Summary
여기에서는 기존의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 초고해상도 이미징을 달성하기 위해 초기 초파리 배아에서 확장 현미경을 구현하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
발생 생물학의 주력 제품은 컨포칼 현미경으로, 이를 통해 연구자들은 복잡한 생물학적 샘플 내에서 태그가 부착된 분자의 3차원 국소화를 결정할 수 있습니다. 기존의 컨포칼 현미경은 수백 나노미터 떨어진 두 개의 인접한 형광점 광원을 분해할 수 있지만, 세포 내 생물학의 미세한 세부 사항을 관찰하려면 수십 나노미터 단위로 신호를 분해할 수 있는 능력이 필요합니다. 연구자들이 이러한 해상도 제한을 피할 수 있도록 초고해상도 현미경을 위한 수많은 하드웨어 기반 방법이 개발되었지만, 이러한 방법에는 모든 연구자가 사용할 수 없는 특수 현미경이 필요합니다. 분해능을 높이는 또 다른 방법은 2015년 Boyden 그룹이 처음 설명한 팽창 현미경(ExM)으로 알려진 프로세스를 통해 샘플 자체를 등방성으로 확대하는 것입니다. ExM은 그 자체로 현미경의 한 종류가 아니라 구성 분자의 상대적인 공간 조직을 보존하면서 샘플을 팽창시키는 방법입니다. 확장된 샘플은 기존의 컨포칼 현미경을 사용하여 효과적으로 증가된 해상도로 관찰할 수 있습니다. 여기서는 표면 상피 세포 내에서 Par-3, myosin II 및 미토콘드리아의 국소화를 검사하는 데 사용되는 전체 마운트 초파리 배아에서 ExM을 구현하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 샘플 크기를 약 4배 증가시켜 기존 컨포칼 현미경으로는 볼 수 없는 세포 내 세부 사항을 검출할 수 있습니다. 원리의 증거로, 반대로 GFP 항체는 인접한 세포 피질 사이 myosin-GFP의 명백한 수영장을 구별하기 위하여 이용되고, 형광으로 레테르를 붙인 streptavidin는 미토콘드리아 네트워크 건축술의 정밀한 세부사항을 계시하기 위하여 내인성 biotinylated 분자를 검출하도록 이용됩니다. 이 프로토콜은 형광 라벨링을 위해 일반적인 항체와 시약을 사용하며 기존의 많은 면역형광 프로토콜과 호환되어야 합니다.
Introduction
세포 및 발생 생물학에서 보는 것은 믿는 것이며, 단백질의 국소화 패턴을 정확하게 결정하는 능력은 많은 유형의 실험에서 기본입니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경은 원형(intact) 시료 내에서 형광 표지된 단백질을 3차원으로 이미징하기 위한 표준 도구입니다. 기존의 컨포칼 현미경은 방출하는 빛의 파장의 1/2 미만으로 분리된 인접한 형광 신호를 구별(분해)할 수 없습니다1. 즉, 두 개의 포인트 소스는 두 개의 별개의 신호로 분해되기 위해 측면 방향으로 최소 200-300nm(축 방향으로 500-700nm) 분리되어야 합니다. 이 기술적 장벽은 회절 한계로 알려져 있으며, 회절 한계 미만의 공간적 특징을 가진 복잡한 세포 내 구조(예: actomyosin 세포골격 또는 미토콘드리아 네트워크)를 연구하는 데 근본적인 장애물입니다. 따라서 기존 컨포칼 현미경의 분해능을 높이는 기술은 생물학계의 일반적인 관심사입니다.
회절 한계를 피하기 위해 수십 나노미터 이하의분해능을 허용하는 다양한 초고해상도 현미경 기술이 개발되어 이전에는 전자 현미경을 통해서만 접근할 수 있었던 생물학적 복잡성의 세계가 드러났습니다. 이러한 하드웨어 기반 방법의 명백한 장점에도 불구하고 초고해상도 현미경은 종종 특정 샘플 라벨링 요구 사항과 긴 획득 시간이 있어 유연성이 제한되거나 일부 실험실에서 접근하기에는 너무 비쌀 수 있습니다. 현미경 기반 초해상도의 대안은 팽창 현미경(ExM)으로, 이는 현미경 그 자체로 일종의 현미경이 아니라 구성 분자의 상대적인 공간 조직을 보존하면서 샘플을 팽창시키는 방법입니다4. 등방성으로 확장된 샘플은 기존의 형광 컨포칼 현미경을 사용하여 효과적으로 증가된 해상도로 관찰할 수 있습니다. ExM은 2015년 Boyden 그룹에 의해 처음 기술되었으며,5 기본 기술은 이후 다양한 실험에 사용하기 위해 채택되었습니다 6,7,8. ExM은 또한 전체 마운트 배아, 특히 초파리 9,10,11, 예쁜꼬마선충 12 및 제브라피시 13에 사용하도록 조정되어 발달 생물학자에게 강력한 도구가 되었습니다.
