Summary
Multiplexed stregkode billedanalyse har for nylig forbedret karakteriseringen af tumormikromiljøet, hvilket tillader omfattende undersøgelser af cellesammensætning, funktionel tilstand og celle-celle-interaktioner. Heri beskriver vi en farvnings- og billeddannelsesprotokol ved hjælp af stregkoden af oligonukleotidkonjugerede antistoffer og cyklusbilleddannelse, som muliggør anvendelse af en højdimensionel billedanalyseteknik.
Abstract
Multiplexed billeddannelsesteknologi ved hjælp af antistofstregkodning med oligonukleotider, som sekventielt detekterer flere epitoper i samme vævssektion, er en effektiv metode til tumorevaluering, der forbedrer forståelsen af tumormikromiljøet. Visualiseringen af proteinekspression i formalinfikserede, paraffinindlejrede væv opnås, når en specifik fluorofor udglødes til en antistofbundet stregkode via komplementære oligonukleotider, og derefter udføres prøvebilleddannelse; Faktisk tillader denne metode brugen af tilpassede paneler med mere end 40 antistoffer i en enkelt vævsfarvningsreaktion. Denne metode er kompatibel med frisk frosset væv, formalinfikseret, paraffinindlejret væv, dyrkede celler og mononukleære celler i perifert blod, hvilket betyder, at forskere kan bruge denne teknologi til at se en række prøvetyper ved enkeltcelleopløsning. Denne metode starter med en manuel farvnings- og fastgørelsesprotokol, og alle antistofstregkoder påføres ved hjælp af en antistofcocktail. Farvningsfluidikinstrumentet er fuldt automatiseret og udfører iterative cyklusser med mærkning, billeddannelse og fjernelse af spektralt forskellige fluoroforer, indtil alle biomarkører er blevet afbildet ved hjælp af et standard fluorescensmikroskop. Billederne indsamles og kompileres derefter på tværs af alle billeddannelsescyklusser for at opnå enkeltcelleopløsning for alle markørerne. Enkelttrinsfarvning og skånsom fjernelse af fluorofor giver ikke kun mulighed for stærkt multiplekset biomarkøranalyse, men bevarer også prøven til yderligere nedstrømsanalyse, hvis det ønskes (f.eks. Hæmatoxylin og eosinfarvning). Desuden muliggør billedanalysesoftwaren billedbehandling-drift kompensation, baggrundssubtraktion, cellesegmentering og klyngedannelse - samt visualisering og analyse af billeder og cellefænotyper til generering af rumlige netværkskort. Sammenfattende anvender denne teknologi et computeriseret mikrofluidiksystem og fluorescensmikroskop til iterativt at hybridisere, afbilde og strippe fluorescerende mærkede DNA-sonder, der er komplementære til vævsbundne, oligonukleotidkonjugerede antistoffer.
Introduction
Tumormikromiljøet (TME) er ekstremt heterogent og består af tumorceller, tumorstromale celler, immunceller, ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrix og talrige rigelige molekyler produceret og frigivet af tumor-, stromale og immunceller 1,2. Akkumulerende beviser viser, at TME har en central rolle i omprogrammering af tumordifferentiering, vækst, invasion, metastase og respons på terapier3.
At forstå, hvordan forskellige celletyper i TME interagerer og kommunikerer med hinanden gennem signalnetværk, er afgørende for at forbedre kræftdiagnosen, optimere immunterapi og udvikle nye behandlinger4. Traditionelle vævsmikroskopiteknikker, herunder immunhistokemi (IHC) og immunofluorescens (IF), er blevet brugt i årtier til at studere celletyper, overflod og kommunikation i tumorprøver. Desværre kan disse teknikker typisk kun evaluere en eller to proteinmarkører i et vævsafsnit og kan ikke afsløre de komplekse rumlige og strukturelle forhold mellem disse celler 5,8,7.
I løbet af de sidste to årtier er der etableret flere multipleksede billedteknologier8. Disse teknologier giver meget bedre overblik over immuncellernes sammensætning, funktion og placering i TME'en, hvilket fører til hurtige fremskridt i evnen til at identificere og profilere komplekse TME'er rumligt på enkeltcelleniveau 9,10. De rumlige og strukturelle forhold mellem forskellige tumor- og immunceller i TME er nu i spidsen for biologiske og kliniske undersøgelser ved hjælp af disse multipleksede billeddannelsesteknologier11,12.
Den nyligt udviklede multipleksede billeddannelsesteknologi ved hjælp af oligonukleotidkonjugeret antistofkodning er en indflydelsesrig enkeltcelle biologisk forskningsplatform baseret på påvisning af oligonukleotidkonjugerede antistoffer i formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) prøver13,14. I øjeblikket giver denne multipleksede billeddannelsesteknologi mulighed for samtidig billeddannelse af mere end 100 markører i en enkelt vævssektion15, hvilket har øget antallet af celletyper, der kan skelnes in situ. Dette muliggør et niveau af rumlig analyse af tumor- og immunceller, der ikke er muligt ved hjælp af traditionelle immunofænotypemetoder16.
Heri beskriver vi en optimeret protokol til konjugering af oprensede antistoffer mod oligonukleotider og validering af denne konjugering ved hjælp af den multipleksede billeddannelsesplatform og en multicyklusbilleddannelsesprocedure med FFPE-væv. Derudover beskriver vi de grundlæggende billedbehandlings- og dataanalyseprocedurer, der anvendes med denne teknologi.
Protocol
Denne retrospektive undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. FFPE-vævsprøverne blev indsamlet fra patienter hos MD Anderson som en del af rutinemæssig standardbehandling. Der blev ikke udført diagnostiske eller terapeutiske indgreb. Der blev indhentet informeret samtykke fra patienterne til at bruge de indsamlede prøver til forskning og offentliggørelse.
1. Antistofkilder, der anvendes til antistofpanelets design
- Opret et antistofpanel til multiplekset billeddannelse efter nøje overvejelse af kvaliteten af væv og proteiner af interesse. Tre kilder til antistoffer overvejes til antistofpaneldesignet: 1) fuldt kommercielt validerede antistoffer, 2) multipleksede billeddannelsesteknologiscreenede antistoffer og 3) slutbrugerdelte antistoffer.
BEMÆRK: Multiplexed imaging technology-screenede antistoffer har vist sig at virke og er tilgængelige fra leverandører. Disse screenede antistoffer kan anvendes til multiplekset billedfarvning efter oligonukleotidkonjugering af brugeren. - Hvis et protein af interesse ikke kan findes i ovennævnte kilder, anvende antistofkloner, der vides at arbejde med IHC. Derudover anbefales IgG-isotyper snarere end IgM-kloner til denne multipleksede billeddannelsesteknologi på grund af den højere fejlrate med IgM end med IgG-kloner.
2. Før antistofkonjugering
- Når du identificerer antistofkloner til konjugering ved hjælp af multipleksede billeddannelsesstregkoder, skal du overveje at købe bærerfrie antistoffer i fosfatbufret saltvand (PBS) eller en lignende buffer. Bærerproteiner, herunder BSA, gluten, glycerol og andre proteinadditiver, er kendt for at reducere konjugeringskapaciteten.
- Vælg den bedst egnede antistofklon, og optimer altid farvningsbetingelserne (dvs. antigenhentning og titrering) før konjugering. Gør dette ved at anvende en ukonjugeret antistofklon på positivt og negativt væv for dette antistof ved hjælp af standard IF eller IHC.
BEMÆRK: Hvis et oprenset antistof ikke er kommercielt tilgængeligt, skal der udføres en antistofrensningsproces før konjugering. Den rensningsprocedure, der anvendes med antistofrensningssæt, diskuteres ikke heri.
3. Konjugering af antistoffer
- Der opnås antistofkonjugeringsreagenserne. Kommercielt tilgængelige konjugationssæt indeholder en filterblokerende opløsning, reduktionsopløsning 2, konjugationsopløsning, rensningsopløsning, antistoflagringsopløsning (alle opbevaret ved 4 °C) og reduktionsopløsning 1 (opbevaret ved -20 °C).
- Konjugation
BEMÆRK: Et renset antistof behandles med et reduktionsmiddel, hvilket gør det muligt for de reducerede dele af antistoffet at reagere med den multipleksede billeddannelsesstregkode, der anvendes med denne teknologi, og danner således en kovalent binding. Denne proces tager ca. 4,5 timer og resulterer i ca. 120 μL konjugeret antistof, som er levedygtigt i 1 år. Al spin-down udføres ved stuetemperatur (RT), og gennemstrømningen kasseres undtagen i det allersidste trin (3.2.9), hvor et opsamlingsrør indeholder det konjugerede antistof.- Der suges og påføres 500 μL af den filterblokerende opløsning med pipette på 50 kDa afskæringsfilterkolonnerne med molekylvægt, og centrifugeres ned ved 12.000 x g i 2 minutter for at blokere uspecifik antistofbinding.
BEMÆRK: Hvis restopløsningen øverst i kolonnen er mærkbar, vendes filteret i opsamlingsrøret på hovedet, og centrifugeres ned ved 3.000 x g i 2 min. - Der pipetteres 50 μg af antistoffet i et volumen opløsning på 100 μL til filtersøjlen, og centrifugeres ned ved 12.000 x g i 8 minutter.
BEMÆRK: Brug et spektrofotometer til at måle koncentrationen af det oprensede antistof og til at beregne volumenet af opløsning svarende til 50 μg af antistoffet. Hvis antistofopløsningens volumen er mindre end 100 μL, justeres lydstyrken til 100 μL ved tilsætning af 1x PBS. Der tilbageholdes 1 μg ukonjugeret antistof til konjugationsbekræftelse (trin 4.4). - Der pipetteres 260 μL reduktionsmasterblanding (20 μL reduktionsopløsning 1 blandet med 825 μL reduktionsopløsning 2, hvilket er tilstrækkeligt til tre antistofkonjugationsreaktioner) til hver filtersøjle. Vortex forsigtigt masterblandingen i 2-3 s, eller pipette op og ned for at blande opløsningen med antistoffet. Inkuber ved RT i 30 min.
- Efter inkubation drejes filterkolonnerne ned ved 12.000 x g i 8 minutter. Der tilsættes 450 μL konjugationsopløsning til filterkolonnerne, og centrifugeres ned ved 12.000 x g i 8 minutter.
- Den ønskede stregkode resuspenderes i 10 μL nukleasefrit vand og 210 μL konjugationsopløsning.
BEMÆRK: Forbered et antistofmærke umiddelbart før brug til farvningen. Genbrug ikke antistofstregkodealikvoter. - Når spin-down er afsluttet i trin 3.2.4, tilsættes det resuspenderede antistofmærke (ca. 220 μL) i hver tilsvarende filterkolonne. Blandingen pipetteres forsigtigt op og ned for at blande reagenserne. Luk filtersøjlelågene, og inkuber konjugationsreaktionen ved RT i 2 timer. Efter 2 timer drejes filterkolonnerne ned ved 12.000 x g i 8 minutter.
BEMÆRK: Til verifikationsprotokollen anbefales 5 μL af den konjugerede opløsning i et polymerasekædereaktionsrør og opbevarer den ved 4 °C (se nedenfor). - Der pipetteres 450 μL af rensningsopløsningen i hver filtersøjle, og centrifugeres ned ved 12.000 x g i 8 minutter. Gentag tre gange.
- Der pipetteres 100 μL af opbevaringsopløsningen ind i filterkolonnerne. Rør forsigtigt blandingen op og ned mere end 10 gange, og vask forsigtigt siderne af filtrene i søjlen.
BEMÆRK: 50 μg antistof opløses i 100 μL af opbevaringsopløsningen. Hvis konjugationsreaktionen startes med mere end 50 μg antistof, tilsættes mere opbevaringsopløsning i dette forhold. - Inverter filterkolonnerne i et frisk opsamlingsrør. Spin ned ved 3.000 x g i 2 min ved RT. Opbevar den indsamlede opløsning. Den konjugerede antistofopløsning pipetteres i sterile skruerør, og den opbevares i op til 1 år ved 4 °C.
BEMÆRK: Et konjugeret antistof skal testes med multiplexbilleddannelsesteknologien efter 2 dage. Testning forud for dette kan resultere i nuklear farvning med høj baggrund.
- Der suges og påføres 500 μL af den filterblokerende opløsning med pipette på 50 kDa afskæringsfilterkolonnerne med molekylvægt, og centrifugeres ned ved 12.000 x g i 2 minutter for at blokere uspecifik antistofbinding.
4. Bekræftelse af bøjning
BEMÆRK: Før der udføres farvningsforsøg med et brugerkonjugeret antistof ved hjælp af multiplexbilleddannelsesteknologien, skal konjugeringen bekræftes ved anvendelse af gelelektroforese med 5 μL af det konjugerede antistof (se trin 3.2.6) sammen med 1 μg af et ukonjugeret antistof (normalt i 2 μL af blandingen) som kontrol. En vellykket antistofkonjugering vil blive demonstreret ved en stigning i antistoffets molekylvægt. Denne bekræftelsesprotokol vurderer imidlertid kun succesen af den kemiske reaktion til konjugering og adresserer ikke den antistofvalidering, der anvendes til multiplekset billeddannelse.
- Der pipetteres henholdsvis 8 μL og 11 μL nukleasefrit vand ind i det reserverede konjugerede antistof og kontrolantistof for at opnå et slutvolumen på 13 μL.
- Der pipetteres 5 μL LDS-prøvebuffer (eller andet natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforesesystem) og 2 μL prøvereduktionsmiddel i hver prøve af det reserverede konjugerede antistof, og prøverne denatureres i et 95 °C tørt bad i 10 minutter.
- Mens prøverne denatureres, fortyndes 40 ml MOPS SDS-løbebuffer i 760 ml ultrarent vand, placeres en gel i tanken i et elektroforesesystem, og den fortyndede løbebuffer hældes over gelen.
- Når denatureringsperioden på 10 minutter er afsluttet, fyldes en brønd af gelen med en præfarvet proteinstandard, en med det ukonjugerede antistof (fra trin 3.2.2) og de resterende huller med de konjugerede antistofprøver. Kør derefter gelen ved 150 V, indtil proteinstandarden vises i slutningen af gelen.
BEMÆRK: Gelen klæber let til mikrobølgesikre beholdere og kan derfor rive, så gelen skal håndteres med forsigtighed i de følgende trin. - Når løbet er afsluttet, overføres gelen til en mikrobølgesikker beholder, der er fyldt med ultrarent vand, og opvarmes i en mikrobølgeovn, indtil den første boble i vandet visualiseres.
BEMÆRK: Den tid, det tager for bobler at dannes, varierer meget afhængigt af den anvendte mikrobølgeovn. - Tøm vandet fra beholderen, hæld ca. 250 ml Coomassie G-250 plet over gelen, og opvarm gelen i en mikrobølgeovn, indtil den første boble er visualiseret. Fjern derefter beholderen med gelen og Coomassie G-250-pletten fra mikrobølgeovnen, og læg den på en ryster i 10 minutter.
- Efter omrystning skal du forsigtigt dræne pletten, udskifte den med ca. 200 ml ultrarent vand og derefter placere beholderen på rysteren for at vaske gelen.
- Tøm det ultrarene vand, og erstat det med nyt ultrarent vand fem gange, eller indtil resterne af pletten ikke er synlige i vandbadet. Lad gelen vaske natten over på rysteren, indtil båndene er synlige, hvis det er nødvendigt, før du fotograferer gelen (figur 1).
BEMÆRK: De antistoffer, der anvendes i multiplekset billeddannelse, skal have farvningsmønstre, der kan sammenlignes med dem af farvestofkonjugerede antistoffer. Vævssektioner med kendte antigener, der er positive for konjugerede antistoffer, kan farves med oligonukleotidkonjugerede og farvestofkonjugerede antistoffer. I dette arbejde var vævsmorfologierne for begge antistoftyper i hvert tilfælde ækvivalente og harmoniserede med hinanden såvel som den forventede cellefordeling baseret på biologien af proteinerne af interesse og testvævsprøverne. Dette resultat demonstrerer effektiviteten af at anvende oligonukleotidkonjugerede antistofdele til vævsfarvningsbaserede tilgange ved anvendelse af FFPE-væv.
5. Oligonukleotid-konjugeret antistoffarvning
- Forbered dæksedler til vævsplacering.
- Sug dæksedlerne i blød i en 0,1% poly-L-lysinopløsning i 24 timer ved RT for at forbedre vævets vedhæftning.
- Efter iblødsætning drænes poly-L-lysinopløsningen, og dækslerne vaskes med ultrarent vand i 30 sekunder. Gentag vasken fire til seks gange. Fjern dæksedlerne fra det ultrarene vand, der bruges til vask, og læg dem på et fnugfrit håndklæde for at tørre natten over.
BEMÆRK: En histolog skal skære det valgte væv i sektioner, der er 5 μm tykke, placere dem på midten af en poly-L-lysinladet dæksel og lade dem tørre natten over. Efter tørring skal dæksedlerne med vævssektionerne opbevares ved 4 °C i højst 6 måneder. Farvningspanelet i denne protokol indeholdt 26 markører. Det væv, der blev anvendt i denne protokol, var normalt humant mandelvæv. Dækselsedtiden bør ikke overstige 1 uge. Poly-L-lysinbelagte dæksedler kan opbevares hos RT og skal anvendes inden for 2 måneder efter forberedelsen.
- Dagen før farvning anbringes dækselholderen i en ovn på 60 °C natten over.
- Den følgende dag anbringes dækselprøven i en forvarmet dækslipholder i en ovn på 60 °C. Efter bagning i 30 minutter skal du kontrollere, at paraffinen er smeltet væk fra vævet.
- Anbring hurtigt dækselholderen/prøven i følgende opløsningsserie: to runder afvoksningsmiddel i 6 minutter hver; to runder 100% ethanol i 5 minutter hver; en runde 90% ethanol i 5 minutter; en runde 70% ethanol i 5 minutter; en runde 50% ethanol i 5 minutter; en runde 30% ethanol i 5 minutter; og to runder diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet ultrarent vand i 5 minutter hver.
BEMÆRK: Alle fortyndinger af ethanol fremstilles med DEPC-behandlet ultrarent vand. Hvis xylen anvendes til afvoksning, skal den bruges i en hætte. - Mens du udsætter dækselholderen/prøven for opløsningsserien, skal du gøre følgende:
- Forbered et fugtighedskammer ved at placere en tom pipettespidsboks med et vandgennemblødt køkkenrulle i bunden.
- Fyld en trykkoger med nok vand til halvvejs at dække et 50 ml bægerglas.
- Der anbringes 5 ml methanol pr. prøve i bægerglasset ved 4 °C.
- Fortynd AR9-buffer med DEPC-behandlet ultrarent vand til 1x; Der kræves ca. 50 ml af den fortyndede buffer pr. dækslipholder.
- Når opløsningsserien er færdig, fyldes et 50 ml glasbægerglas med ca. 40 ml 1x AR9-buffer, dækslipholderen/prøven nedsænkes i bægerglasset, og bægerglasset/dækslipholderen dækkes helt med aluminiumsfolie.
- Anbring det aluminiumsfoliebeklædte bægerglas/dækselholder i den vandfyldte trykkoger, og kog ved højt tryk (ca. 15 psi) i 20 minutter.
- Efter tilberedning fjernes bægerglasset/dækselholderen, aluminiumsfolien pakkes forsigtigt ud, og bægerglasset/dækselholderen afkøles ved RT i ca. 10 minutter.
- Fjern dækselholderen/prøven fra 1x AR9-bufferen, og nedsænk den i to runder DEPC-behandlet ultrarent vand, og udfør en inkubation af prøverne i begge runder i 2 minutter hver.
- Under inkubationen hentes hydreringsbufferen, blokeringen N, blokerende G, blokerende J og blokerende S-opløsninger og antistoffortyndingsmidlet/blokken fra det multipleksede billeddannelsesfarvningssæt. For to dækslipprøver mærkes 6-brøndsplader til opløsningerne ved hjælp af konfigurationerne vist i figur 2.
- Dækslipprøven anbringes i to runder med 5 ml hydreringsbuffer i hver 2 minutter.
- Efter begge runder anbringes i hydreringsbufferen, dækselprøven anbringes i 5 ml af det multipleksede billeddannende antistoffortyndingsmiddel/blok og inkuberes i 20-30 minutter ved RT (må ikke overstige 30 min).
- Under inkubationen fremstilles en antistofcocktail ved at fremstille en 200 μL masterblanding af multipleksede billeddannende antistoffortyndingsmidler/-blokkere, N-blokker-, G-blokker-, J-blokker- og S-blokkeropløsninger.
BEMÆRK: Beregn den samlede antistofmængde baseret på antallet af markører og hver markørs validerede titrering, og træk den samlede antistofmængde fra masterblandingen. For eksempel for seks markører, hver med en 1:200 titrering, ville ligningen være 200 μL masterblanding - 6 μL antistofcocktail = 194 μL masterblanding.
- Efter inkubation i multipleksbilleddannelsesantistoffortyndingsvæsken/-blokken anbringes dækslipprøven i fugtighedskammeret, der er fremstillet i trin 5.5.1, pipette 190 μL af antistofcocktailen på dækslipprøven, og dækslipprøven inkuberes ved RT i 3 timer.
- Efter inkubation vaskes dækselprøven i to runder med 5 ml multiplekset billeddannende antistoffortyndingsmiddel/-blok i hver 2 minutter.
- For at fastgøre de bundne antistoffer mod vævet på dæksedlen skal du udføre trin 5.7.3-5.7.5 i fugtighedskammeret.
- Inkuber dæksedlerne i 10 minutter med 16% formaldehyd fortyndet til 1,6% med opbevaringsopløsning, og vask derefter dæksedlerne tre gange med 1x PBS.
- Dæksedlerne inkuberes i 5 minutter med 4 °C methanol, og derefter vaskes dæksedlerne tre gange med 1x PBS.
- Inkuber dæksedlerne i 20 minutter med 5 ml fikseringsreagens fortyndet med 1x PBS, og vask derefter dæksedlerne tre gange med 1x PBS.
- Opbevar de farvede dækslipprøver i opbevaringsbufferen ved 4 °C i op til 2 uger
6. Multiplexed billeddannende reporterplade
BEMÆRK: En 96-brønds plade, kaldet en reporterplade, der indeholder stregkodede fluoroforer i individuelle brønde, fremstilles i henhold til specialdesignede multipleksede billeddannelseseksperimenter og korrelerer med hver farvet dækselprøve. Følgende trin er til forberedelse af reporterpladen.
- Forbered en reportermasterblanding ved at kombinere 4.880 μL nukleasefrit vand, 600 μL 10x multiplekset billedbuffer, 500 μL af et assayreagens og 20 μL nuklear pletopløsning. Dette vil være nok til 20 cyklusser af alle brøndene.
- I hver cyklus af det specialdesignede multipleksede billeddannelseseksperiment skal du fylde en brønd med 245 μL af en opløsning, der indeholder reportermasterblandingen og de specifikke stregkodede fluoroforer for den cyklus.
BEMÆRK: Se figur 3 for reporterpladekonfigurationen, der anvendes i denne protokol for et karcinompanel. - For at beskytte de stregkodede fluoroforer skal du klæbe et foliepladedæksel over reporterpladen og placere pladen i det multipleksede billeddannelsesinstrument.
- Opbevar reporterpladen i en mørk æske ved 4 °C i op til 2 uger.
7. Kalibrering og kørsel af multiplexbilleddannelsesmaskinen
BEMÆRK: Højopløsningsbilledfluorescensmikroskopet fanger fire forskellige fluorescenskanaler i hver multiplekset billeddannelsescyklus ved 20x, 100% excitationslys og med lav fotoblegning.
- Kalibrer billeddannelsens fokus ved hjælp af DAPI-kanalen ved at placere en prøvedæksel på mikroskoptrinnet og manuelt pipettere 700 μL af en 1:1.500-titrering af nuklear pletopløsning på vævet.
BEMÆRK: Dæksedlen opbevares på mikroskopstadiet under prøvevask og billeddannelse. - For at forberede det multipleksede billeddannelsesinstrument fortyndes 10x multiplekset billedbuffer til 1x ved hjælp af DEPC-behandlet ultrarent vand og fyldes reagensflasker med passende opløsninger/opløsningsmidler, herunder den fortyndede 1x multipleksede billedbuffer, DEPC-behandlet ultrarent vand og dimethylsulfoxid (DMSO).
- Når reagensflaskerne er fyldt korrekt, skal du indtaste det eksperimentelle design i multiplexed imaging instrument manager software; angive den korrekte cyklus, brøndnumre, z-stack-steder, markørnavn, klasse og eksponeringstid for hver cyklus (figur 4); indstil alle mikroskopparametre; , og vælg de interessante områder på den prøveomslag, der skal afbildes.
- Klik på knappen Eksperiment i kontrolsoftwaren (figur 4A). I vinduet Opsætning og administration af eksperiment skal du klikke på knappen Ny skabelon (figur 4B).
- Skriv projektnavnet i området ud for knappen Projekt (Figur 4C). Skriv eller vælg det samlede antal cyklusser (figur 4D).
- Klik på knappen Kanaltildeling , skriv oplysningerne for hver cyklus i kolonnerne (figur 4E), og klik på knappen Gem skabelon . Start eksperimentet ved at klikke på knappen Start eksperiment .
BEMÆRK: Under et multiplekset billeddannelseseksperiment henter instrumentet de stregkodede fluoroforer fra en brønd på reporterpladen (maksimalt fire fluoroforer pr. Brønd, inklusive DAPI), dispenserer dem direkte på prøvedækslet og afbilder interesseområderne for hver fluorescenskanal. Efter al billeddannelse for den cyklus vasker instrumentet de stregkodede fluoroforer af og dispenserer den næste cyklus af reportere (fra den næste brønd på reporterpladen). Billeddannelsen fortsætter, indtil alle cyklusser med 26 markører er afsluttet.
8. Indsamling af billeder
BEMÆRK: Multiplexede billeder kan indsamles ved hjælp af ethvert tilpasset inverteret fluorescensmikroskop konfigureret med fire fluorescenskanaler (DAPI, Cy3, Cy5 og Cy7) og udstyret med et Plan Fluor 20x-objektiv. Billeddannelse og vask af dækslipprøverne udføres iterativt automatisk ved hjælp af en specialudviklet fluidikopsætning. Billederne er erhvervet ved hjælp af processorsoftware (v1.8.0.7) i QPTIFF-format.
- I processorvinduet skal du klikke på knappen Input og vælge eksperimentnavnet.
- I afsnittet Behandlingsindstillinger skal du vælge og kontrollere Baggrundssubtraktion, Dekonvolution, Udvidet dybdeskarphed og Skyggekorrektion. Klik på Start-knappen .
9. Billedanalyse
BEMÆRK: De erhvervede billeder kan uploades til en patenteret automatiseret billedanalysesoftware eller open source-softwareprogram (figur 5) til downstream-analyse.
- Klik på QuPath-ikonet på computeren, og åbn softwaren. Træk QPTIFF-arkivet til fremviservinduet .
- Klik på knappen Lysstyrke og kontrast, som åbner vinduet Lysstyrke og kontrast. Markér eller fjern markeringen af markøren i kolonnen Valgt for at vise eller lukke markørsignalet.
- Klik på knappen Zoom for at tilpasse for at zoome ind eller ud af interesseområdet.
BEMÆRK: Multiplexed billeddatavisualisering giver brugeren et dybt kig ind i vævsmikromiljøet. Individuelle markører i FFPE-prøver kan visualiseres i fluorescensformat (figur 6 og figur 7) eller i patologisk visning. Flere beregningsplatforme kan bruges til at behandle de sammensatte billeder og analysere de multipleksede vævsbilleddata. Ved hjælp af denne software kan rumlig fænotypning samt sjælden celleopdagelse og beregning af cellekvarter opnås med heldiasbilleder af ultrahøjt multiplekset væv genereret via multiplexbilleddannelsesteknologien. Se figur 6 for de 26 antistoffer i karcinompanelet og mandelprøven (supplerende figur 1).
Representative Results
Vi anvendte FFPE-tonsillprøver til at udvikle et 26-markør immunonkologisk panel til at illustrere immunstatus for FFPE-væv ved hjælp af et stregkodebilledanalysesystem. Samlet set anvendes 19 antistoffer i øjeblikket i andre multipleksede billeddannelsesundersøgelser i vores laboratorium. Alle markørerne er testet ved hjælp af FFPE-væv med kromogen IHC. Alle antistofferne blev konjugeret til unikke DNA-oligonukleotider. Når dækslerne opsættes ved hjælp af den webbaserede instrumentstyring (figur 4) til denne stregkodebilledanalyseteknologi, skal det bemærkes, at den første og sidste cyklus altid er "blank" (figur 2 og figur 4), hvilket giver baggrundsfluorescenssignalerne, der skal trækkes fra de specifikke signaler fra antistofferne. Efter billeder i QPTIFF-format er blevet indsamlet med fluorescensmikroskopet, kan de visualiseres ved hjælp af flere patenterede automatiserede billedanalysesoftware eller open source-softwareprogrammer. Sammensatte billeder kan vise alle markører eller markerede markører for en bedre visning af signalerne (figur 5). Desuden kan hvert antistof visuelt evalueres for nuklear, cytoplasmatisk eller membranøs lokalisering. Immun-, tumor- og stromale celler kan let identificeres. Derefter kan billedanalyse give information om signalintensiteten, det dynamiske område og den rumlige fordeling af alle markørerne (figur 6). Denne teknik tillod os at analysere alle 26 markører på subcellulært niveau i et enkelt vævsafsnit (figur 7). Ved at analysere markørernes co-lokalisering kunne vi identificere de cellulære fænotyper, lokalisere den rumlige celleposition, beregne afstanden mellem celler og finde fordelingen af cellerne. Den afgørende virkning af denne teknologi er præsentationen af et robust 26 markørpanel med fokus på immunstatus i vævsmikromiljøet.
Figur 1: Billede af brugerdefineret konjugeret antistofvalidering ved hjælp af en Bis-Tris proteingel. Bane 1 i gelen viser proteinstandarden. Bane 2 og bane 4 viser stregkodekonjugerede antistoffer (pile). Bane 3 og bane 5 viser de tunge og lette kædebånd fra et ukonjugeret antistof (pilespidser). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konfigurationskort over farvningspladen for to dækselprøver. Forkortelser: HB = hydreringsbuffer; B = antistoffortyndingsmiddel/blok PSFS = fikseringsopløsning efter farvning; PBS = fosfatbufret saltvand MeOH = methanol; S = opbevaringsløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Konfiguration af reporterplade. Hvert konjugeret antistof har en stregkode, der er komplementær til en bestemt reporter. For at opsætte reporterpladen skal hvert konjugeret antistof og dets tilsvarende reporter angives. Dernæst tildeles hvert antistof et cyklusnummer. Udførelsen af to blindcykler (C1 og C18) bruges til at evaluere niveauet af autofluorescens i de tre fluorescenskanaler og til post-imaging baggrundssubtraktion ved hjælp af billedoptagelseskontrolsoftwaren. En softwareguide kontrollerer instrumentet på dette tidspunkt for at sikre, at alle indstillinger er korrekte (figur 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Billedoptagelse ved hjælp af kontrolsoftwaren til eksperimentopsætningen. (A) Vælg fanen Eksperiment i nederste venstre hjørne af kontrolsoftwaren for at forberede og starte opsætningen. (B,C) Vælg Ny skabelon for at indtaste eksperimentindstillingerne med et nyt projekt- og eksperimentnavn. (D) Skift startcyklusbrønden og antallet af cyklusser for at afspejle reporterens placering i 96-brønds reporterpladen. E) Tildel de korrekte fluorescenskanaler til de fire kanaler, der er udpeget til forsøgskørslen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Billedvisualisering ved hjælp af webbaseret software (QuPath). Fremviservinduet viser 26 markører i FFPE-sektionen med farvet mandelvæv. Vinduet Lysstyrke & kontrast viser mærkerne med fluebenet. Endelig viser fremviservinduet FFPE-prøven med de valgte markører. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billedvisualisering ved hjælp af webbaseret software. (A) Tonsillvævssektioner blev farvet til de 26 markører, og billederne af sektionerne i QPTIFF-format blev visualiseret ved hjælp af kommerciel digital diasfremvisersoftware eller open source-software (QuPath) til annotering og gennemgang. (B-F) Seks markører blev vist i samme kommentar for bedre visning af signalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Visninger af de 26 individuelle markører, der bruges med webbaseret software. Markørekspressionen i mandelvævet vises via immunofluorescensfarvning med et immunonkologisk panel (øverst til venstre). Individuelle markører i to små områder (røde rektangler) vises. Det indzoomede indlæg viser celler, der er positive for disse markører (hvide pile). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Oversigt over arbejdsprocessen for multiplekset billedoptagelse. FFPE-vævssektioner blev farvet ved hjælp af 26-antistofpanelet efterfulgt af en multicyklusreaktion. Råbilleder af de farvede sektioner blev beregningsmæssigt behandlet, og en celletæthed og rumlig analyse blev udført ved hjælp af de sammensatte billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: IHC-validering i mandlvæv. FFPE-vævssektioner blev farvet under anvendelse af et individuelt antistof. Markørudtrykket i mandelvævet vises ved lav forstørrelse, og det zoomede skær viser celler, der er positive for markøren (røde rektangler). Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
TME spiller en væsentlig rolle i kræftudvikling, progression og behandlingsrespons. Derudover kan tætheden af specifikke tumorinfiltrerende lymfocytundergrupper i TME tjene som en prognostisk biomarkør for visse typer kræft. Bemærkelsesværdigt kan en tumors rumlige egenskaber ud over TME's cellulære sammensætning give en oversigt til forståelse af tumorens biologi og identifikation af potentielle prognostiske biomarkører12,17.
Da mange immuncellepopulationer er involveret i procancer- eller anticancerresponser, vil en bedre forståelse af disse celler og deres rumlige forhold til hinanden og med kræftceller hjælpe med at guide identifikationen af nye immunterapeutiske strategier. Tidligere undersøgelser har stratificeret placeringen og den rumlige fordeling af TME-celler baseret på vævsstrukturen i de intratumorale og peritumorale områder og tumorcellernes invasive margener18,19. I løbet af de sidste 15 år har teknologiske fremskridt gjort fænotypisk analyse af individuelle celler baseret på deres rumlige spredning til et nyt, indflydelsesrigt værktøj til at studere TME og kategorisere potentielle biomarkører for tumorimmunterapi. Multiplex IF histokemi kan samtidig estimere flere biologiske markører20.
I lighed med oligonukleotid-konjugeret antistofstrategi anvendes fire typer proteinbaserede multiplexplatforme til at studere TME: kromogen-, fluorescens-, DNA-stregkode- og metalisotopmærkede antistofdetekteringssystemer. De omkostningseffektive kromogene IHC-platforme muliggør heldiasvisualisering og patologisk vurdering ved hjælp af konventionel lysfeltmikroskopi. I multiplexet IF og IHC anvendes antistoffer konjugeret med fluoroforer. Multiplex IF/IHC-platformen detekterer antistoffer med høj specificitet og kan kvantificere målrettede antistoffer selv på subcellulært niveau 6,21. På grund af kromogenernes og fluoroforernes natur kan brugen af et antistofpanel desuden fange ekspressionen af op til 10 biomarkører på et enkelt dias. På metalisotopbaserede platforme anvendes metalmærkede antistoffer til at udføre multiplekset billeddannelse med enkeltcelle- og rumlig opløsning og høj følsomhed for individuelle vævssektioner22. Teoretisk set muliggør disse metalkonjugerede antistofmetoder samtidig påvisning af mere end 100 biomarkører på en enkelt vævssektion. En udfordring ved isotopmærkningsteknikken er isobarisk interferens, som forhindrer 100% renhed af berigelse i at blive nået23. Desuden øges interferensen, når antallet af markører øges. DNA-konjugerede antistofdetekteringsplatforme genkender antistoffer mærket med unikke DNA-stregkoder. Mere end 40 biomarkører kan fanges samtidigt med høj specificitet på disse platforme6.
Multiplexed imaging er en kommercielt tilgængelig DNA-stregkodemærket antistofdetekteringsplatform til påføring af DNA-konjugerede antistoffer på et enkelt vævsglas i et trin (figur 8). Til vævsforberedelsesfasen, i modsætning til den multipleksede ionstrålebilleddannelsesplatform, som kræver brug af guldbelagte dias opnået fra producenter, kræver den multipleksede billeddannelsesplatform kun regelmæssige dæksedler eller dias belagt med 0,1% poly-L-lysin for at hjælpe vævet med at klæbe til det og holde vævet intakt under farvnings- og billeddannelsesprocessen. Brug af vævssektioner på dæksedler inden for 4 uger efter sektionering anbefales, da langvarig opbevaring af ufarvede dias resulterer i antigenicitetsreduktion. En farvet dækslipprøve kan opbevares i opbevaringsbuffer ved 4 °C i op til 2 uger uden at miste farvesignalet. Der kræves ikke specielt udstyr til opbevaring af dækslipprøverne. Det multipleksede billeddannelsessystem er blevet opgraderet til at bruge almindelige dias i stedet for dæksedler, hvilket muliggør farvning af større væv og nem håndtering. Ved anvendelse af en reduktionsopløsning til antistofkonjugering (trin 3.2.3) bør reaktionen begrænses til højst 30 min for at forhindre beskadigelse af antistoffer. De blokerende buffere i trin 5.6.6 skal være frisklavede, og blokeringsbufferne må ikke genbruges.
Sammenlignet med kromogen-, fluorescens- og metalisotopmærkede multiplex-antistofdetekteringsplatforme har den multipleksede billeddannelsesteknologi visse fordele. For eksempel er mere end 60 foruddesignede antistofpaneler til multiplexbilleddannelse kommercielt tilgængelige, hvilket hjælper med at spare tid og omkostninger ved antistofkonjugering og validering, og antallet af foruddesignede antistofpaneler vokser. Disse antistoffer, som omfatter carcinommarkøren pan-cytokeratin, melanommarkøren SOX10, den vaskulære markør CD31, stromalmarkøren SMA og adskillige immuncellemarkører, er valideret og eksperimentklar. For antistoffer, der ikke er prædesignet, er det kommercielt tilgængelige konjugationssæt designet til brug med multiplexbilleddannelse ligetil og brugervenligt. Kundekonjugerede antistoffer er gode i 1 år, når de opbevares ved 4 °C. Derudover kræves der ikke maskinopvarmning for at tage billederne. I denne multipleksede billeddannelsesteknologi resulterer de iterative vaske-, hybridiserings- og stripping-trin i billedoptagelsen sjældent i nedsat markørintensitet eller nedbrudt vævsmorfologi 5,24,25. Desuden optages sammensatte billeder i QPTIFF-format med et simpelt trefarvet fluorescensmikroskop og kan uploades og analyseres ved hjælp af tredjeparts digital analysesoftware. Farvningsmarkørerne kan visualiseres ved enkeltcelleopløsning, og cellefænotyper kan karakteriseres via co-lokalisering af markørerne (figur 6 og figur 7). Den omfattende analyse af et multiplekset billede afslører yderligere vævsrummene, kvantificering af enkeltcellemarkører og nærmeste nabo- og nærhedsdata (figur 8).
En udfordring i multiplekset billedanalyse er celletypeidentifikation. Normalt, når flere enkeltobjektklassifikatorer anvendes på et billede, vil mere usædvanlige fænotyper blive kommenteret. Derfor anbefales det at bruge kendte markører, der ikke er co-udtrykt i den samme klassifikator, og kun anvende den fænotyperelaterede klassifikator til annoteringen af enkeltceller. Variationer i celletypeannotation vil resultere i væsentligt forskellige rumlige resultater, såsom forskelle i cellerumlig fordeling og cellulær kvarteranalyse26,27.
Multiplexed billedanalyse har vist sig at være vellykket til farvning og billeddannelse af mange prøvetyper, herunder FFPE-væv, frisk frosset væv, arkiverede hele dias og vævsmikroarrays. Multiplexede billeder af bryst-, hjerne-, lunge-, milt-, nyre-, lymfeknude- og hudvævssektioner kan erhverves med dybe enkeltcellede rumlige fænotypedata 5,16,25,28.
I fremtiden forventes flere prædesignede antistoffer til multiplekset billeddannelse. Derudover er udviklingen af specifik software til multiplexet billedanalyse meget nødvendig. I øjeblikket findes der mange kommercielt tilgængelige og open source-softwareprogrammer til Hi-Plex-billedanalyse29, men forskere har stadig brug for hjælp til at skabe en standardarbejdsgang for disse analyser30,31. Selvom de sammensatte billeder, der er taget ved hjælp af denne protokol, er kompatible med tredjepartssoftware, kan dette resultere i ekstra omkostninger for brugeren. En anden ulempe ved den multipleksede billeddannelsesteknologi er signalreduktionen i nuklear proteindetektion efter iterativ vask, hybridisering og stripping med store paneler af antistoffer. Heldigvis kan dette minimeres ved at hente de stregkodede fluoroforer i tidlige cyklusser, når reporterpladerne designes. For nylig blev denne platform opgraderet med et nyt højhastighedsscanningssystem, hvilket dramatisk har reduceret tiden til at opnå sammensatte billeder32. Derudover er en ny strategi ved hjælp af tyramidkonjugerede stregkoder blevet rapporteret for at forbedre oligonukleotid-konjugeret antistof-stregkodningsbaseret billeddannelse. Denne teknologi har til formål at forstærke farvningssignaler, for hvilke stregkodekonjugerede antistoffer er vanskelige at opnå33.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Donald R. Norwood fra Editing Services, Research Medical Library ved MD Anderson for redigering af denne artikel og multiplex IF og billedanalyselaboratoriet i Institut for Translationel Molekylær Patologi ved MD Anderson. Dette projekt blev delvist støttet af Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform ved Institut for Translationel Molekylær Patologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center og NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (til MD Anderson Cancer Center CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
| 10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
| 1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
| Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| Ethanol, 200 proof | |||
| G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
| Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
| Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
| Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
| 5450003 (BX022/RX022) | |||
| 5450023 (BX002/RX002) | |||
| 5250002 (BX020/RX020) | |||
| 2520003 (BX023/RX023) | |||
| 5250005 (BX029/RX029) | |||
| 5250007 (BX035/RX035) | |||
| 5250012 (BX052/RX052) | |||
| 5550012 (BX030/RX030) | |||
| 5550015 (BX042/RX042) | |||
| 5550014 (BX036/RX036) | |||
| QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
| Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses. Frontiers in Immunology. 11, 940 (2020).
- Jin, M. Z., Jin, W. L. The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166 (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Communications Biology. 5 (1), 438 (2022).
- Taube, J. M., et al. Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197 (2021).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
- Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology. Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).
- Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease. Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).
- Phillips, D., et al. Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma. Nature Communications. 12 (1), 6726 (2021).
- Jhaveri, N., et al. Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues. Cancer Research. 82, 3877 (2022).
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Yuan, Y.
- Bruck, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).
- Tsujikawa, T., et al. Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers. Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).
- Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747 (2021).
- Parra, E. R., et al. Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues. Scientific Reports. 11 (1), 4530 (2021).
- Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Frontiers in Immunology. 12, 666233 (2021).
- Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (184), e64015 (2022).
- Schurch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).
- Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging. Frontiers in Immunology. 12, 687673 (2021).
- Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data. Frontiers in Immunology. 12, 727626 (2021).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999 (2022).
- Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays. Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).
- Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry. Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183 (2020).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- DeRosa, J. Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture. Genetic Engineering & Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).
- Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging. Communications Biology. 5 (1), 627 (2022).
