Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64662
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Arkansas

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتنفيذ الفحص المجهري التوسعي في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام مجهر متحد البؤر تقليدي للمسح بالليزر.

Abstract

العمود الفقري لعلم الأحياء التنموي هو المجهر متحد البؤر ، والذي يسمح للباحثين بتحديد التوطين ثلاثي الأبعاد للجزيئات الموسومة داخل العينات البيولوجية المعقدة. في حين أن المجاهر التقليدية متحدة البؤر تسمح للمرء بحل مصدرين متجاورين لنقطة الفلورسنت يقعان على بعد بضع مئات من النانومترات ، فإن مراقبة التفاصيل الدقيقة للبيولوجيا تحت الخلوية تتطلب القدرة على حل الإشارات بترتيب عشرات النانومترات. تم تطوير العديد من الطرق القائمة على الأجهزة للفحص المجهري فائق الدقة للسماح للباحثين بتجنب حدود الدقة هذه ، على الرغم من أن هذه الأساليب تتطلب مجاهر متخصصة غير متوفرة لجميع الباحثين. تتمثل إحدى الطرق البديلة لزيادة قوة التحليل في تكبير العينة نفسها بشكل متناحي من خلال عملية تعرف باسم الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، والتي تم وصفها لأول مرة من قبل مجموعة Boyden في عام 2015. ExM ليس نوعا من الفحص المجهري في حد ذاته ولكنه طريقة لنفخ عينة مع الحفاظ على التنظيم المكاني النسبي للجزيئات المكونة لها. يمكن بعد ذلك ملاحظة العينة الموسعة بدقة متزايدة بشكل فعال باستخدام مجهر متحد البؤر تقليدي. هنا ، نصف بروتوكولا لتنفيذ ExM في أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة ، والتي تستخدم لفحص توطين Par-3 و myosin II والميتوكوندريا داخل الخلايا الظهارية السطحية. ينتج عن هذا البروتوكول زيادة تقارب أربعة أضعاف في حجم العينة ، مما يسمح بالكشف عن التفاصيل تحت الخلوية غير المرئية باستخدام الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر. كدليل على المبدأ ، يتم استخدام جسم مضاد مضاد ل GFP لتمييز مجموعات متميزة من الميوسين-GFP بين قشرة الخلايا المجاورة ، ويستخدم الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت للكشف عن جزيئات البيوتينيل الداخلية للكشف عن التفاصيل الدقيقة لبنية شبكة الميتوكوندريا. يستخدم هذا البروتوكول الأجسام المضادة والكواشف الشائعة لوضع العلامات الفلورية ، ويجب أن يكون متوافقا مع العديد من بروتوكولات التألق المناعي الحالية.

Introduction

في بيولوجيا الخلية والتطور ، الرؤية هي الإيمان ، والقدرة على تحديد أنماط توطين البروتينات بدقة أمر أساسي للعديد من أنواع التجارب. الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر هو الأداة القياسية لتصوير البروتينات ذات العلامات الفلورية في ثلاثة أبعاد داخل عينات سليمة. المجاهر متحدة البؤر التقليدية غير قادرة على تمييز (حل) إشارات الفلورسنت المجاورة التي يفصلها أقل من نصف الطول الموجي للضوء الذي تنبعث منه1. بمعنى آخر ، يجب فصل مصدرين نقطيين بما لا يقل عن 200-300 نانومتر في الاتجاه الجانبي (500-700 نانومتر في الاتجاه المحوري) لحلها كإشارتين متميزتين. يعرف هذا الحاجز التقني باسم حد الحيود ، وهو عقبة أساسية أمام دراسات الهياكل تحت الخلوية المعقدة (على سبيل المثال ، شبكات الهيكل الخلوي أو الميتوكوندريا actomyosin) مع ميزات مكانية أقل من حد الحيود . لذلك ، فإن تقنيات زيادة قوة حل المجاهر متحدة البؤر التقليدية ذات أهمية عامة للمجتمع البيولوجي.

لتجنب حد الحيود ، تم تطوير عدد من تقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة المختلفة التي تسمح بالدقة في حدود عشرات النانومتر أو أقل من 1،2،3 ، مما يكشف عن عالممن التعقيد البيولوجي الذي كان يمكن الوصول إليه سابقا فقط عبر المجهر الإلكتروني. على الرغم من المزايا الواضحة لهذه الأساليب القائمة على الأجهزة ، غالبا ما يكون للمجاهر فائقة الدقة متطلبات محددة لوضع العلامات على العينات وأوقات اكتساب طويلة ، مما يحد من مرونتها ، أو قد تكون ببساطة باهظة الثمن بالنسبة لبعض المختبرات للوصول إليها. بديل للدقة الفائقة القائمة على المجهر هو الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، وهو ليس نوعا من الفحص المجهري في حد ذاته ولكنه بالأحرى طريقة لنفخ العينة مع الحفاظ على التنظيم المكاني النسبي للجزيئات المكونة لها4. يمكن بعد ذلك ملاحظة العينات الموسعة الخواص بدقة متزايدة بشكل فعال باستخدام مجهر متحد البؤر مضان تقليدي. تم وصف ExM لأول مرة من قبل مجموعة Boyden في عام 20155 ، ومنذ ذلك الحين تم تكييف التقنية الأساسية للاستخدام في مجموعة متنوعة من التجارب6،7،8. كما تم تكييف ExM للاستخدام في الأجنة الكاملة ، لا سيما في ذبابة الفاكهة9،10،11 ، C. elegans12 ، و الزرد 13 ، مما يجعلها أداة قوية لعلماء الأحياء التنموية.

يعتمد ExM على اثنين من كيمياء الهيدروجيل المختلفة: 1) الهلاميات المائية متعددة الإلكتروليت القابلة للانتفاخ ، والتي تزداد بشكل كبير في الحجم عند نقعها في الماء14 ، و 2) الهلاميات المائية بولي أكريلاميد ، والتي لها تباعد بوليمر صغير للغاية للسماح بتوسيع عينة الخواص15. في حين أن هناك العديد من بروتوكولات ExM المنشورة ، إلا أنها تشترك بشكل عام في الخطوات التالية: تثبيت العينة ، ووضع العلامات ، والتنشيط ، والهلام ، والهضم ، والتوسع4. ستختلف ظروف التثبيت واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية بالطبع بناء على احتياجات التجربة والنظام ، وفي بعض البروتوكولات ، يحدث وضع العلامات بعد التوسع. يجب تحضير (تنشيط) الجزيئات المستهدفة في العينة للارتباط بالهيدروجيل ، والذي يمكن تحقيقه باستخدام مواد كيميائية مختلفة4. أثناء خطوات الهلام ، يتم تشبع العينة بمونومرات هيدروجيل المستقبل (أكريلات الصوديوم ، والأكريلاميد ، وبيساكريلاميد الرابط المتقاطع) ، ثم يتم تشكيل الهيدروجيل عن طريق بلمرة الجذور الحرة التي يحفزها بادئ ، مثل كبريتات الأمونيوم (APS) ، ومسرع ، مثل رباعي ميثيلين ديامين (TEMED) 4. بعد الهلام ، يتم هضم العينة إنزيميا لتجانس مقاومة العينة للتورم وضمان التمدد الخواص للهيدروجيل4. أخيرا ، يتم وضع الهيدروجيل المهضوم في الماء ، مما يؤدي إلى توسيعه إلى ما يقرب من أربعة أضعاف حجمه الخطي الأصلي4.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على الفحص المجهري التمددي في أجنة ذبابة الفاكهة . ExM هو بروتوكول متعدد الخطوات يستغرق إكماله 4 أيام على الأقل. جمع الأجنة ، والتثبيت ، و devitellinization يستغرق 1 يوم أو أكثر اعتمادا على ما إذا كان يتم تجميع الأجنة من مجموعات متعددة. يستغرق وضع العلامات المناعية 1 يوم أو 2 أيام اعتمادا على ما إذا كانت الأجنة يتم تحضينها بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية. يمكن إجراء تنشيط الجنين ، والهلام ، والهضم ، والتوسع في يوم واحد. يمكن تركيب المواد الهلامية وتصويرها مباشرة بعد التمدد ، على الرغم من أنه لأسباب عملية غالبا ما يكون من المستحسن بدء التصوير في اليوم التالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء ExM على أجنة ذبابة الفاكهة كاملة التركيب في وقت مبكر إلى منتصفالمرحلة 16 لتصور أنماط توطين البروتين تحت الخلوي بدقة فائقة (الشكل 1). تستخدم هذه الطريقة كيمياء حمض الميثيل أكريليك N-hydroxysuccinimidyl ester (MA-NHS) لتنشيط جزيئات البروتين وتثبيتها في الهيدروجيل17 ، وهو تعديل لبروتوكول ExM المنشور مسبقا للاستخدام في أجنة وأنسجة ذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة 11. يستخدم هذا البروتوكول آبار polydimethylsiloxane (PDMS) لتشكيل الهلاميات المائية وتسهيل تبادل المحلول أثناء التنشيط والهلام. تتضمن الطريقة البديلة التي لا تتطلب إنشاء آبار PDMS خفض الأجنة المرتبطة بأغطية الأغطية إلى قطرات من محلول المونومر الموجود على قطعة من فيلم ختمالمختبر 22. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة لإزالة غشاء vitelline غير المنفذ الذي يحيط بأجنة ذبابة الفاكهة يدويا ، وهو شرط أساسي لتلطيخ التألق المناعي. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام طريقة تقشير الأجنة يدويا لاختيار أجنة ذبابة الفاكهة التي تم تنظيمها بشكل صحيح فقط قبل وضع العلامات على العينات ، مما يزيد بشكل كبير من احتمال أن ينتهي الأمر بعينات موسعة من المرحلة والاتجاه الصحيحين ، وبالتالي ، يجعل جمع البيانات النهائية أكثر كفاءة.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات جامعة أركنساس (UARK) للبحث عن الحيوانات اللافقارية ، مثل ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية UARK (البروتوكول # 20001).

1. تثبيت جنين ذبابة الفاكهة وانحرافها

ملاحظة: تصف الخطوة 1 إجراء (تقشير اليدين) للإزالة اليدوية لغشاء vitelline ، وهو غشاء شفاف غير منفذ يحيط بالجنين. الأهم من ذلك ، أن تقشير اليدين يسمح باختيار الأجنة المرحلية بشكل صحيح في بداية بروتوكول ExM ، مما يعزز بشكل كبير من احتمالية الحصول على الأجنة في اتجاه قابل للاستخدام في نهاية بروتوكول ExM. ومع ذلك ، فإن بروتوكول ExM هذا متوافق تماما مع جمع الأجنة السائبة والإجراءات القياسية لإزالة غشاء vitelline القائم على الميثانول ، وفي هذه الحالة يمكن للمرء أن ينتقل مباشرة إلى الخطوة 2 (وضع العلامات المناعية).