ExM은 두 가지 하이드로겔 케미스트리를 기반으로 합니다: 1) 물에 담그면 크기가 크게 증가하는 팽윤성 고분자 전해질 하이드로겔14 및 2) 등방성 시료 팽창을 허용하기 위해 폴리머 간격이 매우 작은 폴리아크릴아미드 하이드로겔15. 발표된 많은 ExM 프로토콜이 있지만 일반적으로 시료 고정, 라벨링, 활성화, 겔화, 분해 및 팽창 단계를 공유합니다4. 물론 고정 조건과 형광 표지 전략은 실험 및 시스템의 요구 사항에 따라 달라지며, 일부 프로토콜에서는 확장 후 표지가 이루어집니다. 샘플의 표적 분자는 하이드로겔에 결합하기 위해 프라이밍(활성화)되어야 하며, 이는 다양한 화학 물질을 사용하여 달성할 수 있습니다4. 겔화 단계에서 샘플은 미래 하이드로겔의 단량체(아크릴산나트륨, 아크릴아마이드 및 가교제 비아크릴아미드)로 포화되고, 하이드로겔은 과황산암모늄(APS)과 같은 개시제와 테트라메틸렌디아민(TEMED)4과 같은 촉진제에 의해 촉매되는 자유 라디칼 중합에 의해 형성됩니다. 겔화 후, 시료는 효소로 분해되어 팽윤에 대한 시료 저항성을 균질화하고 하이드로겔4의 등방성 팽창을 보장합니다. 마지막으로, 소화된 하이드로겔을 물에 넣으면 원래 선형 크기4의 약4배로 팽창합니다.
그림 1: Drosophila 배아의 팽창 현미경 검사의 개요. ExM은 완료하는 데 최소 4일이 걸리는 다단계 프로토콜입니다. 배아 수집, 고정 및 분리는 여러 컬렉션의 배아가 통합되었는지 여부에 따라 1일 이상 소요됩니다. 면역형광 표지는 배아가 1차 항체로 하룻밤 동안 배양되는지 여부에 따라 1일 또는 2일이 소요됩니다. 배아 활성화, 겔화, 소화 및 확장은 하루 만에 수행할 수 있습니다. 겔은 확장 직후 장착하고 이미징할 수 있지만, 실용적인 이유로 다음 날 이미징을 시작하는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 초고해상도에서 세포 내 단백질 국소화 패턴을 시각화하기 위해 전체 마운트 초기 및 중간 단계의 초파리 배아16 에서 ExM을 수행하는 방법을 설명합니다(그림 1). 이 방법은 메틸아크릴산 N-하이드록시숙니미딜 에스테르(MA-NHS) 화학을 사용하여 단백질 분자를 하이드로겔17에 활성화하고 고정시키며, 말기 초파리 배아 및 조직에 사용하기 위해 이전에 발표된 ExM 프로토콜의 변형입니다11. 이 프로토콜은 폴리디메틸실록산(PDMS) 웰을 사용하여 하이드로겔을 성형하고 활성화 및 겔화 중에 용액 교환을 촉진합니다. PDMS 웰의 생성을 필요로 하지 않는 대안적인 방법은 커버슬립에 부착된 배아를 실험실 밀봉 필름(22)의 한 조각 위에 놓인 단량체 용액의 방울로 낮추는 것을 포함한다. 또한 이 프로토콜은 면역형광 염색의 전제 조건인 초파리 배아를 둘러싸고 있는 불투과성 유리체 막을 수동으로 제거하는 방법을 설명합니다. 중요한 것은 배아를 손으로 껍질을 벗기는 이 방법은 샘플 라벨링 전에 적절하게 병기된 초파리 배아만 선택하는 데 사용할 수 있으며, 이는 올바른 단계와 방향의 확장된 검체로 끝날 가능성을 크게 높여 다운스트림 데이터 수집을 훨씬 더 효율적으로 만든다는 것입니다.
Protocol
이 프로토콜은 Drosophila melanogaster와 같은 무척추 동물 연구에 대한 University of Arkansas (UARK) 지침을 따르며 UARK Institutional Biosafety Committee (protocol # 20001)의 승인을 받았습니다.
1. 초파리 배아 고정 및 중질화
참고: 1단계는 배아를 둘러싸고 있는 투명한 불침투성 막인 유리막(vitelline membrane)을 수동으로 제거하는 절차(손 박리)를 설명합니다. 중요한 것은 손으로 필링하면 ExM 프로토콜이 시작될 때 적절하게 병기된 배아를 선택할 수 있으므로 ExM 프로토콜이 끝날 때 사용 가능한 방향으로 배아를 얻을 가능성이 크게 향상된다는 것입니다. 그러나 이 ExM 프로토콜은 vitelline membrane의 메탄올 기반 제거를 위한 벌크 배아 수집 및 표준 절차와 완벽하게 호환되며, 이 경우 2단계(면역형광 라벨링)로 바로 건너뛸 수 있습니다.
- 여러 개의 미세한 유리 바늘을 준비하거나 구입하십시오. 바늘 끝의 실제 치수는 중요하지 않지만 바늘이 고정 배아의 유리체 막을 뚫을 수 있을 만큼 단단하고 날카로워야 합니다. 배아 미세주입을 위한 바늘을 준비하는 것처럼 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관(외경 1mm, 내경 0.75mm)으로 바늘을 만든다18; 또는 미리 뽑은 바늘을 구입하십시오.
- 표준 초파리 기법(19)을 사용하여 배아를 채취하는데, >100마리의 성체 초파리를 과일-주스/한천 플레이트(20)로 밀봉된 통풍이 잘되는 플라스틱 컵에 넣는다. 적절한 단계의 배아를 농축하기 위해 시간 제한 수집 기간을 사용합니다16. 예를 들어, 위축(6단계) 및 수렴 확장(7단계) 단계를 위해 농축하려면 과일 주스 플레이트를 교체하고 25°C에서 2시간 동안 배아를 수집한 다음 플레이트를 제거하고 25°C에서 2시간 더 숙성시켜 ~2-4시간 된 배아를 얻습니다.
- 배아에서 달걀 껍질 모양의 융모를 제거하려면 과일 주스 접시의 표면을 50% 표백제로 덮고(표 1) 작은 붓으로 배아를 휘젓고 한천 표면에서 배아를 방출하고 융모가 녹을 때까지 3분 동안 기다립니다.
- 탈코이온화된 배아를 페인트브러시를 사용하여 4mL의 헵탄(유기 상부상)과 4mL의 고정 완충액(수성 하부상)을 포함하는 30mL 섬광 바이알에 옮깁니다. 표 1). 갓 준비했거나 최근에 개봉한 육수에서 포름알데히드를 갓 희석하고 배아를 추가하기 직전에 10x PBS 및 탈이온수와 혼합합니다.
알림: 유리 앰플에 파라포름알데히드 파워 또는 16% EM 등급 포름알데히드로 포름알데히드를 준비합니다. 농축된 포름알데히드(예: 37% 포름알데히드)를 사용할 수 있지만 결과가 덜 일관적일 수 있습니다. - 배아는 유기기와 수성 단계 사이의 계면에 축적됩니다. 계면에서 단일 층을 형성할 수 있는 만큼 배아를 추가합니다. 바이알에 너무 많은 배아를 첨가하면 잘 고정되지 않습니다.
- 강한 테이프를 사용하여 측면에 있는 신틸레이션 바이알을 탁상용 셰이커에 고정하고 220rpm에서 20분 동안 교반합니다. 최적의 고정을 위해 전체 고정 동안 유기상과 수성 단계 사이에 활발한 에멀젼을 유지하십시오.
- 고정 시간 동안 각 샘플에 대해 다음 중 하나를 준비합니다.
- 3% 한천으로 반쯤 채워진 플라스틱 6cm 페트리 접시 베이스를 가져다가 면도날이나 메스로 한천에 ~5cm x 3cm 직사각형을 만듭니다. 과일 주스/한천 플레이트도 이 용도로 사용할 수 있습니다.
- 작은 실험실 주걱을 사용하여 한천 슬래브를 제거합니다. 페트리 접시의 바닥을 뒤집어 벤치에 놓습니다. 거꾸로 된 접시 위에 한천 슬래브를 놓습니다(그림 2A).
- 페트리 접시의 뚜껑을 열고 건조한지 확인하십시오. 장갑을 끼고 뚜껑 안에 양면 테이프 조각을 놓습니다(테이프 조각은 한천 슬래브보다 약간 커야 합니다. 그림 2B).
- 쉐이커에서 바이알을 꺼내 벤치에 똑바로 세우고 유기상과 수용상을 분리합니다. 적절하게 고정된 배아는 두 단계 사이의 계면에 남아 있을 것입니다.
- 라텍스 전구가 장착된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 고정 배아를 한천 슬래브에 옮깁니다. 배아가 피펫 내부에 달라붙는 것을 방지하려면 배아를 피펫의 좁은 목 안에 보관하고 배아를 한 번에 모두 옮기지 말고 여러 개의 작은 배치로 이식하십시오. 모든 배아가 한천 슬래브에 놓이면 P200 피펫터를 사용하여 배아 주변에서 대부분의 잔류 헵탄을 제거합니다. 형태에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 고정된 배아가 건조되지 않도록 가능한 한 빨리(<3분) 이 단계를 수행합니다.
- ~2cm 높이에서 양면 테이프가 있는 뚜껑을 한천 슬래브에 떨어뜨려 배아를 테이프에 부착합니다(그림 2C). 한천 슬래브에서 뚜껑을 조심스럽게 제거하고 벤치에 거꾸로 놓은 다음 뚜껑의 배아를 덮을 만큼 PBS-트윈(표 1)을 추가합니다.
- 간접 조명과 함께 약 100x 배율의 입체 해부 현미경을 사용하여 형태학적 마커를 사용하여 적절하게 준비된 배아를 식별합니다. 6기 배아의 경우 눈에 보이는 두부 고랑 및 침윤된 중배엽과 같은 마커를 사용합니다. 7기 배아의 경우 확장된 생식반과 같은 마커를 사용합니다. 11기 배아의 경우, 완전히 확장된 생식세포와 머리에서 꼬리까지의 축(16)을 따라 눈에 보이는 분절과 같은 마커를 사용합니다.
- 원하는 배아를 채취하려면 먼저 미세한 유리 바늘로 배아의 앞쪽 또는 뒤쪽 끝 근처에 있는 유리막(배아 주위의 투명한 타원형 막)을 찔러줍니다. 멤브레인은 압력이 해제됨에 따라 약간 수축됩니다. 그런 다음 미세한 집게나 금속 탐침을 사용하여 다른 쪽 끝에 있는 배아를 구멍을 통해 부드럽게 밀어 넣습니다. Vitelline 멤브레인은 양면 테이프에 부착된 상태로 유지됩니다. 원하지 않는 배아가 테이프에 부착된 상태로 두십시오.
- 유리 파스퇴르 피펫으로 부유 중수소화된 배아를 주기적으로 수집하고 1.5mL 미세분리 튜브로 옮깁니다.
- 이때 다음 단계 중 하나를 수행합니다.
- 면역형광 라벨링 단계를 바로 진행합니다. 이질화된 배아는 차단 용액으로 직접 들어갈 수 있습니다(2.2단계). 다음 단계로 진행하기 전에 배아가 PBS-Tween 또는 차단 용액(표 1)에 16시간 이상 남아 있지 않도록 하십시오.
- 배아를 메탄올로 옮겨 보관한다. PBS-Tween을 최대한 많이 제거한 다음 메탄올 1mL를 추가합니다. 배아가 정착되면 가능한 한 많은 메탄올을 제거하고 신선한 메탄올 1mL를 추가합니다. 배아를 -20°C에서 무기한 보관합니다. 메탄올 저장은 또한 여러 컬렉션에서 배아를 풀링할 수 있습니다.
2. 면역형광 라벨링
참고: 항체 배양 단계를 제외하고, 정확한 액체의 양과 시간은 이 섹션에서 중요하지 않습니다. 헹굼 또는 세척을 수행하려면 배아가 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 배아를 빨아들이지 않고 가능한 한 많은 액체를 제거한 다음 ~1mL의 새 액체를 추가합니다. 최적의 투명도와 제어를 위해 라텍스 전구가 장착된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하십시오. 헹굼 단계에서 배아는 흔들리지 않고 가라앉기만 하면 됩니다. 세척 단계의 경우, 배아는 표시된 시간 동안 너트 위에서 흔들린 다음 침전됩니다.
- 배아가 메탄올에 저장되지 않은 경우 2.2단계로 진행합니다. 배아를 메탄올에 보관한 경우 PBS-Tween으로 두 번 헹구고 PBS-Tween으로 20분 동안 두 번 세척합니다.
- 1mL의 차단 용액에서 30-60분 동안 배아를 세척합니다.
- 항체 용액(표 1)에 희석된 1차 항체로 배아를 실온에서 2시간 동안 또는 바람직하게는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체를 보존하기 위해 가능한 한 작은 부피(50-300μL)로 이 단계를 수행합니다. 너트 위에서 흔들리는 것은 반드시 필요한 것은 아닙니다.
- ExM의 경우 일반적인 면역형광 실험에 사용되는 1차 항체의 양을 50% 이상 늘립니다. 항-Par-3 기니피그 다클론21 의 경우 1:200, 항-GFP 토끼 다클론의 경우 1:100의 1차 항체 농도를 사용하십시오.
- 1차 항체 용액을 제거하고(원하는 경우 4°C에서 보관), PBS-Tween으로 두 번 헹구고 PBS-Tween으로 15분 동안 네 번 세척합니다.
- 형광 2차 항체가 있는 배아를 300μL(항체 용액에 희석)의 최종 부피에서 너트레이터 상에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 형광 표지된 스트렙타비딘을 이 단계에서 첨가할 수 있습니다. 이 단계부터는 가능하면 배아를 과도하고 장시간 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오(예: 튜브를 불투명한 상자 뚜껑으로 덮거나 샘플을 서랍에 보관).
- 다음 농도를 사용하십시오 : Alexa Fluor 488에 융합 된 안티 토끼 IgG 염소 다클론의 경우 1 : 500; 1:500 Alexa Fluor 568에 융합된 항기니피그 IgG 염소 다클론항체; 및 streptavidin-Alexa Fluor 488의 경우 1:1000.
- 2차 항체 용액을 제거하고 폐기합니다. PBS-Tween으로 배아를 두 번 헹구고 PBS-Tween으로 15분 동안 네 번 세척합니다.
- 이 시점에서 배아는 어두운 곳에서 4°C에서 보관할 수 있지만 샘플을 가능한 한 빨리(<24시간) 처리할 수 있습니다.
3. PDMS 웰 준비
알림: PDMS 웰은 최대 2주 전에 만들 수 있습니다.
- 인큐베이터 또는 핫플레이트를 55°C로 설정하고 원뿔형 튜브를 회전시킬 수 있는 원심분리기를 15°C로 설정합니다.
- PDMS 용액(표 1)을 준비하려면 50mL 코니컬 튜브를 저울의 보조 용기에 넣고 주사기를 사용하여 실리콘 엘라스토머 베이스 10g을 튜브에 추가합니다. 그런 다음 실리콘 엘라스토머 경화제 1g을 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다.
- 두 번째 50mL 코니컬 튜브에 적절한 양의 물을 추가하여 저울 튜브를 만듭니다. PDMS 용액을 500 x g 에서 15 °C에서 3 분 동안 원심 분리 한 다음 ~ 1 mm 깊이의 10cm 페트리 접시에 붓습니다. 필요한 경우 공기 호스로 용액을 부드럽게 불어 기포를 제거하십시오. PDMS 용액을 55°C에서 밤새 응고시킵니다.
- PDMS 슬래브가 응고되면 메스를 사용하여 22mm x 22mm 커버슬립보다 약간 작은 정사각형 영역에 점수를 매깁니다. 각 사각형 내부에 ~8mm 너비의 정사각형 우물을 채점하고 제거합니다.
- 각 정사각형 PDMS를 22mm x 22mm 커버슬립에 잘 옮기고 단단히 부착합니다(그림 2D). 6개 이상의 커버슬립을 준비하면 이미지화할 수 있는 확장된 배아가 많이 생성됩니다.
4. 배아를 커버슬립에 부착
- 0.1% 폴리-L-라이신을 각 웰 내부의 커버슬립 표면(~50μL)을 덮을 만큼 충분히 바르고 55°C 인큐베이터에 넣어 자연 건조합니다. 접착력을 높이려면 이 단계를 반복합니다.
- 1x PBS에서 한 번 배아를 간단히 헹구어 트윈 세제를 제거한 다음 >10개의 배아를 폴리-L-라이신 코팅된 각 웰에 옮깁니다.
- 배아가 우물 바닥에 가라앉도록 합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 부착된 배아에서 과도한 액체를 제거합니다. 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
5. 활성화 및 겔화
참고: 활성화는 MA-NHS를 배아에 추가하는 것을 말하며, 이는 샘플 단백질과 항체를 수정하여 하이드로겔에 결합할 수 있도록 합니다. 겔화는 각 웰의 배아 내부와 주변에서 하이드로겔이 생성되는 것을 말합니다. 겔화 동안, 배아는 단량체 용액으로 투과된 다음 겔화 용액으로 처리되어 하이드로겔을 형성합니다.
- 웰을 활성화 용액(1x PBS에 갓 희석한 1mM MA-NHS; 표 1). 1시간 동안 약 10분마다 이 용액을 교체하십시오.
- 배아를 1x PBS로 세 번 헹굽니다. 배아를 단량체 용액(표 1)에서 4°C에서 45분 동안 배양합니다.
- 배아가 단량체 용액에 앉아 있는 동안, 겔화 용액을 준비한다(표 1). ~2mL의 겔화 용액을 준비하면 전체 10cm 페트리 접시에서 PDMS 웰을 덮을 수 있습니다. APS는 중합을 시작하고 겔화를 시작하므로 마지막에 추가해야 합니다.
- 분말에서 촉매 산화제를 신선하게 희석합니다(예: 물에 1% TEMPO w/v). 1,960μL의 단량체 용액을 30μL의 10% TEMED 및 10μL의 1% TEMPO와 결합합니다.
- 겔화 용액의 전체 배치를 한 번에 중합하는 것을 방지하려면 작은 배치로 작업하십시오. 겔화 용액(APS 제외)을 PCR 스트립의 8개 튜브 사이에서 125μL 부분 표본으로 분할합니다.
- 배아가 손상되지 않도록 주의하면서 진공을 사용하여 3개의 PDMS 웰에서 단량체 용액을 제거합니다. 겔화 용액이 들어 있는 PCR 튜브 중 하나에 5μL의 APS를 추가하여 중합을 시작합니다. 중합 겔화 용액을 웰 사이에 빠르게 분배합니다(웰당 ~40μL). 모든 우물과 배아가 덮일 때까지 이것을 반복합니다.
- 샘플을 37°C에서 1.5-2.5시간 동안 겔화합니다. 중합을 모니터링하기 위해 하이드로겔을 자주 저어줍니다. 응고된 하이드로겔은 흔들리지 않습니다. 더 두꺼운 하이드로겔은 중합을 완료하고 응고하는 데 더 오래 걸립니다.
6. 소화와 확장
알림: 두껍고 큰 젤은 팽창하는 데 시간이 더 오래 걸리고 겔의 중심이 완전히 팽창하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이것은 젤의 가장자리를 다듬어 속도를 높일 수 있습니다. 겔이 팽창함에 따라 굴절률은 물의 굴절률과 거의 같아지고 보기가 매우 어려워집니다.
- 겔화가 완료되면 하이드로겔을 방해하지 않으면서 커버슬립에서 PDMS 웰을 벗겨냅니다. 원하는 경우 과도한 하이드로겔 재료를 잘라냅니다.
- 하이드로겔(여전히 커버슬립에 부착되어 있음)을 6웰 플레이트의 웰에 개별적으로 옮깁니다(그림 2E). 하이드로겔은 소화 중에 약간 팽창할 수 있습니다.
- 분해 완충액(표 1)으로 겔을 완전히 덮고 37°C에서 1시간 동안 가열합니다. 일반적으로 30mL의 분해 완충액은 6웰 플레이트의 겔을 덮기에 충분합니다.
- 분해 후 각 하이드로겔을 커버슬립에서 밀어내어 6cm 페트리 접시에 개별적으로 옮깁니다. 젤을 제거하기 위해 두 번째 커버슬립을 사용해야 할 수도 있습니다. 각 페트리 접시에 탈이온수를 채워 젤을 팽창시킵니다. 겔이 완전히 팽창할 때까지 1-2시간 동안 물을 3-4회 갈아줍니다(너비가 약 4배 증가할 것으로 예상).
7. 설치 및 이미징
참고: 팽창된 하이드로겔은 거의 전적으로 물로 구성되어 있어 거의 투명하고 매우 깨지기 쉽습니다. 젤은 긴 커버슬립을 사용하여 조작하여 이리저리 움직이고 집어 올릴 수 있습니다. 한 번에 하나 또는 두 개의 젤만 장착하고 이미지화하면 젤이 점차적으로 물을 방출하고 커버슬립 주위를 미끄러지기 시작합니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 가능한 한 많은 여분의 물을 제거하여 취급 시 젤이 움직이는 것을 최소화합니다.
- 이미징을 위해 배아가 바닥면에 있는 확장된 각 겔을 큰 커버슬립(예: 24mm x 40mm)에 움직입니다.
- 각 커버슬립을 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 대물렌즈 위에 젤로 장착합니다. 저배율(5x 또는 10x) 또는 중배율(20x) 공기 대물렌즈를 사용하는 현미경의 epifluorescence 또는 brightfield microscopy 모드를 사용하여 적절하게 준비되고 방향이 지정된 표본을 찾습니다.
- 고해상도로 이미지를 촬영하려면 고배율(60x, 63x 또는 100x) 오일 또는 워터 이멀젼 대물렌즈로 전환하십시오. 이미징을 위해서는 배아의 표면이 대물렌즈의 초점 범위 내에 있어야 합니다(63x 대물렌즈의 경우 커버슬립에서 <300μm).
- 현미경의 레이저 스캐닝 컨포칼 모드를 사용하여 샘플에서 데이터를 수집합니다. 양호한 동적 범위로 비포화 이미지를 수집하고, 샘플(23)에 대한 가능한 최대한의 정보를 캡처하기 위해 이미지당 적절한 수의 픽셀을 사용해야 한다.
그림 2: 수동 중수소화 및 하이드로겔 작업 . (A) 한천/과일 주스 접시에서 한천 슬래브 절단. (B) 6cm 페트리 접시의 뚜껑 안에 양면 테이프를 붙입니다. (C) 테이프로 감싼 뚜껑에 배아를 부착하는 것. (D) 22mm x 22mm 커버슬립에 잘 부착된 정사각형이 있는 PDMS 슬래브. (E) 6웰 플레이트 내부에 PDMS 웰이 있는 커버슬립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
전체 마운트 초파리 배아에서 ExM의 일반적인 효능을 특성화하기 위해 머리에서 꼬리까지의 축을 따라 배아 길이를 확장되지 않은 대조군 배아와 확장된 배아에서 측정했습니다(그림 3A-C). 확장되지 않은 대조군 배아는 이미징 전에 응고된 장착 배지를 사용하여 장착되었다는 점을 제외하고는 확장된 배아와 동일한 고정 조건 및 면역형광 표지 단계를 거쳤습니다. 확장되지 않은 개별 배아는 10x 대물렌즈를 사용할 때 시야의 약 1/2에 걸쳐 있었습니다(그림 3A). 대조적으로, 확장된 배아는 동일한 10x 대물렌즈를 사용할 때 약 2개의 전체 시야에 걸쳐 있었습니다(그림 3B). 확장 정도가 실험 내에서, 그리고 실험 간에 어떻게 변하는지 평가하기 위해, 동일한 ExM 프로토콜을 세 차례에 걸쳐 수행하고, 배아 길이를 각 개별 실험 내에서 세 가지 다른 겔에서 측정했습니다. 확장되지 않은 대조군 배아의 평균 머리에서 꼬리까지의 길이는 398.8μm(표준 편차[SD] = 22.93μm; n=74; 그림 3C). 실험 1, 실험 2 및 실험 3의 평균 배아 길이는 각각 1,596μm(SD=159.9μm, n=57), 1,868μm(SD=150.5μm, n=51) 및 1,954μm(SD=120.3μm, n=44)로 각각 4.0배, 4.7배, 4.9배의 팽창 계수를 나타냅니다(그림 3C). 겔 간의 실험 내 변동은 약 20%인 실험 간 변동보다 훨씬 덜 두드러졌습니다(그림 3C). 세포 및 배아 형태에 대한 ExM의 효과를 평가하기 위해 부착 접합 성분 Par-3(Bazooka)21에 대한 항체를 사용하여 정점 세포막을 표지하고 복잡한 분절 구조를 가진 단계인 11기 초파리 배아의 발달 중인 입 분절을 이미지화했습니다(그림 3D-F). 대조 샘플에서 상악 세그먼트의 세포는 평균 너비가 4.76μm(SD = 1.053μm, n=25; 그림 3D,F). 동일한 40x 대물렌즈 및 확대/축소 계수(1x)를 사용하여 이미징한 확장된 샘플에서 상악 세그먼트의 세포는 평균 너비가 19.10μm(SD = 3.966μm, n = 18; 그림 3E,F)는 4.0배 확장을 나타냅니다. 따라서, 이전 보고들과 일치하게11, 우리는 세포 또는 조직 형태에서 샘플 찢어짐이나 명백한 왜곡 없이 ExM을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 선형 치수에서 약 4배 확장할 수 있었습니다.
그림 3: 초파리 배아의 4배 확장. (A) 1x 줌에서 10x 대물렌즈(0.3 NA)를 사용하여 이미지화한 (A) 확장되지 않은 초파리 배아 및 (B) 확장된 초파리 배아. 개별 시야(FOV)는 점선으로 표시됩니다. 배아는 미오신 경쇄의 GFP 표지 버전을 발현하고 항-GFP 항체로 염색되었습니다. (C) 실험당 3개의 하이드로겔 및 확장되지 않은 대조군과 비교한 3개의 개별 ExM 실험에서 배아 길이(머리에서 꼬리 축을 따라)의 정량화. (디,이) 1x 줌에서 40x 대물렌즈(1.3 NA)를 사용하여 이미지화한 (D) 확장되지 않은 및 (E) 확장된 11단계 초파리 배아의 상악 세그먼트. 세포 윤곽선(부착 접합부)은 항 Par-3/바주카 항체(흰색)로 검출되었습니다. (F) (D) 및 (E)의 동등한 셀 그룹에서 셀 너비(장축)의 정량화. (C)와 (F)의 상자 그림은 25번째, 50번째 및 75번째 백분위수 범위를 보여줍니다. 수염은 최소값과 최대값을 나타냅니다. "+" 기호는 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ExM을 사용하여 일반적인 회절 한계 이하의 세포 내 세부 사항을 해결할 수 있음을 입증하기 위해 actomyosin 세포골격을 수렴 확장(7단계)을 겪고 있는 확장된 배아와 비교하여 확장되지 않은 대조군에서 이미지화했습니다. 위축(gastrulation)과 수렴 확장(convergent extension)의 조직 리모델링 사건은 운동 단백질 미오신 II(myosin II)의 국소화 변화에 의해 크게 조절된다24. 그러나 초기 초파리 외배엽의 조밀하게 밀집된 원주 상피에서는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 일반적인 최대 분해능인 158x 배율(2.5x 광학 줌으로 63x 대물렌즈)로 이미징한 경우에도 미오신 II 국소화 패턴의 많은 미세한 세부 사항을 관찰하기 어렵습니다. 예를 들어, 미오신 II는 피질 단백질(원형질막 바로 아래에 위치)이기 때문에 세포-세포 접촉의 양쪽에 위치한 미오신 II25 풀은 7기 배아에서 분해할 수 없었고 이웃 세포가 만나는 단일 선으로 나타났습니다(그림 4A). 대조적으로, 확장된 7단계 배아에서는 세포-세포 접합부에서 myosin II의 평행선을 관찰할 수 있었는데, 이는 인접한 세포의 피질 단백질 풀을 나타냅니다(그림 4B). 확장된 샘플에서 평행한 미오신 II 라인 사이의 거리는 892.7nm(SD = 0.171nm, n=12)였습니다. 4로 나누면 확장되지 않은 배아의 인접 세포에 있는 미오신 라인 사이의 예상 거리가 ~220nm로 생성되며, 이는 실제로 Alexa 488로 감지된 신호의 회절 한계(~520nm/2 = 260nm의 피크 방출)보다 약간 낮습니다.
또한, ExM을 사용하여 조밀하게 밀집된 초파리 배아(6기)의 미토콘드리아 네트워크 구조를 해결할 수 있는지 여부도 테스트했습니다. 미토콘드리아 기능은 네트워크 구조(즉, 융합된 세포기관 대 단편화된 세포기관)와 밀접하게 연관되어 있지만, 미토콘드리아 네트워크 조직의 세부 사항은 평평하거나 얇지 않은 세포 유형에서 기존의 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화하기 어렵습니다. 미토콘드리아는 자연적으로 비오틴화된 분자가 풍부하며, 따라서 미토콘드리아는 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 초기 초파리 배아에서 표지될 수 있습니다26. 스트렙타비딘-알렉사 488로 표지된 확장되지 않은 6기 배아에서 신호는 종종 겹치고 확인하기 어려운 세포질 반점으로 나타났습니다(그림 4C). 대조적으로, 확장된 6단계 배아에서는 미토콘드리아 네트워크의 더 많은 미세한 세부 사항을 볼 수 있었고 반점은 더 쉽게 분해할 수 있었습니다(그림 4D)26,27. 이러한 결과는 ExM이 전통적으로 미토콘드리아 분석에 적합하지 않은 세포 유형의 미토콘드리아 네트워크 조직을 연구하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다.
그림 4: 확장 현미경으로 밝혀진 actomyosin cytoskeleton 및 mitochondria의 세부 정보. (A,B) 7단계 (A) 미확장 및 (B) 확장 배아에서 2.5x 줌에서 63x 대물렌즈(1.4NA)로 이미징된 신경 외배엽(생식밴드) 세포의 Myosin II 국소화. Myosin II는 myosin II 조절 경쇄 (sqh-GFP)의 형질전환 GFP 표지 버전을 발현하는 배아에서 검출되었으며, 이는 항 GFP 항체 (빨간색)로 검출되었습니다. 인접한 세포에 위치한 대뇌 피질 미오신 (cortical myosin)의 뚜렷한 풀은 확장 된 배아 (흰색 화살표)에서 분해 될 수 있습니다. (씨,디) 6기 미확장(C) 및 확장(D) 배아에서 2.5배 확대에서 63× 대물렌즈(1.4NA)로 이미징된 신경 외배엽 세포의 미토콘드리아 네트워크. 미토콘드리아는 streptavidin-Alexa 488(녹색)로 검출되었고, 세포 윤곽은 항-Par-3/Bazooka 항체(자홍색)로 검출되었습니다. 실험은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 솔루션 레시피. 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 구성(나타나는 순서대로). 달리 명시되지 않는 한 모든 주식은 액체입니다. 화학 물질은 달리 명시되지 않는 한 오토클레이브 여과수에 재현탁되거나 희석되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
수동 분리
대부분의 초파리 배아 고정 프로토콜은 메탄올과 헵탄의 에멀젼에서 고정된 배아를 흔들어 유리체 막을 제거하는 것을 포함하며, 이는 삼투압 파열을 통해 막이 터지게 한다26. 메탄올 기반 중수소화(메탄올 팝핑)는 많은 응용 분야에 효과적이고 적합하지만 수동 중수소화(수동 박리)는 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 첫째, 손으로 껍질을 벗기면 정밀하게 준비된 배아를 선택하여 분리하고 수집할 수 있으므로 실험이 끝날 때 사용 가능한 방향으로 확장된 배아를 얻을 가능성이 크게 높아집니다. 이러한 농축은 빠른 발달 과정(예: 중배엽 침습 또는 수렴 확장)의 특정 측면을 연구할 때 매우 중요하며, 적절하게 병기된 배아는 빡빡한 시기의 수집 기간 내에서도 모든 배아의 몇 %만 차지할 수 있습니다. 물론, 많은 응용 분야의 경우, 시간 제한 수집 창에서 배아를 보다 전통적인 벌크 메탄올 팝핑으로 충분하며, 손으로 껍질을 벗기는 것은 추가 노력의 가치가 없을 수 있습니다. 둘째, 특정 1차 항체 및 염료의 결합은 샘플이 이전에 메탄올에 노출된 것에 의해 부정적인 영향을 받습니다. 이러한 이유로, 손으로 필링하면 메탄올이 터진 샘플에 비해 면역형광 신호 품질이 크게 향상될 수 있어 초파리 발생 생물학자에게 유용한 일반 기법이 됩니다.
확장된 전체 마운트 초파리 배아의 고해상도 컨포칼 현미경
확장된 샘플에 대해 고분해능 컨포칼 현미경을 수행하는 것은 확장되지 않은 샘플과 개념적으로 동일하지만 ExM은 몇 가지 기술적 장애물을 도입합니다. 특히, 무작위인 배아 배향은 샘플 크기가 증가함에 따라 더욱 중요해지는데, 이는 고배율, 높은 개구수 대물렌즈가 커버슬립(27)에 매우 가까운 샘플 영역에서만 빛을 집중시킬 수 있기 때문입니다. 그러므로, 일반적으로 겔이 형성될 때 커버슬립에 인접하게 된 배아의 표면 또는 그 근처에 있는 세포에만 초점을 맞출 수 있습니다. 끝에 올바른 방향의 표본이 있는지 확인하는 가장 좋은 방법은 고정된 배아의 촘촘하게 준비된 수집(예: 손 껍질 벗기기 사용)으로 ExM 프로토콜을 시작하고 각 웰에 많은 배아를 파종하는 것입니다(>10). 배아의 내부 깊숙한 곳에 있는 세포를 시각화하기 위해서는, 광시트 현미경(light-sheet microscopy)과 같은 보다 전문화된 이미징 셋업(imaging setup)을 이용할 필요가 있을 수 있다(28). 또한 공초점 핀홀을 통풍이 잘되는 단위 하나 이상으로 열면 이미지 품질이 향상될 수 있습니다. 물론 핀홀 크기가 증가하면 최대 분해능이 감소하지만 실제로는 핀홀 크기가 조금만 증가해도 신호 강도가 크게 증가할 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 향후 연구에서는 ExM 샘플의 핀홀 크기와 효과적인 분리능을 체계적으로 다루어야 합니다.
기본 ExM의 변형
여기에 설명된 프로토콜은 많은 응용 분야에서 작동하고 대부분의 발달 생물학 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 비교적 간단한 ExM의 예입니다. 그러나 ExM 4,5,7의 기본 개념에는 신호 강도를 증가시키고, 더 많은 확장 정도를 달성하고, 단백질뿐만 아니라 핵산 분자를 검출하는 데 사용할 수 있는 다양한 변형이 있습니다. 이 프로토콜에서 배아는 겔화 및 팽창 전에 항체로 배양됩니다. 대안적으로, 샘플은 6,30 확장된 후 항체로 처리될 수 있으며, 이는 에피토프 접근성 증가 및 확장 단계 동안 결합된 항체의 손실 감소로 인해 신호 강도를 증가시킬 수 있습니다. 또한, RNA 분자를 하이드로겔에 부착시키는데 특이적 가교제 분자를 사용하여 혼성화 연쇄 반응법(30)을 사용하여 팽창된 겔에서 RNA를 검출할 수 있다. 마지막으로, 샘플은 iExM(Iterative Expansion Microscopy)31, pan-ExM(32) 및 ExR(Expansion Revealing (ExR)31)에서와 같이 여러 차례의 팽창을 거쳐 훨씬 더 높은 수준의 분해능을 얻을 수 있습니다.
Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
기니피그 Anti-Par-3 1차 항체를 제공해주신 Jennifer Zallen 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 회원 중 하나인 미국 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Science, NIGMS)와 컨포칼 현미경 구입을 위한 일부 자금을 제공한 아칸소 바이오사이언스 연구소(Arkansas Biosciences Institute, ABI)의 넉넉한 자금(1R15GM143729-01 및 1P20GM139768-01 5743)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
| ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
| anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
| anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
| anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
| bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
| conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
| coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
| coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
| glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
| guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
| heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
| latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
| microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
| paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
| Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
| PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
| Petri plates | Genesee | 32-107 | |
| phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
| Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
| scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
| sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
| sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
| TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
| tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
| TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
| TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
| Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
| Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |
References
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