Summary
인간 진균 병원체인 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 숙주 내에서 생존을 촉진하기 위해 다양한 독성 인자(예: 펩티다아제)를 생성합니다. 환경적 틈새는 새로운 천연 펩티다아제 억제제의 유망한 공급원입니다. 이 프로토콜은 연체 동물 추출물의 준비와 곰팡이 독성 인자 생산에 미치는 영향에 대한 평가를 간략하게 설명합니다.
Abstract
크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 캡슐화된 인간 진균 병원체로 전 세계적으로 분포하여 주로 면역 저하 개체를 감염시킵니다. 임상 환경에서 항진균제의 광범위한 사용, 농업에서의 사용 및 균주 교잡은 내성의 진화를 증가시켰습니다. 항진균제에 대한 내성 증가율은 전 세계 임상의와 과학자들 사이에서 우려가 커지고 있으며 새로운 항진균 요법 개발의 시급성이 높아지고 있습니다. 예를 들어, C. neoformans 는 조직 분해, 세포 조절 및 영양소 획득에 역할을 하는 세포내 및 세포외 효소(예: 펩티다아제)를 포함한 여러 독성 인자를 생성합니다. 억제제에 의한 이러한 펩티다아제 활성의 중단은 곰팡이의 성장과 증식을 교란시켜 이것이 병원체 퇴치를 위한 중요한 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 연체 동물과 같은 무척추 동물이 생물 의학 응용 및 항균 활성을 가진 펩티다제 억제제를 생산하지만 곰팡이 병원체에 대한 사용 측면에서 충분히 연구되지 않았다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 연체동물에서 글로벌 추출을 수행하여 조잡하고 정제된 추출물에서 잠재적인 펩티다제 억제제를 분리하고 고전적인 크립토코커스 독성 인자에 대한 효과를 평가했습니다. 이 방법은 항진균 특성을 가진 연체동물의 우선 순위를 지원하고 연체동물에서 발견되는 천연 억제제를 활용하여 항독성제를 발견할 수 있는 기회를 제공합니다.
Introduction
크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)는 HIV/AIDS 보균자와 같은 면역 저하 숙주에서 심각한 질병을 일으키는 인간 진균 병원체이며1, AIDS 관련 사망의 약 19%를 차지한다2. 곰팡이는 아졸, 폴리엔 및 플루시토신을 포함한 여러 종류의 항진균제에 취약하며, 이는 뚜렷한 메커니즘을 사용하여 살균 및 살균 활성을 발휘합니다 3,4. 그러나 임상 및 농업 환경에서 항진균제의 광범위한 사용과 균주 교잡은 C. neoformans5를 포함한 여러 곰팡이 종에서 내성의 진화를 증폭시켰다.
항진균 내성 문제를 극복하고 전 세계적으로 진균 감염의 유병률을 줄이기 위해, 유망한 접근법은 크립토코커스 종의 독성 인자(예: 온도 적응성, 다당류 캡슐, 멜라닌 및 세포외 효소)를 잠재적인 치료 표적으로 사용하는 것이다 4,6 . 이러한 독성 인자는 문헌에 잘 특성화되어 있고, 이러한 인자를 표적으로 삼으면 세포 성장을 표적으로 삼는 것이 아니라 독성을 손상시켜 더 약한 선택 압력을 가함으로써 항진균 내성 비율을 잠재적으로 감소시킬 수 있기 때문에 이러한 접근법은 몇 가지 장점이 있다6. 이러한 맥락에서 많은 연구에서 크립토코커스 종 7,8,9의 독성을 감소시키거나 억제하기 위해 세포외 효소(예: 프로테아제, 펩티다아제)를 표적으로 삼을 가능성을 평가했습니다.
무척추 동물 및 식물과 같은 유기체는 병원체로부터 자신을 보호하기 위한 적응 면역 체계를 가지고 있지 않습니다. 그러나 그들은 미생물과 포식자를 다루기 위해 엄청난 양의 화합물을 가진 강력한 선천성 면역 체계에 의존합니다10. 이러한 분자에는 펩티다아제 억제제가 포함되어 있는데, 이는 체림프 응고, 사이토카인 및 항균 펩타이드의 합성, 병원체의 프로테아제를 직접 불활성화하여 숙주를 보호하는 것과 같은 무척추동물 면역의 세포 과정을 포함하여 많은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다11. 따라서, 연체동물과 같은 무척추동물의 펩티다아제 억제제는 잠재적인 생물의학적 응용을 가지고 있지만, 많은 것들이 특성화되지 않은 채로 남아 있다10,12,13. 이러한 맥락에서 온타리오에는 약 34종의 육상 연체동물이 있고 캐나다에는 180종의 민물 연체동물이 있습니다14. 그러나 심층적 인 프로파일 링 및 특성화는 여전히 제한적입니다15. 이 유기체들은 잠재적인 항진균 활성을 가진 새로운 화합물의 식별을 위한 기회를 제공한다10.
이 프로토콜에서는 무척추동물(예: 연체동물)에서 추출물을 분리하고 명확히 하는 방법(그림 1)을 설명한 후 추정되는 펩티다아제 억제 활성을 측정하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 표현형 분석을 사용하여 C. neoformans 독성 인자 생산에 미치는 영향을 측정하여 이러한 추출물의 항진균 특성을 평가합니다(그림 2). 원유 추출물과 정제 추출물 사이의 항진균 특성의 차이는 연체 동물의 미생물 인자(예: 숙주 미생물군집에 의해 생성된 2차 대사 산물 또는 독소)를 나타낼 수 있으며, 이는 실험적 관찰에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 발견은 작용 방식을 밝히기 위해 조잡한 추출물과 정제된 추출물을 독립적으로 평가하기 위한 이 프로토콜의 필요성을 뒷받침합니다. 또한 추출 공정은 편향되지 않으며 과다한 곰팡이 및 박테리아 병원체에 대한 항균 특성을 검출할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 C. neoformans 에 대한 항진균 특성을 가진 연체동물 종의 우선 순위를 정하기 위한 시작점과 추정 억제 메커니즘을 통해 효소 활성과 독성 인자 생산 사이의 연관성을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다.
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Protocol
1. 연체 동물에서 단백질 추출
- 지정되고 승인된 자연 지역(예: Speed River, Guelph, Ontario)에서 연체동물을 수집합니다. 이 연구에서는 광범위한 잠재적 항진균 효과를 평가하기 위해 토착 종과 침입 종을 모두 선택했습니다.
- 유봉과 절구를 사용하여 연체 동물 (예 : Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi 및 Cipangopaludina chinensis)의 껍질을 부드럽게 부수고 핀셋으로 단단한 조각을 제거합니다. 일반적으로 프로토콜 전체에서 사용하기 위해 10개의 연체동물이 풀링됩니다.
- 장기를 수집하고 무게를 잰다. 약 15-20g의 샘플이 최적입니다. 가위를 사용하여 장기를 약 0.5-1cm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
- 해부된 장기 샘플을 급속 동결하고 액체 질소로 절단합니다. 그런 다음 유봉과 박격포를 사용하여 장기 샘플을 미세한 분말로 분쇄합니다.
- 장기 샘플 분말(약 15g)을 차가운 증류수(4°C) 30mL에 넣어 1:2 비율(w/v)을 얻습니다.
- 시료 2mL를 고충격 2mL 튜브에 붓습니다. 3mm 스테인리스 스틸 비드(약 500μg)를 각 튜브에 한 스쿱 정도 넣고 1,200rpm 및 4°C에서 3분 동안 블렌더( 재료 표 참조)를 사용하여 균질화합니다.
- 4°C에서 20분 동안 12,000× g 에서 원심분리합니다. 신선한 50mL 튜브에 피펫으로 모든 상층액을 수집하고 펠릿을 버립니다.
- 필터-0.22 μm 멤브레인을 사용하여 상층액을 멸균한다. 샘플을 얼음에 보관하고 해당되는 경우 정화 프로토콜(섹션 2)로 진행합니다.
참고: 샘플은 액체 질소에서 급속 냉동하고 -20°C에서 보관하여 조추출물로 사용할 수 있습니다.
2. 연체 동물 추출물의 정화
- 단계 1.8의 상청액 샘플을 60°C의 열조에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 샘플을 얼음이 담긴 양동이에 20분 동안 옮겨 빠르게 식힙니다.
- 시료를 15,000 × g 에서 4°C에서 45분 동안 원심분리합니다. 신선한 50mL 튜브에 상청액을 모으고 펠릿을 버립니다. 0.22μm 멤브레인 필터를 사용하여 샘플을 필터 멸균한 다음 얼음에 보관합니다.
- 정량 분석법(예: 비신코닌산 분석법17)을 사용하여 단계 1.8(즉, 조추출물) 및 단계 2.2(즉, 정제된 추출물)의 샘플 중 단백질 농도를 측정합니다. 최적의 단백질 농도 범위는 4-8mg/mL입니다.
- 샘플을 얼음에 최대 1시간 동안 보관하거나 액체 질소에서 급속 동결하고 필요할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
3. 저해활성 분석
- 조추출물 및 정제된 추출물의 저해활성을 효소적 분석법을 이용하여 측정하였다.
참고: 각 효소 분석은 효소(예: 곰팡이 독성 16,17,18에 관여하는 서브틸리신 A, 발색 기반 분석의 경우 일반적으로 약 1 x 10-9 mol/L), 완충액 및 기질로 구성됩니다. 기질이 효소를 만나면 반응이 시작됩니다. 효소 활성은 생성물로의 기질 전환 속도에 비례합니다. - 두 매개변수 사이에 선형 의존성이 얻어질 때까지 효소 활성(EA)에 대한 효소 농도(EC)의 영향을 평가합니다. 다음 단계에서는 측정된 선형 범위 내에서 효소 농도를 사용합니다.
참고: 펩티다아제 서브틸리신 A에 대한 효소 분석은 다음 단계에 자세히 설명되어 있습니다. - 미정제(단계 1.11) 또는 정화(단계 2.5)를 10μL의 서브틸리신 A(3.2단계에서 결정된 농도) 및 pH 8.6에서 100mM Tris-HCl 220μL(대조군의 경우 추출물을 추가하지 않고 Tris 완충액 230μL 추가)와 함께 96웰 평면 바닥 플레이트에서 25°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 서브틸리신 A의 기질인 N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide 10μL을 최종 농도1Km (Michaelis-Menten 상수, 서브틸리신 A가 있는 이 기질의 경우 0.2mM)로 첨가하여 최종 반응 부피 250μL를 만듭니다.
- 3분 동안 15초마다 405nm에서 광학 밀도(OD)를 판독하여 시간 경과에 따른 제품의 외관을 모니터링하여 효소 활성을 측정합니다.
- 잔류 효소 활성을 결정하여 연체동물 추출물의 존재 하에서의 효소 활성과 추출물의 부재 시의 효소 활성의 비율을 계산한다.
- 저해 활성이 관찰되면(즉, 잔류 활성이 1 미만인 경우) 표준 방법19에 따라 추출물의 농도 범위(예: 200μg/mL에서 1μg/mL까지 2배 희석 시리즈)를 사용하여 억제 농도50(IC50) 값을 측정합니다.
4. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 성장에 미치는 영향
- 10μL 피펫 팁을 사용하여 C. neoformans var. grubii H99 야생형(WT) 5mL의 효모 추출물-펩톤-포도당(YPD) 배지(10g/L 효모 추출물, 20g/L 펩톤 및 20g/L 덱스트로스, pH 6.5)에 단일 콜로니를 넣고 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다. 생물학적 삼중 및 기술 복제로 실험을 수행하십시오.
- 배양액 500 μL를 큐벳에 모으고, 600 nm에서 OD를 판독하여 성장을 측정하였다. 배양물을 효모 질소 염기(YNB) 배지로 희석하여 최종OD600 0.02가 되도록 하였다.
- C. neoformans 추출물(즉, 미정제 및 정제)의 농도가 다른 세포(예: 440μg/mL에서 15μg/mL 단백질의 3배 희석 시리즈)를 공동 배양합니다. 이를 위해 10 μL의 추출물과 희석 된 C. neoformans 배양 물 190 μL의 (4.2 단계)를 96 웰 플레이트에 혼합합니다.
- 200 rpm 및 37°C에서 72시간 동안 1시간 간격으로 플레이트 리더를 사용하여 OD600 을 판독하여 성장을 측정합니다.
5. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 멜라닌 생성에 미치는 영향
- L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA) 플레이트를 준비합니다.
- 14g/L 한천 230mL를 오토클레이브하고 50-60°C에 도달할 때까지 식힙니다.
- 3.25 mL의 1 M 글리신, 7.35 mL의 1 M KH2PO4, 2.5 mL의 1 M MgSO4.7H 2O, 0.6 mL의 40 % 글루코스, 70 μL의 10 mM 티아민 및 2.5 mL의 100 mM L-DOPA (필터-멸균)를 액체 한천에 첨가한다.
- 혼합물 15mL를 페트리 플레이트에 붓고 어두운 곳에서 약 1시간 동안 건조시킨 다음 2-4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다. 한천이 제대로 건조되도록 뚜껑이 부분적으로 들어 올려졌는지 확인하십시오.
- 5mL의 YNB 배지에 4.1단계의 C. neoformans 배양액 50μL를 접종합니다. 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다.
- 세포를 1,000 × g 에서 4°C에서 5분 동안 스핀 다운합니다. pH 7.4에서 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 2배 세척합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포를 PBS 1mL에 재현탁하여 최종 농도 106 cells/mL에 도달합니다.
- 미정제 및 정제된 연체동물 추출물의 희석 시리즈(예를 들어, 2배)를 준비한다. 유사하게, 96웰 플레이트에서 멸균 PBS를 사용하여 1 x 106 cells/mL에서 1 x 101 cells/mL까지 C. neoformans 세포(단계 5.4)의 10배 희석 시리즈(단계 96)를 준비합니다.
- 면봉을 사용하여 L-DOPA 한천이 들어 있는 페트리 플레이트에 추출물 200μL를 바르고 15분 동안 건조시킵니다.
- 각 웰에서 배양액 5μL를 L-DOPA 플레이트에 스팟하고 방울 사이에 1cm를 남겨 둡니다. 어두운 곳에서 15분 동안 말리십시오.
- 플레이트를 30°C 및 37°C의 정적 인큐베이터에서 3-5일 동안 배양하고 카메라 또는 플레이트 이미저(예: 스캐너)로 24시간마다 이미지를 캡처합니다.
참고: 연체동물 추출물의 성장 억제 효과에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해 두 가지 온도 조건이 사용되며, 30°C는 환경을, 37°C는 인간의 생리적 온도를 나타냅니다.
6. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 다당류 캡슐 생산에 미치는 영향
- 아래 설명과 같이 저철분 매체(LIM)를 준비합니다.
- 킬레이트 수지 5g( 재료 표 참조)을 초순수 60mL에 녹이고 유리 컬럼(직경 2cm x 길이 25cm)에 포장합니다. 100mL의 물로 컬럼을 세척하고 수집된 물을 버립니다.
- 킬레이트 컬럼에 멸균 초순수 2L를 통과시켜 저철분수(LI-water)를 준비합니다. LI-water를 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다.
- 5g의 포도당을 100mL의 LI-물에 녹입니다. 별도의 비커에 5g의 L-아스파라긴을 200mL의 LI-water에 녹입니다.
- 500 mL의 LI-water에 다음을 순서대로 첨가한다: 4.78 g의 HEPES, 0.4 g의 K2HPO4, 0.08 g의 MgSO4.7H2O, 1.85 g의 NaHCO3, 0.25 g의 CaCl2.2H2O.
- 6.1.3단계와 6.1.4단계의 솔루션을 결합합니다. 100 μM의 최종 농도에 100 mM bathophenanthrolinedisulfonic acid sodium salt (BPS)의 1 mL를 첨가한다.
- 7.2M LI-MOPS로 pH를 1로 조정합니다. LI-water를 최종 부피 1L에 첨가하고 배지를 0.22μm 멤브레인을 통과시켜 여과 멸균합니다. 100 μL의 멸균 티아민 (4 mg / mL)을 배지에 첨가하십시오.
- 5mL의 YNB 배지에 4.1단계의 C. neoformans 배양액 50μL를 접종합니다. 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다. 이 배양액을 사용하여 5mL의 LIM을 105 cells/mL의 최종 농도로 접종합니다.
- 적절한 부피의 연체동물 추출물(예: 2배 희석 또는 이전 독성 분석에서 측정된 부피)을 추가하여 원하는 농도에 도달합니다. 느슨한 캡으로 37°C 및 200rpm에서 72시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 1 mL의 세포를 수집하고, 멸균 PBS, pH 7.4, 4°C에서 2분 동안 1,500 × g 으로 2x 세척하였다.
- 세포를 PBS 1mL에 부드럽게 재현탁합니다. 유리 현미경 슬라이드 위에 India Ink와 1:1 비율(예: India Ink 4μL과 세포 현탁액 4μL)로 세포를 혼합합니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다.
- 63x 오일 대물렌즈가 있는 미분 간섭 대비(DIC) 현미경을 사용하여 샘플을 시각화합니다( 재료 표 참조). 콘트라스트를 자동으로 설정하고 현미경 다이얼을 사용하여 수동으로 초점을 맞춥니다. 모든 사진을 선택하고 TIFF 형식으로 내보냅니다. 필터를 적용할 필요가 없습니다.
- ImageJ20의 눈금자 도구를 사용하여 셀 본체 크기에 대한 전체 셀 크기(캡슐 포함)의 비율을 정량화합니다.
7. 연체 동물 추출물이 C. neoformans 생물막 생산에 미치는 영향
- 5mL의 YNB 배지에 4.1단계의 C. neoformans 배양액 50μL를 접종합니다. 30°C 및 200rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다.
- 5mL 배양물에서 세포를 수확합니다. 세포를 멸균 PBS, pH 7.4, 4°C에서 2분 동안 1,500 × g 으로 세척한다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 3mL의 세포를 최종 농도 107 cells/mL로 재현탁합니다.
- 300 μL의 세포 현탁액을 멸균된 폴리스티렌 바닥이 평평한 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 미디어가 있는 웰은 컨트롤로만 사용하십시오.
- 적절한 부피의 연체 동물 추출물(예: 2배 희석 또는 이전 독성 분석에서 측정된 부피)을 추가하여 10-20 μg/mL 단백질의 최종 농도에 도달합니다. 추출 볼륨이 총 볼륨의 10%를 초과하지 않는지 확인합니다.
- 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고(배지 증발을 방지하기 위해) 30°C 및 37°C에서 정적 인큐베이터를 사용하여 48시간 동안 배양합니다.
- 병이나 디스펜서를 사용하여 웰을 멸균 수로 2 배 세척하고 실온에서 10-15 분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 0.3% 크리스탈 바이올렛 용액 100μL를 각 웰(배지 전용 대조군 웰 포함)에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 멸균 된 물로 우물을 3 번 철저히 씻으십시오 (세척 중에 생물막이 파괴되지 않습니다). 100% 에탄올 200μL를 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
- 75 μL를 새로운 96-웰 플랫 바닥 플레이트로 옮기고 OD550을 판독합니다. 생물막 형성을 (샘플의 OD550nm - 블랭크의 OD550nm)으로 정량화한다.
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Representative Results
본원에 기술된 워크플로우는 C. neoformans에 대한 잠재적인 항독성 특성을 갖는 연체동물로부터 단백질 및 펩티드의 분리를 가능하게 한다. 유사하게, 다양한 형태의 추출물(즉, 원유 및 정제)을 평가하면 잠재적인 활성 화합물의 반정제가 가능하고 다운스트림 평가(예: 질량 분석 기반 단백질체학)를 지원합니다. 일반적으로 단백질 추출 워크플로우는 단백질 농도가 4-8mg/mL인 균질화된 용액을 생성합니다. 여기에서 대표적인 결과는 C. chinensis 추출물의 효소 활성 및 항진균 특성의 평가를 보여줍니다. 조잡하고 정제된 추출물은 서브틸리신 A(C. neoformans의 독성과 관련됨)(그림 3)의 단백질 분해 활성을 억제할 수 있었으며, IC 50 값은 각각 5.3μg/mL 및 4.53μg/mL였습니다. C. chinensis 추출물의 활성은 곰팡이 성장, 캡슐 및 멜라닌 생성, 생물막 형성을 포함하여 C. neoformans 독성 인자 생산과 관련된 과정에 대해 추가로 테스트되었습니다. 미정제 (도 4A) 및 정화 (도 4B) C. chinensis 추출물의 존재 하에서 37°C에서 진균 성장의 현저한 감소가 있었다. 특히, 조잡하거나 정제된 C. chinensis 추출물의 존재 하에서 캡슐 또는 멜라닌 생성에 변화가 없었습니다(그림 4C,D). 그러나 처리되지 않은 대조군에 비해 고농도의 조추출물(그림 4E) 및 정화된(그림 4F) 추출물에서 생물막 형성에서 70%-80%의 상당한 감소가 관찰되었습니다.
그림 1: 연체동물에서 전체 단백질을 추출하기 위한 워크플로우. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)의 단백질 분해 활성, 성장 및 독성 인자 생성에 대한 연체동물 추출물의 효과를 평가하는 데 사용되는 일반 전략. DIC = 미분 간섭 대비 현미경. 나노미터(nm) 단위의 파장으로 표시된 광학 밀도 측정. BioRender.com 로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 연체동물 단백질 추출물이 서브틸리신 A의 단백질 분해 활성에 미치는 영향의 대표적인 결과 . (A) Cipangopaludina chinensis 조 추출물. (비) C. chinensis 정화 추출물. 각 점은 반복실험 횟수 3번의 평균을 나타냅니다. 막대는 표준 편차를 나타냅니다. IC50 = 절반-최대 억제 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: C. chinensis 추출물이 C. neoformans의 독성 인자 생성에 미치는 영향의 대표적인 결과. (ᄀ,ᄂ) 각각 미정제 및 정제된 C. chinensis 추출물의 존재 하에 37°C에서 C. neoformans의 성장. (C) 원유(50μg/mL) 및 정제된(40μg/mL) 추출물이 있는 상태에서 캡슐 생산을 보여주는 C. neoformans의 DIC 현미경 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (D) 30°C 및 37°C에서 원조(440μg/mL) 및 정제(410μg/mL) 추출물이 있는 상태에서 C. neoformans의 멜라닌 생성. (E,F) 각각 조 및 정제 추출물의 존재 하에서 C. neoformans의 상대적 생물막 형성. 통계 분석을 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 검정과 Dunnett의 다중 비교 검정(Dunnett's multiple comparison test)을 수행하였다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ****p < 0.0001. 각 값은 최소 5개의 생물학적 반복실험과 2개의 기술적 반복실험의 평균에 해당합니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 표시된 멜라닌 이미지는 3개의 생물학적 복제물과 2개의 기술적 복제물을 나타냅니다. 표시된 캡슐 이미지는 조건당 40-50개의 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 추출 프로토콜은 캐나다 온타리오에서 수집한 연체동물에서 화합물을 분리하는 방법을 설명하고 인간 진균 병원체인 C. neoformans에 대한 연체동물 추출물 사용에 대한 새로운 조사를 보여줍니다. 이 프로토콜은 무척추동물의 펩티다아제 억제제 활성을 조사하는 연구의 증가에 추가된다13. 추출하는 동안 일부 추출물 샘플은 필터 멤브레인을 막는 가용성 다당류 및/또는 안료의 존재로 인해 필터 멸균이 어려웠습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 먼저 5μm 멤브레인을 통해 필터링하여 큰 화합물(예: 파괴된 세포막, 게놈 DNA)을 배제하여 단백질이 필터를 통과하도록 한 다음 0.22μm 멤브레인을 통해 다시 필터링하는 것이 좋습니다. 이러한 단계는 샘플을 오염시키고 다운스트림 실험을 방해할 수 있는 미생물의 존재를 제한하기 때문에 프로토콜에 매우 중요합니다.
이 조사 동안, 펩티다아제 억제제는 서브틸리신의 S8 계열에 대한 모델 효소인 서브틸리신 A에 대해 검출되었습니다. 이 효소 패밀리의 구성원은 유기체 사이에 널리 분포되어 있으며 단백질 처리, 영양 및 독성 메커니즘과 같은 다양한 역할을 합니다21,22, 이는 이 연구에서 관찰된 표현형 효과를 뒷받침합니다. 예를 들어, 조잡하고 정제된 추출물의 존재와 상대적으로 높은 농도 및 낮은 농도에서 곰팡이 성장의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이는 억제 활성이 테스트된 모델에서 강력했음을 시사합니다. 플레이트 리더로 OD를 측정 할 때 추출물의 존재로 인해 우물 바닥에 곰팡이 세포가 응집되어 성장 측정을 방해한다는 것이 주목할 만합니다. 이러한 한계는 고속 진탕 인큐베이터(예: 900rpm)를 사용하여 극복할 수 있으며, 이는 세포 덩어리를 방지할 수 있습니다.
예상되는 표현형 관찰에 영향을 미칠 수 있는 다른 기술적 한계가 존재할 수 있습니다. 예를 들어, 서브틸리신 유사 펩티다아제는 C. neoformans에서 멜라닌 합성 및 정족수 감지와 관련이 있지만, 연체동물의 조잡하거나 정제된 추출물은 멜라닌 생성에 큰 영향을 미치지 않습니다16,17,18. 이것은 연체 동물 추출물이 곰팡이의 세포 내 성분에 영향을 미치는 것을 방지할 수 있는 외부 물질에 대한 멜라닌과 캡슐의 자연적인 보호 효과 때문일 수 있습니다. 유기 기질로 작업할 때 고려해야 할 중요한 요소에는 한천 플레이트 내에서 용해도 문제를 나타낼 수 있는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해해야 하는 필요성이 포함됩니다(멜라닌 분석에 사용됨). 이 문제를 극복하기 위해, 추출물은 한천 플레이트의 표면을 따라 퍼지고, 플레이트 상에 곰팡이 세포를 발견하기 전에 건조시킬 수 있다.
이전 연구는 암포테리신 B와 카스포펑진을 포함한 시험관 내에서 두 가지 항진균제에 대한 C. neoformans 생물막의 감수성을 입증했습니다. 그러나 곰팡이는 플루코나졸과 보리코나졸23에 내성이 있었습니다. 독성 및 항생제 내성에서 곰팡이 생물막의 중요성을 감안할 때 생물막 형성을 방해하거나 방해하는 새로운 전략을 발견하는 것이 중요할 것입니다. 현재의 연구에서, C. chinensis의 조잡하고 정제 된 추출물은 명백한 용량 반응 거동을 갖는 크립토 코카인 세포의 생물막 형성을 손상시켰다. 이러한 결과는 접근 방식의 영향과 참신함을 뒷받침합니다. 특히, 생물막 형성은 정제된 추출물에 비해 미정제로 처리했을 때 더 큰 정도로 억제되었는데, 이는 정화 과정 동안 억제 화합물의 손실 또는 시험된 조건 하에서 억제 기능의 감소로 인한 것일 수 있습니다. 이러한 억제 효과를 담당하는 단백질은 분자량이 높고 정화 과정에서 손실되었거나 열처리 중에 분해되기 쉬웠을 수 있습니다. 이러한 결과는 억제제 공급원과 관련된 차이가 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 억제 기능의 변화를 감지하기 위해 조추출물과 정제 추출물을 모두 사용하는 것의 중요성을 강조합니다.
전반적으로, 이 프로토콜은 연체동물에서 화합물을 추출하고 곰팡이 독성에서 입증된 역할을 가진 선택된 펩티다아제에 대한 추정 억제 활성의 측정을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 추출물의 높은 수율 및 강력한 펩티다아제 억제 활성과 C. neoformans 성장 및 생물막 형성에 대한 효과를 평가했습니다. 추가 실험이 필요하지만 이러한 결과는 이 위험한 곰팡이 병원체에 대한 화합물의 새로운 공급원으로 연체동물의 중요성을 강조합니다. 또한, 이 프로토콜은 연체동물에서 억제제를 추출하는 데 초점을 맞추고 있지만, 이 방법론은 다른 무척추동물에 적용할 수 있으며 곰팡이 및 박테리아를 포함한 다양한 미생물에서 독성 인자 생성에 대한 다양한 무척추동물에서 파생된 억제제의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다24,25,2 6 . 궁극적으로, 천연 자원에서 화합물을 추출하면 새로운 항균제의 레퍼토리가 증가하여 전염병 퇴치 능력이 향상 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 이 조사와 원고 피드백 전반에 걸쳐 귀중한 지원을 해준 Geddes-McAlister Lab 회원들에게 감사를 표합니다. 저자는 온타리오 대학원 장학금 및 국제 대학원 연구상 - University of Guelph에서 D.G.-G까지, 캐나다 혁신 재단(JELF 38798) 및 온타리오 대학 및 대학부 - J.G.-M에 대한 조기 연구원 상.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