  1. إعداد أو شراء عدد من الإبر الزجاجية الدقيقة. الأبعاد الفعلية لطرف الإبرة ليست حرجة ، ولكن تأكد من أن الإبر صلبة وحادة بما يكفي لاختراق أغشية فيتيلين للأجنة الثابتة. اصنع إبرا من أنابيب شعرية زجاجية (قطر خارجي 1 مم ، قطر داخلي 0.75 مم) باستخدام مجتذب دقيق ، حيث يقوم المرء بإعداد الإبر للحقن المجهري للأجنة18 ؛ بدلا من ذلك ، قم بشراء الإبر المسحوبة مسبقا.
  2. جمع الأجنة باستخدام تقنيات ذبابة الفاكهة القياسية19 عن طريق وضع >100 ذبابة الفاكهة البالغة في كوب بلاستيكي منفيس مختوم بعصير فاكهة / طبق أجار20. استخدم نوافذ التجميع الموقوتة لإثراء أجنة المرحلةالمناسبة 16. على سبيل المثال ، لإثراء مراحل المعدة (المرحلة 6) والتمديد المتقارب (المرحلة 7) ، قم بتغيير طبق عصير الفاكهة ، وجمع الأجنة لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية ، ثم قم بإزالة اللوحة ، وعمرها لمدة ساعتين أخريين عند 25 درجة مئوية للحصول على أجنة عمرها ~ 2-4 ساعات.
  3. لإزالة المشيم الشبيه بقشر البيض من الأجنة ، قم بتغطية سطح ألواح عصير الفاكهة بنسبة 50٪ مبيض (الجدول 1) ، ثم حرر الأجنة من سطح الآجار عن طريق تحريكها بفرشاة رسم صغيرة ، وانتظر 3 دقائق حتى يذوب المشيم.
  4. نقل الأجنة المنزوعة الأيونات باستخدام فرشاة الرسم إلى قنينة تلألؤ سعة 30 مل تحتوي على 4 مل من الهيبتان (المرحلة العليا العضوية) و 4 مل من محلول التثبيت (المرحلة السفلية المائية؛ الجدول 1). قم بتخفيف الفورمالديهايد حديثا من مرق طازج أو تم فتحه مؤخرا ، واخلطه مع 10x PBS والماء منزوع الأيونات مباشرة قبل إضافة الأجنة.
    ملاحظة: تحضير الفورمالديهايد من قوة بارافورمالدهايد أو 16٪ فورمالديهايد من الدرجة EM في أمبولات زجاجية. يمكن استخدام مخزون الفورمالديهايد المركز (على سبيل المثال ، 37٪ فورمالديهايد) ، على الرغم من أن النتائج قد تكون أقل اتساقا.
  5. سوف تتراكم الأجنة عند السطح البيني بين المرحلتين العضوية والمائية. أضف أكبر عدد ممكن من الأجنة التي ستشكل طبقة واحدة في الواجهة. إذا تمت إضافة عدد كبير جدا من الأجنة إلى قارورة ، فلن يتم إصلاحها أيضا.
  6. باستخدام شريط قوي ، شل قوارير التلألؤ على جوانبها على شاكر منضدية ، وقم بتحريكها لمدة 20 دقيقة عند 220 دورة في الدقيقة. للتثبيت الأمثل ، حافظ على مستحلب قوي بين المرحلتين العضوية والمائية أثناء التثبيت بأكمله.
  7. أثناء وقت التثبيت ، قم بإعداد واحد مما يلي لكل عينة.
    1. خذ قاعدة طبق بتري بلاستيكية 6 سم مملوءة في منتصف الطريق بأجار 3٪ وسجل مستطيلا ~ 5 سم × 3 سم في الآجار بشفرة حلاقة أو مشرط. يمكن أيضا استخدام عصير الفاكهة / ألواح الآجار لهذا الغرض.
    2. باستخدام ملعقة مختبر صغيرة ، قم بإزالة لوح أجار. اقلب قاعدة طبق بتري ، وضعه على مقاعد البدلاء. ضع لوح أجار أعلى الطبق المقلوب (الشكل 2 أ).
    3. خذ غطاء طبق بتري وتأكد من جفافه. ارتداء القفازات ، ضع قطعة من الشريط على الوجهين داخل الغطاء (يجب أن تكون قطعة الشريط أكبر قليلا من لوح أجار ؛ الشكل 2 ب).
  8. قم بإزالة القوارير من شاكر ، وضعها في وضع مستقيم على المقعد ، والسماح للمراحل العضوية والمائية بالانفصال. ستبقى الأجنة الثابتة بشكل صحيح في الواجهة بين المرحلتين.
  9. انقل الأجنة المثبتة إلى لوح أجار باستخدام ماصة باستور زجاجية مزودة بمصباح من اللاتكس. لمنع الأجنة من الالتصاق بداخل الماصة ، حاول إبقاء الأجنة داخل عنق الماصة الضيق ، ونقل الأجنة على دفعات صغيرة متعددة بدلا من كلها مرة واحدة. بمجرد أن تصبح جميع الأجنة على لوح الآجار ، قم بإزالة معظم الهيبتان المتبقي من حول الأجنة باستخدام ماصة P200. نفذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن (<3 دقائق) لتجنب جفاف الأجنة الثابتة ، مما قد يؤثر سلبا على التشكل.
  10. من ارتفاع ~ 2 سم ، أسقط الغطاء بالشريط على الوجهين على لوح أجار للصق الأجنة بالشريط (الشكل 2 ج). قم بإزالة الغطاء برفق من لوح أجار ، وضعه رأسا على عقب على المقعد ، ثم أضف ما يكفي من PBS-Tween (الجدول 1) لتغطية الأجنة في الغطاء.
  11. باستخدام مجهر تشريح ستيريو عند تكبير 100x تقريبا مع إضاءة غير مباشرة ، حدد الأجنة التي تم تنظيمها بشكل صحيح باستخدام العلامات المورفولوجية. بالنسبة للأجنة في المرحلة 6 ، استخدم علامات مثل ثلم رأسي مرئي وأديم متوسط مغزوح. بالنسبة لأجنة المرحلة 7 ، استخدم علامات مثل الشريط الجرثومي الممتد ؛ بالنسبة لأجنة المرحلة 11 ، استخدم علامات مثل الشريط الجرثومي الممتد بالكامل والتجزئة المرئية على طول المحور16 من الرأس إلى الذيل.
    1. لجمع الأجنة المرغوبة ، قم أولا بوخز الغشاء الزجاجي (غشاء بيضاوي شفاف حول الجنين) بالقرب من الطرف الأمامي أو الخلفي للجنين بإبرة زجاجية دقيقة. سوف ينكمش الغشاء قليلا مع إطلاق الضغط. ثم ، باستخدام ملقط دقيق أو مسبار معدني ، ادفع الجنين برفق على الطرف الآخر من خلال الفتحة ؛ سيبقى غشاء vitelline ملتصقا بالشريط على الوجهين. اترك الأجنة غير المرغوب فيها ملتصقة بالشريط.
  12. اجمع بشكل دوري الأجنة المنحرفة العائمة باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، وانقلها إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل.
  13. عند هذه النقطة، قم بتنفيذ إحدى الخطوات التالية.
    1. تابع مباشرة إلى خطوات وضع العلامات المناعية. يمكن أن تذهب الأجنة المنحرفة مباشرة إلى محلول الحجب (الخطوة 2.2). لا تسمح للأجنة بالبقاء في PBS-Tween أو محلول مانع (الجدول 1) لمدة تزيد عن 16 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    2. نقل الأجنة إلى الميثانول لتخزينها. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS-Tween ، ثم أضف 1 مل من الميثانول. بمجرد استقرار الأجنة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الميثانول ، وأضف 1 مل من الميثانول الطازج. قم بتخزين الأجنة في درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. يسمح تخزين الميثانول أيضا بتجميع الأجنة من مجموعات متعددة.

2. وضع العلامات المناعية

ملاحظة: بصرف النظر عن خطوات حضانة الأجسام المضادة ، فإن كميات السوائل الدقيقة والأوقات ليست حرجة في هذا القسم. لإجراء شطف أو غسل ، اسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الأنبوب ، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل دون امتصاص الأجنة ، ثم إضافة ~ 1 مل من السائل الجديد ؛ استخدم ماصة باستور الزجاجية المزودة بمصباح لاتكس للحصول على الوضوح والتحكم الأمثل. بالنسبة لخطوة الشطف ، لا تهتز الأجنة ، فقط يسمح لها بالاستقرار ؛ بالنسبة لخطوة الغسيل ، يتم هز الأجنة على مغذي للفترة الزمنية المحددة ثم يسمح لها بالاستقرار.

  1. إذا لم يتم تخزين الأجنة في الميثانول ، فانتقل إلى الخطوة 2.2. إذا تم تخزين الأجنة في الميثانول ، اشطفها مرتين باستخدام PBS-Tween ، ثم اغسلها لمدة 20 دقيقة مرتين باستخدام PBS-Tween.
  2. اغسل الأجنة لمدة 30-60 دقيقة في 1 مل من محلول الحظر.
  3. احتضان الأجنة بالأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الأجسام المضادة (الجدول 1) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو يفضل طوال الليل عند 4 درجات مئوية. نفذ هذه الخطوة في أصغر حجم ممكن (50-300 ميكرولتر) للحفاظ على الأجسام المضادة الأولية ؛ هزاز على nutator ليست مطلوبة بدقة.
    1. زيادة كمية الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في تجربة التألق المناعي النموذجية بنسبة 50٪ على الأقل ل ExM. استخدم تركيزات الأجسام المضادة الأولية التالية: 1: 200 لخنزير غينيا متعدد النسيلة المضاد ل Par-3و 1 : 100 للأرانب متعددة النسيلة المضادة ل GFP.
  4. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي (احفظه عند 4 درجات مئوية إذا رغبت في ذلك) ، واشطفه مرتين باستخدام PBS-Tween ، ثم اغسله لمدة 15 دقيقة أربع مرات باستخدام PBS-Tween.
  5. احتضان الأجنة بأجسام مضادة ثانوية فلورية في حجم نهائي قدره 300 ميكرولتر (مخفف في محلول الأجسام المضادة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على مغذي. يمكن إضافة الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت خلال هذه الخطوة. من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بحماية الأجنة من التعرض المفرط والمطول للضوء عندما يكون ذلك ممكنا ، على سبيل المثال عن طريق تغطية الأنابيب بغطاء صندوق غير شفاف أو الاحتفاظ بالعينات في درج.
    1. استخدم التركيزات التالية: 1: 500 للأرانب IgG الماعز متعدد النسيلة المنصهر في Alexa Fluor 488 ؛ 1: 500 لخنزير غينيا المضاد IgG الماعز متعدد النسيلة المنصهر في Alexa Fluor 568 ؛ و 1: 1000 للستربتافيدين أليكسا فلور 488.
  6. إزالة والتخلص من محلول الأجسام المضادة الثانوية. شطف الأجنة مرتين مع PBS-Tween ، واغسل لمدة 15 دقيقة أربع مرات مع PBS-Tween.
  7. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية في الظلام ولكن معالجة العينات في أسرع وقت ممكن (<24 ساعة).

3. إعداد آبار PDMS

ملاحظة: يمكن إجراء آبار PDMS حتى 2 أسابيع مقدما.

  1. اضبط حاضنة أو صفيحة تسخين على 55 درجة مئوية ، واضبط جهاز طرد مركزي يمكنه تدوير الأنابيب المخروطية إلى 15 درجة مئوية.
  2. لتحضير محلول PDMS (الجدول 1) ، ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل في وعاء ثانوي على مقياس ، وأضف 10 جم من قاعدة المطاط الصناعي السيليكوني إلى الأنبوب باستخدام حقنة. ثم ، أضف 1 غرام من عامل علاج المطاط الصناعي السيليكوني ، واقلب الأنبوب عدة مرات للخلط.
  3. قم بإنشاء أنبوب توازن عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء إلى أنبوب مخروطي ثان سعة 50 مل. قم بطرد محلول PDMS عند 500 × جم لمدة 3 دقائق عند 15 درجة مئوية ، ثم اسكبه في طبق بتري 10 سم على عمق ~ 1 مم. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الفقاعات عن طريق النفخ برفق على المحلول بخرطوم هواء. اسمح لمحلول PDMS بالتصلب طوال الليل عند 55 درجة مئوية.
  4. بمجرد تصلب لوح PDMS ، باستخدام مشرط ، قم بتسجيل مساحات مربعة أصغر قليلا من غطاء 22 مم × 22 مم. داخل كل مربع ، قم بتسجيل وإزالة بئر مربع بعرض ~ 8 مم.
  5. انقل كل PDMS مربع جيدا على غطاء مقاس 22 مم × 22 مم ، وقم بلصقه بإحكام (الشكل 2 د). يجب أن ينتج عن تحضير ستة أغطية أو أكثر عددا كبيرا من الأجنة الموسعة للتصوير.

4. التصاق الأجنة بأغطية الأغطية

  1. ضع ما يكفي من 0.1٪ بولي-إل-ليسين لتغطية سطح الغطاء داخل كل بئر (~ 50 ميكرولتر) ، وضعها في حاضنة 55 درجة مئوية لتجف في الهواء. كرر هذه الخطوة لزيادة الالتصاق.
  2. اشطف الأجنة لفترة وجيزة مرة واحدة في 1x PBS لإزالة منظف Tween ، ثم انقل >10 أجنة إلى كل من الآبار المطلية ب poly-L-lysine.
  3. اسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الآبار. قم بإزالة السائل الزائد من الأجنة الملتصقة باستخدام ماصة باستور. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.

5. التنشيط والهلام

ملاحظة: يشير التنشيط إلى إضافة MA-NHS إلى الأجنة ، والتي ستعدل بروتينات العينة والأجسام المضادة حتى تتمكن من الارتباط بالهيدروجيل. يشير الهلام إلى توليد هيدروجيل داخل وحول الأجنة في كل بئر. أثناء الهلام ، تتخلل الأجنة بمحلول مونومر ثم تعالج بمحلول جيلي لتكوين الهيدروجيل.

  1. تنشيط الأجنة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة عن طريق ملء الآبار بمحلول التنشيط (1 mMM MA-NHS المخفف حديثا في 1x PBS ؛ الجدول 1). قم بتغيير هذا الحل كل 10 دقائق تقريبا على مدار 1 ساعة.
  2. شطف الأجنة مع 1x PBS ثلاث مرات. احتضان الأجنة في محلول مونومر (الجدول 1) لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. أثناء جلوس الأجنة في محلول المونومر ، قم بإعداد محلول الهلام (الجدول 1). يعد تحضير ~ 2 مل من محلول الهلام كافيا لتغطية آبار PDMS من طبق بتري كامل 10 سم. تأكد من إضافة APS أخيرا ، حيث سيبدأ البلمرة ويبدأ الهلام.
    1. قم بتخفيف المؤكسد الحفاز حديثا من المسحوق (على سبيل المثال ، 1٪ TEMPO w / v في الماء). اجمع بين 1960 ميكرولتر من محلول المونومر مع 30 ميكرولتر من 10٪ TEMED و 10 ميكرولتر من 1٪ TEMPO.
    2. لتجنب بلمرة الدفعة الكاملة من محلول الهلام دفعة واحدة ، اعمل على دفعات صغيرة. قسم محلول الهلام (بدون APS) إلى حصص 125 ميكرولتر بين الأنابيب الثمانية لشريط PCR.
    3. قم بإزالة محلول المونومر من آبار PDMS الثلاثة باستخدام فراغ مع الحرص على عدم تعطيل الأجنة. أضف 5 ميكرولتر من APS إلى أحد أنابيب PCR التي تحتوي على محلول الهلام لبدء البلمرة. قم بتوزيع محلول البلمرة بسرعة بين الآبار (~ 40 ميكرولتر لكل بئر). كرر هذا حتى يتم تغطية جميع الآبار والأجنة.
  4. دع العينات تتكاثر لمدة 1.5-2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بتحريك الهلاميات المائية بين الحين والآخر لمراقبة البلمرة. الهلاميات المائية الصلبة لن تذبذب. سوف تستغرق الهلاميات المائية السميكة وقتا أطول لإكمال البلمرة والتصلب.

6. الهضم والتوسع

ملاحظة: سوف يستغرق المواد الهلامية السميكة والأكبر وقتا أطول للتوسع ، وقد يستغرق مركز المواد الهلامية عدة ساعات للتوسع تماما ؛ يمكن تسريع ذلك عن طريق تقليم حواف الجل. مع توسع المواد الهلامية ، سيصبح معامل انكسارها مطابقا تقريبا لمؤشر الماء ، وسيصبح من الصعب جدا رؤيتها.

  1. بعد اكتمال الهلام ، قشر آبار PDMS من غطاء الغطاء مع محاولة عدم إزعاج الهلاميات المائية. قطع المواد هيدروجيل الزائدة ، إذا رغبت في ذلك.
  2. انقل الهلاميات المائية (التي لا تزال متصلة بأغطية الغطاء) بشكل فردي إلى آبار صفيحة من ستة آبار (الشكل 2E). لاحظ أن الهلاميات المائية قد تتوسع قليلا أثناء الهضم.
  3. قم بتغطية المواد الهلامية بالكامل بمحلول الهضم (الجدول 1) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بشكل عام ، 30 مل من محلول الهضم يكفي لتغطية المواد الهلامية في لوحة 6 آبار.
  4. بعد الهضم ، انقل كل هيدروجيل على حدة إلى طبق بتري 6 سم عن طريق تحريكه من الغطاء. قد يكون من الضروري استخدام غطاء ثان لإزاحة الجل. املأ كل طبق بتري بالماء منزوع الأيونات لتوسيع الجل. قم بتغيير الماء ثلاث إلى أربع مرات على مدار 1-2 ساعة حتى يتم توسيع المواد الهلامية بالكامل (توقع زيادة تقريبية في العرض بمقدار أربعة أضعاف).

7. التركيب والتصوير

ملاحظة: تتكون الهلاميات المائية الموسعة بالكامل تقريبا من الماء، مما يجعلها شفافة تقريبا وهشة للغاية. يمكن التلاعب بالمواد الهلامية باستخدام أغطية طويلة لتحريكها والتقاطها. قم بتركيب وتصوير واحد أو اثنين فقط من المواد الهلامية في كل مرة ، حيث ستطلق المواد الهلامية الماء تدريجيا وتبدأ في الانزلاق حول غطاء الغطاء.

  1. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء الزائد من طبق بتري لتقليل المواد الهلامية التي تتحرك عند التعامل معها.
  2. قم بمناورة كل هلام موسع ، مع وضع الأجنة على السطح السفلي ، على غطاء كبير (على سبيل المثال ، 24 مم × 40 مم) للتصوير.
  3. قم بتركيب كل غطاء باستخدام الجل على هدف مجهر متحد البؤر مقلوب للمسح بالليزر. حدد موقع العينات التي تم تنظيمها وتوجيهها بشكل صحيح باستخدام أوضاع الفحص المجهري epifluorescence أو brightfield على المجهر مع أهداف جوية منخفضة التكبير (5x أو 10x) أو متوسطة التكبير (20x).
  4. للتصوير بدقة عالية، قم بالتبديل إلى هدف التكبير العالي (60x أو 63x أو 100x) للغمر بالزيت أو الماء. يجب أن يكون سطح الأجنة ضمن نطاق تركيز الهدف (<300 ميكرومتر من غطاء الغطاء لهدف 63x) حتى يتم تصويره.
  5. اجمع البيانات من العينات باستخدام وضع المسح البؤري بالليزر على المجهر. تأكد من جمع الصور غير المشبعة ذات النطاق الديناميكي الجيد ، واستخدم عددا مناسبا من وحدات البكسل لكل صورة لالتقاط أقصى قدر ممكن من المعلومات حول العينة23.

Figure 2
الشكل 2: الانحراف اليدوي والعمل مع الهلاميات المائية . (أ) قطع لوح أجار من طبق أجار / عصير فاكهة. (ب) وضع شريط لاصق على الوجهين داخل غطاء طبق بتري طوله ٦ سم. ج: لصق الأجنة بالغطاء المسجل. (د) لوح PDMS مع بئر مربع ملتصق بغطاء 22 مم × 22 مم. (ه) غطاء مع بئر PDMS داخل لوحة 6 آبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

لتوصيف الفعالية العامة ل ExM في أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة ، تم قياس طول الجنين على طول المحور من الرأس إلى الذيل في أجنة التحكم غير الموسعة مقابل الأجنة الموسعة (الشكل 3A-C). تعرضت الأجنة الضابطة غير الموسعة لنفس ظروف التثبيت وخطوات وضع العلامات المناعية مثل الأجنة الموسعة، باستثناء أنها تم تركيبها باستخدام وسط تركيب صلب قبل التصوير. امتدت الأجنة الفردية غير الموسعة إلى ما يقرب من نصف مجال الرؤية عند استخدام هدف 10x (الشكل 3 أ). على النقيض من ذلك ، امتدت الأجنة الموسعة إلى مجالين كاملين تقريبا للرؤية عند استخدام نفس الهدف 10x (الشكل 3B). لتقييم كيفية اختلاف درجة التوسع داخل التجارب وفيما بينها ، تم إجراء نفس بروتوكول ExM في ثلاث مناسبات منفصلة ، وتم قياس طول الجنين في ثلاث مواد هلامية مختلفة في كل تجربة فردية. كان متوسط طول الأجنة الضابطة غير الموسعة من الرأس إلى الذيل 398.8 ميكرومتر (الانحراف المعياري [SD] = 22.93 ميكرومتر ؛ ن = 74 ؛ الشكل 3 ج). بالنسبة للتجربة 1 والتجربة 2 والتجربة 3 ، كان متوسط أطوال الأجنة 1,596 ميكرومتر (SD = 159.9 ميكرومتر ؛ ن = 57) ، 1,868 ميكرومتر (SD = 150.5 ميكرومتر ؛ ن = 51) ، و 1,954 ميكرومتر (SD = 120.3 ميكرومتر ؛ ن = 44) ، على التوالي ، وهو ما يمثل عوامل تمدد 4.0 أضعاف و 4.7 أضعاف و 4.9 أضعاف على التوالي (الشكل 3C). كان الاختلاف داخل التجربة بين المواد الهلامية أقل وضوحا بكثير من الاختلاف بين التجارب ، والذي كان حوالي 20 ٪ (الشكل 3C). لتقييم آثار ExM على مورفولوجيا الخلايا والأجنة ، تم استخدام جسم مضاد ضد مكون تقاطع adherens Par-3 (Bazooka) 21 لتسمية أغشية الخلايا القمية ، وقمنا بتصوير أجزاء الفم النامية من أجنة ذبابة الفاكهة في المرحلة 11 - وهي مرحلة ذات بنية مجزأة معقدة (الشكل 3D-F). في عينة التحكم ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 4.76 ميكرومتر (SD = 1.053 μm ، n = 25 ؛ الشكل 3D ، F). في العينات الموسعة المصورة باستخدام نفس الهدف 40x وعامل التكبير (1x) ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 19.10 ميكرومتر (SD = 3.966 μm ، n = 18 ؛ الشكل 3E ، F) ، يمثل توسعا بمقدار 4.0 أضعاف. لذلك ، تمشيا مع التقارير السابقة11 ، تمكنا من توسيع أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة التركيب بحوالي أربعة أضعاف في الأبعاد الخطية باستخدام ExM دون تمزق العينة أو تشوهات واضحة في مورفولوجيا الخلايا أو الأنسجة.

Figure 3
الشكل 3: تمدد أجنة ذبابة الفاكهة بمقدار أربعة أضعاف. (أ) أجنة ذبابة الفاكهة غير الموسعة و (ب) الموسعة المصورة باستخدام هدف 10x (0.3 NA) عند تكبير 1x. يشار إلى حقول الرؤية الفردية (FOV) بخطوط متقطعة. عبرت الأجنة عن نسخة موسومة ب GFP من سلسلة ضوء الميوسين وكانت ملطخة بجسم مضاد ل GFP. (ج) التحديد الكمي لطول الجنين (على طول المحور من الرأس إلى الذيل) في ثلاث هلاميات مائية لكل تجربة ومن ثلاث تجارب ExM منفصلة مقارنة بالضوابط غير الموسعة. (د، ه) تم تصوير الأجزاء الفكية من (D) غير الموسعة و (E) الأجنة الموسعة من ذبابة الفاكهة في المرحلة 11 باستخدام هدف 40x (1.3 NA) عند تكبير 1x. تم الكشف عن الخطوط العريضة للخلية (تقاطعات الالتصاق) باستخدام جسم مضاد مضاد Par-3 / Bazooka (أبيض). (و) القياس الكمي لعرض الخلية (المحور الطويل) من مجموعات الخلايا المتكافئة من (د) و(ه). تظهر المخططات المربعة في (C) و (F) النطاقات المئوية 25 و 50 و 75 ؛ تشير الشعيرات إلى القيم الدنيا والقصوى ؛ تشير الرموز "+" إلى المتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لإثبات أنه يمكن استخدام ExM لحل التفاصيل تحت الخلوية تحت حد الحيود النموذجي ، تم تصوير الهيكل الخلوي actomyosin في سيطرة غير موسعة مقابل الأجنة الموسعة التي تخضع لتمديد متقارب (المرحلة 7). يتم التحكم إلى حد كبير في أحداث إعادة تشكيل الأنسجة من المعدة والتمديد المتقارب من خلال التغيرات في توطين البروتين الحركي myosin II24. ومع ذلك ، في الظهارة العمودية المكتظة بكثافة في الأديم الظاهر لذبابة الفاكهة المبكرة ، من الصعب ملاحظة العديد من التفاصيل الدقيقة لنمط توطين الميوسين II ، حتى عند تصويرها بتكبير 158x (هدف 63x مع تقريب بصري 2.5x) - قوة حل قصوى نموذجية لمجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. على سبيل المثال ، نظرا لأن الميوسين الثاني هو بروتين قشري (يقع مباشرة أسفل غشاء البلازما) ، فإن برك الميوسين II25 الموجودة على جانبي ملامسات الخلايا الخلوية لم تكن قابلة للحل في أجنة المرحلة 7 ، وظهرت كخط واحد حيث تلتقي الخلايا المجاورة (الشكل 4 أ). على النقيض من ذلك ، في أجنة المرحلة 7 الموسعة ، يمكن ملاحظة خطوط متوازية من الميوسين II عند تقاطعات الخلايا الخلوية ، والتي تمثل تجمعات البروتين القشري في الخلايا المجاورة (الشكل 4B). كانت المسافة بين خطوط الميوسين II المتوازية في العينات الموسعة 892.7 نانومتر (SD = 0.171 نانومتر ، ن = 12) ؛ عند القسمة على أربعة ، ينتج عن هذا مسافة متوقعة تبلغ ~ 220 نانومتر بين خطوط الميوسين في الخلايا المجاورة في الأجنة غير الموسعة ، وهو في الواقع أقل بقليل من حد الحيود للإشارة المكتشفة باستخدام Alexa 488 (ذروة انبعاث ~ 520 نانومتر / 2 = 260 نانومتر).

بالإضافة إلى ذلك ، اختبرنا أيضا ما إذا كان يمكن استخدام ExM لحل بنية شبكة الميتوكوندريا في الخلايا المعبأة بكثافة من أجنة ذبابة الفاكهة المعدة (المرحلة 6). ترتبط وظيفة الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا ببنية الشبكة (أي العضيات المنصهرة مقابل العضيات المجزأة) ، ولكن من الصعب تصور تفاصيل تنظيم شبكة الميتوكوندريا باستخدام المجهر التقليدي متحد البؤر في أنواع الخلايا غير المسطحة و / أو الرقيقة. الميتوكوندريا غنية بشكل طبيعي بجزيئات البيوتينيل، وبالتالي، يمكن تسمية الميتوكوندريا في جنين ذبابة الفاكهة المبكر باستخدام ستربتافيدين26 المسمى بالفلورسنت. في أجنة المرحلة 6 غير الموسعة الموسومة ب streptavidin-Alexa 488 ، ظهرت الإشارة على شكل نقطية سيتوبلازمية غالبا ما كانت متداخلة ويصعب حلها (الشكل 4C). على النقيض من ذلك ، في أجنة المرحلة 6 الموسعة ، كانت العديد من التفاصيل الدقيقة لشبكة الميتوكوندريا مرئية وكانت النقاط قابلة للحل بسهولة أكبر (الشكل 4D)26,27. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام ExM لدراسة تنظيم شبكة الميتوكوندريا في أنواع الخلايا غير المناسبة تقليديا لتحليل الميتوكوندريا.

Figure 4
الشكل 4: تفاصيل الهيكل الخلوي للأكتوميوسين والميتوكوندريا التي تم الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري للتمدد. (أ ، ب) توطين الميوسين II في خلايا الأديم الظاهر العصبي (النطاق الجرثومي) المصور بهدف 63x (1.4 NA) عند تكبير 2.5x في المرحلة 7 (A) الأجنة غير الموسعة و (B) الموسعة. تم الكشف عن الميوسين الثاني في الأجنة التي تعبر عن نسخة معدلة وراثيا موسومة ب GFP من سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين II (sqh-GFP) ، والتي تم اكتشافها بجسم مضاد ل GFP (أحمر). يمكن حل برك مميزة من الميوسين القشري الموجود في الخلايا المجاورة في الجنين الموسع (الأسهم البيضاء). (ج، د) تم تصوير شبكات الميتوكوندريا في خلايا الأديم الظاهر العصبي بهدف 63× (1.4 NA) عند تكبير 2.5x في المرحلة 6 من الأجنة غير الموسعة (C) والموسعة (D). تم الكشف عن الميتوكوندريا باستخدام streptavidin-Alexa 488 (أخضر) ، وتم الكشف عن الخطوط العريضة للخلية باستخدام جسم مضاد مضاد ل Par-3 / Bazooka (أرجواني). أجريت التجارب باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات الحل. تكوين الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول بترتيب المظهر. جميع الأسهم سوائل ما لم يذكر خلاف ذلك. تم إعادة تعليق المواد الكيميائية أو تخفيفها في المياه المصفاة المعقمة ما لم يذكر خلاف ذلك. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

الانحراف اليدوي
تتضمن معظم بروتوكولات تثبيت جنين ذبابة الفاكهة إزالة غشاء فيتيلين عن طريق هز الأجنة الثابتة في مستحلب من الميثانول والهيبتان ، مما يؤدي إلى انفجار الأغشية عن طريق التمزق التناضحي26. في حين أن الانحراف القائم على الميثانول (فرقعة الميثانول) فعال ومناسب للعديد من التطبيقات ، فإن الانحراف اليدوي (التقشير اليدوي) يوفر بعض المزايا المهمة. أولا ، يسمح التقشير اليدوي للمرء باختيار الأجنة المرحلية بدقة لتقسيمها وجمعها ، مما يزيد بشكل كبير من احتمالية الحصول على أجنة موسعة في اتجاه قابل للاستخدام في نهاية التجربة. هذا التخصيب أمر بالغ الأهمية عند دراسة جوانب محددة من عمليات النمو السريع (على سبيل المثال ، غزو الأديم المتوسط أو التمديد المتقارب) ، حيث قد تمثل الأجنة ذات المراحل المناسبة نسبة قليلة فقط من جميع الأجنة ، حتى في نافذة تجميع ضيقة التوقيت. بالطبع ، بالنسبة للعديد من التطبيقات ، سيكون ظهور الميثانول السائب التقليدي للأجنة من نافذة تجميع موقوتة كافيا ، وقد لا يستحق التقشير اليدوي الجهد الإضافي. ثانيا ، يتأثر ارتباط بعض الأجسام المضادة الأولية والأصباغ سلبا بالتعرض السابق للعينة للميثانول. لهذا السبب ، يمكن أن يؤدي التقشير اليدوي إلى زيادات كبيرة في جودة إشارة التألق المناعي مقارنة بالعينات المفرقعة بالميثانول ، مما يجعلها تقنية عامة مفيدة لعلماء الأحياء التنموية في ذبابة الفاكهة .

الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة في أجنة ذبابة الفاكهة الموسعة كاملة التركيب
في حين أن إجراء الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة على العينات الموسعة هو نفسه من الناحية المفاهيمية كما هو الحال في العينات غير الموسعة ، فإن ExM يقدم بعض العقبات الفنية. والجدير بالذكر أن اتجاه الجنين ، وهو عشوائي ، يصبح أكثر أهمية مع زيادة حجم العينة ، لأن الأهداف عالية التكبير وعالية NA قادرة فقط على تركيز الضوء من مناطق العينة القريبة جدا من الغطاء27. لذلك ، عادة ما يكون من الممكن التركيز فقط على الخلايا الموجودة على سطح الجنين أو بالقرب منه والتي انتهى بها الأمر بجوار غطاء الغطاء عند تكوين الجل. أفضل طريقة للتأكد من وجود عينات من الاتجاه الصحيح في النهاية هي بدء بروتوكول ExM بمجموعة محكمة من الأجنة الثابتة (على سبيل المثال ، باستخدام التقشير اليدوي) وزرع العديد من الأجنة في كل بئر (>10). لتصور الخلايا العميقة في داخل الجنين ، قد يكون من الضروري استخدام إعدادات تصوير أكثر تخصصا ، مثل المجهر الضوئي28. بالإضافة إلى ذلك ، نجد أنه يمكن تحسين جودة الصورة عن طريق فتح الثقب البؤري إلى حجم أكبر من وحدة تهوية واحدة. بالطبع ، سيأتي حجم الثقب المتزايد على حساب انخفاض الدقة القصوى ، ولكن من الناحية العملية ، حتى الزيادات الصغيرة في حجم الثقب يمكن أن تعزز بشكل كبير شدة الإشارة (البيانات غير معروضة). يجب أن تتناول الدراسات المستقبلية بشكل منهجي حجم الثقب والدقة الفعالة في عينات ExM.

الاختلافات في ExM الأساسية
البروتوكول الموصوف هنا هو مثال بسيط نسبيا على ExM الذي يجب أن يعمل مع العديد من التطبيقات وأن يكون سهل التنفيذ في معظم مختبرات علم الأحياء التنموي. ومع ذلك ، هناك العديد من الاختلافات في المفهوم الأساسي ل ExM4،5،7 والتي يمكن استخدامها لزيادة شدة الإشارة ، وتحقيق درجات أخرى من التوسع ، واكتشاف جزيئات الحمض النووي وكذلك البروتينات. في هذا البروتوكول ، يتم تحضين الأجنة بالأجسام المضادة قبل الهلام والتوسع. بدلا من ذلك ، يمكن معالجة العينات بالأجسام المضادة بعد توسيعها 6,30 ، مما قد يزيد من شدة الإشارة بسبب زيادة إمكانية الوصول إلى الحواتم وتقليل فقدان الأجسام المضادة المرتبطة أثناء خطوات التمدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام جزيئات متشابكة محددة لربط جزيئات الحمض النووي الريبي بالهيدروجيل للسماح باكتشاف الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الموسعة باستخدام طريقة تفاعل سلسلة التهجين30. أخيرا ، يمكن إخضاع العينات لجولات متعددة من التوسع ، كما هو الحال في الفحص المجهري للتمدد التكراري (iExM) 31 ، و pan-ExM32 ، وكشف التمدد (ExR) 31 ، لتحقيق درجات أعلى من الدقة المتزايدة.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتورة جينيفر زالين على توفير الجسم المضاد الأولي المضاد لخنزير غينيا المضاد ل Par-3. تم دعم هذا العمل بتمويل سخي (1R15GM143729-01 و 1P20GM139768-01 5743) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) ، أحد أعضاء المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، وكذلك معهد أركنساس للعلوم البيولوجية (ABI) ، الذي قدم تمويلا جزئيا لشراء مجهرنا متحد البؤر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acrylamide Milipore Sigma 1490-100ML
ammonium persulfate VWR BDH9214-500G
anti-GFP rabbit polyclonal antibody Torrey Pines BioLabs TP-401
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11075
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
bisacrylamide Research Products International A11275
bovine serum albumin (30% solution) Millipore Sigma A7284
conical tubes, 50 mL fisherscientific  21008-940
coverlip glass, square 22 mm VWR 48366-227
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm VWR 48393-230
glass capillaries for pulling needles World Precision Instruments TW100F-4
glass microinjection needles (pre-pulled) World Precision Instruments TIP10LT
guanidine HCl VWR 101970-606
heptane VWR EM-HX0078-1
latex pipet bulbs VWR 82024-554
methanol VWR BDH1135-4LP
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester VWR 730300-1G
microfuge tube, 1.5 mL VWR 20170-038
multi-well plate, 6-well Genesee 25-100
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) Electron Microscopy Sciences 509804487 (Fisher)
Pasteur pipet (2 mL, short tip) VWR 14673-010
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) VWR 102092-312
Petri plates Genesee 32-107
phosphate-buffered saline (10x solution) VWR 97063-660
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) VWR P8920-1ooML
Proteinase K Thermo Fisher Scientific E00491
scintillation vials (30 mL) VWR 66022-128
sodium acrylate VWR 101181-226
sodium azide (powder) Millipore Sigma 71289 make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific S32354
TAE (50x) VWR 97063-692
tape (double-sided, 1 inch wide) Scotch  3M 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed
TEMED Thermo Fisher Scientific PI17919
TEMPO VWR EM8.14681.0005 catalytic oxidant
Tween-20 VWR 97063-872 extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water
Zeiss LSM 900 Zeiss Laser scanning microscope used without AiryScan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  3. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  5. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  6. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Chang, J. -B. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  9. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  10. Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons. eLife. 6, e27347 (2017).
  11. Jiang, N., et al. Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy. Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).
  12. Yu, C. -C. J., et al. Expansion microscopy of C. elegans. eLife. 9, e46249 (2020).
  13. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  14. Tanaka, T., et al. Phase transitions in ionic gels. Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).
  15. Hausen, P., Dreyer, C. The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues. Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).
  16. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).
  17. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  18. Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).
  19. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protocols. 2007, (2007).
  20. Cold Spring Harbor Protocols. Drosophila apple juice-agar plates. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  21. de Matos Simões, S., et al. Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation. Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).
  22. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  23. Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging (2022).
  24. Paré, A. C., Zallen, J. A. Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation. Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).
  25. Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
  26. Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
  27. Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization. Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).
  28. Stelzer, E. H. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).
  29. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  30. Wen, G., et al. A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).
  31. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
  32. Sarkar, D. Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures. bioRxiv. , (2020).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 194 ، Actomyosin ، التمديد المتقارب ، علم الأحياء التنموي ، ذبابة الفاكهة ، علم الأجنة ، الفحص المجهري التوسعي ، المعدة ، الميتوكوندريا ، الميوسين II ، Par-3 ، الفحص المجهري فائق الدقة
استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة <em>ذبابة الفاكهة</em> المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parveen, S., Jones, N. W.,… More

Parveen, S., Jones, N. W., Millerschultz, I., Paré, A. C. Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging. J. Vis. Exp. (194), e64662, doi:10.3791/64662 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter