minuten. Decanteer het supernatant en resuspenseer de pellet in 4 ml verse BSK. Breng het monster over naar de kleinste steriele buis die beschikbaar is om het monster met minimale ruimte op de kop te houden.
  3. Voeg de juiste hoeveelheid inductiemiddel toe aan de aanbevolen concentratie (tabel 3) op basis van een kweekvolume van 4 ml om de faagproductie te induceren. Sluit de tube goed af en meng grondig.
  4. Incubeer het monster bij 33 °C gedurende 2-4 uur.
  5. Breng het monster na incubatie over naar een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer het monster bij 6.000 x g gedurende 10 minuten. Decanteer het supernatant.
  6. Resuspendeer de celpellet in 15 ml 1x BSK.
    OPMERKING: Na inductie van de faag zijn er twee verschillende manieren om door te gaan met de transductietest. Deze methoden zijn weergegeven in figuur 1 en in stap 4 en stap 6.

4. Transductie tijdens cocultuur na blootstelling van de donor aan het inducerende middel (figuur 1A)

OPMERKING: Dit protocol kan alleen worden gebruikt wanneer de faagproducerende stam (donor) resistentie heeft tegen een bepaald antibioticum en de stam die moet worden overgeheveld (ontvanger) resistentie heeft tegen een ander antibioticum.

  1. Bereid een B. burgdorferi-cultuur voor om te worden gebruikt als de ontvanger in transductietests, zoals beschreven voor de donorstam in stap 1 hierboven. Bereken op basis van de in stap 2 bepaalde dichtheid het volume dat nodig is om 15 ml van 1 × 107 spirocheten·ml−1 op te leveren.
  2. Centrifugeer het in stap 4.1 berekende cultuurvolume bij 6.000 x g gedurende 10 minuten. Decanteer het supernatant.
  3. Resuspendeer de pellet in 1 ml kweek uit stap 3.6 (geresuspendeerde faagdonor). Voeg de geresuspendeerde ontvanger weer toe aan de cultuur met de donor. Niet aanvullen met antibiotica. Het totale volume dat beide culturen bevat, is 15 ml.
  4. Incubeer bij 33 °C gedurende 72-96 uur.
  5. Voer de selectie van transductanten uit door middel van solid-phase plating na co-kweek zoals beschreven in stap 7.

5. Precipitatie van polyethyleenglycol (PEG) om faag terug te winnen voor gebruik bij transductietests

OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt in gevallen waarin de faagproducerende stam (donor) resistentie heeft tegen een bepaald antibioticum en de stam die moet worden overgeheveld (ontvanger) geen antibioticaresistentie of resistentie tegen een ander antibioticum heeft.

  1. Vul de kweek uit stap 3.6 aan met het juiste antibioticum in de in tabel 2 aangegeven concentratie. Incubeer het monster bij 33 °C gedurende 72-96 uur.
  2. Bereid oplossingen voor PEG-neerslag voor.
    1. Bereid 500 ml van 5 M NaCl. Steriliseren door autoclaveren en laten afkoelen voor gebruik. Bewaren bij kamertemperatuur.
    2. Bereid 500 ml 40% PEG door 200 g PEG8000 op te lossen in 400 ml water; verwarm zachtjes tijdens het roeren totdat de oplossing goed gemengd is. Breng het volume op 500 ml met water. Om de PEG8000 volledig op te lossen en de oplossing te steriliseren, autoclaaft u de oplossing en koelt u deze af voor gebruik. Bewaren bij kamertemperatuur.
    3. Bereid 100 ml suspensiemedium (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 en 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Steriliseren door autoclaveren. Bewaren bij 4 °C.
  3. Voor PEG-precipitatie van faag van de donor B. burgdorferi-kloon (uit stap 3.6), na 72-96 uur incubatie, centrifugeer de monsters bij 8.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  4. Decanteer het supernatant in een schone conische buis van 50 ml; gooi de celpellet weg. Voeg 5 M NaCl toe aan een eindconcentratie van 1 M. Meng goed. Schommel zachtjes op kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  5. Centrifugeer de monsters bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatant in een schone conische buis van 50 ml; de pellet kan klein of afwezig zijn. Voeg 40% PEG8000-oplossing toe aan het supernatant tot een eindconcentratie van 10%. Meng goed en zet meer dan 1 uur tot een nacht op ijs.
    OPMERKING: Langere tijden lijken niet te correleren met significant verhoogd faagherstel.
  6. Centrifugeer de monsters bij 8.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en verwijder zoveel mogelijk overtollige vloeistof zonder pellet te verliezen, die de faagdeeltjes bevat.
  7. Resuspendeer de pellet in een minimaal volume SM, gebruik de SM om de zijkant van de fles af te spoelen en eventuele faagdeeltjes te verzamelen. De aanbevolen verhouding is 400 μL SM per 10 ml origineel supernatant, maar afhankelijk van de grootte van de pellet kan meer of minder SM nodig zijn voor volledige resuspensie.
  8. Behandel het teruggewonnen faagmonster met een gelijk volume chloroform op basis van het volume resuspensie. Meng het monster goed en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 8.000 x g . Verwijder de waterige (bovenste) laag naar een schone buis en vermijd een van de dikke interfacelagen.
    OPMERKING: φBB-1 is een niet-omhulde bacteriofaag en is niet gevoelig voor chloroformbehandeling25. Deze stap wordt gedaan om membraangebonden structuren (d.w.z. cellen of blebs) verder te verstoren en om potentiële cellulaire verontreinigingen te doden. Chloroform is een vluchtige organische stof en mag alleen worden gebruikt in een goed geventileerde zuurkast; materiaal dat chloroform bevat als organisch afval teruggooien.
  9. Bepaal het volume dat na de eerste chloroformbehandeling is teruggewonnen en behandel het monster opnieuw met een hoeveelheid chloroform gelijk aan 10% van dat volume. Meng goed en centrifugeer op 8.000 x g gedurende 10 min. Verwijder de waterige (bovenste) laag en zorg ervoor dat u de interface- of organische laag vermijdt. Breng de waterige laag over op een schone buis.
  10. Gebruik de faag onmiddellijk (zoals beschreven in stap 6) of bewaar bij 4 °C.
    OPMERKING: Het invriezen van φBB-1 faagmonsters wordt niet aanbevolen. Hoewel de stabiliteit van φBB-1 bij 4 °C niet grondig is onderzocht, zijn monsters die tot 1 maand na herstel bij 4 °C zijn opgeslagen, met succes gebruikt bij transductietests.

6. Transductietest na PEG-neerslag van φBB-1 (figuur 1B)

  1. Bereid B. burgdorferi-culturen voor om te worden gebruikt als de ontvanger bij transductietests, zoals beschreven voor de donorstam in stap 1 hierboven. Bereken op basis van de dichtheid die is bepaald zoals in stap 2, het volume van de cultuur van de ontvanger dat nodig is om 15 ml van 1 × 107 spirocheten·ml−1 op te leveren.
  2. Centrifugeer het in stap 6.1 berekende cultuurvolume bij 6.000 x g gedurende 10 minuten. Decanteer het supernatant en resuspendeer de pellet in 14,5 ml verse BSK.
  3. Voeg ≤ 500 μL PEG-geprecipiteerd faagmonster (uit stap 5) toe aan de cultuur van de ontvanger kloon. Meng goed en incubeer bij 33 °C gedurende 72-96 uur.
    OPMERKING: De hoeveelheid faag die tijdens PEG-neerslag wordt teruggewonnen, kan variabel zijn, afhankelijk van een aantal factoren. Echter, van 15 ml kweek van geïnduceerde B. burgdorferi stam CA-11.2A, bevat 500 μL meestal 50-1.000 levensvatbare faag28. Volumes van faagherstel ≥ 500 μL hebben een negatieve invloed op de groei van B. burgdorferi , waarschijnlijk als gevolg van de verhoogde verhouding tussen SM en BSK.
  4. Voer de selectie van transductanten uit door vaste-fasebeplating na menging met PEG-geprecipiteerde faag zoals beschreven in stap 7.

7. Selectie van transductanten

OPMERKING: Solid-phase plating van potentiële transductanten wordt uitgevoerd met behulp van een single-layer modificatie van het protocol dat voor het eerst werd beschreven door Samuels15. B. burgdorferi-kolonies groeien in de agar, dus voor de selectie van transductanten door middel van vastefasebeplating moeten de monsters aan de media worden toegevoegd terwijl de platen worden gegoten. Een alternatieve methode voor de selectie van transformatoren met behulp van een verdunningsmethode in 96-well platen is ook eerder beschreven35. Deze techniek kan ook effectief zijn voor de selectie van transductanten, maar is nog niet voor dit doel uitgeprobeerd.

  1. Bepaal het aantal platen dat nodig is voor de selectie van transductanten op basis van het aantal monsters van de transductietests en -controles die moeten worden geplateerd.
    OPMERKING: Meestal worden twee platen per monster gegoten, één gelijk aan ongeveer 10% van het kweekvolume en één die de rest van de cultuur omvat. Bovendien gieten platen die dienen als negatieve controles om individueel te testen of het faagpreparaat en / of de ouderklonen die als donor en de ontvanger worden gebruikt, niet groeien in de aanwezigheid van het antibioticum (en) dat (en) tijdens de selectie wordt gebruikt. Het voorbereiden van plaatmateriaal voor ten minste twee extra platen wordt ook aanbevolen. Als het aantal monsters en controles dat moet worden verguld bijvoorbeeld acht is, bereid dan voldoende platingmix voor 10 platen.
  2. Bereid oplossingen voor plating voor zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Elke plaat is 30 ml, bestaande uit 20 ml 1,5x BSK voor beplating en 10 ml agarose (2: 1-verhouding). Dit levert een plaat op met eindconcentraties van 1x BSK en 0,7% agarose. Bereid bijvoorbeeld voor 10 platen een totale platingmix van 300 ml, bestaande uit 200 ml 1,5x BSK en 100 ml 2,1% agarose.
    1. Bereid 1 L van 1,5x BSK zoals beschreven voor 1x BSK in stap 1.1 met behulp van de hoeveelheden van elk onderdeel die in tabel 1 voor 1,5x BSK zijn vermeld. Bewaren zoals beschreven voor 1x BSK.
    2. Bereid 2,1% agarose in water en autoclaaf. Gebruik de agarose-oplossing vers of bewaar bij kamertemperatuur. Indien bewaard bij kamertemperatuur, magnetron met het deksel losjes totdat het volledig gesmolten is voordat het plating wordt geplaatst.
    3. Bepaal het volume antibiotica dat nodig is om de juiste concentratie te bereiken (tabel 2) op basis van de gehele beplatingsmix.
      OPMERKING: Als het totale volume van de uiteindelijke platingoplossing 300 ml is, meng dan 200 ml 1,5x BSK en voldoende antibioticum om ervoor te zorgen dat de volledige 300 ml de juiste uiteindelijke antibioticaconcentratie heeft. Als zowel de donor als de ontvanger in de transductietest verschillende antibioticaresistentiegenen hebben, moet de platingmix beide antibiotica bevatten. Als de PEG-geprecipiteerde faag van de donor (zoals bereid in stap 5) codeert voor een antibioticaresistentiemarker en de ontvanger heeft er geen, dan mag de platingmix alleen het ene antibioticum bevatten.
  3. Breng op basis van het aantal te gieten platen de juiste hoeveelheid 1,5x BSK en antibioticum (en) over naar een steriele fles die groot genoeg is om de hele platingmix te bevatten. Balanceer in een waterbad bij 56 °C gedurende ≥15 min.
  4. Equilibrate gesmolten agarose uit de autoclaaf of magnetron in een waterbad van 56 °C gedurende ≥15 min.
  5. Voeg na equilibratie de vastgestelde hoeveelheid van 2,1% agarose toe aan de fles met de 1,5x BSK (met antibioticum) en plaats de platingoplossing terug in het waterbad bij 42 °C gedurende 10-15 minuten.
    OPMERKING: Hogere temperaturen kunnen de spirocheten beschadigen of doden36. Als u hetzelfde waterbad gebruikt als hierboven, koelt u het waterbad tot 42-45 °C voordat u de timer voor de evenwichtsmeting start. Laat de platingoplossing niet langer dan 20 minuten in evenwicht brengen bij 42 °C, anders begint deze te stollen tijdens het gieten van de platen.
  6. Bereid tijdens de equilibratie de B. burgdorferi-monsters voor om te worden verguld. Breng de te vergulden hoeveelheid over in een steriele conische centrifugebuis van 50 ml (zie materiaaltabel).
    1. Als u een hoeveelheid van minder dan 1,5 ml (<5% van het uiteindelijke plaatvolume van 30 ml plateert), breng het monster dan over naar de nieuwe buis en voeg het platingmengsel tijdens het plateren rechtstreeks aan het monster toe.
    2. Breng voor grotere volumes het gewenste cultuurvolume over naar de nieuwe buis en centrifugeer vervolgens bij 6.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer alles behalve 100-500 μL van het supernatant en gebruik de rest om de pellet volledig te resuspenderen voordat het plating wordt geplaatst.
    3. Voeg voor controleplaten na cocultuur ≥ 107 cellen van de donor- of ontvangerklonen toe aan steriele conische centrifugebuizen van 50 ml. Als het volume groter is dan 1,5 ml, centrifugeer en resuspenseer de pellet dan zoals in stap 7.6.2. Als een transductietest werd uitgevoerd met behulp van de PEG-geprecipiteerde faag, voeg dan naast de ontvanger-kloon 100-250 μL van het faagmonster toe aan een steriele conische buis van 50 ml voor plating.
  7. Nadat de platingoplossing gedurende 10-15 minuten bij 42-45 °C in evenwicht is gebracht, brengt u 30 ml van de platingoplossing over in een buis met het juiste monster; doseer onmiddellijk de beplatingsmix en monster in een gelabelde plaat. Herhaal dit met een verse pipet voor elk monster dat moet worden verguld.
  8. Laat de platen 15-20 minuten stollen en plaats ze vervolgens in een incubator van 33 °C aangevuld met 5% CO2. Keer de platen niet om gedurende ten minste 48 uur na het gieten.
  9. Afhankelijk van de achtergrond van de ontvanger kloon, controleer of de kolonies verschijnen in de agarose op de selectieplaten na 10-21 dagen incubatie. Kies ten minste 5-10 kolonies die op de plaat groeien in aanwezigheid van beide antibiotica met behulp van een gesteriliseerde katoengeplugde 5,75 in borosilicaatpipet (zie Materiaaltabel) en ent ze in tot 1,5 ml 1x BSK met het juiste antibioticum (en).
  10. Kweek de geënte kolonies bij 33 °C zoals in stap 1.3 gedurende 3-5 dagen of totdat ze een dichtheid van ongeveer 20-40 spirocheten per veld bereiken bij 200x vergroting met behulp van darkfieldmicroscopie.
    OPMERKING: Eenmaal gescreend (zie stap 8), kunnen de spirocheten worden ingevroren voor langdurige opslag bij −80 °C door een gelijk volume cultuur te mengen met een mengsel van 60% glycerol en 40% 1x BSK gesteriliseerd door filtratie door een filter van 0,22 μm.

8. Verificatie van potentiële transductanten

OPMERKING: Screen de klonen die op platen groeien in aanwezigheid van twee antibiotica om te controleren of ze echte transductanten vertegenwoordigen op de verwachte (ontvanger) achtergrond. Deze methoden zijn gebaseerd op de versterking, en mogelijk sequencing, van specifieke regio's door de polymerasekettingreactie. Gedetailleerde protocollen en praktijken voor het uitvoeren van PCR in B. burgdorferi worden elders beschreven (voor een recent voorbeeld, zie Seshu et al.37). Selecteer de primers die worden gebruikt voor het screenen van de transductanten op basis van de gebruikte stammen. Enkele suggesties voor de aanpak van de screening van de transductanten worden hieronder beschreven.

  1. Bereid B. burgdorferi lysates voor op PCR-screening.
    OPMERKING: Het volgende protocol wordt gebruikt om gewassen B. burgdorferi-lysaten te produceren uit gekweekte cellen gekweekt zoals in stap 7.9 voor onmiddellijke analyse van het DNA door PCR. Deze methode is ontworpen om de interferentie van potentiële remmers in BSK te minimaliseren, maar wordt niet aanbevolen voor het produceren van hoogwaardig DNA voor sequencing of opslag. Gebruik daarvoor een protocol of kit voor totale genoomextractie (zie Materiaaltabel). Het wordt ten zeerste aanbevolen dat lysaten van de moederklonen (zowel donor- als ontvangerstammen) tegelijkertijd worden bereid om in elke analyse te worden opgenomen.
    1. Breng 500 μL van elke potentiële transductant die is geselecteerd en gekweekt zoals in stap 7.10 over naar een schone microcentrifugebuis.
    2. Centrifugeer de culturen gedurende 10 minuten bij 8.000 x g bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 8.000 x g bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatant en resuspenseer elke pellet in 50 μL water van PCR-kwaliteit. Kook de monsters gedurende 10 min. Laat ze kort afkoelen en centrifugeer vervolgens op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gebruik voor elke PCR onmiddellijk 2 μL vanaf de bovenkant van het gecentrifugeerde monster; vermijd het verstoren van de pellet.
  2. Screen de potentiële transductanten op de specifieke genen die coderen voor antibioticaresistentie met behulp van PCR. Zie tabel 4 voor de primers voor het screenen van antibioticaresistentiemarkers die vaak worden gebruikt bij transductietests.
    OPMERKING: Hoewel zeldzaam in onze ervaring, kan spontane mutatie in de aminoglycoside-antibiotica die worden gebruikt voor de selectie van heterologe DNA in B. burgdorferi optreden.
  3. Screen de potentiële transductanten ook met behulp van een andere stam of kloonmarker om te bevestigen dat de achtergrond die van de ontvanger is. Neem zowel de donor- als de ontvangende ouderklonen op in deze analyses. Screen op stamspecifieke markers met behulp van sequenties op basis van de gebruikte stammen en individuele laboratoriumprotocollen voor het bepalen van de stamintegriteit.
  4. Als u probeert te transduceren in virulente klonen voor gebruik binnen de tekenvector of zoogdiergastheer of voor directe vergelijking met een andere kloon, bepaal dan het volledige plasmidegehalte van de transductanten en de ouderklonen. Dit wordt gedaan om hetzelfde plasmidegehalte te garanderen als dat van de vergelijkende stam of de aanwezigheid van de genetische elementen die nodig zijn voor de voortplanting binnen de enzoötische cyclus, zoals elders is beschreven 18,19,37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gebruik van bacteriofaag om DNA te verplaatsen tussen gemakkelijker transformeerbare B. burgdorferi-stammen of klonen die recalcitrant zijn voor elektrotransformatie, vertegenwoordigt een ander hulpmiddel voor het voortdurende moleculaire onderzoek naar de determinanten van de ziekte van Lyme. De hierin beschreven transductietest kan indien nodig worden aangepast om de beweging van DNA tussen klonen van belang te vergemakkelijken met behulp van een of twee antibiotica voor de selectie van potentiële transductanten. De transductie van zowel profaag-DNA als heterologe E. coli/B. burgdorferi shuttlevectoren tussen een high-passage stam CA-11.2A kloon en zowel een high-passage stam B31 kloon als een low-passage virulente kloon van stam 297 zijn eerder aangetoond28. De onderstaande resultaten tonen de beweging van profaag-DNA tussen twee avirulente klonen met hoge passage. De donorkloon, c1673, is een B. burgdorferi-stam CA-11.2A-kloon die codeert voor een kanamycine-resistentiegen op het profaag-DNA27,28. De ontvanger is een kloon van B. burgdorferi stam B31, aangeduid als c1706, die codeert voor een gentamicine-resistentiemarker op het chromosoom28. De transductietest werd uitgevoerd zoals geïllustreerd in figuur 1B; de PEG-geprecipiteerde faag die werd teruggevonden uit de supernatanten van c1673 blootgesteld aan 5% ethanol werd gemengd met c1706 zoals beschreven in stap 6 van het protocol.

Na het mengen van ongeveer 20% van de faag die werd teruggewonnen door PEG-precipitatie van de supernatanten van ethanol-blootgestelde c1673 (coderend voor resistentie tegen kanamycine) met c1706 (coderend voor resistentie tegen gentamicine), werd het mengsel verguld in aanwezigheid van beide antibiotica; kolonievormende eenheden (CFU's) die kunnen groeien in aanwezigheid van zowel kanamycine als gentamicine zijn indicatief voor transductiegebeurtenissen (figuur 2)27,28. Het aantal CFU's wordt gerapporteerd als de transductiefrequentie per initiële ontvangende cel. In dit representatieve experiment werden ongeveer 275 transductanten teruggevonden na incubatie van de faag met 1 × 107 ontvangende cellen, wat een transductiefrequentie van 2,75 × 10−5 CFU's per ontvangende cel opleverde.

Na het herstel van de potentiële transductanten werd PCR-amplificatie van de genen die coderen voor kanamycine- en gentamicineresistentie uitgevoerd op 10 van de klonen, met twee representatieve monsters in figuur 3. Het kanamycine-resistentiegen kon worden versterkt door de donor (c1673) en de potentiële transductanten, maar niet door de ontvangers (c1706). Evenzo kan het gentamicine-resistentiegen worden versterkt door de ontvanger (c1706) en de potentiële transductanten, maar niet door de donor. De herstelde klonen coderen dus specifiek voor beide antibioticaresistentiegenen en vertegenwoordigen transductiegebeurtenissen, geen spontane mutanten.

Om aan te tonen dat de kanamycine-resistentiecassette door φBB-1 van de donor naar de ontvanger werd overgeheveld, werd de achtergrond van de transductanten bepaald met behulp van stamspecifieke markers, zoals eerder beschreven28. Dit is vooral belangrijk als de transductanten zijn gegenereerd door de co-kweekmethode van transductie. In het kort werden eerder gepubliceerde primers28 gebruikt om specifieke regio's van verschillende borreliale plasmiden te versterken, waardoor een profiel werd gegenereerd dat kan worden gebruikt om de achtergrond van de kloon te identificeren (figuur 4). De c1673-kloon in de CA-11.2A-achtergrond codeert specifieke amplicons 4, 5 en 6, terwijl c1706, dat een B31-achtergrond met hoge passage heeft, dat niet doet. Evenzo missen de twee transductanten ampliconen 4, 5 en 6; deze klonen hebben dus de c1706-achtergrond en hebben het kanamycine-resistentiegen van c1673 verworven.

Bestanddeel 1x BSK (voor kweken) (1 L) 1,5x BSK (voor beplating) (1 L)
Runderserumalbumine (fractie V) 35 gr 52,5 g
10x CMRL-1066 (zonder L-glutamine) 8 gr 12 gr
Neopepton 4 gr 6 gr
gistolaat 1,6 g 2,4 g
Hepes 4,8 g 7,2 g
Glucose 4 gr 6 gr
Natriumcitraat 0,56 g 0,84 g
Natriumpyruvaat 0,64 g 0,96 g
N-acetyl-glucosamine 0,32 g 0,48 g
Natriumbicarbonaat 1,76 gr 2,64 g
Warmte-geïnactiveerd normaal konijnenserum (INRS) 66 ml 99 ml

Tabel 1: BSK voor de teelt en selectie van B. burgdorferi-klonen voor transductietests. De formulering en bereiding van 1x BSK voor het kweken van B. burgdorferi en 1,5x BSK voor de hier beschreven vaste-fase selectie van B. burgdorferi klonen zijn gebaseerd op Samuels15. Verschillende formuleringen van BSK (of MKP)37,40,41 die de groei van B. burgdorferi ondersteunen, zijn nog niet getest met behulp van de transductietest.

Antibioticum Concentratie van de voorraden Eindconcentratie in cultuur van Bb
Kanamycine 100 mg.mL-1 (in water) 200-400 μ g.mL-1
Gentamicine 50 mg.mL-1 (in water) 50 μ g.mL-1
Streptomycine 50 mg.mL-1 (in water) 50 μ g.mL-1
Erytromycine 2 mg.mL-1 (in EtOH) 0,06 μ g.mL-1

Tabel 2: Potentiële antibiotica en concentraties die moeten worden gebruikt voor de selectie en het onderhoud van heterologe DNA in B. burgdorferi. Deze lijst is gebaseerd op de huidige antibioticaresistente markers die vaak worden gebruikt in Borrelia burgdorferi 42,43,44,45. Kanamycine, gentamicine en streptomycine worden bereid in water, gefilterd gesteriliseerd door een filter van 0,22 μM en bewaard bij −20 °C. Erytromycine wordt bereid in 95% ethanol en bewaard bij −20 °C. Veel laboratoria melden het succesvolle gebruik van kanamycine voor selectie in een concentratie van 200 μg·ml−1; bij gebruik van zowel gentamicine als kanamycine voor selectie in transductietests wordt 400 μg·ml−1 kanamycine gebruikt. Het aadA-gen verleent resistentie tegen zowel streptomycine als spectinomycine44. Voor de selectie van constructen die het aadA-gen in E bevatten. coli, 100 μg·ml−1 spectinomycine wordt gebruikt. Merk op dat de aminoglycosiden (kanamycine, gentamicine en streptomycine) niet klinisch relevant zijn bij de behandeling van de ziekte van Lyme; erytromycine wordt echter klinisch gebruikt in bepaalde situaties46. Hoewel natuurlijke resistentie tegen dit antibioticum in B. burgdorferi is gemeld47, is deze resistentiemarker tot nu toe niet gebruikt in de hier gerapporteerde transductietests.

Inducerende agent Voorraadconcentratie (oplosmiddel) Eindconcentratie in het monster
Ethanol 100% (geen) 5%
Mitomycine C 2 mg.mL-1 (water) 20 μ g.mL-1
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

Tabel 3: Potentiële inducerende stoffen en concentraties die worden gebruikt voor de inductie van φBB-1 van B. burgdorferi. Van N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), mitomycine C en ethanol, evenals methanol en isopropanol, is aangetoond dat ze φBB-1 induceren boven constitutieve niveaus in B. burgdorferi stam CA.11-2A 25,26,28. MNNG is een vermoedelijk carcinogeen en milieugevaar; voorzichtig gebruiken, oplossen in een brandbaar oplosmiddel en verbranden voor verwijdering. Mitomycine C is een vermoedelijk carcinogeen en potentieel gevaar voor het milieu; voorzichtig gebruiken onder een chemische zuurkast en op de juiste manier weggooien. Hoewel gepubliceerde gegevens suggereren dat MNNG het meest effectieve middel is voor het induceren van φBB-126, maken de gevaren van het werken met deze chemische stof en moeilijkheden bij het verkrijgen ervan het gebruik ervan ingewikkeld48, vooral bij studenten. Inductie met ethanol is consistent beter dan met methanol of isopropanol28 en is het meest gebruikt in de transductietest.

Gennaam of -aanduiding Antibioticaresistentie Referentie Naam primer Primervolgorde (5 ́ tot 3 ́)
kanR van Tn903 Kanamycine 42 Kanr 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
Kanr 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
AACC1 gentamicine 43 AACC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
AACC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
AADA streptomycine 44 AADA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
AADA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

Tabel 4: Primers die worden gebruikt voor de voorlopige analyse van transductie van antibioticaresistentiemarkers. De hier aangegeven primers zijn voor de detectie van antibioticaresistentiegenen die vaak worden gebruikt in transductietests. Deze primers worden gebruikt in PCR met de volgende omstandigheden herhaald gedurende 28 cycli: denaturatie bij 92 °C gedurende 15 s, primergloeien bij 56 °C gedurende 15 s en doel-DNA-extensie bij 72 °C gedurende 30 s.

Figure 1
Figuur 1: Transductietest voor het monitoren van de faag-gemedieerde beweging (transductie) van DNA. De transductietest kan worden uitgevoerd met behulp van (A) de co-kweekmethode of (B) faag die door PEG-neerslag uit de cultuur supernatant wordt teruggewonnen. Voor de cocultuurmethode (A) wordt een geïnduceerde B. burgdorferi-kloon (de donor) die codeert voor een antibioticumresistentiegen op het DNA dat moet worden getransduceerd door φBB-1 (groene cirkel) gekweekt met een niet-geïnduceerde B. burgdorferi-kloon (de ontvanger), die codeert voor een tweede antibioticumresistentiegen op het chromosoom of een ander stabiel genetisch element (rode cirkel). Deze methode vereist het gebruik van twee verschillende antibioticaresistentiemarkers (in dit voorbeeld genen die coderen voor kanamycine en gentamicineresistentie). Om de gezuiverde faag in de transductietest (B) te gebruiken, worden faagdeeltjes die door PEG-precipitatie van het supernatant van de geïnduceerde donor worden teruggewonnen, gemengd met de ontvanger. Hoewel hier getoond met behulp van twee verschillende antibiotica, kan deze methode worden uitgevoerd met het gebruik van slechts één antibioticaresistentiemarker gecodeerd op het φBB-1-profaag-DNA, zoals eerder aangetoond27. Na incubatie worden transductanten geselecteerd door vaste-fase plating in aanwezigheid van beide antibiotica; als methode B wordt gebruikt met slechts één antibioticaresistentiemarker gecodeerd op het faag-DNA, wordt selectie gedaan met alleen dat antibioticum tijdens solid-phase plating. De transductanten bevatten zowel antibioticaresistentiemarkers als hebben de achtergrond van de ontvanger. Deze figuur is herdrukt uit Eggers et al.28 met toestemming van Oxford University Press. In het gemodelleerde experiment vertegenwoordigen c1673 en c1650 twee verschillende CA-11.2A-klonen; c1673 draagt een φBB-1 profaag die codeert voor kanamycineresistentie, en c1650 codeert voor een gentamicine-resistentiemarker op een niet-faaglocatie28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kolonievormende eenheden geselecteerd door middel van solid-phase plating na de transductietest. Kolonies die groeien in aanwezigheid van beide antibiotica na vermenging van de faag van c1673 met c1706 vertegenwoordigen potentiële transductanten. Er mogen geen kolonies groeien op controleplaten met de individuele donor- en ontvangerklonen of een monster van faagvoorbereiding (niet weergegeven). Het minimumaantal productieve faag in het oorspronkelijke monster kan worden bepaald door het aantal CFU's te tellen en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor. In dit geval leverde 20% van het faagmonster PEG-neergeslagen uit een 15 ml-cultuur van de donor ongeveer 275 kolonies op. De oorspronkelijke concentratie van productieve faag die werd teruggewonnen door PEG-neerslag was dus ≥1,3 × 103 virionen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: PCR-amplificatie van de genen die kanamycineresistentie en gentamicineresistentie van twee potentiële transductanten verlenen. PCR met behulp van primers voor de kanamycine- en gentamicineresistentiegenen (tabel 4) werd uitgevoerd om de lysaten te screenen die werden gegenereerd uit twee kolonies (transductant 1 en transductant 2). Deze kolonies werden geselecteerd op een plaat met zowel kanamycine als gentamicine na het mengen van c1673 (donor) en c1706 (ontvanger). De ampliconen werden opgelost op een 1% agarose gel elektroforen gedurende 60 min bij 120 V in 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer en gekleurd met 0,5 μg·ml−1 ethidiumbromide. De getallen geven maatmarkeringen aan in kilobaseparen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Bevestiging van de achtergrond van de transductanten. Regio's van specifieke genetische elementen werden versterkt vanaf c1673, c1706, en de twee transductanten, zoals eerder beschreven28, om te bevestigen dat de achtergrond van de transductanten die van de ontvanger kloon, c1706, was. De gekozen regio's waren gebaseerd op de sequenties van genen op specifieke lineaire of circulaire plasmiden (respectievelijk lp of cp) binnen de B. burgdorferi-type stam, B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) en 8 = fla-gen (chromosoom). De ampliconen werden opgelost op een 1% agarose gel elektroforen gedurende 60 min bij 120 V in 1x TAE buffer en gekleurd met 0,5 μg·ml−1 ethidiumbromide. De getallen geven maatmarkeringen aan in kilobaseparen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gebruik van transductie zou een methode kunnen zijn om ten minste enkele van de biologische en technische barrières in verband met de elektrotransformatie van B. burgdorferi 1,4,13,37 te overwinnen. In veel systemen kan bacteriofaag gastheer (niet-profaag) DNA tussen bacteriële cellen verplaatsen door gegeneraliseerde of gespecialiseerde transductie 22,23,24,49,50. Bij gespecialiseerde transductie worden altijd een paar gastheergenen verpakt in de faagcapsid samen met het profaag-DNA49,50. φBB-1 verpakt bijvoorbeeld altijd die delen van de cp32 die bacterieel van oorsprong zijn, omdat ze onlosmakelijk verbonden zijn op het plasmide met de delen van de cp32 die het faaggenoom zijn. Bij gegeneraliseerde transductie wordt aangenomen dat het verpakkingsmechanisme van de bacteriofaag zich vastklampt aan homologe niet-faagsequenties en "per ongeluk" willekeurig gastheer-DNA verpakt in plaats van faag-DNA; deze stukjes DNA kunnen vervolgens in een andere cel worden geïntroduceerd49,50. Er is nog weinig bekend over gegeneraliseerde transductie door faag in B. burgdorferi; in beter gekarakteriseerde bacteriële systemen kan echter maar liefst 1% van de bacteriofaag die uit een cel vrijkomt willekeurige bacteriële genen bevatten in plaats van faag-DNA51. Tot nu toe zijn er geen chromosomale markers waargenomen die worden getransduceerd tussen verschillende B. burgdorferi-klonen, maar de eerdere demonstratie dat zowel cp32's als kleine heterologe shuttlevectoren kunnen worden verpakt en getransduceerd door φBB-1 geeft aan dat deze faag kan deelnemen aan zowel gespecialiseerde als gegeneraliseerde transductie28. Daarom wordt een use-case voor transductie in het laboratorium voorgesteld, waarbij elektrotransformatie die een chromosomale mutatie genereert nog steeds wordt gedaan op de achtergrond van interesse; de introductie van shuttlevectoren voor complementatie in trans of voor expressiestudies met behulp van reporterconstructen in spanningen die recalcitrant zijn voor elektrotransformatie zou echter kunnen worden gedaan via transductie tussen een meer transformeerbare kloon met hoge passage en minder transformeerbare stammen. Als toekomstige studies het vermogen van φBB-1 aantonen om ook chromosomale loci te verpakken en te verplaatsen, dan kunnen de hierin beschreven methoden ook nuttig zijn bij het verplaatsen van gemodificeerd chromosomaal DNA tussen gemakkelijker transformeerbare stammen en stammen die anders moeilijk te elektrotransformeren zijn. De cp32-achtige plasmiden zijn alomtegenwoordig onder alle B. burgdorferi-stammen en de overgrote meerderheid van de andere Lyme-ziekten spirocheten52,53; er is ook bewijs voor homologen in andere Borrelia-soorten, waaronder B. mayonii, B. miyamotoi en degenen die recidiverende koorts veroorzaken 54,55,56. Of de homologen in andere Borrelia-soorten ook profaag zijn, is nog niet bekend, maar als dat zo is, dan zou transductie ook een hulpmiddel kunnen zijn voor de moleculaire dissectie van deze soorten, waarvan sommige nog niet met succes genetisch zijn gemanipuleerd.

Twee methoden voor het transduceren van DNA zijn hier gepresenteerd: het samen kweken van de donor- en ontvangerklonen voorafgaand aan de selectie (figuur 1A) of PEG-neerslaande faag van de donor en het mengen van alleen die faag met de ontvanger (figuur 1B). Het aantal transductiegebeurtenissen per ontvangende cel is hoger na co-kweek dan met PEG-geprecipiteerde faag28, maar co-kweek vereist dat zowel de donor als de ontvanger verschillende antibioticaresistentiemarkers dragen en dat de achtergrond van potentiële transductanten zorgvuldig wordt gescreend. Aangezien de φBB-1-profaag alomtegenwoordig zijn onder de Borrelia52,53, is er een theoretische kans dat, bij het mengen van actief groeiende klonen, een antibioticaresistentiemarker of ander heterologe DNA van de ontvanger naar de donor kan gaan (in plaats van van de donor naar de ontvanger, zoals bedoeld). Het gebruik van PEG-geprecipiteerde faag in de transductietest elimineert deze mogelijkheid, omdat de donor niet aanwezig is in de faag / ontvanger-mix. Bovendien is PEG-neerslag van de faag vereist als de faag en zijn genomische inhoud zowel voor analyse (d.w.z. structurele analyse, kwantificering, identificatie van verpakt materiaal, enz.) als voor transductie moeten worden gebruikt. Ondanks deze voordelen heeft het gebruik van PEG-geprecipiteerde faag zijn potentiële nadelen; naast het feit dat niet zoveel transductanten worden opgeleverd als bij co-kweek, kan PEG-neerslag tijdrovend zijn, kan dit leiden tot aanzienlijk faagverlies en resulteert dit in monsters met verontreinigingen die stroomafwaartse toepassingen kunnen verstoren57,58.

Transductie is tot nu toe aangetoond van drie B. burgdorferi-stammen: CA-11.2A, een B31-kloon met hoge passage, en een low-passage 297-kloon28. Van deze drie produceert de B. burgdorferi-stam CA-11.2A de hoogste hoeveelheid faag na inductie 25,26,28; zelfs na inductie is het aantal fagen dat is teruggevonden bij B. burgdorferi echter nog steeds ordes van grootte lager dan de faag die wordt teruggevonden in beter gekarakteriseerde systemen, zoals die van colifaag λ 25,28,59. Een probleem dat zich kan voordoen bij het gebruik van transductie via co-kweek of menging van faag na PEG-neerslag is het kleine aantal bacteriofaag dat vrijkomt uit B. burgdorferi, zelfs wanneer het wordt blootgesteld aan inducerende middelen. Bovendien is batch-to-batch variatie in faagproductie significant, zelfs wanneer alle omstandigheden, mediacomponenten en methoden consistent lijken te zijn tussen experimenten. Om deze reden is het belangrijk om vast te stellen dat ten minste een minimum aantal fagen wordt geproduceerd van een bepaalde kloon of onder een bepaalde voorwaarde. Traditionele testen om het aantal fagen in een monster te bepalen, vereisen het mengen van een kleine hoeveelheid monster dat faag bevat met een permissieve bacteriële gastheer waarin de bacteriofaag lytisch is; het aantal productieve faagdeeltjes in het monster wordt bepaald door het aantal lytische gebeurtenissen dat zich op die achtergrond voordoet, wat resulteert in de vorming van plaques op een gazon van de bacterie 60,61. Het aantal fagen wordt gerapporteerd als plaquevormende eenheden (PFUs)61. Het kwantificeren van het aantal productieve φBB-1 dat vrijkomt na inductie met behulp van een plaquetest wordt belemmerd door het onvermogen om Borrelia burgdorferi in een dicht gazon te laten groeien en een huidig gebrek aan begrip van de mechanismen die de schakelaar tussen de lysogene en lytische replicatiecycli van φBB-1 regelen. Inderdaad, hoewel anekdotische rapporten van gelyseerde culturen van B. burgdorferi talrijk zijn, zijn er tot nu toe geen gepubliceerde studies geweest die de observatie van de lysis van een hele cultuur correleren met de productie van faag. Uit ervaring blijkt dat slechts een klein aantal cellen in een bepaalde cultuur spontaan faag lijkt te produceren, vermoedelijk door lysis, en deze productie kan slechts bescheiden worden verhoogd met blootstelling aan de bekende inducerende stoffen 25,28,62. Een plaquetest is momenteel dus niet mogelijk om φBB-1 van B. burgdorferi te kwantificeren.

Om het aantal productieve fagen te kwantificeren dat wordt geproduceerd na de inductie van B. burgdorferi, kan de transductietest zoals beschreven in dit rapport worden uitgevoerd met behulp van een permissieve B. burgdorferi-kloon met een ander antibioticum dan dat verpakt door de bacteriofaag. Deze test resulteert in kolonies die het resultaat zijn van transductie, waarbij elke kolonie een bevestigde faag vertegenwoordigt. Het minimale aantal fagen in een monster kan dus worden gerapporteerd als CFU in plaats van PFU. Dit aantal is waarschijnlijk (veel) lager dan het werkelijke totale aantal geproduceerde fagen als gevolg van inefficiënties die inherent zijn aan het herstel van faag door PEG-neerslag (indien gebruikt), de aanhechting en injectie van DNA door faag en de vaste-fase plating van B. burgdorferi.

Een mogelijke methode om de totale hoeveelheid profaag-DNA binnen de supernatanten van B. burgdorferi-culturen te bepalen, is kwantitatieve PCR (qPCR), maar qPCR-protocollen voor cp32-DNA van B. burgdorferi zijn niet goed vertegenwoordigd in de literatuur en qPCR is nog geen methodologie die veel voor dit doel wordt gebruikt. Om kwalitatief vast te stellen dat er ten minste een matig niveau van faag-DNA in een bepaald monster is, kan het totale DNA worden geëxtraheerd uit de PEG-neergeslagen supernatanten van de B. burgdorferi-culturen na DNase-behandeling voorafgaand aan extractie; het faag-DNA wordt beschermd door een intacte faagcapside25. Het teruggevonden DNA wordt vervolgens opgelost in een agarose-gel en gevisualiseerd met een DNA-vlek; dit protocol levert meestal een vage band van 30 kb op die het lineaire DNA vertegenwoordigt dat in de faagkopis verpakt 25. Op basis van de gevoeligheid van de vlek en de intensiteit van de faag-DNA-band van de juiste grootte ten opzichte van een marker, kan het geschatte aantal totale teruggevonden fagen worden bepaald25,27. Een sterke positieve correlatie van de niveaus van totaal faag-DNA teruggevonden uit het supernatant met het aantal transductiva dat na de transductietest is teruggevonden, is eerder aangetoond28.

De keuze van de donor- en ontvangerstammen is van cruciaal belang voor het succes van het gebruik van transductie als moleculair hulpmiddel. Ons begrip van cp32s als een prophage van φBB-1 wordt gecompliceerd door zowel de alomtegenwoordigheid van de cp32s in de Lyme-ziekte spirocheten52,53 als door het feit dat een individuele B. burgdorferi-cel meerdere homologen van deze plasmiden kan bevatten. Alle cp32's in een cel lijken verpakt te zijn in faagkoppen in de faagproducerende stammen die zijn onderzocht27. Het is echter niet duidelijk of alle B. burgdorferi-stammen die cp32's bevatten bacteriofaag kunnen produceren, en stammen moeten vóór gebruik op dit vermogen worden getest. Evenzo is er niets bekend over de receptoren waardoor een bepaalde stam kan worden getransduceerd door φBB-1, hoewel de alomtegenwoordigheid van het profaagplasmide in het hele geslacht een grote kans suggereert dat een bepaalde stam kan worden getransduceerd. Zoals kan worden afgeleid uit de aanwezigheid van meerdere cp32-plasmiden in een individuele B. burgdorferi-cel, lijkt er geen faagimmuniteit63 te zijn die wordt verleend door de aanwezigheid van een bestaande profaag; stammen CA.11-2A, B31 en 297 zijn gebruikt in transductietests en produceren beide en kunnen worden overgeheveld door φBB-127,28. Hoewel eerdere rapporten aangaven dat transductie mogelijk was in slechts een beperkt aantal stammen met peg-geprecipiteerde faag27, kan dat te wijten zijn geweest aan technische problemen met die methode, aangezien alle tot nu toe geteste stammen met succes transduceerbaar zijn geweest met behulp van de co-kweekmethode28.

Bij het ontwerpen van een experiment om de transductietest te gebruiken, moeten de belangrijkste overwegingen voor de keuze van de donorstam de genetische achtergrond zijn, het vermogen om gemakkelijk te worden getransformeerd via elektroporatie en het vermogen om faag te produceren. Hoewel er geen uitputtend onderzoek is gedaan naar de high-passage klonen van elke stam, produceert de stam CA-11.2A faag constitutief op detecteerbare niveaus, zelfs bij afwezigheid van inductie. Evenzo produceren high-passage klonen van B31, de eerste B. burgdorferi-stam die volledig gesequencedis 5 en een veelgebruikte stam in moleculaire studies, ook constitutief detecteerbare hoeveelheden φBB-1 en zijn ze over het algemeen zeer transformeerbaar 1,4,25,27,37,64 . Als onderzoek andere stammen vereist, wordt aanbevolen om klonen met een hoge passage van die stam eerst op hun transformeerbaarheid te testen door een plasmide met een antibioticaresistentiemarker via elektroporatie in te brengen en vervolgens te beoordelen op hun vermogen om te worden getransduceerd door een transductietest uit te voeren met een permissieve ontvanger, zoals CA-11.2A of B31, die codeert voor een andere antibioticaresistentiemarker. Evenzo, om ervoor te zorgen dat een ontvangende stam of kloon tolerant is voor transductie, kan een faagproducerende stam, zoals CA-11.2A met een profaag die codeert voor resistentie tegen een antibioticum, worden gemengd met de kloon van belang om ervoor te zorgen dat transductie optreedt.

Er moet nog veel worden begrepen over de moleculaire biologie van φBB-1 en zijn rol in HGT binnen B. burgdorferi, vooral omdat het de enzoötische cyclus passeert. Het vermogen van φBB-1 om zowel faag- als heterologe DNA experimenteel binnen het laboratorium te transduceren, biedt echter een kans om een ander hulpmiddel toe te voegen voor de moleculaire dissectie van B. burgdorferi en zijn rol in de pathogenese van de ziekte van Lyme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteur wil Shawna Reed, D. Scott Samuels en Patrick Secor bedanken voor hun nuttige discussie en Vareeon (Pam) Chonweerawong voor hun technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door het Department of Biomedical Sciences en facultaire onderzoeksbeurzen aan Christian H. Eggers van de School of Health Sciences aan de Quinnipiac University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 187 Borrelia burgdorferi bacteriofaag horizontale genoverdracht transductie
Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete <em>Borrelia burgdorferi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter