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Immunology and Infection

लाइम रोग स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी के फेज-मध्यस्थता आनुवंशिक हेरफेर

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

जीवाणु कोशिकाओं के बीच डीएनए को स्थानांतरित करने के लिए बैक्टीरियोफेज की क्षमता उन्हें अपने जीवाणु मेजबानों के आनुवंशिक हेरफेर के लिए प्रभावी उपकरण बनाती है। यहां प्रस्तुत लाइम रोग स्पाइरोकेट के विभिन्न उपभेदों के बीच हेटरोलॉगस डीएनए को ट्रांसड्यूस करने के लिए बोरेलिया बर्गडोर्फेरी के एक बैक्टीरियोफेज, एबीबी -1 को प्रेरित करने, ठीक करने और उपयोग करने के लिए एक पद्धति है।

Abstract

स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी में विदेशी डीएनए का परिचय लगभग विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके परिवर्तन द्वारा पूरा किया गया है। इस प्रक्रिया में अन्य, बेहतर विशेषता वाले ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के सापेक्ष लाइम रोग स्पाइरोकेट में विशेष रूप से कम क्षमता है। परिवर्तन की सफलता की दर विशिष्ट पृष्ठभूमि से उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए की केंद्रित मात्रा पर अत्यधिक निर्भर है और महत्वपूर्ण तनाव-से-तनाव परिवर्तनशीलता के अधीन है। बर्गडोर्फेरी में विदेशी डीएनए (यानी, शटल वैक्टर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर) को पेश करने के लिए वैकल्पिक साधन लाइम रोग स्पाइरोकेट के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपयोगी उपकरणों के आयुध के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त हो सकता है। ट्रांसडक्शन नामक प्रक्रिया में बैक्टीरिया के बीच डीएनए के आंदोलन के लिए प्राकृतिक तंत्र के रूप में बैक्टीरियोफेज को अच्छी तरह से मान्यता दी गई है। इस अध्ययन में, एक ही और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि दोनों के बी बर्गडोर्फरी कोशिकाओं के बीच डीएनए को ट्रांसड्यूस करने के लिए सर्वव्यापी बोरेरियल फेज एबबी -1 का उपयोग करने के लिए एक विधि विकसित की गई है। ट्रांसड्यूस्ड डीएनए में छोटे शटल वैक्टर के रूप में बोरेरियल डीएनए और हेटरोलॉगस डीएनए दोनों शामिल हैं। यह प्रदर्शन लाइम रोग स्पाइरोकेट के आनुवंशिक हेरफेर के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के पूरक के रूप में फेज-मध्यस्थता पारगमन के संभावित उपयोग का सुझाव देता है। यह रिपोर्ट बी बर्गडोर्फेरी से फेज एबीबी -1 के प्रेरण और शुद्धिकरण के तरीकों का वर्णन करती है, पारगमन परख में इस फेज का उपयोग, और संभावित ट्रांसडक्टेंट्स के चयन और स्क्रीनिंग।

Introduction

स्पाइरोकेटल जीवाणु बोरेलिया बर्गडोरफेरी के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपकरणों के विकास ने लाइम रोग 1,2,3,4 की प्रकृति की समझ में अथाह मूल्य जोड़ा है। बर्गडॉर्फेरी में एक असामान्य रूप से जटिल जीनोम होता है जिसमें एक छोटा रैखिक गुणसूत्र और रैखिक और परिपत्र प्लास्मिड 5,6 दोनों होते हैं। सहज प्लास्मिड हानि, इंट्राजेनिक पुनर्व्यवस्था (एक ही जीव के भीतर एक प्लास्मिड से दूसरे में जीन की गति), और क्षैतिज जीन स्थानांतरण (एचजीटी, दो जीवों के बीच डीएनए की गति) ने बी बर्गडोरफेरी के बीच आनुवंशिक विषमता की एक बड़ी मात्रा को जन्म दिया है (उदाहरण के लिए, देखें शुत्ज़र एट अल।7)। परिणामी जीनोटाइप (या "उपभेद") सभी एक ही प्रजाति के सदस्य हैं, लेकिन आनुवंशिक अंतर हैं जो विभिन्न स्तनधारीमेजबानों को संचारित करने और संक्रमित करने की उनकी क्षमता को प्रभावित करते हैं। इस रिपोर्ट में, "तनाव" शब्द का उपयोग एक विशेष प्राकृतिक रूप से व्युत्पन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ बी बर्गडॉर्फेरी को संदर्भित करने के लिए किया जाएगा; "क्लोन" शब्द का उपयोग एक तनाव को संदर्भित करने के लिए किया जाएगा जिसे आनुवंशिक रूप से किसी विशेष उद्देश्य के लिए या प्रयोगात्मक हेरफेर के परिणामस्वरूप संशोधित किया गया है।

बर्गडोरफेरी में उपयोग के लिए उपलब्ध आणविक टूलबॉक्स में चयन योग्य मार्कर, जीन रिपोर्टर, शटल वैक्टर, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस, इंड्यूसेबल प्रमोटर और काउंटर-सेलेक्शनेबल मार्कर शामिल हैं (समीक्षा के लिए, ड्रेकट्राह और सैमुअल्स12 देखें)। इन पद्धतियों के प्रभावी उपयोग के लिए बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन में हेटरोलॉगस (विदेशी) डीएनए के कृत्रिम परिचय की आवश्यकता होती है। बर्गडोरफेरी में, हेटरोलॉगस डीएनए की शुरूआत लगभग विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से प्राप्त की जाती है, एक विधिजो मीडिया में पेश किए गए डीएनए के छोटे टुकड़ों के लिए बैक्टीरिया झिल्ली को क्षणिक रूप से पारगम्य बनाने के लिए बिजली की पल्स का उपयोग करती है। अधिकांश कोशिकाएं (अनुमानित ≥99.5%) नाड़ी द्वारा मार दी जाती हैं, लेकिन शेष कोशिकाओं में हेटरोलॉगस डीएनए13 को बनाए रखने की उच्च आवृत्ति होती है। हालांकि बैक्टीरिया में डीएनए को पेश करने के सबसे अधिक कुशल तरीकों में से एक माना जाता है, बी बर्गडॉर्फेरी में इलेक्ट्रोपोरेशन की आवृत्ति बहुत कम है (5 में 1 ट्रांसफॉर्मेंट से 1 × 104 से 5 × 106 कोशिकाओं तक)13। परिवर्तन की उच्च आवृत्तियों को प्राप्त करने के लिए बाधाएं तकनीकी और जैविक दोनों प्रतीत होती हैं। बी. बर्गडोरफेरी के सफल विद्युतीकरण के लिए तकनीकी बाधाओं में डीएनए की मात्रा (>10 डिग्री) शामिल है जो आवश्यक है और इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं को तैयार करते समय स्पाइरोकेट्स की बिल्कुल सही विकास चरण (मध्य-लॉग, 2 × 107 सेल-एमएल-1 और 7 × 107 सेल-एमएल -1) में होने की आवश्यकता शामिल है। हालांकि, इन तकनीकी बाधाओं को जैविक बाधाओं की तुलना में दूर करना आसान हो सकता है।

लाइम रोग शोधकर्ताओं का मानना है कि बी बर्गडोर्फेरी क्लोन कोआनुवंशिक रूप से हेरफेर करने की उनकी क्षमता के संबंध में दो व्यापक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है। उच्च मार्ग, प्रयोगशाला-अनुकूलित आइसोलेट्स अक्सर आसानी से रूपांतरित हो जाते हैं, लेकिन आमतौर पर संक्रामकता के लिए आवश्यक प्लास्मिड खो देते हैं, शारीरिक रूप से असामान्य तरीके से व्यवहार करते हैं, और स्तनधारी मेजबान को संक्रमित करने या टिक वेक्टर12,13 के भीतर बने रहने में सक्षम नहीं होते हैं। जबकि ये क्लोन प्रयोगशाला के भीतर स्पाइरोकेट के आणविक जीव विज्ञान को विच्छेदित करने के लिए उपयोगी रहे हैं, वे एन्ज़ोटिक चक्र के जैविक संदर्भ में स्पाइरोकेट का अध्ययन करने के लिए बहुत कम मूल्य के हैं। दूसरी ओर, कम-मार्ग वाले संक्रामक आइसोलेट्स, एक संक्रामक अवस्था को प्रतिबिंबित करने वाले शारीरिक तरीके से व्यवहार करते हैं और संक्रामक चक्र को पूरा कर सकते हैं, लेकिन आमतौर पर हेटरोलॉगस डीएनए की शुरूआत के लिए उद्दंड होते हैं और इसलिए, अध्ययन12,13 के लिए हेरफेर करना मुश्किल होता है। कम-मार्ग आइसोलेट्स को बदलने में कठिनाई कम से कम दो अलग-अलग कारकों से संबंधित है: (i) कम-मार्ग आइसोलेट्स अक्सर एक साथ कसकर झुरमुट करते हैं, विशेष रूप से इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए आवश्यक उच्च घनत्व वाली स्थितियों के तहत, इस प्रकार कई कोशिकाओं को या तो विद्युत आवेश के पूर्ण अनुप्रयोग या मीडिया में डीएनए तक पहुंच से अवरुद्ध करता है; बर्गडोर्फेरी कम से कम दो अलग-अलग प्लास्मिड-जनित प्रतिबंध-संशोधन (आर-एम) प्रणालियों को एन्कोड करता है जो उच्च-मार्ग आइसोलेट्स14,16 में खो सकते हैं। आर-एम सिस्टम बैक्टीरिया को विदेशी डीएनए17 को पहचानने और खत्म करने की अनुमति देने के लिए विकसित हुए हैं। दरअसल, बी बर्गडोर्फेरी में कई अध्ययनों से पता चला है कि परिवर्तन क्षमता तब बढ़ जाती है जब डीएनए का स्रोत एस्चेरिचिया कोलाई13,16 के बजाय बी बर्गडोर्फेरी होता है। दुर्भाग्य से, बी बर्गडॉर्फेरी से इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए डीएनए की अपेक्षित उच्च सांद्रता प्राप्त करना एक महंगी और समय लेने वाली संभावना है। इलेक्ट्रोपोरेटिंग और कम-मार्ग आइसोलेट्स का चयन करते समय एक और संभावित चिंता यह है कि यह प्रक्रिया उन ट्रांसफॉर्मेंट्स का पक्ष लेती है जिन्होंने महत्वपूर्ण विषाणु से जुड़े प्लास्मिड, एलपी 25 14,18,19 को खो दिया है; इस प्रकार, इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से कम-मार्ग बी बर्गडोरफेरी आइसोलेट्स को आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने का कार्य उन क्लोनों के लिए चयन कर सकता है जो एन्ज़ोटिक चक्र20 के भीतर जैविक रूप से प्रासंगिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इन मुद्दों को देखते हुए, एक प्रणाली जिसमें हेटरोलॉगस डीएनए को उच्च-मार्ग बी बर्गडॉर्फेरी क्लोन में इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म किया जा सकता है और फिर इलेक्ट्रोपोरेशन के अलावा किसी अन्य विधि द्वारा कम-मार्ग संक्रामक आइसोलेट्स में स्थानांतरित किया जा सकता है, लाइम रोग स्पाइरोकेट में उपयोग के लिए उपलब्ध आणविक उपकरणों के बढ़ते संग्रह के लिए एक स्वागत योग्य अतिरिक्त हो सकता है।

परिवर्तन (नग्न डीएनए का उत्थान) के अलावा, दो अन्य तंत्र हैं जिनके द्वारा बैक्टीरिया नियमित रूप से हेटरोलॉगस डीएनए लेते हैं: संयुग्मन, जो एक दूसरे के साथ सीधे शारीरिक संपर्क में बैक्टीरिया के बीच डीएनए का आदान-प्रदान है, और पारगमन, जो एक बैक्टीरियोफेज21 द्वारा मध्यस्थता डीएनए का आदान-प्रदान है। दरअसल, एचजीटी को मध्यस्थ करने के लिए बैक्टीरियोफेज की क्षमता का उपयोग कई जीवाणु प्रणालियों22,23,24 के भीतर आणविक प्रक्रियाओं को विच्छेदित करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में किया गया है। बर्गडॉर्फेरी नग्न डीएनए के उत्थान के लिए स्वाभाविक रूप से सक्षम नहीं है, और इस बात के बहुत कम सबूत हैं कि बी बर्गडोर्फरी सफल संयुग्मन को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक तंत्र को एन्कोड करता है। हालांकि, पिछली रिपोर्टों में बी बर्गडॉर्फेरी25,26,27,28 के समशीतोष्ण बैक्टीरियोफेज एबीबी -1 की पहचान और प्रारंभिक लक्षण वर्णन का वर्णन किया गया है। बीबीबी -1 बी बर्गडोरफेरी25 के भीतर पाए जाने वाले 30 केबी प्लास्मिड के एक परिवार को पैकेज करता है; इस परिवार के सदस्यों को cp32 नामित किया गया है। बी. बर्गडोरफेरी उपभेदों के बीच एचजीटी में भाग लेने में एबीबी -1 की भूमिका के अनुरूप, स्टीवेन्सन एट अल ने दो उपभेदों में पाए गए एक समान सीपी 32 की सूचना दी, जो इन दो उपभेदों के बीच इस सीपी 32 के हालिया साझाकरण का सुझाव देता है, संभवतः पारगमन29 के माध्यम से। अपेक्षाकृत स्थिर जीनोम 30,31,32,33 में सीपी32 के बीच एचजीटी के माध्यम से महत्वपूर्ण पुनर्संयोजन के सबूत भी हैं। अंत में, एक ही तनाव की कोशिकाओं के बीच और दो अलग-अलग उपभेदों की कोशिकाओं के बीच सीपी 32 और हेटरोलॉगस शटल वेक्टर डीएनए दोनों को ट्रांसड्यूस करने के लिए एबीबी -1 की क्षमता पहले27,28 प्रदर्शित की गई है। इन निष्कर्षों को देखते हुए, बी बर्गडॉर्फेरी के आणविक जीव विज्ञान के विच्छेदन के लिए विकसित किए जाने वाले एक अन्य उपकरण के रूप में एबीबी -1 प्रस्तावित किया गया है।

इस रिपोर्ट का लक्ष्य बी बर्गडोर्फेरी से फेज एबीबी -1 को प्रेरित करने और शुद्ध करने के लिए एक विधि का विस्तार करना है, साथ ही साथ बी बर्गडॉर्फेरी क्लोन के बीच पारगमन परख करने और संभावित ट्रांसडक्टेंट्स का चयन और स्क्रीनिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है।

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Protocol

पुनः संयोजक डीएनए और बीएसएल -2 जीवों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोगों की समीक्षा की गई और क्विनिपियाक विश्वविद्यालय संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. बी.-1 के उत्पादन के लिए बी. बर्गडोरफेरी संस्कृति की तैयारी

  1. 6.6% गर्मी-निष्क्रिय सामान्य खरगोश सीरम (बीएसके) 15 के साथ पूरक बारबोर-स्टोनर-केली माध्यम तैयार करें। 1x BSK के 1 L के लिए, 900 mL पानी में तालिका 1 में सूचीबद्ध घटकों को संयोजित करें, 1 N सोडियम हाइड्रॉक्साइड का उपयोग करके pH को 7.6 में समायोजित करें, और 2-4 घंटे के लिए 4 °C पर धीरे-धीरे मिलाएं। मिश्रण पूरा होने के बाद, यदि आवश्यक हो तो पीएच को 7.6 तक जांचें और पुन: व्यवस्थित करें, और पानी के साथ मात्रा को 1 एल तक बढ़ाएं। 0.22 μM फ़िल्टर ( सामग्री की तालिका देखें) से गुजरकर माध्यम को निष्फल करें और ≤2 महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा या स्टोर का उपयोग करें।
  2. ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल शुरू करने से तीन से पांच दिन पहले, उपयुक्त बी. बर्गडोर्फेरी क्लोन (ओं) के 150 μL को कसकर ढके हुए बाँझ शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 15 mL 1x BSK में टीका लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। बी बर्गडोरफेरी क्लोन (ओं) के भीतर हेटरोलॉगस डीएनए के चयन और रखरखाव के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की उचित एकाग्रता या एंटीबायोटिक दवाओं के संयोजन के साथ माध्यम को पूरक करें (तालिका 2)।
    बर्गडॉर्फेरी एक जैव सुरक्षा स्तर 2 जीव है। इस जीव के साथ काम करते समय सभी उचित सावधानी बरतें। बर्गडोरफेरी की लाइव संस्कृतियों के साथ एक प्रमाणित और ठीक से कीटाणुरहित वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी काम करें। सीडीसी दिशानिर्देशों34 के आधार पर बी बर्गडोरफेरी और जीवों से संपर्क करने वाली सभी सामग्री का ठीक से निपटान करें।
  3. संस्कृतियों को बिना हिलाए 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृतियां ≥5 × 107 स्पाइरोकेट्स-एमएल -1 के घनत्व तक नहीं पहुंच जाती हैं, जिसमें लगभग 3-5 दिन लगते हैं।

2. बी. बर्गडोरफेरी संस्कृति (ओं) का घनत्व ज्ञात कीजिए (सैमुएल्स से संशोधित) 15

  1. 5 × 106 कोशिकाओं से ऊपर होने की उम्मीद के लिए, स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारित करें।
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज को 8,000 x g पर 1 एमएल कल्चर स्थानांतरित करें।
    2. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और सेल पेलेट को 1 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस; 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 10 एमएम एनए2एचपीओ4, और 1.8 एमएम केएच2पीओ4) में पुन: निलंबित करें। पूरे सेल निलंबन को अर्ध-माइक्रो यूवी पारदर्शी क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    3. 600 एनएम(ए 600) की तरंग दैर्ध्य पर पुन: निलंबित नमूने का ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित करें। पीबीएस के खिलाफ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) शून्य करें।
    4. मूल संस्कृति में स्पाइरोकेट्स-एमएल -1 की एकाग्रता की गणना करने के लिए, ए600 पर ऑप्टिकल घनत्व को 1.4 × 109 से गुणा करें।
  2. 5 × 104 कोशिकाओं के बीच अनुमानित घनत्व के लिए 106 कोशिकाओं -एमएल -1 × 5 के लिए, सीधे स्पाइरोकेट्स की संख्या की गणना करने के लिए पेट्रोफ-हौसर गिनती कक्ष (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारित करें। इस विधि का उपयोग उचित कमजोर पड़ने के बाद उच्च घनत्व के लिए भी किया जा सकता है।
    नोट: लाइव स्पाइरोकेट्स के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए डार्कफील्ड कंडेनसर के साथ संशोधित माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है।
    1. गिनती कक्ष में 10 μL नमूना लागू करें और उचित कवर ग्लास के साथ कवर करें। 1 से 10 7 × अधिक घनत्वके लिए, प्रति क्षेत्र 50-100 स्पाइरोकेट्स उत्पन्न करने के लिए पीबीएस में नमूने को पतला करें।
    2. 200x-400x के आवर्धन पर डार्कफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। सभी विमानों में 16 छोटे वर्गों के 25 समूहों के पूरे क्षेत्र की गणना करें।
    3. मूल संस्कृति के कोशिकाओं-एमएल-1 को प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक (यदि कोई हो) और 5 × 10 4 से गणना की गई संख्या को गुणा करें।

3. बी. बर्गडोरफेरी फेज का प्रेरण

नोट: आटोक्लेविंग द्वारा सभी ग्लासवेयर और प्लास्टिकवेयर को निष्फल करें; 0.22 μM फ़िल्टर के माध्यम से ऑटोक्लेविंग या निस्पंदन द्वारा सभी समाधानों को निष्फल करें। नीचे दिए गए चरणों को 15 एमएल की मात्रा के आधार पर प्रस्तुत किया गया है, लेकिन विधि प्रयोग की व्यक्तिगत आवश्यकताओं के आधार पर छोटे या बड़े संस्करणों के लिए स्केलेबल है।

  1. बर्गडोरफेरी संस्कृति के लिए, जहां से फेज का उत्पादन किया जाएगा (दाता), चरण 2 में किसी भी विधि द्वारा गणना की गई एकाग्रता का उपयोग करें ताकि 2 × 108 स्पाइरोकेट्स-एमएल -1 के 4 एमएल प्राप्त करने के लिए आवश्यक स्टार्टर कल्चर की मात्रा निर्धारित की जा सके। यह रिकवरी चरण के दौरान 15 एमएल में 5 × 107 स्पाइरोकेट्स-एमएल -1 की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करेगा (नीचे चरण 3.6)।
  2. 10 मिनट के लिए 6,000 x g पर चरण 3.1 में गणना की गई संस्कृति की मात्रा को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को डिकैंटिन करें और पैलेट को 4 एमएल ताजा बीएसके में फिर से निलंबित करें। नमूने को न्यूनतम सिर स्थान के साथ नमूने को पकड़ने के लिए उपलब्ध सबसे छोटे बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. फेज उत्पादन को प्रेरित करने के लिए 4 एमएल की संस्कृति मात्रा के आधार पर अनुशंसित एकाग्रता (तालिका 3) में उत्प्रेरण एजेंट की उचित मात्रा जोड़ें। ट्यूब को कसकर कैप करें और अच्छी तरह मिलाएं।
  4. नमूने को 2-4 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, नमूने को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10 मिनट के लिए 6,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को अलग करें।
  6. सेल पेलेट को 15 एमएल 1x BSK में पुन: निलंबित करें।
    नोट: फेज के प्रेरण के बाद, पारगमन परख के साथ आगे बढ़ने के दो अलग-अलग तरीके हैं। इन विधियों को चित्रा 1 और चरण 4 और चरण 6 में प्रस्तुत किया गया है।

4. उत्प्रेरण एजेंट के लिए दाता के संपर्क के बाद सह-संस्कृति के दौरान पारगमन (चित्रा 1 ए)

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग केवल तभी किया जा सकता है जब फेज-उत्पादक तनाव (दाता) में किसी विशेष एंटीबायोटिक का प्रतिरोध होता है और ट्रांसड्यूस किए जाने वाले तनाव (प्राप्तकर्ता) में किसी अन्य एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध होता है।

  1. बर्गडोर्फरी संस्कृति को ट्रांसडक्शन परख में प्राप्तकर्ता के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार करें, जैसा कि ऊपर चरण 1 में दाता तनाव के लिए वर्णित है। चरण 2 में निर्धारित घनत्व के आधार पर, 107 स्पाइरोकेट्स-एमएल -1 के 15 एमएल उत्पन्न करने के लिए आवश्यक मात्रा × गणना करें।
  2. 10 मिनट के लिए 6,000 x g पर चरण 4.1 में गणना की गई संस्कृति की मात्रा को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को अलग करें।
  3. चरण 3.6 (पुन: निलंबित फेज दाता) से 1 एमएल संस्कृति में गोली को पुन: निलंबित करें। दाता के साथ संस्कृति में पुन: निलंबित प्राप्तकर्ता को वापस जोड़ें। एंटीबायोटिक के साथ पूरक न करें। दोनों संस्कृतियों से युक्त कुल मात्रा 15 एमएल है।
  4. 72-96 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. चरण 7 में वर्णित सह-संस्कृति के बाद ठोस-चरण चढ़ाना द्वारा ट्रांसडक्टेंट्स का चयन करें।

5. ट्रांसडक्शन परख में उपयोग के लिए फेज को पुनर्प्राप्त करने के लिए पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल (पीईजी) वर्षा

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग उन मामलों में किया जा सकता है जहां फेज-उत्पादक तनाव (दाता) में एक विशेष एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध होता है और ट्रांसड्यूस किए जाने वाले तनाव (प्राप्तकर्ता) में या तो कोई एंटीबायोटिक प्रतिरोध या किसी अन्य एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध नहीं होता है।

  1. तालिका 2 में दर्शाए गए एकाग्रता पर उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ चरण 3.6 से संस्कृति को पूरक करें। 72-96 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
  2. पीईजी वर्षा के लिए समाधान तैयार करें।
    1. 5 M NaCl का 500 mL तैयार करें। ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें और उपयोग करने से पहले ठंडा होने दें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. 400 एमएल पानी में 200 ग्राम पीईजी 8000 को भंग करके 40% पीईजी का 500 एमएल तैयार करें; घोल को अच्छी तरह से मिश्रित होने तक हिलाते समय धीरे से गर्म करें। पानी के साथ 500 मिलीलीटर तक की मात्रा लाएं। पीईजी 8000 को पूरी तरह से भंग करने और समाधान को निष्फल करने के लिए, समाधान को ऑटोक्लेव करें और उपयोग करने से पहले ठंडा करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    3. 100 एमएल निलंबन माध्यम (एसएम; 100 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम एमजीएसओ4, और 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल [पीएच 7.5]) तैयार करें। आटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. दाता बी बर्गडोरफेरी क्लोन (चरण 3.6 से) से फेज की पीईजी वर्षा के लिए, इनक्यूबेशन के 72-96 घंटे के बाद, नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सुपरनैटेंट को एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डुबोएं; सेल गोली का निपटान करें। 1 M की अंतिम सांद्रता में 5 M NaCl जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे से हिलाएं।
  5. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डुबोएं; गोली छोटी या अनुपस्थित हो सकती है। 10% की अंतिम एकाग्रता के लिए सतह पर तैरने वाले में 40% पीईजी 8000 समाधान जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और रात भर 1 घंटे से अधिक समय तक बर्फ पर सेट करें।
    नोट: लंबे समय में फेज रिकवरी में काफी वृद्धि के साथ सहसंबंध नहीं लगता है।
  6. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और बिना किसी गोली को खोए जितना संभव हो उतना अतिरिक्त तरल निकालें, जिसमें फेज कण होते हैं।
  7. बोतल के किनारे को धोने और किसी भी संभावित फेज कणों को इकट्ठा करने के लिए एसएम का उपयोग करके एसएम की न्यूनतम मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। अनुशंसित अनुपात मूल सतह पर तैरने वाले के प्रति 10 एमएल एसएम का 400 μL है, लेकिन गोली के आकार के आधार पर, पूर्ण पुन: निलंबन के लिए कम या ज्यादा एसएम की आवश्यकता हो सकती है।
  8. पुनर्प्राप्त फेज नमूने को पुन: निलंबन की मात्रा के आधार पर क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा के साथ इलाज करें। नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं और फिर 10 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। किसी भी मोटी इंटरफ़ेस परत से बचते हुए, जलीय (शीर्ष) परत को एक साफ ट्यूब में हटा दें।
    नोट: एबीबी -1 एक गैर-आवरण वाला बैक्टीरियोफेज है और क्लोरोफॉर्म उपचार25 के लिए अतिसंवेदनशील नहीं है। यह कदम किसी भी झिल्ली-बाध्य संरचनाओं (यानी, कोशिकाओं या ब्लीब्स) को बाधित करने और किसी भी संभावित सेलुलर दूषित पदार्थों को मारने के लिए किया जाता है। क्लोरोफॉर्म एक वाष्पशील कार्बनिक है और इसका उपयोग केवल एक अच्छी तरह से हवादार फ्यूम हुड में किया जाना है; कार्बनिक अपशिष्ट के रूप में क्लोरोफॉर्म युक्त सामग्री को त्याग दें।
  9. पहले क्लोरोफॉर्म उपचार के बाद पुनर्प्राप्त मात्रा निर्धारित करें और उस मात्रा के 10% के बराबर क्लोरोफॉर्म की मात्रा के साथ नमूने का फिर से इलाज करें। अच्छी तरह से मिलाएं और 10 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। किसी भी इंटरफ़ेस या कार्बनिक परत से बचने के लिए सावधान रहते हुए जलीय (शीर्ष) परत को हटा दें। जलीय परत को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. फेज का उपयोग तुरंत करें (जैसा कि चरण 6 में वर्णित है) या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एबीबी -1 फेज नमूने को फ्रीज करने की सिफारिश नहीं की जाती है। यद्यपि 4 डिग्री सेल्सियस पर एबीबी -1 की स्थिरता की सख्ती से जांच नहीं की गई है, वसूली के बाद 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों का ट्रांसडक्शन परख में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

6. पीईजी वर्षा के बाद ट्रांसडक्शन परख (चित्रा 1 बी)

  1. बर्गडोरफेरी संस्कृतियों को ट्रांसडक्शन परख में प्राप्तकर्ता के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार करें, जैसा कि ऊपर चरण 1 में दाता तनाव के लिए वर्णित है। चरण 2 में निर्धारित घनत्व के आधार पर, प्राप्तकर्ता की संस्कृति की मात्रा की गणना करें जो 1 × 10 7 स्पाइरोकेट्स-एमएल-1 के 15 एमएल का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है।
  2. 10 मिनट के लिए 6,000 x g पर चरण 6.1 में गणना की गई संस्कृति की मात्रा को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को अलग करें और 14.5 एमएल ताजा बीएसके में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. प्राप्तकर्ता क्लोन की संस्कृति में पीईजी-अवक्षेपित फेज नमूना (चरण 5 से) के ≤500 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 72-96 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: पीईजी वर्षा के दौरान बरामद फेज की मात्रा कई कारकों के आधार पर परिवर्तनशील हो सकती है। हालांकि, प्रेरित बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन सीए -11.2 ए के 15 एमएल कल्चर से, 500 μL में आमतौर पर 50-1,000 व्यवहार्य फेज28 होते हैं। फेज रिकवरी ≥500 μL की मात्रा बी बर्गडॉर्फेरी विकास पर प्रतिकूल प्रभाव डालती है, संभवतः एसएम से बीएसके के बढ़ते अनुपात के कारण।
  4. चरण 7 में वर्णित पीईजी-अवक्षेपित फेज के साथ मिश्रण के बाद ठोस-चरण चढ़ाना द्वारा ट्रांसडक्टेंट्स का चयन करें।

7. ट्रांसडक्टेंट्स का चयन

नोट: संभावित ट्रांसडक्टेंट्स की ठोस-चरण प्लेटिंग को सैमुअल्स15 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के एकल-परत संशोधन का उपयोग करके किया जाता है। बर्गडॉर्फेरी कॉलोनियां आगर के भीतर बढ़ती हैं, इसलिए ठोस-चरण चढ़ाना द्वारा ट्रांसडक्टेंट्स के चयन के लिए, प्लेटों को डालते समय नमूनों को मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए। 96-वेल प्लेटों में कमजोर पड़ने की विधि का उपयोग करके ट्रांसफॉर्मेंट्स के चयन के लिए एक वैकल्पिक विधि भी पहलेवर्णित की गई है। यह तकनीक ट्रांसडक्टेंट्स के चयन के लिए भी प्रभावी हो सकती है लेकिन इस उद्देश्य के लिए अभी तक कोशिश नहीं की गई है।

  1. ट्रांसडक्शन परख और प्लेट किए जाने वाले नियंत्रणों से नमूनों की संख्या के आधार पर ट्रांसडक्टेंट्स के चयन के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या निर्धारित करें।
    नोट: आमतौर पर, प्रति नमूना दो प्लेटें डाली जाती हैं, एक संस्कृति की मात्रा के लगभग 10% के बराबर होती है और एक जिसमें शेष संस्कृति शामिल होती है। इसके अतिरिक्त, व्यक्तिगत रूप से परीक्षण करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करने वाली प्लेटें डालें कि दाता और प्राप्तकर्ता के रूप में उपयोग किए जाने वाले फेज तैयारी और / या माता-पिता क्लोन चयन के दौरान उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक (ओं) की उपस्थिति में नहीं बढ़ते हैं। कम से कम दो अतिरिक्त प्लेटों के लिए चढ़ाना सामग्री तैयार करने की भी सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, यदि चढ़ाए जाने वाले नमूनों और नियंत्रणों की संख्या आठ है, तो 10 प्लेटों के लिए पर्याप्त चढ़ाना मिश्रण तैयार करें।
  2. नीचे वर्णित के रूप में चढ़ाना के लिए समाधान तैयार करें।
    नोट: प्रत्येक प्लेट 30 एमएल होगी, जिसमें प्लेटिंग के लिए 1.5 एक्स बीएसके के 20 एमएल और 2.1% अगारोस (2: 1 अनुपात) के 10 एमएल शामिल होंगे। यह 1x BSK और 0.7% Agarose की अंतिम सांद्रता के साथ एक प्लेट का उत्पादन करेगा। उदाहरण के लिए, 10 प्लेटों के लिए, 300 एमएल का कुल चढ़ाना मिश्रण तैयार करें, जिसमें 1.5 x BSK के 200 mL और 2.1% Agarose के 100 mL शामिल हैं।
    1. तालिका 1 में 1.5x BSK के लिए सूचीबद्ध प्रत्येक घटक की मात्रा का उपयोग करके चरण 1.1 में 1x BSK के लिए वर्णित 1.5x BSK का 1 L तैयार करें। 1x BSK के लिए वर्णित के रूप में स्टोर करें।
    2. पानी और आटोक्लेव में 2.1% एगारोस तैयार करें। कमरे के तापमान पर एगारोस घोल को ताजा या स्टोर करें। यदि कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाता है, तो ढक्कन के साथ माइक्रोवेव करें जब तक कि चढ़ाना से पहले पूरी तरह से पिघल न जाए।
    3. संपूर्ण चढ़ाना मिश्रण के आधार पर उपयुक्त एकाग्रता (तालिका 2) प्राप्त करने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक (ओं) की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: यदि अंतिम चढ़ाना समाधान की कुल मात्रा 300 एमएल है, तो 1.5 x BSK के 200 mL और पर्याप्त एंटीबायोटिक मिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पूरे 300 mL में सही अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता है। यदि ट्रांसडक्शन परख में दाता और प्राप्तकर्ता दोनों में अलग-अलग एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन हैं, तो चढ़ाना मिश्रण में दोनों एंटीबायोटिक्स होने चाहिए। यदि दाता से पीईजी-अवक्षेपित फेज (जैसा कि चरण 5 में तैयार किया गया है) एक एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर को एन्कोड करता है और प्राप्तकर्ता के पास कोई नहीं है, तो चढ़ाना मिश्रण में केवल एक एंटीबायोटिक होना चाहिए।
  3. डाली जाने वाली प्लेटों की संख्या के आधार पर, 1.5x BSK और एंटीबायोटिक (ओं) की उचित मात्रा को एक बाँझ बोतल में स्थानांतरित करें जो पूरे चढ़ाना मिश्रण को पकड़ने के लिए पर्याप्त है। ≥15 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में संतुलन बनाएं।
  4. ≥15 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ऑटोक्लेव या माइक्रोवेव से पिघले हुए एग्रोस को बराबर करें।
  5. संतुलन के बाद, 1.5x BSK (एंटीबायोटिक के साथ) के साथ बोतल में 2.1% अगारोस की निर्धारित मात्रा जोड़ें और चढ़ाना समाधान को 10-15 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में वापस रखें।
    नोट: उच्च तापमान स्पाइरोकेट्स36 को नुकसान पहुंचा सकता है या मार सकता है। यदि ऊपर के समान पानी के स्नान का उपयोग कर रहे हैं, तो संतुलन के लिए टाइमर शुरू करने से पहले पानी के स्नान को 42-45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। प्लेटिंग घोल को 20 मिनट से अधिक समय तक 42 डिग्री सेल्सियस पर बराबर न होने दें अन्यथा प्लेटों को डालते समय यह जमना शुरू हो जाएगा।
  6. संतुलन के दौरान, बी बर्गडोरफेरी नमूने को चढ़ाने के लिए तैयार करें। बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चढ़ाए जाने के लिए राशि स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. यदि 1.5 एमएल (अंतिम 30 एमएल प्लेट वॉल्यूम का <5%) से कम मात्रा चढ़ाना है, तो नमूने को नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और चढ़ाना के दौरान सीधे नमूने में चढ़ाना मिश्रण जोड़ें।
    2. बड़ी मात्रा के लिए, संस्कृति की वांछित मात्रा को नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़कर सभी को 100-500 μL को डिसेंट करें और प्लेटिंग से पहले गोली को पूरी तरह से पुन: निलंबित करने के लिए शेष का उपयोग करें।
    3. सह-संस्कृति के बाद नियंत्रण प्लेटों के लिए, दाता या प्राप्तकर्ता क्लोन की ≥10 7 कोशिकाओं को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में जोड़ें। यदि आयतन 1.5 एमएल से अधिक है, तो सेंट्रीफ्यूज और चरण 7.6.2 में गोली को पुन: निलंबित करें। यदि पीईजी-अवक्षेपित फेज का उपयोग करके एक पारगमन परख की गई थी, तो प्राप्तकर्ता क्लोन के अलावा, प्लेटिंग के लिए बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फेज नमूने के 100-250 μL जोड़ें।
  7. प्लेटिंग समाधान 10-15 मिनट के लिए 42-45 डिग्री सेल्सियस पर बराबर होने के बाद, उपयुक्त नमूने के साथ एक ट्यूब में 30 एमएल चढ़ाना समाधान स्थानांतरित करें; तुरंत प्लेटिंग मिश्रण और नमूना को लेबल प्लेट में वितरित करें। प्रत्येक नमूने को चढ़ाने के लिए एक ताजा पिपेट के साथ दोहराएं।
  8. प्लेटों को 15-20 मिनट के लिए जमने दें और फिर उन्हें 5% सीओ2 के साथ पूरक 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। डालने के बाद प्लेटों को कम से कम 48 घंटे तक उलट न करें।
  9. प्राप्तकर्ता क्लोन की पृष्ठभूमि के आधार पर, जांचें कि इनक्यूबेशन के 10-21 दिनों के बाद चयन प्लेटों पर कॉलोनियां अगारोस के भीतर दिखाई देती हैं। कम से कम 5-10 कॉलोनियों को चुनें जो बोरोसिलिकेट पिपेट में एक निष्फल कपास-प्लग किए गए 5.75 का उपयोग करके दोनों एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में प्लेट पर बढ़ते हैं ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें उपयुक्त एंटीबायोटिक (ओं) के साथ 1x BSK के 1.5 एमएल में टीका लगाएं।
  10. 3-5 दिनों के लिए चरण 1.3 में 33 डिग्री सेल्सियस पर टीका कॉलोनियों को उगाएं या जब तक वे डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 200x आवर्धन पर प्रति क्षेत्र लगभग 20-40 स्पाइरोकेट्स के घनत्व तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: एक बार जांच किए जाने के बाद (चरण 8 देखें), स्पाइरोकेट्स को 60% ग्लिसरॉल और 40% 1x BSK के मिश्रण के साथ कल्चर की समान मात्रा को मिलाकर -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए फ्रीज किया जा सकता है।

8. संभावित ट्रांसडक्टेंट्स का सत्यापन

नोट: दो एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में प्लेटों पर बढ़ने वाले क्लोनों को स्क्रीन करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि वे प्रत्याशित (प्राप्तकर्ता) पृष्ठभूमि में सच्चे ट्रांसडक्टेंट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये विधियां पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा विशिष्ट क्षेत्रों के प्रवर्धन, और संभावित अनुक्रमण पर आधारित हैं। बर्गडोरफेरी में पीसीआर प्रदर्शन के विस्तृत प्रोटोकॉल और प्रथाओं को कहीं और वर्णित किया गया है (हाल के उदाहरण के लिए, सेशु एट अल.37 देखें)। उपयोग किए गए उपभेदों के आधार पर ट्रांसडक्टेंट्स की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों का चयन करें। ट्रांसडक्टेंट्स की स्क्रीनिंग के तरीके के बारे में कुछ सुझाव नीचे वर्णित हैं।

  1. पीसीआर स्क्रीनिंग के लिए बी बर्गडॉर्फेरी लाइसेट तैयार करें।
    नोट: पीसीआर द्वारा डीएनए के तत्काल विश्लेषण के लिए चरण 7.9 में विकसित सुसंस्कृत कोशिकाओं से धोए गए बी बर्गडॉरफेरी लाइसेट का उत्पादन करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है। यह विधि बीएसके में संभावित अवरोधकों के हस्तक्षेप को कम करने के लिए डिज़ाइन की गई है, लेकिन अनुक्रमण या भंडारण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के उत्पादन के लिए अनुशंसित नहीं है। उस उद्देश्य के लिए, कुल जीनोम निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल या किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक विश्लेषण में शामिल करने के लिए मूल क्लोन (दाता और प्राप्तकर्ता दोनों उपभेदों) से लाइसेट भी एक ही समय में तैयार किए जाएं।
    1. चरण 7.10 में चयनित और सुसंस्कृत प्रत्येक संभावित ट्रांसडक्टेंट के 500 μL को एक स्वच्छ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. कमरे के तापमान पर 8,000 x g पर 10 मिनट के लिए संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और प्रत्येक गोली को 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0) में पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 8,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    4. सतह पर तैरने वाले को निकालें और प्रत्येक गोली को 50 μL पीसीआर-गुणवत्ता वाले पानी में पुन: निलंबित करें। नमूने को 10 मिनट के लिए उबालें। उन्हें संक्षेप में ठंडा होने दें, और फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. प्रत्येक पीसीआर के लिए, तुरंत सेंट्रीफ्यूज्ड नमूने के शीर्ष से 2 μL का उपयोग करें; गोली को परेशान करने से बचें।
  2. पीसीआर का उपयोग करके एंटीबायोटिक प्रतिरोध को एन्कोडिंग करने वाले विशिष्ट जीन के लिए संभावित ट्रांसडक्टेंट्स को स्क्रीन करें। आमतौर पर पारगमन परख में उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्करों की स्क्रीनिंग के लिए प्राइमरों के लिए तालिका 4 देखें।
    नोट: हालांकि हमारे अनुभव में दुर्लभ है, बी बर्गडोरफेरी में हेटरोलॉगस डीएनए के चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक दवाओं के लिए सहज उत्परिवर्तन हो सकता है।
  3. संभावित ट्रांसडक्टेंट्स को एक और तनाव या क्लोन मार्कर का उपयोग करके स्क्रीन करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि पृष्ठभूमि प्राप्तकर्ता की है। इन विश्लेषणों में दाता और प्राप्तकर्ता माता-पिता क्लोन दोनों को शामिल करें। तनाव अखंडता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए गए उपभेदों और व्यक्तिगत प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के आधार पर अनुक्रमों का उपयोग करके तनाव-विशिष्ट मार्करों के लिए स्क्रीन।
  4. यदि टिक वेक्टर या स्तनधारी मेजबान के भीतर उपयोग के लिए या किसी अन्य क्लोन के साथ सीधी तुलना के लिए वायरल क्लोन में ट्रांसड्यूस करने का प्रयास किया जाता है, तो ट्रांसडक्टेंट्स और मूल क्लोन की पूर्ण प्लास्मिड सामग्री निर्धारित करें। यह तुलनात्मक तनाव या एन्ज़ोटिक चक्र के भीतर प्रसार के लिए आवश्यक आनुवंशिक तत्वों की उपस्थिति के समान प्लास्मिड सामग्री सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है, जैसा कि कहीं और वर्णित है 18,19,37,38,39।

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Representative Results

बर्गडोरफेरी उपभेदों या क्लोनों के बीच डीएनए को स्थानांतरित करने के लिए बैक्टीरियोफेज का उपयोग जो इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म के लिए उद्दंड हैं, लाइम रोग के निर्धारकों की निरंतर आणविक जांच के लिए एक और उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। यहां वर्णित ट्रांसडक्शन परख को संभावित ट्रांसडक्टेंट्स के चयन के लिए एक या दो एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके रुचि के किसी भी क्लोन के बीच डीएनए के आंदोलन को सुविधाजनक बनाने के लिए आवश्यकतानुसार संशोधित किया जा सकता है। प्रोफेज डीएनए और हेटरोलॉगस ई कोलाई/बी बर्गडोर्फेरी शटल वैक्टर दोनों का ट्रांसडक्शन एक उच्च-मार्ग तनाव सीए -11.2 ए क्लोन और एक उच्च-मार्ग तनाव बी 31 क्लोन और स्ट्रेन 297 के कम-मार्ग वायरल क्लोन दोनों के बीचपहले प्रदर्शित किया गया है। नीचे प्रस्तुत परिणाम दो उच्च-मार्ग, विषाक्त क्लोनों के बीच प्रोफेज डीएनए की गति को प्रदर्शित करते हैं। दाता क्लोन, सी 1673, एक बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन सीए -11.2 ए क्लोन है जो प्रोफेज डीएनए27,28 पर एक कनामाइसिन-प्रतिरोध जीन को एन्कोड करता है। प्राप्तकर्ता बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन बी 31 का क्लोन है, जिसे सी 1706 नामित किया गया है, जो क्रोमोसोम28 पर एक जेंटामाइसिन-प्रतिरोध मार्कर को एन्कोड करता है। ट्रांसडक्शन परख चित्रा 1 बी में चित्रित के रूप में किया गया था; 5% इथेनॉल के संपर्क में आने वाले सी 1673 के सुपरनैटेंट से बरामद पीईजी-अवक्षेपित फेज को प्रोटोकॉल के चरण 6 में वर्णित सी 1706 के साथ मिलाया गया था।

इथेनॉल-उजागर सी 1673 (कनामाइसिन के लिए एन्कोडिंग प्रतिरोध) के सुपरनैटेंट्स से पीईजी वर्षा द्वारा पुनर्प्राप्त फेज का लगभग 20% सी 1706 (जेंटामाइसिन के प्रतिरोध को एन्कोडिंग) के साथ मिलाने के बाद, मिश्रण को दोनों एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में चढ़ाया गया था; कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू) जो कनामाइसिन और जेंटामाइसिन दोनों की उपस्थिति में बढ़ने में सक्षम हैं, पारगमन घटनाओं का संकेत हैं (चित्रा 2)27,28। सीएफयू की संख्या को प्रति प्रारंभिक प्राप्तकर्ता सेल में पारगमन आवृत्ति के रूप में रिपोर्ट किया गया है। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, 1 × 10 7 प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के साथ फेज के इनक्यूबेशन के बाद लगभग275 ट्रांसडक्टेंट्स बरामद किए गए, जिससे प्रति प्राप्तकर्ता सेल 10-5 सीएफयू × 2.75 की पारगमन आवृत्ति प्राप्त हुई।

संभावित ट्रांसडक्टेंट्स की वसूली के बाद, 10 क्लोनों पर कनामाइसिन और जेंटामाइसिन प्रतिरोध को एन्कोडिंग करने वाले जीन का पीसीआर प्रवर्धन किया गया था, जिसमें चित्र 3 में दिखाए गए दो प्रतिनिधि नमूने थे। कानामाइसिन-प्रतिरोध जीन को दाता (सी 1673) और संभावित ट्रांसडक्टेंट्स से प्रवर्धित किया जा सकता है लेकिन प्राप्तकर्ताओं (सी 1706) से नहीं। इसी तरह, जेंटामाइसिन-प्रतिरोध जीन को प्राप्तकर्ता (सी 1706) और संभावित ट्रांसडक्टेंट्स से प्रवर्धित किया जा सकता है लेकिन दाता से नहीं। इस प्रकार, पुनर्प्राप्त क्लोन विशेष रूप से एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन दोनों को एन्कोड करते हैं और पारगमन घटनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, न कि सहज उत्परिवर्ती।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि कनामाइसिन-प्रतिरोध कैसेट को दाता से प्राप्तकर्ता में एबीबी -1 द्वारा ट्रांसड्यूस किया गया था, ट्रांसडक्टेंट्स की पृष्ठभूमि तनाव-विशिष्ट मार्करों का उपयोग करके निर्धारित की गई थी, जैसा कि पहलेवर्णित है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि ट्रांसडक्टेंट्स ट्रांसडक्शन की सह-संस्कृति विधि द्वारा उत्पन्न किए गए हैं। संक्षेप में, पहले प्रकाशित प्राइमर28 का उपयोग विभिन्न बोरेरियल प्लास्मिड के विशिष्ट क्षेत्रों को बढ़ाने के लिए किया गया था, जिससे एक प्रोफ़ाइल उत्पन्न होती है जिसका उपयोग क्लोन की पृष्ठभूमि की पहचान करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 4)। सीए -11.2 ए पृष्ठभूमि में सी 1673 क्लोन विशिष्ट एम्प्लिकॉन 4, 5 और 6 को एन्कोड करता है, जबकि सी 1706, जिसमें उच्च-मार्ग बी 31 पृष्ठभूमि है, नहीं करता है। इसी तरह, दो ट्रांसडक्टेंट्स एमप्लिकॉन 4, 5 और 6 गायब हैं; इस प्रकार, इन क्लोनों में सी 1706 पृष्ठभूमि है और सी 1673 से कनामाइसिन-प्रतिरोध जीन हासिल किया है।

घटक 1x BSK (संवर्धन के लिए) (1 L) 1.5x BSK (चढ़ाना के लिए) (1 L)
बोवाइन सीरम एल्बुमिन (अंश वी) 35 ग्राम 52.5 ग्राम
10x CMRL-1066 (एल-ग्लूटामाइन के बिना) 8 ग्राम 12 ग्राम
नियोपेप्टोन 4 ग्राम 6 ग्राम
यीस्टोलेट 1.6 ग्राम 2.4 ग्राम
HEPES 4.8 ग्राम 7.2 ग्राम
ग्लूकोज़ 4 ग्राम 6 ग्राम
सोडियम साइट्रेट 0.56 ग्राम 0.84 ग्राम
सोडियम पाइरूवेट 0.64 ग्राम 0.96 ग्राम
एन-एसिटाइल-ग्लूकोसामाइन 0.32 ग्राम 0.48 ग्राम
सोडियम बाइकार्बोनेट 1.76 ग्राम 2.64 ग्राम
हीट-निष्क्रिय सामान्य खरगोश सीरम (INRS) 66 mL 99 mL

तालिका 1: ट्रांसडक्शन परख के लिए बी बर्गडॉर्फेरी क्लोन की खेती और चयन के लिए बीएसके। यहां वर्णित बी. बर्गडोर्फेरी क्लोनों के ठोस चरण चयन के लिए बी. बर्गडोरफेरी और 1.5x BSK की खेती के लिए 1x BSK का निर्माण और तैयारी सैमुएल्स15 पर आधारित है। बीएसके (या एमकेपी) 37,40,41 के विभिन्न योग जो बी बर्गडोर्फरी के विकास का समर्थन करते हैं, अभी तक पारगमन परख का उपयोग करके परीक्षण नहीं किए गए हैं।

प्रतिजैविक स्टॉक एकाग्रता बीबी की संस्कृति में अंतिम एकाग्रता
कैनामाइसिन 100 mg.mL-1 (पानी में) 200-400 μ g.mL-1
Gentamicin 50 mg.mL-1 (पानी में) 50 μ g.mL-1
स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 mg.mL-1 (पानी में) 50 μ g.mL-1
इरिथ्रोमाइसिन 2 mg.mL-1 (EtOH में) 0.06 μ g.mL-1

तालिका 2: बी बर्गडोरफेरी में हेटरोलॉगस डीएनए के चयन और रखरखाव के लिए उपयोग किए जाने वाले संभावित एंटीबायोटिक्स और सांद्रता। यह सूची वर्तमान एंटीबायोटिक प्रतिरोधी मार्करों पर आधारित है जो आमतौर पर बोरेलिया बर्गडोरफेरी 42,43,44,45 में उपयोग किए जाते हैं। कनामाइसिन, जेंटामाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन पानी में तैयार किए जाते हैं, 0.22 μM फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर-स्टरलाइज़ किए जाते हैं, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होते हैं। एरिथ्रोमाइसिन 95% इथेनॉल में तैयार किया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। कई प्रयोगशालाएं 200 μg.mL-1 की एकाग्रता पर चयन के लिए कानामाइसिन के सफल उपयोग की रिपोर्ट करती हैं; ट्रांसडक्शन परख में चयन के लिए जेंटामाइसिन और कनामाइसिन दोनों का उपयोग करते समय, 400 μg.mL-1 कनामाइसिन का उपयोग किया जाता है। एएडीए जीन स्ट्रेप्टोमाइसिन और स्पेक्टिनोमाइसिन44 दोनों के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। ई में एडीए जीन युक्त संरचनाओं के चयन के लिए। कोलाई, 100 μg.mL-1 स्पेक्टिनोमाइसिन का उपयोग किया जाता है। ध्यान दें कि एमिनोग्लाइकोसाइड्स (कनामाइसिन, जेंटामाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) लाइम रोग के उपचार में चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक नहीं हैं; हालांकि, एरिथ्रोमाइसिन का उपयोग कुछ स्थितियों में चिकित्सकीय रूप से कियाजाता है। हालांकि बी बर्गडॉर्फेरी में इस एंटीबायोटिक के लिए प्राकृतिक प्रतिरोधकी सूचना दी गई है, लेकिन इस प्रतिरोध मार्कर का उपयोग अब तक यहां रिपोर्ट किए गए पारगमन परखों में नहीं किया गया है।

उत्प्रेरण एजेंट स्टॉक एकाग्रता (विलायक) नमूने में अंतिम एकाग्रता
एथनॉल 100% (कोई नहीं) 5%
मिटोमाइसिन सी 2 mg.mL-1 (पानी) 20 g.mL-1
1-मिथाइल-3-नाइट्रोसो-नाइट्रोगुआनिडाइन (एमएनएनजी) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 g.mL-1

तालिका 3: संभावित उत्प्रेरण एजेंट और सांद्रता का उपयोग बी. बर्गडोरफेरी से एबीबी -1 के प्रेरण के लिए किया जाता है। एन-मिथाइल-एन'-नाइट्रो-एन-नाइट्रोसोगुआनिडाइन (एमएनएनजी), मिटोमाइसिन सी, और इथेनॉल, साथ ही मेथनॉल और आइसोप्रोपेनॉल, सभी को बी बर्गडॉर्फेरी स्ट्रेन सीए.11-2 ए 25,26,28 में संवैधानिक स्तर से ऊपर एबीबीबी -1 को प्रेरित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। एमएनएनजी एक संदिग्ध कार्सिनोजेन और पर्यावरणीय खतरा है; सावधानी के साथ उपयोग करें, एक दहनशील विलायक में घुल जाएं, और निपटान के लिए भस्म करें। मिटोमाइसिन सी एक संदिग्ध कार्सिनोजेन और संभावित पर्यावरणीय खतरा है; रासायनिक फ्यूम हुड के तहत सावधानी के साथ उपयोग करें और ठीक से निपटान करें। जबकि प्रकाशित आंकड़ों से पता चलता है कि एमएनएनजी एबीबी -126 को प्रेरित करने के लिए सबसे प्रभावी एजेंट है, इस रसायन के साथ काम करने के खतरे और इसे प्राप्त करने में कठिनाइयों ने इसके उपयोगको जटिल बना दिया है, खासकर छात्रों के साथ। इथेनॉल के साथ प्रेरण मेथनॉल या आइसोप्रोपेनॉल28 की तुलना में लगातार बेहतर है और पारगमन परख में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है।

जीन नाम या पदनाम एंटीबायोटिक प्रतिरोध संदर्भ प्राइमर का नाम प्राइमर अनुक्रम (5'से 3')
Tn903 से kanR कानामाइसिन 42 kanR 382F CGGTTGCATTCTCCTGT
kanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 gentamicin 43 AACC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCACT
AadA स्ट्रेप्टोमाइसिन 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
AADA 594R TACTGCGCTGTACCAATGC

तालिका 4: एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों के पारगमन के प्रारंभिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। यहां इंगित प्राइमर आमतौर पर पारगमन परख में उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन का पता लगाने के लिए हैं। इन प्राइमरों का उपयोग पीसीआर में 28 चक्रों के लिए दोहराए जाने वाले निम्नलिखित स्थितियों के साथ किया जाता है: 15 सेकंड के लिए 92 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, 15 सेकंड के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर एनीलिंग, और 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर लक्ष्य डीएनए विस्तार।

Figure 1
चित्रा 1: डीएनए के फेज-मध्यस्थता आंदोलन (पारगमन) की निगरानी के लिए पारगमन परख। ट्रांसडक्शन परख को या तो (ए) सह-संस्कृति विधि या (बी) पीईजी वर्षा द्वारा कल्चर सुपरनैटेंट से बरामद फेज का उपयोग करके किया जा सकता है। सह-संस्कृति विधि (ए) के लिए, एक प्रेरित बी. बर्गडोरफेरी क्लोन (दाता) डीएनए पर एक एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन को एन्कोडिंग करता है जिसे एबीबी -1 (ग्रीन सर्कल) द्वारा ट्रांसड्यूस किया जाता है, जिसे गैर-प्रेरित बी बर्गडोर्फेरी क्लोन (प्राप्तकर्ता) के साथ संवर्धित किया जाता है, जो क्रोमोसोम या अन्य स्थिर आनुवंशिक तत्व (लाल सर्कल) पर एक दूसरे एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन को एन्कोड करता है। इस विधि के लिए दो अलग-अलग एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्करों (इस उदाहरण में, कनामाइसिन और जेंटामाइसिन प्रतिरोध को एन्कोडिंग करने वाले जीन) के उपयोग की आवश्यकता होती है। ट्रांसडक्शन परख (बी) में शुद्ध फेज का उपयोग करने के लिए, प्रेरित दाता से सतह पर तैरने वाले पीईजी वर्षा द्वारा पुनर्प्राप्त फेज कणों को प्राप्तकर्ता के साथ मिलाया जाता है। जबकि यहां दो अलग-अलग एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करके दिखाया गया है, इस विधि को केवल एक एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर के उपयोग के साथ किया जा सकता है, जैसा कि पहले दिखाया गयाथा। इनक्यूबेशन बाद, ट्रांसडक्टेंट्स को दोनों एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में ठोस-चरण चढ़ाना द्वारा चुना जाता है; यदि विधि बी का उपयोग फेज डीएनए पर एन्कोड किए गए केवल एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर के साथ किया जा रहा है, तो ठोस-चरण चढ़ाना के दौरान केवल उस एंटीबायोटिक का उपयोग करके चयन किया जाता है। ट्रांसडक्टेंट्स में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर दोनों होंगे और प्राप्तकर्ता की पृष्ठभूमि होगी। यह आंकड़ा ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस की अनुमति से एगर्स एट अल .28 से पुनर्मुद्रित है। मॉडलिंग प्रयोग में, c1673 और c1650 दो अलग-अलग CA-11.2A क्लोन का प्रतिनिधित्व करते हैं; c1673 में एक φBB-1 प्रोफेज एन्कोडिंग कानामाइसिन प्रतिरोध होता है, और c1650 एक गैर-फेज स्थान28 में एक जेंटामाइसिन-प्रतिरोध मार्कर को एन्कोड करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसडक्शन परख के बाद ठोस-चरण चढ़ाना द्वारा कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों का चयन किया गया। सी 1673 से सी 1706 के साथ फेज के मिश्रण के बाद दोनों एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में बढ़ने वाली कॉलोनियां संभावित ट्रांसडक्टेंट्स का प्रतिनिधित्व करती हैं। कोई भी कॉलोनी नियंत्रण प्लेटों पर नहीं बढ़नी चाहिए जिसमें व्यक्तिगत दाता और प्राप्तकर्ता क्लोन या फेज प्रेप का नमूना होता है (नहीं दिखाया गया)। मूल नमूने में उत्पादक फेज की न्यूनतम संख्या सीएफयू की संख्या की गणना करके और कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करके निर्धारित की जा सकती है। इस मामले में, दाता के 15 एमएल संस्कृति से उपजी फेज नमूना पीईजी-अवक्षेपित 20% ने लगभग 275 कॉलोनियों का उत्पादन किया। इस प्रकार, पीईजी वर्षा द्वारा पुनर्प्राप्त उत्पादक फेज की मूल एकाग्रता ≥1.3 × 103 वायरियन थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: दो संभावित ट्रांसडक्टेंट्स से कनामाइसिन प्रतिरोध और जेंटामाइसिन प्रतिरोध प्रदान करने वाले जीन का पीसीआर प्रवर्धन। दो कॉलोनियों (ट्रांसडक्टेंट 1 और ट्रांसडक्टेंट 2) से उत्पन्न लाइसेट को स्क्रीन करने के लिए कनामाइसिन- और जेंटामाइसिन-प्रतिरोध जीन (तालिका 4) के लिए प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर किया गया था। इन कॉलोनियों को सी 1673 (दाता) और सी 1706 (प्राप्तकर्ता) के मिश्रण के बाद कनामाइसिन और जेंटामाइसिन दोनों युक्त प्लेट पर चुना गया था। एम्प्लिकॉन को 1x Tris-एसीटेट-EDTA (TAE) बफर में 120 V पर 60 मिनट के लिए 1% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन पर हल किया गया था और 0.5 μg.ml-1 एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दाग दिया गया था। संख्याएं किलोबेस जोड़े में आकार मार्करों को इंगित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसडक्टेंट्स की पृष्ठभूमि की पुष्टि करना। विशिष्ट आनुवंशिक तत्वों के क्षेत्रों को सी 1673, सी 1706, और दो ट्रांसडक्टेंट्स से प्रवर्धित किया गया था, जैसा कि पहले28 वर्णित किया गया था, यह पुष्टि करने के लिए कि ट्रांसडक्टेंट्स की पृष्ठभूमि प्राप्तकर्ता क्लोन, सी 1706 की थी। चुने गए क्षेत्र बी बर्गडोरफेरी प्रकार के तनाव, बी 31 6 के भीतर विशिष्ट रैखिक या परिपत्र प्लास्मिड (क्रमशः एलपी या सीपी) पर जीनके अनुक्रमों पर आधारित थे। 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32), और 8 = fla जीन (क्रोमोसोम)। एम्प्लिकॉन को 1x TAE बफर में 120 V पर 60 मिनट के लिए 1% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन पर हल किया गया था और 0.5 μg.ml-1 एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दाग दिया गया था। संख्याएं किलोबेस जोड़े में आकार मार्करों को इंगित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ट्रांसडक्शन का उपयोग बी बर्गडॉर्फेरी 1,4,13,37 के इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म से जुड़े कम से कम कुछ जैविक और तकनीकी बाधाओं पर काबू पाने की एक विधि का प्रतिनिधित्व कर सकता है। कई प्रणालियों में, बैक्टीरियोफेज सामान्यीकृत या विशेष पारगमन 22,23,24,49,50 द्वारा जीवाणु कोशिकाओं के बीच मेजबान (गैर-प्रोफेज) डीएनए को स्थानांतरित कर सकता है। विशेष पारगमन में, कुछ मेजबान जीन हमेशा प्रोफेज डीएनए49,50 के साथ फेज कैप्सिड के भीतर पैक किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, φBB-1 हमेशा cp32 के उन हिस्सों को पैकेज करता है जो मूल रूप से जीवाणु हैं, क्योंकि वे प्लास्मिड पर सीपी 32 के उन हिस्सों से अटूट रूप से जुड़े होते हैं जो फेज जीनोम हैं। सामान्यीकृत पारगमन में, बैक्टीरियोफेज के पैकेजिंग तंत्र को गैर-फेज अनुक्रमों के समरूप रूप में जोड़ा जाता है और फेज डीएनए के बजाय "गलती से" यादृच्छिक मेजबान डीएनए को पैकेज किया जाता है; डीएनए के ये टुकड़े तब किसी अन्य सेल49,50 में पेश किए जाने में सक्षम हैं। बर्गडोरफेरी में फेज द्वारा सामान्यीकृत पारगमन के बारे में अभी तक बहुत कम जाना जाता है; हालांकि, बेहतर विशेषता वाले जीवाणु प्रणालियों में, एक कोशिका से जारी बैक्टीरियोफेज के 1% में फेज डीएनए51 के बजाय यादृच्छिक जीवाणु जीन हो सकते हैं। इस प्रकार, अब तक, विभिन्न बी बर्गडोरफेरी क्लोनों के बीच कोई क्रोमोसोमल मार्कर ट्रांसड्यूस नहीं देखा गया है, लेकिन पूर्व प्रदर्शन कि सीपी 32 और छोटे हेटरोलॉगस शटल वैक्टर दोनों को एबीबी -1 द्वारा पैक और ट्रांसड्यूस किया जा सकता है, इंगित करता है कि यह फेज विशेष और सामान्यीकृत पारगमन28 दोनों में भाग ले सकता है। इसलिए, प्रयोगशाला में पारगमन के लिए एक उपयोग-मामला प्रस्तावित है, जिसमें क्रोमोसोमल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने वाले इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म अभी भी रुचि की पृष्ठभूमि में किया जाता है; हालांकि, ट्रांस में पूरक के लिए शटल वैक्टर की शुरूआत या अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए रिपोर्टर संरचनाओं का उपयोग करके इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म के लिए उद्दंड उपभेदों में किया जा सकता है, जो अधिक परिवर्तनीय उच्च-मार्ग क्लोन और कम परिवर्तनीय उपभेदों के बीच पारगमन के माध्यम से किया जा सकता है। यदि भविष्य के अध्ययन क्रोमोसोमल लोकी को पैकेज करने और स्थानांतरित करने के लिए एबीबी -1 की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं, तो यहां वर्णित विधियां संशोधित क्रोमोसोमल डीएनए को अधिक आसानी से बदलने योग्य उपभेदों और उपभेदों के बीच स्थानांतरित करने में भी उपयोगी साबित हो सकती हैं जो अन्यथा इलेक्ट्रोट्रांसफॉर्म करना मुश्किल है। सीपी 32 जैसे प्लास्मिड सभी बी बर्गडोरफेरी उपभेदों के बीच व्यापक हैं और अन्य लाइम रोगों के विशाल बहुमत 52,53; अन्य बोरेलिया प्रजातियों में होमोलॉग के लिए भी सबूत हैं, जिनमें बी मेयोनी, बी मियामोतोई और वे शामिल हैं जो रिलैप्सिंग बुखार54,55,56 का कारण बनते हैं। क्या अन्य बोरेलिया प्रजातियों में होमोलॉग भी प्रोफेज हैं, यह अभी तक ज्ञात नहीं है, लेकिन यदि हां, तो पारगमन इन प्रजातियों के आणविक विच्छेदन के लिए एक उपकरण भी हो सकता है, जिनमें से कुछ को अभी तक आनुवंशिक रूप से सफलतापूर्वक हेरफेर नहीं किया गया है।

डीएनए ट्रांसड्यूसिंग के लिए दो तरीके यहां प्रस्तुत किए गए हैं: चयन से पहले दाता और प्राप्तकर्ता क्लोन को एक साथ सह-संवर्धन करना (चित्रा 1 ए) या दाता से पीईजी-अवक्षेपण फेज और प्राप्तकर्ता के साथ केवल उस फेज को मिलाना (चित्रा 1 बी)। पीईजी-अवक्षेपित फेज28 का उपयोग करने की तुलना में सह-संस्कृति के बाद प्रति प्राप्तकर्ता सेल पारगमन घटनाओं की संख्या अधिक है, लेकिन सह-संस्कृति के लिए आवश्यक है कि दाता और प्राप्तकर्ता दोनों अलग-अलग एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर ों को ले जाएं और किसी भी संभावित ट्रांसडक्टेंट्स की पृष्ठभूमि को सावधानीपूर्वक जांचा जाए। जैसा कि बोरेलिया52,53 के बीच एबीबी -1 प्रोफेज सर्वव्यापी हैं, एक सैद्धांतिक संभावना है कि, सक्रिय रूप से बढ़ते क्लोनों को मिलाते समय, एक एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर या अन्य हेटरोलॉगस डीएनए प्राप्तकर्ता से दाता तक जा सकता है (दाता से प्राप्तकर्ता के बजाय, जैसा कि इरादा है)। ट्रांसडक्शन परख में पीईजी-अवक्षेपित फेज का उपयोग करने से यह संभावना समाप्त हो जाती है, क्योंकि दाता फेज / प्राप्तकर्ता मिश्रण में मौजूद नहीं है। इसके अतिरिक्त, फेज की पीईजी वर्षा की आवश्यकता होती है यदि फेज और इसकी जीनोमिक सामग्री का उपयोग विश्लेषण (यानी, संरचनात्मक विश्लेषण, परिमाणीकरण, पैक की गई सामग्री की पहचान, आदि) और पारगमन दोनों के लिए किया जाना है। इन फायदों के बावजूद, पीईजी-अवक्षेपित फेज का उपयोग करने से इसकी संभावित कमियां होती हैं; सह-संस्कृति के साथ कई ट्रांसडक्टेंट्स नहीं देने के अलावा, पीईजी वर्षा समय लेने वाली हो सकती है, इससे महत्वपूर्ण फेज हानि हो सकती है, और इसके परिणामस्वरूप ऐसे नमूने होते हैं जिनमें दूषित पदार्थ होते हैं जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

बर्गडॉर्फेरी उपभेदों से अब तक ट्रांसडक्शन का प्रदर्शन किया गया है: सीए -11.2 ए, एक उच्च-मार्ग बी 31 क्लोन, और एक कम-मार्ग 297 क्लोन28। इन तीन में से, बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन सीए -11.2 ए प्रेरण25,26,28 के बाद फेज की उच्चतम मात्रा का उत्पादन करता है; हालांकि, प्रेरण के बाद भी, बी बर्गडोर्फरी से बरामद फेज की संख्या अभी भी बेहतर विशेषता वाले सिस्टम में बरामद फेज की तुलना में कम परिमाण के आदेश हैं, जैसे कि कोलिफेज 25,28,59। इस प्रकार, पीईजी वर्षा के बाद सह-संस्कृति या फेज के मिश्रण के माध्यम से पारगमन के उपयोग में उत्पन्न होने वाला एक मुद्दा बी बर्गडोर्फरी से जारी बैक्टीरियोफेज की छोटी संख्या है, भले ही उत्प्रेरण एजेंटों के संपर्क में हो। इसके अतिरिक्त, फेज उत्पादन में बैच-टू-बैच भिन्नता महत्वपूर्ण है, तब भी जब सभी स्थितियां, मीडिया घटक और विधियां प्रयोगों के बीच सुसंगत लगती हैं। इस कारण से, यह निर्धारित करना कि किसी दिए गए क्लोन से या किसी दी गई स्थिति के तहत कम से कम न्यूनतम संख्या में फेज का उत्पादन किया जाता है, महत्वपूर्ण है। एक नमूने में फेज की संख्या निर्धारित करने के लिए पारंपरिक परख को एक अनुमेय जीवाणु मेजबान के साथ फेज युक्त नमूने की एक छोटी मात्रा को मिलाने की आवश्यकता होती है जिसमें बैक्टीरियोफेज लिटिक होता है; नमूने में उत्पादक फेज कणों की संख्या उस पृष्ठभूमि में होने वाली लिटिक घटनाओं की संख्या से निर्धारित होती है, जिसके परिणामस्वरूप बैक्टीरिया60,61 के लॉन पर सजीले टुकड़े बनते हैं। फेज की संख्या को पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) 61 के रूप में सूचित किया गया है। एक पट्टिका परख का उपयोग करके प्रेरण के बाद जारी उत्पादक एबीबी -1 की संख्या को निर्धारित करना एक घने लॉन में बोरेलिया बर्गडोर्फेरी को विकसित करने में असमर्थता और तंत्र की समझ की वर्तमान कमी से बाधित होता है जो एबीबी -1 के लाइसोजेनिक और लिटिक प्रतिकृति चक्रों के बीच स्विच को नियंत्रित करते हैं। वास्तव में, जबकि बी बर्गडोरफेरी की लाइस्ड संस्कृतियों की वास्तविक रिपोर्टें कई हैं, इस प्रकार, अब तक, फेज के उत्पादन के साथ एक पूरी संस्कृति के लाइसिस के अवलोकन को सहसंबंधित करने वाला कोई प्रकाशित अध्ययन नहीं हुआ है। अनुभव से, किसी दिए गए संस्कृति में केवल थोड़ी संख्या में कोशिकाएं अनायास फेज का उत्पादन करती हैं, संभवतः लाइसिस द्वारा, और इस उत्पादन को केवल ज्ञात उत्प्रेरणएजेंटों 25,28,62 के संपर्क में आने के साथ मामूली रूप से बढ़ाया जा सकता है। इस प्रकार, बी बर्गडोरफेरी से एबीबी -1 की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्तमान में एक पट्टिका परख संभव नहीं है।

बर्गडॉर्फेरी के प्रेरण के बाद उत्पादित उत्पादक फेज की संख्या को निर्धारित करने के लिए, इस रिपोर्ट में वर्णित ट्रांसडक्शन परख को बैक्टीरियोफेज द्वारा पैक किए गए एंटीबायोटिक से अलग एंटीबायोटिक के साथ अनुमेय बी बर्गडॉर्फेरी क्लोन का उपयोग करके किया जा सकता है। इस परख के परिणामस्वरूप ट्रांसडक्शन के परिणामस्वरूप कॉलोनियां होती हैं, जिसमें प्रत्येक कॉलोनी एक पुष्टि किए गए फेज का प्रतिनिधित्व करती है। इस प्रकार, एक नमूने में फेज की न्यूनतम संख्या को पीएफयू के बजाय सीएफयू के रूप में रिपोर्ट किया जा सकता है। यह संख्या पीईजी वर्षा (यदि उपयोग किया जाता है) द्वारा फेज की वसूली में निहित अक्षमताओं के कारण उत्पादित फेज की वास्तविक कुल संख्या से कम है (यदि उपयोग किया जाता है), फेज द्वारा डीएनए के लगाव और इंजेक्शन, और बी बर्गडोरफेरी के ठोस-चरण चढ़ाना।

बी बर्गडोरफेरी संस्कृतियों के सुपरनैटेंट्स के भीतर प्रोफेज डीएनए की कुल मात्रा निर्धारित करने के लिए एक संभावित विधि मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) है, लेकिन बी बर्गडोरफेरी से सीपी 32 डीएनए के लिए क्यूपीसीआर प्रोटोकॉल साहित्य में अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं किया गया है, और क्यूपीसीआर अभी तक इस उद्देश्य के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली पद्धति नहीं है। गुणात्मक रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि किसी दिए गए नमूने में फेज डीएनए का कम से कम एक मध्यम स्तर है, निष्कर्षण से पहले डीनेस उपचार के बाद बी बर्गडोर्फरी संस्कृतियों के पीईजी-अवक्षेपित सुपरनैटेंट से कुल डीएनए निकाला जा सकता है; फेज डीएनए को एक बरकरार फेज कैप्सिड25 द्वारा संरक्षित किया जाएगा। पुनर्प्राप्त डीएनए को फिर एक अगारोस जेल में हल किया जाता है और डीएनए दाग के साथ कल्पना की जाती है; यह प्रोटोकॉल आमतौर पर फेज हेड25 के भीतर पैक किए गए रैखिक डीएनए का प्रतिनिधित्व करने वाला एक बेहोश 30 केबी बैंड उत्पन्न करता है। दाग की संवेदनशीलता और मार्कर के सापेक्ष सही आकार के फेज डीएनए बैंड की तीव्रता के आधार पर, बरामद कुल फेज की अनुमानित संख्या25,27 निर्धारित की जा सकती है। ट्रांसडक्शन परख के बाद बरामद ट्रांसडक्टेंट्स की संख्या के साथ सुपरनैटेंट से बरामद कुल फेज डीएनए के स्तर का एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध पहले28 प्रदर्शित किया गया है।

दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों की पसंद आणविक उपकरण के रूप में पारगमन के उपयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। cp32s की हमारी समझ लाइम रोग स्पाइरोकेट्स52,53 में cp32s की व्यापकता और इस तथ्य से जटिल है कि एक व्यक्ति B. burgdorferi सेल में इन प्लास्मिड के कई होमोलॉग हो सकते हैं। एक सेल के भीतर सभी सीपी 32 फेज-उत्पादक उपभेदों में फेज हेड के भीतर पैक किए गए प्रतीत होते हैं जिनकीजांच की गई है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि सीपी 32 युक्त सभी बी बर्गडॉर्फेरी उपभेद बैक्टीरियोफेज का उत्पादन कर सकते हैं, और उपयोग से पहले इस क्षमता के लिए उपभेदों का परीक्षण किया जाना चाहिए। इसी तरह, रिसेप्टर्स के बारे में कुछ भी ज्ञात नहीं है जो एक विशेष तनाव को एबीबी -1 द्वारा ट्रांसड्यूस करने की अनुमति देता है, हालांकि जीनस में प्रोफेज प्लास्मिड की सर्वव्यापकता एक उच्च संभावना का सुझाव देती है कि एक विशेष तनाव को ट्रांसड्यूस किया जा सकता है। जैसा कि एक व्यक्तिगत बी बर्गडोर्फरी सेल के भीतर कई सीपी 32 प्लास्मिड की उपस्थिति से अनुमान लगाया जा सकता है, मौजूदा प्रोफेज की उपस्थिति से कोई फेज प्रतिरक्षा63 प्रदान नहीं होती है; CA.11-2A, B31, और 297 उपभेदों का उपयोग पारगमन परख में किया गया है और दोनों का उत्पादन होता है और इन्हें27,28 द्वारा ट्रांसड्यूस किया जा सकता है। जबकि पिछली रिपोर्टों ने संकेत दिया कि पीईजी-अवक्षेपित फेज27 का उपयोग करके केवल सीमित संख्या में उपभेदों में पारगमन संभव था, यह उस विधि के साथ तकनीकी कठिनाइयों के कारण हो सकता है, क्योंकि आज तक परीक्षण किए गए सभी उपभेदों को सह-संस्कृति विधि28 का उपयोग करके सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूसेबल किया गया है।

ट्रांसडक्शन परख का उपयोग करने के लिए एक प्रयोग तैयार करते समय, दाता तनाव की पसंद के लिए प्रमुख विचार आनुवंशिक पृष्ठभूमि, इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से आसानी से रूपांतरित होने की क्षमता और फेज का उत्पादन करने की इसकी क्षमता होनी चाहिए। यद्यपि हर स्ट्रेन के उच्च-मार्ग क्लोन का एक विस्तृत सर्वेक्षण नहीं किया गया है, लेकिन सीए -11.2 ए स्ट्रेन प्रेरण की अनुपस्थिति में भी पता लगाने योग्य स्तरों पर फेज का उत्पादन करता है। इसी तरह, बी 31 के उच्च-मार्ग क्लोन, पहला बी बर्गडोरफेरी स्ट्रेन जिसे पूरी तरह से अनुक्रमित कियाजाता है 5 और आणविक अध्ययनों में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला तनाव, भी संवैधानिक रूप से एबीबी -1 की पता लगाने योग्य मात्रा का उत्पादन करता है और आम तौर पर अत्यधिक परिवर्तनीय 1,4,25,27,37,64 होता है। . यदि जांच में अन्य उपभेदों की आवश्यकता होती है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि उस तनाव के उच्च-मार्ग क्लोन को पहले इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर युक्त प्लास्मिड पेश करके उनकी परिवर्तनीयता के लिए परीक्षण किया जाए और फिर एक अनुमेय प्राप्तकर्ता, जैसे सीए -11.2 ए या बी 31 के साथ ट्रांसडक्शन परख करके ट्रांसड्यूस करने की उनकी क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जाए, जो एक अलग एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्कर को एन्कोडिंग करता है। इसी तरह, यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक प्राप्तकर्ता तनाव या क्लोन पारगमन के लिए अनुमेय है, एक फेज-उत्पादक तनाव, जैसे कि सीए -11.2 ए जिसमें एंटीबायोटिक के लिए प्रोफेज एन्कोडिंग प्रतिरोध होता है, को यह सुनिश्चित करने के लिए रुचि के क्लोन के साथ मिलाया जा सकता है कि पारगमन होता है।

बी बर्गडॉर्फेरी के भीतर एचजीटी में इसकी भूमिका और एबीबीबी -1 के आणविक जीव विज्ञान के बारे में बहुत कुछ समझा जाना बाकी है, खासकर जब यह एन्जोटिक चक्र को स्थानांतरित करता है। प्रयोगशाला के भीतर फेज और हेटरोलॉगस डीएनए दोनों को प्रयोगात्मक रूप से ट्रांसड्यूस करने के लिए एबीबी -1 की क्षमता, हालांकि, बी बर्गडोर्फेरी के आणविक विच्छेदन और लाइम रोग के रोगजनन में इसकी भूमिका के लिए एक और उपकरण जोड़ने का अवसर प्रस्तुत करती है।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

स्कॉट सैमुएल्स और पैट्रिक सेकोर को उनकी उपयोगी चर्चा के लिए और वेरोन (पाम) चोनवेरावोंग को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहता है। इस काम को बायोमेडिकल साइंसेज विभाग और क्विनिपियाक विश्वविद्यालय में स्कूल ऑफ हेल्थ साइंसेज से क्रिश्चियन एच एगर्स को संकाय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

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References

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Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

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