Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse av S-fasevarighet ved bruk av 5-etynyl-2'-deoksyuridininkorporering i Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Vi beskriver to komplementære protokoller for nøyaktig bestemmelse av S-fasevarighet i S. cerevisiae ved bruk av EdU, en tymidinanalog, som er inkorporert in vivo og detektert ved hjelp av klikkkjemi ved mikroskopi og flowcytometri. Det muliggjør enkel karakterisering av varigheten av DNA-replikasjon og oversett replikasjonsfeil i mutanter.

Abstract

Eukaryotisk DNA-replikasjon er en sterkt regulert prosess som sikrer at den genetiske blåkopien av en celle dupliseres riktig før kromosomsegregering. Ettersom DNA-syntesefeil ligger til grunn for kromosomomorganiseringer, har overvåking av DNA-replikasjon blitt viktig for å forstå grunnlaget for genomstabilitet. Saccharomyces cerevisiae er en klassisk modell for å studere cellesyklusregulering, men viktige DNA-replikasjonsparametere, som fraksjonen av celler i S-fasen eller S-fasevarigheten, er fortsatt vanskelig å bestemme. Denne protokollen bruker korte og ikke-toksiske pulser av 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU), en tymidinanalog, i konstruerte TK-hENT1 gjærceller, etterfulgt av deteksjon av klikkreaksjon for å tillate visualisering og kvantifisering av DNA-replikasjon med høy romlig og tidsmessig oppløsning på både enkeltcelle- og populasjonsnivå ved mikroskopi og flowcytometri. Denne metoden kan identifisere tidligere oversett defekter i S-fasen og cellesyklusprogresjonen av gjærmutanter, og dermed tillate karakterisering av nye spillere som er avgjørende for å sikre genomstabilitet.

Introduction

Genomstabilitet gjennom mitotisk deling sikres ved overføring av et komplett og likt sett med kromosomer til de to produserte celleavkomene. Dette er avhengig av nøyaktig fullføring av en rekke hendelser som forekommer i en gitt tid i hver fase av cellesyklusen. I G 1 lisensieres replikeringsopprinnelsen ved rekruttering av flere lisensieringsfaktorer, inkludert Cdc61. I S-fasen initieres helgenomduplisering fra flere aktive replikasjonsopprinnelser og utføres av replikasjonsmaskiner som samles i mikroskopisk synlige foci kalt replikasjonsfabrikker2. I M-fasen er dupliserte søsterkromatider festet og biorientert på den mitotiske spindelen for å tillate segregering til motsatte poler av den mitotiske cellen3. Reguleringen, riktig fullføring og varighet av hver fase er nøkkelen til å sikre genomstabilitet. Faktisk fører for tidlig utgang fra noen av disse fasene til genom ustabilitet. For eksempel vil en kortere G 1 indusert ved sletting av den spirende gjær CDK-hemmeren Sic1 eller ved overekspresjon av G 1-sykliner endre den påfølgende S-fasen 4,5,6. Følgelig resulterer disse dereguleringene, assosiert eller ikke med replikasjonsstress, i kromosombrudd, omorganiseringer og feilsegregering 4,5,6. Derfor kan overvåking av varigheten av S-fasen og, mer generelt, varigheten av de andre fasene i cellesyklusen være avgjørende for å identifisere feilene som forekommer i forskjellige mutanter og i forskjellige stressende forhold.

En tradisjonell metode for måling av cellesyklusfasevarighet inkluderer enkel DNA-innhold flowcytometri (figur 1A) og er avhengig av en tilpasningsalgoritme (tilgjengelig i de fleste cytometriprogrammer) som brukes til å skille befolkningen i G1, S og G2 + M fasefraksjoner fra 1C- og 2C-toppene. Brøkene multipliseres deretter med at populasjonen dobler tid7. Denne metoden gir imidlertid bare estimerte verdier, krever en homogen cellestørrelsesfordeling innenfor en gitt brøkdel, og gjelder ikke for synkroniserte kulturer. For å studere S-fasevarigheten i pattedyrceller har flere tymidinanaloger blitt utviklet og mye brukt, inkludert EdU. Deres opptak fra det ekstracellulære mediet og fosforylering av tymidinkinase (heretter kalt TK) gjør dem tilgjengelige for DNA-polymeraser for å inkorporere dem på steder for DNA-syntese (replikasjon, rekombinasjon, reparasjon). For å omgå fraværet av TK-genet i Saccharomyces cerevisiae-celler , har gjærstammer blitt konstruert for å tillate stabilt og konstitutivt uttrykk av herpes simplex-viruset TK8 og den humane likevekts nukleosidtransportøren (hENT1)9. Når den er innlemmet i DNA, oppdages EdU via den selektive klikkreaksjonen, som kjemisk kobler alkyndelen til azidmodifiserte fluorokromer10.

Dette papiret gir to optimaliserte omfattende protokoller for å pulsmerke asynkrone og synkrone TK-hENT1-konstruerte celler med EdU for å nøyaktig visualisere og måle DNA-replikasjonsvarighet og dynamikk, samt varigheten av de andre fasene av cellesyklusen, med høy romlig og tidsmessig oppløsning på både enkeltcelle- og populasjonsnivå ved mikroskopi og flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. cerevisiae cellekultur

MERK: Gjærstammene som brukes er oppført i tabell 1

MERK: S-fasevarigheten kan overvåkes på forskjellige måter. Avhengig av spørsmålet som skal tas opp, kan cellene dyrkes asynkront eller synkront etter G1-arrestasjon .

  1. Fra asynkront voksende S. cerevisiae-celler
    MERK: Denne metoden tillater bestemmelse av prosentandelen celler i S-fasen i en asynkront voksende cellepopulasjon. Ved å bestemme doblingstiden kan varigheten av S-fasen (og de andre fasene) ekstrapoleres.
    1. Inokulere S. cerevisiae-celler i 10 ml syntetisk komplett (SC) medium ved lav cellekonsentrasjon (5 × 104 celler/ml) for en nattkultur ved 30 °C med orbital agitasjon ved 130 o/min.
      MERK: Konsentrasjonen måles med en celleteller. For å effektivt beregne doblingstidene, anbefales det å inokulere kulturen fra en nattkultur som fortsatt er i eksponentiell fase (dvs. ideelt under 2 × 107 celler / ml). Dyrking av celler i rikt medium (YPD) anbefales ikke, da EdU-deteksjon ikke er effektiv.
    2. Dagen etter fortynnes cellene i 20 ml friskt SC-medium ved den endelige konsentrasjonen på 5 × 105 celler/ml.
    3. Dyrk cellene ved 30 °C i et skjelvende vannbad med horisontal risting ved 120 o/min.
    4. Mål cellekonsentrasjonen hver time til den når 1 × 107 celler/ml.
      MERK: Dette trinnet gjør det mulig å få en grafisk fremstilling av cellekonsentrasjonen til å øke over tid. Formelen som brukes til å beregne doblingstidene er forklart i forklaringen i tabell 2.
    5. Fortsett parallelt med trinn 2 for EdU-merking når cellekonsentrasjonen er ca. 2 × 106-5 × 106 celler/ml.
  2. Fra G 1-synkroniserte S. cerevisiae-celler
    MERK: Denne metoden gjør det mulig å bestemme når S-fasen starter og avsluttes ved hjelp av flowcytometri og/eller mikroskopianalyser.
    1. Inokulere S. cerevisiae-celler i 10 ml SC-medium ved lav cellekonsentrasjon (5 × 104 celler/ml) for en nattkultur ved 30 °C med orbital agitasjon ved 130 o/min.
      MERK: Se notatene etter trinn 1.1.1.
    2. Dagen etter fortynnes cellene i 20 ml friskt SC-medium ved en endelig konsentrasjon på 2 × 10 6-3 × 106 celler/ml.
    3. Tilsett 40 μL 1 mg/ml α-faktor fortynnet i vann.
    4. Dyrk cellene ved 30 °C med orbital agitasjon ved 130 o / min i 1 time.
    5. Tilsett igjen 40 μL 1 mg/ml α-faktor fortynnet i vann.
    6. Dyrk cellene ved 30 °C med orbital agitasjon ved 130 o / min i 1 time.
    7. Visualiser cellene under et lysmikroskop for å overvåke G1-arrestasjonen . Fortsett hvis mer enn 90 % av cellene viser en shmoo og de andre er avrundede, ubuddede celler.
      MERK: Avhengig av bakgrunnen som brukes, anbefales det å sonikere cellene før shmoo visualisering. For W303-bakgrunnen, sonikere 2x, for 2 s hver gang, med en amplitude på 40-50.
    8. Sentrifuge i 3 min ved 1.500 × g. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    9. Resuspend cellene i 20 ml SC medium.
    10. Gjenta trinn 1.2.8-1.2.9 én gang.
      MERK: Den α-faktoren vaskes bort med disse trinnene, og cellene frigjøres i cellesyklusen. Alternativt kan α-faktoren vaskes bort ved å filtrere gjærcellene med et 1,2 μm nitrocellulosefilter ved hjelp av et traktsett på en sidearmskolbe koblet til en vakuumpumpe.
    11. Samle 1 ml celler 2x hvert 5. minutt og fortsett til trinn 2 for EdU-merking.
      MERK: Merk cellene fra bare ett av de to rørene med EdU. De ikke-pulsmerkede cellene brukes til å skille EdU-positive fra EdU-negative celler på en bivariat propidiumjodid (PI)-EdU-graf.
    12. Tilsett 400 μL 1 mg/ml α-faktor fortynnet i vann 30 minutter etter frigjøring.
      MERK: Denne høye dosen av α-faktor er nødvendig for å arrestere cellene i G1-fasen i neste cellesyklus og for å forhindre at cellene går inn i den påfølgende S-fasen.

2. EdU-merking

  1. Overfør 1 ml cellekultur til et 2,0 ml mikrofugerør inneholdende 1 μL 10 mM EdU. Bland godt ved inversjon.
    MERK: For å diskriminere de EdU-positive cellene fra de EdU-negative cellene på en PI-EdU bivariat FACS, overfør ytterligere 1 ml cellekultur til et 2,0 ml mikrofugerør som inneholder 1 μL DMSO.
  2. Inkuber i 3-5 minutter ved 30 °C under omrøring i et skjelvende vannbad.
    MERK: Tre minutter er tilstrekkelig for EdU-deteksjon med et mikroskop; 5 minutter er nødvendig for optimal EdU-deteksjon på et flowcytometer.
  3. Stopp reaksjonen med tilsetning av 100 μL av 100% etanol.
    1. Stopp reaksjonen med tilsetning av 100 μL på 20% paraformaldehyd hvis måling av cellestørrelse er nødvendig.
      MERK: Hvis kjernearkitekturen til de mitotiske cellene skal holdes intakt for videre analyser etter Click-reaksjonen, anbefaler vi å fikse celler med 2% paraformaldehyd ved romtemperatur (RT) i stedet for å sette cellene på is, siden sistnevnte forårsaker mikrotubulidepolymerisering.
    2. La cellene stå i 20 minutter ved RT under mild omrøring på en variabel hastighetsvelger ved 20 vipper/min for å fikse cellene før tilsetning av 100 μL 100% etanol.

3. Cellefiksering og permeabilisering

  1. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrofuge. Fjern supernatanten med en vakuumpipette.
  2. Resuspend cellepelleten i 500 μL 70% etanol. Bland godt ved vortexing.
  3. La i ≥ 1 time ved RT ved 20 tilts / min på en variabel hastighet rocker å permeabilize cellene.
    MERK: Celler dyrket i SC-medium pelleterer ikke godt, da de har en tendens til å holde seg til mikrofugeveggene. Tilsetningen av etanol forbedrer pelletering og reduserer celletap. Cellene kan lagres ved 4 °C over natten eller i lengre perioder ved −20 °C.
  4. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
  5. Vask cellene 2x med 500 μL 10% etanol i PBS.
    MERK: Vaskene er avgjørende for å fjerne ikke-inkorporert EdU fra cellene.

4. Klikk-det-reaksjon

  1. For cytometrianalyse
    1. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    2. Resuspendere pelleten i 200 μL PBS inneholdende 0,1 mg/ml RNase A og 0,2 mg/ml proteinase K.
    3. Inkuber i 1-2 timer ved 50 °C ved sporadisk risting (eller over natten ved 37 °C).
    4. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    5. Vask cellene med 500 μL PBS.
    6. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    7. Resuspendere cellepelleten i 200 μL PBS + 1% bovint serumalbumin (BSA). Inkuber i 30 min på RT.
      MERK: Lengre tider er ikke nødvendig og er til og med skadelig for effektiviteten til klikkreaksjoner.
    8. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    9. Resuspend pelleten i 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Fordel cellene mellom to rør: 200 μL i et 1,5 ml mikrosentrifugerør for klikkreaksjonen og 100 μL i et annet 1,5 ml mikrosentrifugerør for Sytox Green-farging.
    11. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    12. For Sytox Green farging
      MERK: Vi anbefaler på det sterkeste å ta en aliquot for Sytox Green-farging (uten klikk) for å oppnå referanseprofiler av DNA-innhold av høy kvalitet. Faktisk slukker klikkreaksjonen sterkt intercalant fluorescens, inkludert Sytox Green og PI fluorescens. Følgelig kan klikkreaksjonen forvrenge lesingen av DNA-innhold.
      1. Resuspend cellepelleten i 100 μL PBS.
      2. Overfør 10-30 μL (avhengig av cellekonsentrasjonen) til et flowcytometerrør som inneholder 300 μL på 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 og 0,5 μM Sytox Green.
      3. Sonikere 2x, for 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
      4. La stå i mørket til du behandler prøvene på et flowcytometer.
        MERK: Cellene kan oppbevares på dette stadiet ved 4 °C i noen dager.
    13. For Klikk reaksjon
      1. Tilbered fersk Azide Dye-buffer ved å blande reagensene i følgende rekkefølge (mengde for ett rør): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL av 2 mM Cy5 Azide og 2 μL 1 M askorbinsyre.
        MERK: Det er mulig å tilberede en hovedblanding av Azide Dye-bufferen. Reagensene må blandes i samme rekkefølge som nevnt ovenfor.
      2. Resuspend cellepelleten med 40 μL nystekte Azide Dye mix. Inkuber på RT i mørket i 60 min.
      3. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
      4. Vask cellene 3x med 300 μL 10% etanol i PBS.
        MERK: Vaskene er avgjørende for å eliminere alt løselig EdU-Cy5-azid.
      5. Resuspend cellene i 100 μL av 50 μg / ml PI i PBS. La stå i 10 minutter i mørket.
      6. Overfør 10-30 μL av cellesuspensjonen (avhengig av cellekonsentrasjonen) til et flowcytometerrør inneholdende 300 μL av 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
      7. Sonikere 2x, for 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
      8. La stå i mørket til du behandler prøvene på et cytometer.
        MERK: Cellene kan oppbevares på dette stadiet ved 4 °C i noen dager.
    14. Les Sytox Green-prøvene ved hjelp av en eksitasjonsblå laser ved 488 nm og et 530/30 BP-filter. Se figur 1A for typiske resultater. Les de bivariate PI-EdU-prøvene på et punktplott ved hjelp av en eksitasjonsblå laser ved 488 nm og et 615/20 BP-filter for PI (x-aksen) og en eksitasjonsrød laser ved 640 nm og et 660/20 BP-filter (y-akse). Se figur 1B for typiske resultater.
      MERK: Figur 1C representerer det typiske PI-EdU bivariate FACS-resultatet for EdU-negative celler. Det tillater diskriminering av EdU-negative celler fra EdU-positive celler.
  2. For mikroskopi analyse
    1. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    2. Resuspend pelleten i 200 μL PBS + 1% BSA. Inkuber i 30 min på RT.
    3. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    4. Forbered fersk Azide Dye buffer ved å blande reagensene i følgende rekkefølge (mengde for ett rør): 36 μL PBS, 2 μL av 0,2 M CuSO4, 0,2 μL av 2 mM Dy-530 azid, 2 μL av 1 M askorbinsyre.
      MERK: En hovedblanding av Azide Dye-bufferen kan tilberedes fersk ved å blande reagensene i nevnte rekkefølge.
    5. Resuspend pelleten med 40 μL nylaget Azide Dye buffer. Inkuber på RT i mørket i 60 min.
    6. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    7. Vask cellene 2x med 300 μL 10% etanol i PBS.
      MERK: Vaskene er avgjørende for å eliminere alt løselig Dy-530 azid.
    8. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    9. Resuspend cellene i 100 μL av 0,5 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i PBS. La stå i 30 minutter i mørket ved romtemperatur.
    10. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrosentrifuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    11. Vask med 300 μL PBS for å fjerne overflødig DAPI.
    12. Pellet cellene i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kast supernatanten med en vakuumpipette.
    13. Resuspend pelleten med 10-50 μL PBS avhengig av cellekonsentrasjonen.
    14. Sonikere 2x, for 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
      MERK: Cellene kan oppbevares på dette stadiet ved 4 °C i noen dager.
    15. Pipette 1,7 μL av cellene på et glassmikroskop lysbilde og deksel med et rent deksel.
    16. Observer umiddelbart under et fluorescensmikroskop med DAPI- og TexasRed- eller Cy3-filtre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å bestemme S-fasevarigheten og, mer generelt, varigheten av G 1 og G2 + M (protokolltrinn 1.1), ble S. cerevisiae W303 villtypeceller (WT, tabell 1) dyrket asynkront i SC-medium i 7 timer. Hver time ble cellekonsentrasjonen overvåket for å bestemme doblingstiden (figur 2B). Under disse vekstforholdene var beregnet doblingstid 120 min ± 13 minutter ved 25 °C (tabell 2). Når cellene var i eksponentiell fase (2 × 10 6-5 × 106 celler / ml), ble en aliquot av celler pulsmerket med EdU (10 μM) i 5 minutter for å sette ut cellene i S-fasen og bestemme prosentandelen av celler som var i G1, S og G2 + M faser. Tre populasjoner av celler ble observert i en bivariat EdU-PI cytometeranalyse (figur 1B). Diskrimineringen mellom de EdU-negative og EdU-positive populasjonene ble gjort ved hjelp av et kontrolleksperiment der cellene ikke var pulsmerket med EdU, men klikkreaksjonen ble utført (figur 1C). De to EdU-negative populasjonene nederst til venstre og nederst til høyre som skilte seg i PI-intensitet to ganger, tilsvarte henholdsvis G1 og G2 + M (figur 1B, C). Derfor korresponderte den øvre populasjonen (med en intensitet >1× 104-2 × 104) med de EdU-positive cellene som var i S-fasen på tidspunktet for pulsen (figur 1B). Derfor var 27 % ± 5 % av cellepopulasjonen i G1-fasen, 29 % ± 3 % var i S-fasen og 44 % ± 2 % var i G2 + M. Siden doblingstiden var 120 min ± 13 min under disse forholdene, ekstrapolerte vi at G1, S og G 2 + M-fasene varte henholdsvis 32 min ± 4 min, 35 min ± 6 min og 53 min ± 7 min ved 25 °C (tabell2 og tabell 3).

Deretter hadde vi som mål å validere denne metoden og vise at den er følsom nok til å identifisere mutanter med DNA-replikasjonsfeil som har blitt oversett så langt. Vi resonnerte at justerbare tap-av-funksjon alleler av faktorene som er involvert i DNA-replikasjon, ville være ideelle valideringskontroller. Derfor brukte vi en gjærstamme som inneholder en temperaturfølsom cdc6-1 mutant (tabell 1)11. Cdc6 er en viktig lisensieringsfaktor som uttrykkes i sen M og G1 for å sette sammen prereplikasjonskomplekser (preRC) på ORC-bundne kromosomsteder som senere kan brukes som replikasjonsopprinnelse. Derfor, ved en permissiv temperatur, bør S-fasevarigheten være den samme som for WT, mens ved en restriktiv temperatur bør ingen DNA-replikasjon forekomme, da ingen opprinnelse er lisensiert12. Men ved en semi-permissiv temperatur, hvor færre opprinnelser er lisensiert, men det er nok til å gi celle levedyktighet (våre upubliserte data; Barba Tena et al., i forberedelse), forventet vi forskjellige varigheter for hver fase. Som forventet, basert på falltester, vokste cdc6-1-cellene det samme som WT-celler ved en permissiv temperatur (dvs. 25 ° C, figur 2A), og viste samme doblingstid (figur 2B og tabell 2), men var døde ved eller over 34 ° C (figur 2A). Av interesse, ved en semi-permissiv temperatur (dvs. 28 ° C), var cdc6-1 levedyktig (28 ° C, figur 2A). Doblingstiden var imidlertid lengre enn for WT (figur 2B og tabell 2), og varigheten av hver fase var forskjellig. Faktisk, i cdc6-1 var G 1 litt kortere (12 min ±1 min mot 16 min ± 2 min), mens S-fasen var litt utvidet (34 min ± 4 min mot 29 min ± 5 min), og G2 + M-fasen var betydelig lengre (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) sammenlignet med WT (figur 2C, D og tabell 3). S-fasen ble overraskende nok ikke utvidet veldig mye, men gjennomsnittsintensiteten til EdU-signalet ble redusert med 25% (figur 2C, D), noe som er i samsvar med en S-fase initiert fra færre opprinnelser. Videre, mens de EdU-positive WT-cellene var homogent fordelt mellom de tidlige (S1) og sene S (S2) fasene (figur 2C, supplerende figur S1A, tidlig [S1] og sen S [S2] faser avgrenset med en vertikal stiplet linje i den øvre porten), akkumulerte 65% av de EdU-positive cdc6-1-cellene i sen S-fase (figur 2D, supplerende figur S1B). Det var til og med ikke noe klart skille mellom S- og G 2 + M-populasjonene (figur 2D), noe som tyder på at cellene slet med å fullføre S-fasen før de gikk inn i G2-fasen. Derfor er denne metoden egnet og følsom for å identifisere mutanter med defekter i S-fasen (varighet og/eller distribusjon) og i cellesyklusfasevarighet.

En komplementær metode ble utviklet for å bestemme når celler starter og fullfører DNA-replikasjonen og estimerer S-fasevarigheten ved hjelp av synkroniserte celler (protokoll trinn 1.2). Til dette formål, ved hjelp av α-faktor med synkroniserte celler i G1, ble celler frigjort i SC-medium og samlet hvert 5. minutt. Varigheten av S-fasen kan være ca. 25 minutter basert på tidspunktet da DNA-innholdet endret seg fra 1C til 2C på Sytox Green flowcytometerprofil (figur 3A). Denne estimeringen avhenger imidlertid av når en betydelig cellefraksjon av befolkningen har innlemmet nok Sytox Green til å bli sett i FACS-profilen. De tidlige og sene replikeringshendelsene kan ikke oppdages med denne metoden. For å definere nøyaktig når S-fasen starter og slutter og hvor lenge den varer, ble S-faseceller utpekt fra en aliquot av celler ved pulsmerking med EdU (10 μM) i 5 minutter hvert 5. minutt etter G1-utgivelsen. Som forventet, i løpet av de første 10 minuttene etter utgivelsen, var alle cellene i nedre venstre område (dvs. i G1, figur 3B, supplerende figur S2). Femten minutter etter frigjøringen var det allerede påvist en brøkdel av EdU-positive celler (sammenlign de to første radene i tilleggsfigur S2 og tilleggsfigur S3, henholdsvis EdU-behandlede og EdU-frie celler), noe som indikerer at S-fasen hadde startet (figur 3C). Progresjonen gjennom S-fasen ble sett ved at celleskyen først beveget seg oppover og deretter til høyre i den bivariate PI-EdU-grafen (figur 3D-F). Til slutt, 35 minutter fra utgivelsen, var en brøkdel av cellene EdU-negative, men med dobbelt så mye DNA, noe som indikerer at disse cellene hadde fullført S-fasen og var i G2 + M-fasen (figur 3G). Dermed varer S-fasen 20 minutter under disse forholdene. Til tross for den høye synkroniseringen observert med overlegget av DNA-innhold oppdaget med Sytox Green, noe som tyder på at S-fasen var over i hele populasjonen 40 minutter etter utgivelsen, viste de bivariate analysene at noen celler fullførte S-fasen 60 min etter utgivelsen, og at S-fasen var fullført for hele befolkningen 65 minutter etter utgivelsen (figur 3H, I og tilleggsfigur S2).

I tillegg kan S-fasen og DNA-syntesen overvåkes ved mikroskopi. Fra hver aktivert replikasjonsopprinnelse utføres DNA-syntese av to bundet replisomer, og danner et nukleært replikasjonsfokus som kan følges av mikroskopi ved å avbilde en merket versjon av en replikasjonsfaktor og / eller operatørmatrise og deres tilsvarende repressor smeltet sammen til et fluorescerende protein 2,13. Alternativt kan DNA-syntese detekteres ved mikroskopi ved bruk av tymidinanaloger14,15. Vi brukte EdU til å overvåke de subnukleære DNA-regionene som gjennomgår DNA-syntese. Til dette formål pulsmerket vi asynkrone WT- og cdc6-1-celler med EdU (10 μM) i 3 minutter ved 28 ° C og avbildet dem etter Click-reaksjonen. Vi forventet å oppdage variasjoner i EdU-signalintensitetene avhengig av DNA-syntesehastigheten og på celleprogresjonen i cellesyklusen i løpet av 3 min EdU-puls (dvs. celler som bruker hele 3 minutter i S-fasen vil vise et sterkere signal enn de som går inn eller ut av S-fasen under pulsen). Følgelig viste WT S-faseceller et EdU-signal i kjernen som varierte i intensitet (figur 4A). S-fasevarigheten kan lett ekstrapoleres fra denne analysen. Faktisk ble det bestemt fra to biologiske replikasjoner (minst 150 celler ble talt), at 34% ± 3% og 38% ± 3% av WT- og cdc6-1-cellene var henholdsvis EdU-positive. Som i disse vekstforholdene var doblingstiden 90 min og 123 min for henholdsvis WT- og cdc6-1-cellene (tabell 2), vi ekstrapolerte at S-fasen varte henholdsvis 31 min og 47 min. Det førstnevnte resultatet er i tråd med det vi har fått fra våre FACS-analyser (tabell 3), noe som indikerer at påvisning av EdU-positive celler ved mikroskopi gjør det mulig å bestemme S-fasevarigheten. Det er verdt å merke seg at sistnevnte er høyere enn S-fasevarigheten ekstrapolert fra våre FACS-analyser fordi det ikke var noe klart skille mellom S- og G2 + M-populasjonene (figur 2D). EdU-foci ble lett observert i WT-cellene (figur 4B), men var svakere og færre i cdc6-1-cellene (figur 4C). For å utelukke muligheten for at EdU-signalintensitetsforskjellen mellom WT- og cdc6-1-cellene var avhengig av trinnet i S-fasen, ble intensiteten kvantifisert fra synkroniserte celler. Som forventet var den gjennomsnittlige EdU-signalintensiteten tre ganger lavere i cdc6-1-cellene (figur 4D), i samsvar med DNA-replikasjon initiert fra færre replikasjonsopprinnelser. EdU-signalet var begrenset til kjernen, colocalizing med et sterkt DAPI-signal, og organisert i kuleformede mønstre, i samsvar med organiseringen av DNA-replikasjon i kjernefysiske regioner eller replikasjonsfabrikker. Det er viktig at EdU bare ble oppdaget i ubuddede eller små spirede celler og aldri tilstede i celler med store knopper, noe som indikerer at WT-gjærcellene var ferdige med replikasjonen da de kom inn i mitose. Denne metoden er derfor følsom for å visualisere DNA-replikasjon ved høy romlig oppløsning, samt for å oppdage og kvantifisere milde DNA-replikasjonsdefekter.

Figure 1
Figur 1: Representative FACS-analyser. (A) Representative Sytox Green FACS-analyser for WT-celler dyrket ved 25 °C. (B,C) Representative EdU-PI bivariate FACS-analyser for WT-celler dyrket ved 25 °C og pulsmerket i 5 minutter med EdU (10 μM) eller 1 μL DMSO. Polygonene var de samme i begge analysene. C ble brukt til å avgrense EdU-negativet fra de EdU-positive cellene (vanligvis er grensen satt med en intensitet >1× 10 4-2 × 104). Den øverste polygonporten avgrenset de EdU-positive cellene (S-fasefraksjon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fraksjon av celler iG1-, S- og G2 + M-cellesyklusfasene i asynkrone cellepopulasjoner. (A) WT- og cdc6-1-stammer ble oppdaget ved serielle fem ganger fortynninger på rikt medium og dyrket enten ved 25 °C, 28 °C eller 34 °C. (B) Befolkningsdoblingstid. Asynkrone WT- og cdc6-1-celler ble dyrket ved 25 °C eller 28 °C, og cellekonsentrasjonen ble målt hver time i 7 timer. (C,D) EdU-PI bivariat FACS-analyse av WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 28 °C og pulsmerket i 5 minutter med EdU (10 μM). Multiplikasjon av populasjonsdoblingstiden med S-fasefraksjonen gir S-fasevarigheten. Middelintensitetene til de EdU-positive og EdU-negative cellene ble beregnet som gjennomsnittet av intensiteten til hver verdi i den tilsvarende polygonen. Gjennomsnittsintensiteten til WT- og cdc6-1 EdU-negative celler (henholdsvis 5 077 og 4 454) ble normalisert til 1. Gjennomsnittlig intensitet av WT og cdc6-1 EdU-positive celler (henholdsvis 52.604 og 36.141) ble delt med normaliseringsfaktoren som ble brukt for hver stamme. De oppnådde verdiene var henholdsvis 10,4 og 8,1 (dvs. en reduksjon på 25%, som nevnt i teksten). Forkortelser: WT = villtype; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; PI = propidiumjodid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse av S-fasevarighet på synkroniserte celler. (A) Tidsforløpsanalyse av DNA-innholdet i WT-celler etter α-faktor frigjøring ved 28 °C. Den angitte tiden tar hensyn til varigheten av EdU-pulsen (5 min). (B-I) EdU-PI bivariate FACS-analyser for synkroniserte WT-celler pulsmerket i 5 minutter med EdU (10 μM) og samlet på de angitte tidspunktene etter frigjøring fra G1-arrestasjon. Forkortelser: WT = villtype; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; PI = propidiumjodid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: EdU-påvisning og kvantifisering ved mikroskopi. Asynkrone WT- og cdc6-1-stammer ble dyrket i 2 timer ved 28 °C, og deretter pulsmerket i 3 minutter med EdU (10 μM) og avbildet ved bredfeltsmikroskopi ved bruk av tilstrekkelige eksitasjons- / utslippsfiltre. (A) Representative bilder fra vidvinkelmikroskopi for WT og (B,C) individuelle celler for WT og cdc6-1 visualisert av DIC og farget med DAPI eller for EdU, som angitt. Skalastolpene i (A) og (B,C) er henholdsvis 10 μm og 2 μm. (D) EdU-intensitetsmålinger på synkrone WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 28 °C 30 minutter etter frigjøring fra G 1-arrestering. Grafen representerer samlingen av tre biologiske replikasjoner (minst 50 celler ble talt i hver biologisk replikasjon). Gjennomsnittlig ± SD vises på grafen. En uparret tosidig t-test mellom WT- og cdc6-1-celler indikeres av **** (p < 0,0001). Forkortelser: WT = villtype; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; DIC = differensial interferenskontrast; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; A.U. = vilkårlige enheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn Genotype Figurer og tabeller
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, Supp Fig.1,2,3 Tabeller2,3
cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tabeller2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Fig.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Fig.4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Fig.4

Tabell 1: Liste over stammene som ble brukt i denne studien.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Doblingstid (min) 120 90 118 123
SD ± 13 min ± 3 min ± 10 min ± 6 min

Tabell 2: Gjennomsnittlig doblingstid for WT- og cdc6-1-stammer dyrket ved 25 °C og 28 °C. Doblingstidene ble beregnet fra tre biologiske replikasjoner (fire tekniske replikasjoner for hver biologisk replikasjon) ved hjelp av følgende formel: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), hvor Cf og Ci tilsvarer henholdsvis den endelige og initiale cellekonsentrasjonen, og Δt tilsvarer forskjellen i minutter mellom tf og ti, når Cf og Ci ble målt, henholdsvis.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Prosent Varighet
(min)		 Prosent Varighet
(min)		 Prosent Varighet
(min)		 Prosent Varighet
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tabell 3: Gjennomsnittlige fraksjoner av celler og varighet av G 1-, S- og G2 + M-fasene i WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 25 °C og 28 °C. Fraksjonene av celler ble bestemt fra tre biologiske replikasjoner (to tekniske replikasjoner for hver biologisk replikasjon). Forskjellene iG1-, S- og G2 + M-varighet mellom WT- og cdc6-1-cellene dyrket ved 28 °C var statistisk signifikante (uparret tosidig t-test, p < 0,1).

Supplerende figur S1: Fraksjon av celler i de tidlige og sene S-fasene i WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 28 °C. To identiske polygoner kalt S1 og S2 for henholdsvis tidlig og sen S-fase ble trukket i fraksjonen av EdU-positive celler for å dele den i to halvdeler på EdU-PI bivariate FACS-analyser for (A) WT-celler dyrket ved 28 ° C og (B) cdc6-1 celler dyrket ved 28 ° C. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Cellesyklusprogresjon av EdU-pulsmerkede celler etter frigjøring fra G1-arrestasjon visualisert av EdU-PI bivariat FACS. En aliquot av celler ble pulsmerket i 5 minutter med 10 μM EdU hvert 5. minutt etter frigjøring fra α-faktor arrestasjon ved 28 ° C og til 80 min, som angitt. Forkortelser: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; PI = propidiumjodid. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S3: Cellesyklusprogresjon av DMSO-behandlede celler etter frigjøring fra G1-arrestasjon visualisert av EdU-PI bivariat FACS. Dette er det samme som supplerende figur 2, men cellene ble inkubert i 5 minutter med 1 μL DMSO (dimetylsulfoksid). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: BrdU- og EdU-toksisitet i TK hENT1 gjærceller. Celler av den angitte genotypen ble oppdaget i fem ganger serielle fortynninger på YPROD-plater som inneholdt økende konsentrasjoner av BrdU eller EdU og dyrket i 40 timer ved 30 ° C. Forkortelser: DMSO = dimetylsulfoksid; BrdU = bromodeoxyuridin; Edu = 5-etynyl-2'-deoksyuridin; TK = tymidinkinase; hENT1 = human likevekts nukleosidtransportør. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gjær er en førsteklasses modellorganisme for cellesyklusstudier, men karakteriseringen av S-fasen har lenge blitt hindret av dens manglende evne til å inkorporere eksogene nukleosider, som BrdU, som brukes som sporstoffer av DNA-replikasjon. Å utstyre gjær med et høyt uttrykk av herpes simplex tymidinkinase (TK) og tilsetning av en human nukleosidtransportør (hENT) har i stor grad løst dette problemet15,16. EdU er mer allsidig enn BrdU da deteksjonen med lite fluorescerende azid og klikkkjemi er egnet til permeabiliserte gjærceller og FACS-analyse, i motsetning til anti-BrdU-antistoffer17. Her optimaliserte vi betingelsene for EdU-merking og deteksjon i denne TK-hENT1-stammen og viste at tidligere uoppdagede replikasjonsfeil kan kvantifiseres ved hjelp av denne protokollen ved FACS eller mikroskopi.

Å studere en biologisk mekanisme ved hjelp av verktøy som kan forstyrre den samme mekanismen er et vanlig problem i biologi. Siden EdU har en kjent cytotoksisk effekt, søkte vi etter EdU-konsentrasjoner som ikke er giftige ved kronisk eksponering for den konstruerte TK-hENT1-stammen og fant at 10 μM var en passende dose. TK-hENT1-celler klarer ikke å proliferere ved 25 μM EdU, mens TK-alene eller hENT1-alene celler lett tåler 100 μM EdU (tilleggsfigur S4). Selv om gjærceller er betydelig mer følsomme for EdU enn BrdU, fant vi at spredning redusert først etter den andre cellesyklusen etter EdU-eksponering, noe som tyder på at den må innlemmes på begge tråder for å påvirke celleproliferasjon (data ikke vist). For å forbli på den sikre siden brukte vi 10 μM EdU gjennom hele denne protokollen, med bare korte pulser (3 min for mikroskopi, 5 min for FACS), og fant at dette var egnet for god deteksjon ved hjelp av denne optimaliserte protokollen.

Subtile defekter i DNA-replikasjon kan ha en sterk innvirkning på kromosomomorganiseringer4. Derfor er utviklingen av teknikker og protokoller som er i stand til å oppdage disse subtile feilene, nøkkelen til å avdekke etiologien til kromosomale avvik. Her viser vi at denne optimaliserte protokollen for EdU-inkorporering og deteksjon kan måle opptil en tre ganger reduksjon i signalintensiteten (figur 2 og figur 4), noe som indikerer at frekvensen av DNA-syntese reduseres i temperaturfølsomme cdc6-1-celler dyrket ved 28 ° C, som foreløpig ikke viser noen feil på platens levedyktighetsanalyser (figur 2A ). Denne protokollen for EdU-inkorporering og kvantifisering kan dermed brukes til å screene andre mutanter som replikasjonsfeil ikke mistenkes i utgangspunktet. I tillegg kan det være nyttig å oppdage mitotisk DNA-syntese (MiDAS), meiotisk rekombinasjonsavhengig DNA-syntese eller annen langveis DNA-syntese.

En ulempe er at EdU-deteksjon kun kan utføres på faste celler, og utelukker levende analyse som med PCNA-GFP eller andre fluorescerende avlesninger av DNA-replikasjon, som lider seg av den høye fototoksisiteten til laserstrålene som brukes til avbildning. Voksende celler i et syntetisk medium er avgjørende for best deteksjon, da YDD-rester ser ut til å slukke Click-reaksjonen betydelig. Interessant nok tillater utpeking av S-fasecellene ved hjelp av bivariat EdU-PI FACS-analyse på synkroniserte populasjoner estimering av varigheten av S-fasen til 20 minutter i enkeltceller (figur 3, supplerende figur S2 og supplerende figur S3). Men selv når synkron etter α-faktor utgivelse virker så nær perfekt som i klassisk Sytox Green FACS-analyse (figur 3A), blir det klart fra bivariat EdU-PI FACS-analyse at celler går inn i S-fasen relativt asynkront (figur 3B-I).

Her beskriver vi tre metoder for å bestemme S-fasevarighet ved hjelp av flowcytometri og mikroskopi på synkrone og asynkrone celler både på enkeltcelle- og populasjonsnivå. Gjennomsnittlig S-fasevarighet bestemt i asynkrone WT-celler på populasjonsnivå er lik ved bruk av flowcytometri og mikroskopi, henholdsvis ved 29 minutter og 31 minutter, mens vår synkroniserte enkeltcellebaserte tilnærming viser at varigheten kan være så kort som 20 minutter (figur 2, figur 3, figur 4 og tabell 3 ). Avviket mellom disse verdiene er overraskende, men kan lett forklares. Faktisk, med vår enkeltcellebaserte tilnærming, ble S-fasevarigheten bestemt basert på de tidligste hendelsene (dvs. de første cellene som går inn og ut av S-fasen, figur 3C, G), men det betyr ikke at S-fasen varer 20 minutter i hver celle i en populasjon. Disse dataene vil støtte den uventede oppfatningen om at det er et visst nivå av heterogenitet i S-fasevarighet mellom celler.

Forbedrede protokoller eller nye teknikker kan styrte langvarige dogmer eller nye ideer. Det er tre som disse dataene utfordrer. For det første antas det at DNA-syntese er samtidig med knoppoppoppkomst i S. cerevisiae. Figur 4A-C viser at EdU-farging er sterkest i ubuddede og små spirede celler, til tross for 3 min merkingsforsinkelse, noe som indikerer at S-fasen tydelig starter før spirende, som vist tidligere16. For det andre er det rapportert at gjærceller ikke har en G2-fase, med mitotiske spindler som dannes samtidig med DNA-syntese. De svært korte pulsene kombinert med sensitiv EdU-deteksjon av FACS (figur 3, supplerende figur S2 og supplerende figur S3) eller mikroskopi (figur 4) gjør det mulig å bestemme nøyaktig når S-fasen begynner og slutter i enkeltceller. Ved å gjøre dette fant vi at bulk DNA-syntese avsluttes 40 min etter α-faktor utgivelse (figur 3, supplerende figur S2 og supplerende figur S3), mens korte mitotiske spindler bare danner 20 min senere16 (data ikke vist). Vi konkluderer med at gjærceller har en G2-fase. For det tredje ble det nylig foreslått at opptil 30% av gjærcellene fullfører DNA-syntese i anafase-telofase18. Ved hjelp av denne optimaliserte protokollen oppdaget vi ikke EdU-inkorporering i celler som viser en anafase / telofase-spindel (data ikke vist), men vi kan ikke utelukke at denne andre bølgen av DNA-syntese er under den brukte deteksjonsgrensen. Gitt det sterke signal/ støyforholdet, anser vi det siste alternativet som usannsynlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne Agence Nationale de la Recherche (ANR) og Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) for ph.d.-stipendene til J.d.D.B.T. og Agence Nationale pour la Recherche (ANR) for økonomisk støtte (stipend ANR-18-CE12-0018-01). Cytometri og mikroskopi ble utført ved bildebehandlingsanlegget Montpellier MRI BioCampus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

Biologi utgave 188
Bestemmelse av S-fasevarighet ved bruk av 5-etynyl-2'-deoksyuridininkorporering i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter