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Détermination de la durée de la phase S à l’aide de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine chez Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Nous décrivons deux protocoles complémentaires pour déterminer avec précision la durée de la phase S chez S. cerevisiae à l’aide d’EdU, un analogue de la thymidine, qui est incorporé in vivo et détecté à l’aide de la chimie Click par microscopie et cytométrie en flux. Il permet de caractériser facilement la durée de la réplication de l’ADN et les défauts de réplication négligés chez les mutants.

Abstract

La réplication de l’ADN eucaryote est un processus hautement réglementé qui garantit que le plan génétique d’une cellule est correctement dupliqué avant la ségrégation chromosomique. Comme les défauts de synthèse de l’ADN sous-tendent les réarrangements chromosomiques, la surveillance de la réplication de l’ADN est devenue essentielle pour comprendre la base de l’instabilité du génome. Saccharomyces cerevisiae est un modèle classique pour étudier la régulation du cycle cellulaire, mais les paramètres clés de réplication de l’ADN, tels que la fraction de cellules dans la phase S ou la durée de la phase S, sont encore difficiles à déterminer. Ce protocole utilise des impulsions courtes et non toxiques de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), un analogue de la thymidine, dans des cellules de levure TK-hENT1 modifiées, suivies de sa détection par réaction Click pour permettre la visualisation et la quantification de la réplication de l’ADN avec une résolution spatiale et temporelle élevée aux niveaux de la cellule unique et de la population par microscopie et cytométrie en flux. Cette méthode peut identifier des défauts auparavant négligés dans la phase S et la progression du cycle cellulaire des mutants de levure, permettant ainsi la caractérisation de nouveaux acteurs essentiels pour assurer la stabilité du génome.

Introduction

La stabilité du génome par division mitotique est assurée par la transmission d’un ensemble complet et égal de chromosomes aux deux descendants cellulaires produits. Cela repose sur l’achèvement précis d’une série d’événements se produisant dans un temps donné dans chaque phase du cycle cellulaire. Dans G 1, les origines de réplication sont concédées sous licence lors du recrutement de plusieurs facteurs de licence, y compris Cdc61. Dans la phase S, la duplication du génome entier est initiée à partir de multiples origines de réplication actives et effectuée par des machines de réplication qui rassemblent des foyers microscopiquement visibles appelés usines de réplication2. Dans la phase M, des chromatides sœurs dupliquées sont attachées et biorientées sur le fuseau mitotique pour permettre leur ségrégation aux pôles opposés de la cellule mitotique3. La régulation, la bonne réalisation et la durée de chaque phase sont essentielles pour assurer la stabilité du génome. En effet, la sortie prématurée de l’une de ces phases conduit à une instabilité du génome. Par exemple, un G 1 plus court induit par la délétion de l’inhibiteur de CDK de levure bourgeonnant Sic1 ou par la surexpression de cyclines G1 modifiera la phase S 4,5,6 suivante. Par conséquent, ces dérégulations, associées ou non au stress de réplication, entraînent des cassures chromosomiques, des réarrangements et une mauvaise ségrégation 4,5,6. Par conséquent, la surveillance de la durée de la phase S et, plus largement, de la durée des autres phases du cycle cellulaire peut être cruciale pour identifier les défauts survenant chez différents mutants et dans différentes conditions stressantes.

Une méthode traditionnelle de mesure de la durée de phase du cycle cellulaire comprend une cytométrie en flux de contenu d’ADN simple (Figure 1A) et repose sur un algorithme d’ajustement (disponible dans la plupart des logiciels de cytométrie) utilisé pour séparer la population en fractions de phase G1, S et G2 + M des pics 1C et 2C. Les fractions sont ensuite multipliées par la population en doublant le temps7. Cependant, cette méthode ne donne que des valeurs estimées, nécessite une distribution homogène de la taille des cellules dans une fraction donnée et n’est pas applicable aux cultures synchronisées. Pour étudier la durée de la phase S dans les cellules de mammifères, plusieurs analogues de la thymidine ont été développés et largement utilisés, y compris EdU. Leur absorption à partir du milieu extracellulaire et leur phosphorylation par la thymidine kinase (ci-après dénommée TK) les rendent disponibles pour les ADN polymérases afin de les incorporer sur des sites de synthèse de l’ADN (réplication, recombinaison, réparation). Pour contourner l’absence du gène TK dans les cellules de Saccharomyces cerevisiae , des souches de levure ont été conçues pour permettre une expression stable et constitutive du virus de l’herpès simplex TK8 et du transporteur nucléosidique équilibré humain (hENT1)9. Une fois incorporé dans l’ADN, l’EdU est détecté via la réaction Click sélective, qui couple chimiquement sa fraction alcyne à des fluorochromes modifiés par azoture10.

Cet article fournit deux protocoles complets optimisés pour marquer des impulsions asynchrones et synchrones TK-hENT1 modifiées avec EdU afin de visualiser et de mesurer avec précision la durée et la dynamique de la réplication de l’ADN, ainsi que la durée des autres phases du cycle cellulaire, avec une résolution spatiale et temporelle élevée aux niveaux de la cellule unique et de la population par microscopie et cytométrie en flux.

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Protocol

1. Culture cellulaire de S. cerevisiae

REMARQUE : Les souches de levure utilisées sont énumérées dans le tableau 1.

REMARQUE: La durée de la phase S peut être surveillée de différentes manières. Selon la question à traiter, les cellules peuvent être cultivées de manière asynchrone ou synchrone après l’arrêt G1 .

  1. À partir de cellules de S. cerevisiae en croissance asynchrone
    REMARQUE : Cette méthode permet de déterminer le pourcentage de cellules en phase S dans une population cellulaire à croissance asynchrone. En déterminant le temps de doublement, la durée de la phase S (et des autres phases) peut être extrapolée.
    1. Inoculer des cellules de S. cerevisiae dans 10 mL de milieu synthétique complet (SC) à une faible concentration cellulaire (5 × 104 cellules/mL) pour une culture nocturne à 30 °C avec agitation orbitale à 130 rpm.
      REMARQUE: La concentration est mesurée avec un compteur de cellules. Pour calculer efficacement les temps de doublement, il est recommandé d’inoculer la culture à partir d’une culture de nuit qui est encore en phase exponentielle (c.-à-d. idéalement inférieure à 2 × 107 cellules/mL). La croissance de cellules en milieu riche (YPD) n’est pas recommandée, car la détection de l’EdU n’est pas efficace.
    2. Le lendemain, diluer les cellules dans 20 mL de milieu SC frais à la concentration finale de 5 × 105 cellules/mL.
    3. Culture des cellules à 30 °C dans un bain-marie oscillant avec agitation horizontale à 120 tr/min.
    4. Mesurer la concentration cellulaire toutes les heures jusqu’à ce qu’elle atteigne 1 × 107 cellules/mL.
      REMARQUE: Cette étape permet de faire une représentation graphique de l’augmentation de la concentration cellulaire au fil du temps. La formule utilisée pour calculer les temps de doublement est expliquée dans la légende du tableau 2.
    5. Procéder parallèlement à l’étape 2 pour le marquage EdU lorsque la concentration cellulaire est d’environ 2 × 10 6-5× 106 cellules/mL.
  2. À partir de cellules de S. cerevisiae synchronisées G1
    NOTE: Cette méthode permet de déterminer le début et la fin de la phase S au moyen d’analyses de cytométrie en flux et / ou de microscopie.
    1. Inoculer des cellules de S. cerevisiae dans 10 mL de milieu SC à une faible concentration cellulaire (5 × 104 cellules/mL) pour une culture nocturne à 30 °C avec agitation orbitale à 130 rpm.
      NOTA : Voir les remarques après l’étape 1.1.1.
    2. Le lendemain, diluer les cellules dans 20 mL de milieu SC frais à une concentration finale de 2 × 10 6-3× 106 cellules/mL.
    3. Ajouter 40 μL de facteur α de 1 mg/mL dilué dans de l’eau.
    4. Culture des cellules à 30 °C avec agitation orbitale à 130 tr/min pendant 1 h.
    5. Ajouter de nouveau 40 μL de facteur α à 1 mg/mL dilué dans de l’eau.
    6. Culture des cellules à 30 °C avec agitation orbitale à 130 tr/min pendant 1 h.
    7. Visualisez les cellules au microscope optique pour surveiller l’arrêt G1 . Procédez si plus de 90% des cellules présentent un shmoo et les autres sont des cellules arrondies et non bourgeonnées.
      REMARQUE: Selon l’arrière-plan utilisé, il est recommandé de soniciser les cellules avant la visualisation shmoo. Pour le fond W303, sonicer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
    8. Centrifuger pendant 3 min à 1 500 × g. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    9. Remettez les cellules en suspension dans 20 mL de milieu SC.
    10. Répétez les étapes 1.2.8 à 1.2.9 une fois.
      REMARQUE: Le facteur α est éliminé avec ces étapes et les cellules sont libérées dans le cycle cellulaire. Alternativement, le facteur α peut être éliminé en filtrant les cellules de levure avec un filtre en nitrocellulose de 1,2 μm à l’aide d’un entonnoir placé sur un ballon à bras latéral relié à une pompe à vide.
    11. Prélever 1 mL de cellules 2x toutes les 5 minutes et passer à l’étape 2 pour l’étiquetage EdU.
      REMARQUE: Marquez les cellules d’un seul des deux tubes avec EdU. Les cellules non marquées par impulsions sont utilisées pour distinguer les cellules EdU-positives des cellules EdU-négatives sur un graphe bivarié d’iodure de propidium (PI)-EdU.
    12. Ajouter 400 μL de facteur α à 1 mg/mL dilué dans de l’eau 30 minutes après la libération.
      NOTE: Cette dose élevée de facteur α est nécessaire pour arrêter les cellules dans la phase G1 du prochain cycle cellulaire et pour empêcher les cellules de réintégrer la phase S suivante.

2. Étiquetage EdU

  1. Transférer 1 mL de culture cellulaire dans un tube à microfuge de 2,0 mL contenant 1 μL de 10 mM d’EdU. Bien mélanger par inversion.
    REMARQUE: Pour distinguer les cellules EdU-positives des cellules EdU-négatives sur un FACS bivarié PI-EdU, transférer un autre 1 mL de culture cellulaire dans un tube de microfuge de 2,0 mL contenant 1 μL de DMSO.
  2. Incuber pendant 3-5 min à 30 °C sous agitation dans un bain-marie agité.
    REMARQUE: Trois minutes sont suffisantes pour la détection EdU avec un microscope; 5 min sont nécessaires pour une détection optimale de l’EdU sur un cytomètre en flux.
  3. Arrêtez la réaction avec l’ajout de 100 μL d’éthanol à 100%.
    1. Arrêter la réaction avec l’ajout de 100 μL de paraformaldéhyde à 20% si une mesure de la taille des cellules est nécessaire.
      NOTE: Si l’architecture nucléaire des cellules mitotiques doit être conservée intacte pour d’autres analyses après la réaction de clic, nous recommandons de fixer les cellules avec 2% de paraformaldéhyde à température ambiante (RT) plutôt que de mettre les cellules sur de la glace, car cette dernière provoque la dépolymérisation des microtubules.
    2. Laisser les cellules pendant 20 min à TA sous agitation légère sur une bascule à vitesse variable à 20 inclinaisons/min pour fixer les cellules avant l’ajout de 100 μL d’éthanol à 100 %.

3. Fixation cellulaire et perméabilisation

  1. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
  2. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 500 μL d’éthanol à 70%. Bien mélanger en tourbillonnant.
  3. Laisser reposer ≥1 h à RT à 20 inclinaisons/min sur une bascule à vitesse variable pour perméabiliser les cellules.
    REMARQUE: Les cellules cultivées en milieu SC ne s’enrobent pas bien car elles ont tendance à adhérer aux parois des microfuges. L’ajout d’éthanol améliore la granulation et réduit la perte cellulaire. Les cellules peuvent être conservées à 4 °C pendant une nuit ou pendant de plus longues périodes à −20 °C.
  4. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
  5. Laver les cellules 2x avec 500 μL d’éthanol à 10% dans du PBS.
    REMARQUE: Les lavages sont cruciaux pour éliminer l’EdU non incorporé des cellules.

4. Réaction au clic

  1. Pour l’analyse cytométrique
    1. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    2. Resuspendre la pastille dans 200 μL de PBS contenant 0,1 mg/mL de RNase A et 0,2 mg/mL de protéinase K.
    3. Incuber pendant 1-2 h à 50 °C avec agitation occasionnelle (ou toute la nuit à 37 °C).
    4. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    5. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS.
    6. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    7. Resuspendre la pastille cellulaire dans 200 μL de PBS + 1% d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber pendant 30 min à RT.
      REMARQUE: Des temps plus longs ne sont pas nécessaires et nuisent même à l’efficacité des réactions de clic.
    8. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    9. Remettez la pastille en suspension dans 300 μL de PBS + 1% de BSA.
    10. Répartir les cellules entre deux tubes : 200 μL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL pour la réaction Click et 100 μL dans un autre tube microcentrifuge de 1,5 mL pour la coloration Sytox Green.
    11. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    12. Pour la coloration verte Sytox
      REMARQUE: Nous recommandons fortement de prendre une partie aliquote pour la coloration verte Sytox (sans clic) afin d’obtenir des profils de référence de contenu ADN de haute qualité. En effet, la réaction Click éteint fortement la fluorescence intercalante, y compris la fluorescence Sytox Green et PI. Par conséquent, la réaction de clic peut fausser la lecture du contenu de l’ADN.
      1. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 100 μL de PBS.
      2. Transférer 10 à 30 μL (selon la concentration cellulaire) dans un tube de cytomètre en flux contenant 300 μL de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 et 0,5 μM Sytox Green.
      3. Soniquer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
      4. Laisser dans l’obscurité jusqu’à ce que les échantillons soient traités sur un cytomètre en flux.
        NOTE: Les cellules peuvent être conservées à ce stade à 4 ° C pendant quelques jours.
    13. Pour la réaction Click
      1. Préparer un tampon de colorant azoté frais en mélangeant les réactifs dans l’ordre suivant (quantité pour un tube) : 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL d’azoture de Cy5 2 mM et 2 μL d’acide ascorbique 1 M.
        NOTE: Il est possible de préparer un mélange maître du tampon de colorant azoté. Les réactifs doivent être mélangés dans le même ordre que celui mentionné ci-dessus.
      2. Remettez en suspension la pastille de cellule avec 40 μL de mélange de colorant azotural fraîchement préparé. Incuber à RT dans le noir pendant 60 min.
      3. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
      4. Lavez les cellules 3x avec 300 μL d’éthanol à 10% dans du PBS.
        NOTE: Les lavages sont cruciaux pour éliminer tout l’azoture soluble d’EdU-Cy5.
      5. Resuspendre les cellules dans 100 μL de 50 μg/mL PI dans du PBS. Laisser reposer 10 min dans l’obscurité.
      6. Transférer 10 à 30 μL de la suspension cellulaire (selon la concentration cellulaire) dans un tube de cytomètre en flux contenant 300 μL de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5.
      7. Soniquer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
      8. Laisser dans l’obscurité jusqu’à ce que les échantillons soient traités sur un cytomètre.
        NOTE: Les cellules peuvent être conservées à ce stade à 4 ° C pendant quelques jours.
    14. Lisez les échantillons Sytox Green à l’aide d’un laser bleu d’excitation à 488 nm et d’un filtre 530/30 BP. Voir la figure 1A pour les résultats typiques. Lire les échantillons PI-EdU bivariés sur un diagramme de points à l’aide d’un laser bleu d’excitation à 488 nm et d’un filtre 615/20 BP pour le PI (axe x) et d’un laser rouge d’excitation à 640 nm et d’un filtre 660/20 BP (axe y). Voir la figure 1B pour les résultats typiques.
      REMARQUE : La figure 1C représente le résultat FACS bivarié PI-EdU typique pour les cellules EdU négatives. Il permet la discrimination des cellules EdU-négatives des cellules EdU-positives.
  2. Pour l’analyse microscopique
    1. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    2. Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de PBS + 1% de BSA. Incuber pendant 30 min à RT.
    3. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    4. Préparer un tampon de colorant azoturé frais en mélangeant les réactifs dans l’ordre suivant (quantité pour un tube) : 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 MCuSO4, 0,2 μL d’azoture Dy-530 2 mM, 2 μL d’acide ascorbique 1 M.
      NOTE: Un mélange maître du tampon de colorant azoté peut être préparé frais en mélangeant les réactifs dans l’ordre susmentionné.
    5. Remettez la pastille en suspension avec 40 μL de tampon de colorant azotural fraîchement préparé. Incuber à RT dans le noir pendant 60 min.
    6. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    7. Laver les cellules 2x avec 300 μL d’éthanol à 10% dans du PBS.
      REMARQUE: Les lavages sont cruciaux pour éliminer tous les azotures solubles de Dy-530.
    8. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    9. Resuspendre les cellules dans 100 μL de 0,5 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS. Laisser reposer 30 min dans l’obscurité à température ambiante.
    10. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    11. Laver avec 300 μL de PBS pour éliminer l’excès de DAPI.
    12. Enduire les cellules pendant 2 min à 10 000 × g dans un microfuge. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à vide.
    13. Remettez la pastille en suspension avec 10-50 μL de PBS selon la concentration de la cellule.
    14. Soniquer 2x, pendant 2 s à chaque fois, à une amplitude de 40-50.
      NOTE: Les cellules peuvent être conservées à ce stade à 4 ° C pendant quelques jours.
    15. Pipeter 1,7 μL des cellules sur une lame de microscope en verre et couvrir avec une lamelle de couverture propre.
    16. Observez immédiatement au microscope à fluorescence avec DAPI et filtres TexasRed ou Cy3.

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Representative Results

Pour déterminer la durée de la phase S et, plus largement, la durée de G1 et G2 + M (étape de protocole 1.1), des cellules de type sauvage W303 de S. cerevisiae (WT, Tableau 1) ont été cultivées de manière asynchrone en milieu SC pendant 7 h. Toutes les heures, la concentration de la cellule a été surveillée pour déterminer le temps de doublement (figure 2B). Dans ces conditions de croissance, le temps de doublement calculé était de 120 min ± 13 min à 25 °C (tableau 2). Lorsque les cellules étaient en phase exponentielle (2 × 10 6-5× 106 cellules/mL), une partie aliquote des cellules a été marquée par impulsions avec EdU (10 μM) pendant 5 minutes pour distinguer les cellules de la phase S et déterminer le pourcentage de cellules qui étaient dans les phases G1, S et G2 + M. Trois populations de cellules ont été observées dans une analyse bivariée du cytomètre EdU-PI (figure 1B). La discrimination entre les populations EdU-négatives et EdU-positives a été faite à l’aide d’une expérience de contrôle dans laquelle les cellules n’ont pas été marquées par impulsions avec EdU, mais la réaction Click a été réalisée (Figure 1C). Les deux populations négatives pour l’EDU dans les zones inférieure gauche et inférieure droite qui différaient en intensité PI deux fois correspondaient à G1 et G2 + M, respectivement (Figure 1B,C). Par conséquent, la population supérieure (avec une intensité >1× 10 4-2 × 104) correspondait aux cellules EdU-positives qui étaient en phase S au moment de l’impulsion (Figure 1B). Par conséquent, 27% ± 5% de la population cellulaire était en phase G1, 29% ± 3% en phase S et 44% ± 2% en G2 + M. Comme le temps de doublement était de 120 min ± 13 min dans ces conditions, nous avons extrapolé que les phases G1, S et G 2 + M duraient respectivement 32 min ± 4 min, 35 min ± 6 min et 53 min ± 7 min, à 25 °C (Tableau2 et Tableau 3).

Ensuite, nous avons cherché à valider cette méthode et à montrer qu’elle est suffisamment sensible pour identifier les mutants présentant des défauts de réplication de l’ADN qui ont été négligés jusqu’à présent. Nous avons estimé que les allèles de perte de fonction accordables des facteurs impliqués dans la réplication de l’ADN seraient des contrôles de validation idéaux. Par conséquent, nous avons utilisé une souche de levure contenant un mutant cdc6-1 sensible à la température (tableau 1)11. Cdc6 est un facteur de licence essentiel qui est exprimé dans les derniers M et G1 pour assembler des complexes de préréplication (préRC) sur des sites chromosomiques liés à l’ORC qui peuvent ensuite être utilisés comme origines de réplication. Par conséquent, à une température permissive, sa durée de phase S devrait être la même que celle du WT, tandis qu’à une température restrictive, aucune réplication de l’ADN ne devrait se produire car aucune origine n’est autorisée12. Cependant, à une température semi-permissive, où moins d’origines sont autorisées, mais il y en a suffisamment pour conférer la viabilité cellulaire (nos données non publiées; Barba Tena et al., en préparation), nous avons anticipé des durées différentes pour chaque phase. Comme prévu, d’après les essais de chute, les cellules cdc6-1 ont grandi de la même manière que les cellules WT à une température permissive (c.-à-d. 25 °C, figure 2A), affichant le même temps de doublement (figure 2B et tableau 2), mais étaient mortes à 34 °C ou au-dessus (figure 2A). Fait intéressant, à une température semi-permissive (c.-à-d. 28 °C), cdc6-1 était viable (28 °C, figure 2A). Cependant, le temps de doublement était plus long que pour WT (figure 2B et tableau 2), et la durée de chaque phase était différente. En effet, dans cdc6-1, G 1 était légèrement plus court (12 min ±1 min vs 16 min ± 2 min), tandis que la phase S était légèrement allongée (34 min ± 4 min vs 29 min ± 5 min), et la phase G2 + M était significativement plus longue (77 min ± 4 min vs 45 min ± 3 min) par rapport à WT (Figure 2C, D et tableau 3). La phase S n’a étonnamment pas été beaucoup étendue, mais l’intensité moyenne du signal EdU a diminué de 25% (Figure 2C,D), ce qui est cohérent avec une phase S initiée à partir de moins d’origines. De plus, alors que les cellules WT EdU-positives étaient réparties de manière homogène entre les phases précoce (S1) et tardive de S (S2) (Figure 2C, Figure supplémentaire S1A, phases S précoce [S1] et S tardive [S2] délimitées par une ligne pointillée verticale dans la porte supérieure), 65% des cellules CDC6-1 EdU-positives se sont accumulées dans la phase S tardive (Figure 2D, Figure supplémentaire S1B). Il n’y avait même pas de distinction claire entre les populations S et G 2 + M (Figure 2D), suggérant que les cellules avaient du mal à terminer la phase S avant d’entrer dans la phase G2. Par conséquent, cette méthode est appropriée et sensible pour identifier les mutants présentant des défauts dans la phase S (durée et/ou distribution) et dans la durée de la phase du cycle cellulaire.

Une méthode complémentaire a été conçue pour déterminer quand les cellules commencent et terminent leur réplication de l’ADN et estimer la durée de la phase S à l’aide de cellules synchronisées (étape de protocole 1.2). À cette fin, en utilisant α-facteur avec des cellules synchronisées dans G1, les cellules ont été libérées dans le milieu SC et collectées toutes les 5 minutes. La durée de la phase S peut être d’environ 25 minutes en fonction du moment où la teneur en ADN est passée de 1C à 2C sur le profil du cytomètre en flux Sytox Green (Figure 3A). Cependant, cette estimation dépend du moment où une fraction cellulaire significative de la population a incorporé suffisamment de Sytox Green pour être observée dans le profil FACS. Les événements de réplication précoce et tardive ne peuvent pas être détectés avec cette méthode. Pour définir avec précision quand la phase S commence et se termine et combien de temps elle dure, les cellules de phase S ont été distinguées à partir d’une aliquote de cellules lors du marquage par impulsions avec EdU (10 μM) pendant 5 minutes toutes les 5 minutes après la libération de G1. Comme prévu, dans les 10 premières minutes suivant la libération, toutes les cellules se trouvaient dans la zone inférieure gauche (c.-à-d. dans G1, Figure 3B, Figure supplémentaire S2). Quinze minutes après la libération, une fraction de cellules EdU-positives a déjà été détectée (comparer les deux premières rangées de la figure supplémentaire S2 et de la figure supplémentaire S3, cellules traitées par EdU et exemptes d’EdU, respectivement), indiquant que la phase S avait commencé (Figure 3C). La progression à travers la phase S a été observée par le nuage cellulaire se déplaçant d’abord vers le haut, puis vers la droite dans le graphique bivarié PI-EdU (Figure 3D-F). Enfin, 35 minutes après la libération, une fraction des cellules était EdU-négative mais avec deux fois plus d’ADN, indiquant que ces cellules avaient terminé la phase S et étaient en phase G2 + M (Figure 3G). Ainsi, la phase S dure 20 min dans ces conditions. Il est à noter que, malgré la forte synchronie observée avec la superposition de contenu en ADN détectée avec Sytox Green, suggérant que la phase S était terminée dans l’ensemble de la population 40 minutes après la libération, les analyses bivariées ont montré que certaines cellules terminaient la phase S 60 minutes après la libération et que la phase S était complète pour l’ensemble de la population 65 minutes après la libération (Figure 3H, I et figure supplémentaire S2).

De plus, la phase S et la synthèse de l’ADN peuvent être surveillées par microscopie. A partir de chaque origine de réplication activée, la synthèse de l’ADN est réalisée par deux réplisomes attachés, formant un foyer de réplication nucléaire qui peut être suivi par microscopie par imagerie d’une version marquée d’un facteur de réplication et/ou d’un réseau d’opérateurs et de leur répresseur correspondant fusionné à une protéine fluorescente 2,13. Alternativement, la synthèse de l’ADN peut être détectée par microscopie à l’aide d’analogues de la thymidine14,15. Nous avons utilisé EdU pour surveiller les régions d’ADN subnucléaires qui subissent la synthèse de l’ADN. À cette fin, nous avons marqué par impulsions des cellules asynchrones WT et cdc6-1 avec EdU (10 μM) pendant 3 minutes à 28 °C et les avons imagées après la réaction de clic. Nous nous attendions à détecter des variations dans les intensités du signal EdU en fonction du taux de synthèse de l’ADN et de la progression cellulaire dans le cycle cellulaire pendant l’impulsion EdU de 3 min (c’est-à-dire que les cellules passant les 3 minutes entières dans la phase S afficheront un signal plus fort que celles entrant ou sortant de la phase S pendant l’impulsion). En conséquence, les cellules de phase S WT ont affiché un signal EdU dans leur noyau qui variait en intensité (Figure 4A). La durée de la phase S peut être facilement extrapolée à partir de cette analyse. En effet, il a été déterminé à partir de deux réplicats biologiques (au moins 150 cellules ont été comptées), que 34% ± 3% et 38% ± 3% des cellules WT et cdc6-1 étaient EdU positives, respectivement. Comme dans ces conditions de croissance, le temps de doublement était de 90 min et 123 min pour les cellules WT et cdc6-1, respectivement (Tableau 2), nous avons extrapolé que la phase S a duré 31 min et 47 min, respectivement. Le premier résultat est conforme à celui obtenu à partir de nos analyses FACS (tableau 3), indiquant que la détection de cellules EdU-positives par microscopie permet de déterminer la durée de la phase S. Il convient de noter que cette dernière est supérieure à la durée de la phase S extrapolée à partir de nos analyses FACS, car il n’y avait pas de distinction claire entre les populations S et G2 + M (Figure 2D). Les foyers EdU ont été facilement observés dans les cellules WT (Figure 4B) mais étaient plus faibles et moins nombreux dans les cellules cdc6-1 (Figure 4C). Pour exclure la possibilité que la différence d’intensité du signal EdU entre les cellules WT et cdc6-1 dépende de l’étape de la phase S, l’intensité a été quantifiée à partir de cellules synchronisées. Comme prévu, l’intensité moyenne du signal EdU était trois fois plus faible dans les cellules cdc6-1 (Figure 4D), ce qui correspond à la réplication de l’ADN initiée à partir de moins d’origines de réplication. Le signal EdU était limité au noyau, colocalisant avec un signal DAPI fort, et organisé en modèles globulaires, cohérents avec l’organisation de la réplication de l’ADN dans les régions nucléaires ou les usines de réplication. Il est important de noter que l’EdU n’a été détecté que dans les cellules non bourgeonnées ou à petits bourgeons et n’a jamais été présent dans les cellules avec de gros bourgeons, ce qui indique que les cellules de levure WT avaient terminé leur réplication au moment où elles sont entrées en mitose. Cette méthode est donc sensible pour visualiser la réplication de l’ADN à une résolution spatiale élevée, ainsi que pour détecter et quantifier les défauts légers de réplication de l’ADN.

Figure 1
Figure 1 : Analyses FACS représentatives. (A) Analyses représentatives du FACS vert Sytox pour les cellules WT cultivées à 25 °C. (B,C) Analyses FACS bivariées représentatives EdU-PI pour les cellules WT cultivées à 25 °C et marquées par impulsions pendant 5 minutes avec EdU (10 μM) ou 1 μL de DMSO. Les polygones étaient les mêmes dans les deux analyses. C a été utilisé pour délimiter les cellules EdU-négatives des cellules EdU-positives (généralement, la limite est fixée à une intensité >1× 10 4-2 × 104). La porte polygonale supérieure délimitait les cellules EdU-positives (fraction de phase S). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fraction de cellules dans les phases du cycle cellulaire G 1, S et G2 + M dans les populations cellulaires asynchrones. (A) Les souches WT et cdc6-1 ont été repérées à des dilutions quintuples en série sur milieu riche et cultivées soit à 25 °C, 28 °C ou 34 °C. (B) Temps de doublement de la population. Des cellules asynchrones WT et cdc6-1 ont été cultivées à 25 °C ou 28 °C, et la concentration cellulaire a été mesurée toutes les heures pendant 7 h. (C,D) Analyse FACS bivariée EdU-PI de cellules WT et cdc6-1 cultivées à 28 °C et marquées par impulsions pendant 5 min avec EdU (10 μM). En multipliant le temps de doublement de la population par la fraction de phase S, on obtient la durée de la phase S. Les intensités moyennes des cellules EdU-positives et EdU-négatives ont été calculées comme la moyenne de l’intensité de chaque valeur dans le polygone correspondant. Les intensités moyennes des cellules WT et cdc6-1 EdU-négatives (5 077 et 4 454, respectivement) ont été normalisées à 1. Les intensités moyennes des cellules WT et cdc6-1 EdU-positives (52 604 et 36 141, respectivement) ont été divisées par le facteur de normalisation utilisé pour chaque souche. Les valeurs obtenues étaient respectivement de 10,4 et 8,1 (c.-à-d. une diminution de 25 %, comme mentionné dans le texte). Abréviations : WT = type sauvage; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; PI = iodure de propidium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Détermination de la durée de la phase S sur des cellules synchronisées. (A) Analyse du parcours temporel de la teneur en ADN des cellules WT après libération de facteurs α à 28 °C. Le temps indiqué tient compte de la durée de l’impulsion EdU (5 min). (B-I) Analyses FACS bivariées EdU-PI pour les cellules WT synchronisées marquées par impulsions pendant 5 minutes avec EdU (10 μM) et collectées aux moments indiqués après la libération de l’arrêt G1. Abréviations : WT = type sauvage; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; PI = iodure de propidium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Détection et quantification de l’EdU par microscopie. Des souches asynchrones WT et cdc6-1 ont été cultivées pendant 2 h à 28 °C, puis marquées par impulsions pendant 3 min avec EdU (10 μM) et imagées par microscopie à grand champ à l’aide de filtres d’excitation/émission adéquats. (A) Images représentatives de la microscopie à grand champ pour WT et (B,C) cellules individuelles pour WT et cdc6-1 visualisées par DIC et colorées avec DAPI ou pour EdU, comme indiqué. Les barres d’échelle en (A) et (B,C) sont respectivement de 10 μm et 2 μm. (D) Mesures de l’intensité EdU sur des cellules synchrones WT et cdc6-1 cultivées à 28 °C 30 min après la libération de l’arrêt G1. Le graphique représente la mise en commun de trois réplicas biologiques (au moins 50 cellules ont été comptées dans chaque réplica biologique). Les ± moyennes SD sont affichées sur le graphique. Un test t bilatéral non apparié entre les cellules WT et cdc6-1 est indiqué par **** (p < 0,0001). Abréviations : WT = type sauvage; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine; DIC = contraste d’interférence différentielle; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; A.U. = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom Génotype Figures et tableaux
WT (E3087) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, Supp Fig.1,2,3 Tableaux2,3
cdc6-1 (E5956) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tableaux2,3
TK+ (E1000) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Fig.4
TK+ hENT+ (E2031) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
hENT+ (E2031) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Fig.4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
W303-1A (E001) : MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Fig.4

Tableau 1 : Liste des souches utilisées dans cette étude.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Temps de doublement (min) 120 90 118 123
SD ± 13 min ± 3 min ± 10 min ± 6 min

Tableau 2: Temps moyens de doublement des souches WT et cdc6-1 cultivées à 25 °C et 28 °C. Les temps de doublement ont été calculés à partir de trois réplicas biologiques (quatre réplicas techniques pour chaque réplica biologique) à l’aide de la formule suivante: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), où Cf et Ci correspondent respectivement aux concentrations cellulaire finale et initiale, et Δt correspond à la différence en minutes entre tf et ti, lorsque Cf et Ci ont été mesurés, respectivement.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Pour cent Durée
(min)		 Pour cent Durée
(min)		 Pour cent Durée
(min)		 Pour cent Durée
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tableau 3 : Fractions moyennes de cellules et durée des phases G1, S et G2 + M dans les cellules WT et cdc6-1 cultivées à 25 °C et 28 °C. Les fractions de cellules ont été déterminées à partir de trois réplicats biologiques (deux réplicas techniques pour chaque réplica biologique). Les différences de durée G 1, S et G2 + M entre les cellules WT et cdc6-1 cultivées à 28 °C étaient statistiquement significatives (test t bilatéral non apparié, p <0,1).

Figure supplémentaire S1 : Fraction de cellules dans les phases S précoce et tardive dans les cellules WT et cdc6-1 cultivées à 28 °C. Deux polygones identiques nommés S1 et S2 pour les phases S précoce et tardive, respectivement, ont été tirés dans la fraction de cellules EdU-positives pour la diviser en deux moitiés sur les analyses FACS bivariées EdU-PI pour (A) cellules WT cultivées à 28 °C et (B) cellules cdc6-1 cultivées à 28 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Progression du cycle cellulaire des cellules marquées par impulsions EdU après libération de l’arrêt G1 visualisé par FACS bivarié EdU-PI. Une partie aliquote de cellules a été marquée par impulsion pendant 5 minutes avec 10 μM d’EdU toutes les 5 minutes après la libération de l’arrêt de facteur α à 28 °C et jusqu’à 80 minutes, comme indiqué. Abréviations : EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; PI = iodure de propidium. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Progression du cycle cellulaire des cellules traitées par le DMSO après libération de l’arrêt G1 visualisée par le FACS bivarié EdU-PI. C’est la même chose que la figure supplémentaire 2, mais les cellules ont été incubées pendant 5 minutes avec 1 μL de DMSO (diméthylsulfoxyde). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Toxicité du BrdU et de l’EdU dans les cellules de levure TK hENT1. Des cellules du génotype indiqué ont été repérées dans des dilutions en série quintuples sur des plaques YPD contenant des concentrations croissantes de BrdU ou d’EdU et cultivées pendant 40 h à 30 °C. Abréviations : DMSO = diméthylsulfoxyde; BrdU = bromodeoxyuridine; Edu = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine; TK = thymidine kinase; hENT1 = transporteur de nucléosides équilibrants humains. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La levure est un organisme modèle de premier plan pour les études du cycle cellulaire, mais la caractérisation de sa phase S a longtemps été entravée par son incapacité à incorporer des nucléosides exogènes, tels que BrdU, qui sont utilisés comme traceurs de la réplication de l’ADN. L’équipement de la levure avec une expression élevée de l’herpès simplex thymidine kinase (TK) et l’ajout d’un transporteur nucléosidique humain (hENT) a largement résolu ce problème15,16. EdU est plus polyvalent que BrdU car sa détection avec de petits azotures fluorescents et la chimie Click se prête à la perméabilisation des cellules de levure et à l’analyse FACS, contrairement aux anticorps anti-BrdU17. Ici, nous avons optimisé les conditions de marquage et de détection EdU dans cette souche TK-hENT1 et montré que les défauts de réplication non détectés auparavant peuvent être quantifiés à l’aide de ce protocole par FACS ou microscopie.

L’étude d’un mécanisme biologique à l’aide d’outils qui peuvent interférer avec le même mécanisme est un problème courant en biologie. Comme l’EdU a un effet cytotoxique connu, nous avons recherché des concentrations d’EdU qui ne sont pas toxiques en cas d’exposition chronique à la souche TK-hENT1 modifiée et avons trouvé que 10 μM était une dose appropriée. Les cellules TK-hENT1 ne prolifèrent pas à 25 μM EdU, tandis que les cellules TK-seul ou hENT1 seul résistent facilement à 100 μM EdU (figure supplémentaire S4). Bien que les cellules de levure soient considérablement plus sensibles à l’EdU que le BrdU, nous avons constaté que la prolifération ne diminuait qu’après le deuxième cycle cellulaire après l’exposition à l’EdU, ce qui suggère qu’elle doit être incorporée sur les deux brins pour avoir un impact sur la prolifération cellulaire (données non présentées). Pour rester du bon côté, nous avons utilisé 10 μM EdU tout au long de ce protocole, avec des impulsions courtes seulement (3 min pour la microscopie; 5 min pour FACS), et nous avons trouvé que cela convenait à une bonne détection en utilisant ce protocole optimisé.

Des défauts subtils dans la réplication de l’ADN peuvent avoir un fort impact sur les réarrangements chromosomiques4. Par conséquent, le développement de techniques et de protocoles capables de détecter ces défauts subtils est essentiel pour découvrir l’étiologie des aberrations chromosomiques. Ici, nous montrons que ce protocole optimisé d’incorporation et de détection d’EdU peut mesurer jusqu’à trois fois l’intensité du signal (Figure 2 et Figure 4), ce qui indique que le taux de synthèse de l’ADN est réduit dans les cellules cdc6-1 sensibles à la température cultivées à 28 °C, qui, pour l’instant, ne présentent aucun défaut sur les tests de viabilité sur plaque (Figure 2A ). Ce protocole d’incorporation et de quantification d’EdU peut donc être utilisé pour dépister d’autres mutants pour lesquels les défauts de réplication ne sont pas suspectés initialement. En outre, il peut être utile de détecter la synthèse d’ADN mitotique (MiDAS), la synthèse d’ADN dépendante de la recombinaison méiotique ou d’autres synthèses d’ADN à long tractus.

Un inconvénient est que la détection EdU ne peut être effectuée que sur des cellules fixes, ce qui exclut l’analyse en direct comme avec PCNA-GFP ou d’autres lectures fluorescentes de la réplication de l’ADN, qui souffrent elles-mêmes de la phototoxicité élevée des faisceaux laser utilisés pour l’imagerie. La croissance de cellules dans un milieu synthétique est cruciale pour une meilleure détection, car les restes de YPD semblent éteindre de manière significative la réaction de clic. Il est intéressant de noter que la sélection des cellules de la phase S à l’aide de l’analyse bivariée EdU-PI FACS sur des populations synchronisées permet d’estimer la durée de la phase S à 20 min dans des cellules individuelles (Figure 3, Figure supplémentaire S2 et Figure supplémentaire S3). Cependant, même lorsque la synchronie après libération de facteurs α semble presque parfaite comme dans l’analyse classique Sytox Green FACS (Figure 3A), il ressort clairement de l’analyse bivariée EdU-PI FACS que les cellules entrent dans la phase S de manière relativement asynchrone (Figure 3B-I).

Ici, nous décrivons trois méthodes pour déterminer la durée de la phase S en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie sur des cellules synchrones et asynchrones aux niveaux de la cellule unique et de la population. Les durées moyennes de phase S déterminées dans les cellules WT asynchrones au niveau de la population sont similaires en utilisant la cytométrie en flux et la microscopie, à 29 min et 31 min, respectivement, tandis que notre approche synchronisée basée sur une seule cellule montre que la durée peut être aussi courte que 20 min (Figure 2, Figure 3, Figure 4 et Tableau 3 ). L’écart entre ces valeurs est surprenant mais peut être facilement expliqué. En effet, avec notre approche basée sur une seule cellule, la durée de la phase S a été déterminée en fonction des premiers événements (c’est-à-dire les premières cellules entrant et sortant de la phase S, Figure 3C, G), mais cela n’implique pas que la phase S dure 20 minutes dans chaque cellule d’une population. Ces données soutiendraient la notion inattendue qu’il existe un certain niveau d’hétérogénéité dans la durée de la phase S entre les cellules.

Des protocoles améliorés ou de nouvelles techniques peuvent renverser des dogmes de longue date ou de nouvelles idées. Il y en a trois que ces données remettent en question. Premièrement, on pense que la synthèse de l’ADN est concomitante à l’émergence des bourgeons chez S. cerevisiae. La figure 4A-C montre que la coloration EdU est plus forte dans les cellules non bourgeonnées et à petits bourgeons, malgré le décalage d’étiquetage de 3 minutes, ce qui indique que la phase S commence clairement avant le bourgeonnement, comme indiqué précédemment16. Deuxièmement, il est rapporté que les cellules de levure n’ont pas de phase G2, avec des fuseaux mitotiques se formant en même temps que la synthèse de l’ADN. Les impulsions très courtes combinées à la détection sensible de l’EDU par FACS (Figure 3, Figure supplémentaire S2 et Figure supplémentaire S3) ou microscopie (Figure 4) permettent de déterminer précisément quand la phase S commence et se termine dans des cellules individuelles. Ce faisant, nous avons constaté que la synthèse globale de l’ADN se termine 40 minutes après la libération de facteurs α (Figure 3, Figure supplémentaire S2 et Figure supplémentaire S3), tandis que les fuseaux mitotiques courts ne se forment que 20 minutes plus tard16 (données non présentées). Nous concluons que les cellules de levure ont une phase G2. Troisièmement, il a été proposé récemment que jusqu’à 30% des cellules de levure complètent la synthèse de l’ADN en anaphase-télophase18. En utilisant ce protocole optimisé, nous n’avons pas détecté l’incorporation d’EdU dans les cellules présentant un fuseau anaphase/télophase (données non présentées), mais nous ne pouvons pas exclure que cette deuxième vague de synthèse d’ADN soit inférieure au seuil de détection utilisé. Compte tenu du fort rapport signal/bruit, nous considérons que cette dernière option est peu probable.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) et l’Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) pour les bourses doctorales à J.d.D.B.T. et à l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR) pour leur soutien financier (subvention ANR-18-CE12-0018-01). La cytométrie et la microscopie ont été réalisées au centre d’imagerie BioCampus de Montpellier IRM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

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References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

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Biologie numéro 188
Détermination de la durée de la phase S à l’aide de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine chez <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

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