Summary
यह प्रोटोकॉल कवक और बैक्टीरिया द्वारा संदूषण से बचने के लिए अनुसंधान सेल संस्कृति प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली आवश्यक सेल कल्चर तकनीकों और प्रथाओं को प्रस्तुत करता है। बैक्टीरिया की श्रेणी के भीतर, माइकोप्लाज्मा संदूषण को रोकने पर विशेष जोर दिया जाएगा।
Abstract
सेल कल्चर एक नियंत्रित वातावरण में मानव, पशु और कीट कोशिकाओं, या अन्य ऊतकों को बढ़ाने के लिए आवश्यक एक नाजुक कौशल है। प्रोटोकॉल का लक्ष्य कवक और बैक्टीरिया से संदूषण को रोकने के लिए एक शोध प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली सही तकनीकों पर जोर देना है। माइकोप्लाज्मा संदूषण से बचने पर विशेष जोर दिया जाता है, जो सेल कल्चर रूम में एक बड़ी चिंता का विषय है क्योंकि इसके छोटे आकार और सेल कल्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध के कारण। ये समान तकनीकें निरंतर विकास सुनिश्चित करती हैं और स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखती हैं। नए और अनुभवी सेल संस्कृति उपयोगकर्ताओं के लिए समान रूप से, संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए इन सर्वोत्तम प्रथाओं का लगातार पालन करना महत्वपूर्ण है। वर्ष में एक बार, प्रयोगशालाओं को सेल संस्कृति सर्वोत्तम प्रथाओं की समीक्षा करनी चाहिए और यदि आवश्यक हो तो चर्चा या अतिरिक्त प्रशिक्षण के साथ अनुवर्ती कार्रवाई करनी चाहिए। पहले स्थान पर संदूषण को रोकने के लिए प्रारंभिक कार्रवाई करने से समय और धन की बचत होगी, संदूषण होने के बाद सफाई की तुलना में। सार्वभौमिक सर्वोत्तम प्रथाएं सेल संस्कृतियों को स्वस्थ रखती हैं, जिससे लगातार नई कोशिकाओं को पिघलाने, महंगे सेल कल्चर मीडिया खरीदने और इनक्यूबेटर परिशोधन और डाउनटाइम की मात्रा को कम करने की आवश्यकता कम हो जाती है।
Introduction
अनुसंधान प्रयोगशाला में सेल कल्चर के कई उपयोग हैं। 20 वीं शताब्दी की शुरुआत में सेल संस्कृति की उत्पत्ति के बाद से, सेल लाइनों ने विज्ञान को आगे बढ़ाने में मदद की है। सेल लाइनों के कई फायदे हैं; विभिन्न सेल लाइनें शोधकर्ताओं को सेल बायोलॉजी का अध्ययन करने, आगे के अध्ययन के लिए बैकुलोवायरस का उत्पादन करने,या बड़ी मात्रा में प्रोटीन का उत्पादन करने में मदद कर सकती हैं। कुछ अतिरिक्त उपयोगों में ऊतक वृद्धि का अध्ययन करना, वैक्सीन विकास को आगे बढ़ाने में मदद करना, विष विज्ञान अनुसंधान, स्वस्थ जीवों और रोगग्रस्त मॉडल में जीन की भूमिका का अध्ययन करना और हाइब्रिड सेल लाइनों 2,3 का उत्पादन शामिल है। सेल लाइनें दवा उत्पादन को भी सक्षम कर सकतीहैं 3. सेल लाइनों के साथ काम करते समय उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक आवश्यक है; इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रथाएं और तकनीकें अनुसंधान प्रयोगशालाओं पर लागू होती हैं जहां सेल कल्चर कार्य किया जाता है। अन्य प्रयोगशाला सेटिंग्स पर चर्चा नहीं की जाती है।
सेल कल्चर कार्य करते समय संदूषण अक्सर प्राथमिक चिंता का विषय होता है। इस पेपर के संदर्भ में, संदूषण आम तौर पर कवक और बैक्टीरिया को संदर्भित करता है। इस पेपर में उल्लिखित विधि का समग्र लक्ष्य संदूषण से बचने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का पूरी तरह से वर्णन करना है। सभी प्रयोगशाला सदस्यों को एक शोध प्रयोगशाला के सेल कल्चर रूम में काम करते समय इन प्रथाओं का पालन करना चाहिए। प्रयोगशालाओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सभी श्रमिक संदूषण को रोकने के लिए इन सर्वोत्तम प्रथाओं का उपयोग करने में सक्रिय भागीदार हैं। सही प्रथाओं और तकनीकों का ज्ञान यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि सेल संस्कृतियां व्यवहार्य, स्वस्थ और संदूषण से मुक्त रहें। इस तकनीक का विकास साहित्य के अनुसंधान, सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के सात साल के अनुभव और एक ऐसी विधि की आवश्यकता पर आधारित है जिसे नौसिखिए और अनुभवी सेल संस्कृति कार्यकर्ता दोनों वार्षिक आधार पर संदर्भित कर सकते हैं।
एक स्पष्ट, मानकीकृत तकनीक की आवश्यकता है जिसे सभी अनुसंधान सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं का पालन करना चाहिए। सेल कल्चर संदूषण पर अधिकांश साहित्य माइकोप्लाज्मा का पता लगाने, सड़न रोकनेवाली तकनीकों, संदूषण के स्रोतों, दूषित पदार्थों के उन्मूलन और एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग और नियमित परीक्षण 4,5,6,7,8 की रोकथाम पर चर्चा करता है। हालांकि यह जानकारी सहायक है, साहित्य में कोई वीडियो मौजूद नहीं है जो उचित सेल संस्कृति तकनीकों का प्रदर्शन करता है जिसका पालन करना चाहिए। वैकल्पिक तकनीकों पर प्रस्तुत प्रथाओं का लाभ बाद में गलतियों का पता लगाने और सुधारने के बजाय, संदूषण को रोकने पर ध्यान केंद्रित करना है। इसके अलावा, सड़न रोकनेवाला तकनीकों का एक संपूर्ण प्रदर्शन, कवक और जीवाणु विकास को रोकने के बारे में चर्चा, और जैव सुरक्षा कैबिनेट एयरफ्लो के बारे में जानकारी नौसिखिया और अनुभवी सेल कल्चर श्रमिकों दोनों के लिए समान रूप से मूल्यवान है।
बैक्टीरिया और कवक दो सबसे आम प्रकार के दूषित पदार्थ हैं। बैक्टीरिया श्रेणी के भीतर, माइकोप्लाज्मा अपने छोटे आकार और प्रसार की क्षमता के कारण एक प्रमुख चिंता का विषय है, जबकि इस पर ध्यान नहीं दिया जाता है। वे आत्म-प्रतिकृति जीव हैं जिनमें कोई कठोर कोशिका भित्ति नहीं है जो बढ़ने के लिए यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर निर्भर करते हैं। उन्होंने चयापचय क्षमताओं को कम कर दिया है और सेल संस्कृतियों के नियमित दृश्य निरीक्षण और नियमित सूक्ष्म विश्लेषण में अज्ञात रहते हुए बहुत बढ़ सकते हैं, हालांकि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइकोप्लाज्मा 9,10 का पता लगा सकती है। इसके अलावा, वे माइक्रोबायोलॉजिकल फिल्टर10 से गुजर सकते हैं। सेल कल्चर माध्यम पोषक तत्वों के साथ माइकोप्लाज्मा प्रदान करता है, हालांकि दुर्भाग्य से एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया को पूरक करना माइकोप्लाज्मा10 को प्रभावित नहीं करता है। किसी को ध्यान देना चाहिए कि, सामान्य तौर पर, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मीडिया को पूरक करना आवश्यक नहीं है; संदूषण को दूर रखने के लिए उचित तकनीक पर्याप्त होनी चाहिए। माइकोप्लाज्मा के साथ संक्रमण तत्काल कोशिका मृत्यु का कारण नहीं बनता है, लेकिन यह शोधकर्ताओं से संबंधित है क्योंकि यह डेटा प्रजनन क्षमता और गुणवत्ता को प्रभावित करता है।
सभी प्रयोगशाला कर्मियों को अच्छी सेल संस्कृति प्रथाओं का सख्ती से पालन करना चाहिए। संस्कृतियों को माइकोप्लाज्मा के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए जब वे नए खरीदे गए हैं, जबकि वे वर्तमान में उगाए जा रहे हैं, क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले, और जब तरल नाइट्रोजन 2,10 से पिघलाया जाता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा), या इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके बाजार पर विभिन्न परीक्षण उपलब्ध हैं। साहित्य इंगित करता है कि "मानव आइसोलेट्स सेल कल्चर में पाए जाने वाले माइकोप्लाज्मा दूषित पदार्थों के एक बड़े प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं"। हालांकि 200 से अधिक माइकोप्लाज्मा प्रजातियों का वर्णन किया गया है, इनमें से लगभग छह अधिकांश संक्रमणों के लिए जिम्मेदार हैं। ये छह प्रजातियां हैं एम. आर्गिनी, एम. फर्मेंटन्स, एम. होमिनिस, एम. ह्योरिनिस, एम. ओरल, और अचोलेप्लाज़्मा लेडलावी10. अन्य प्रकार के संदूषण के साथ, हवा और एरोसोल इन्हेंसेल संस्कृतियों में लाते हैं। यह अन्य पत्रों में प्रतिध्वनित होता है क्योंकि "मानव ऑपरेटर संभावित रूप से प्रयोगशाला में सबसे बड़ा खतरा है"। हालांकि यह मानव त्रुटि के माध्यम से किया जाता है, यदि एक मानक प्रक्रिया का पालन किया जाता है तो जोखिम को समाप्त किया जा सकता है। कर्मियों से शेडिंग केवल माइकोप्लाज्मा संदूषण तक ही सीमित नहीं है; एक प्रयोगशाला में सेल कल्चर आमतौर पर एक ही माइकोप्लाज्मा प्रजातियों से संक्रमित होते हैं, यह दर्शाता है कि अनुचित सेलकल्चर तकनीकों के कारण संदूषण एक फ्लास्क से दूसरे फ्लास्क में फैलता है।
क्रॉस-संदूषण की रोकथाम भी एक और कारण है कि उचित सेल कल्चर तकनीकों का पालन किया जाना चाहिए। यह ध्यान दिया जाता है कि दुनिया भर में कम से कम 15% -18% सेल लाइनें क्रॉस-दूषित यागलत पहचान की जा सकती हैं। माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए सेल लाइनों का परीक्षण करने के अलावा, उन्हें क्रॉस-संदूषण10 के लिए भी परीक्षण किया जाना चाहिए। मानव सेल लाइनों के लिए, शॉर्ट टेंडम रिपीट (एसटीआर) प्रोफाइलिंग नामक एक सस्ती डीएनए-आधारित तकनीक द्वारा सेल लाइन प्रमाणीकरण वर्तमान अंतरराष्ट्रीय संदर्भ मानक है, क्योंकि यह सेल लाइन पहचान 2,10,13,14 की पुष्टि करने का एक आसान तरीका है। एसटीआर गलत लेबल या क्रॉस-दूषित सेल लाइनों की पहचान कर सकता है, लेकिन यह गलत ऊतक उत्पत्ति10,13,14 का पता नहीं लगा सकता है। अनुसंधान डेटा की वैधता से समझौता किया जा सकता है यदि सेल लाइनों को गलत तरीके से लेबल किया जाता है, गलत तरीके से पहचाना जाता है, यादूषित किया जाता है। अन्य प्रकार के संदूषण के समान, क्रॉस-संदूषण खराब तकनीक के कारण हो सकता है जिससे एरोसोल फैल जाते हैं, गलत संपर्क के कारण गलत सेल प्रकार फ्लास्क में प्रवेश करता है, या विभिन्नसेल लाइनों के साथ एक ही मीडिया बोतल और अभिकर्मकों का उपयोग करता है। मीडिया की बोतलों का कोई साझाकरण नहीं होना चाहिए; दो अलग-अलग सेल लाइनों के बीच मीडिया की एक बोतल साझा करने से उन सेल आबादी को मिश्रित किया जा सकता है, जिससे तेजी से बढ़ते सेल प्रकार फ्लास्क पर पूरी तरह से कब्जा कर सकते हैं। यह प्रतिस्थापन ध्यान देने योग्य नहीं है और गलत लेबलिंग और गलत पहचान की ओर जाताहै। एक सेल लाइन को दूसरे के लिए भी गलत माना जा सकता है यदि संस्कृतियों को हैंडलिंग या लेबलिंग10 के दौरान भ्रमित किया जाता है। अभिकर्मकों, मीडिया और फ्लास्क को एक दूसरे से अलग रखने पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रत्येक प्रयोगशाला सदस्य के पास अपनी मीडिया बोतलें होनी चाहिए; प्रयोगशाला के सदस्यों के बीच कोई साझाकरण नहीं होना चाहिए। सेल लाइनों को स्वयं एक योग्य सेल बैंक और प्रदाता से खरीदा जाना चाहिए। प्रयोगशालाओं को कोशिकाओं को साझा नहीं करना चाहिए। अध्ययनों से पता चलता है कि, हालांकि एसटीआर और माइकोप्लाज्मा परीक्षण नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं, साहित्य में कई शोध पत्रों ने पहले से ही गलत पहचान या दूषित सेल लाइनों15 का उपयोग किया है। इन समस्याग्रस्त पत्रों को खोजने और इस मामले के बारे में पाठकों को पूर्वव्यापी रूप से सूचित करने के लिए शोध के माध्यम से जांच करना बोझिल है। रोकथाम यह सुनिश्चित करने का सबसे अच्छा तरीका है कि यह समस्या पहली जगह में नहीं होती है।
70% ईटीओएच के साथ वस्तुओं को छिड़कने की सरल क्रिया जीवों को मार सकती है; 70% ईटीओएच प्रोटीन को विकृत करके और बैक्टीरियाऔर कवक सहित सबसे अधिक दूषित जीवों में लिपिड को भंग करके काम करता है। अध्ययनों से पता चला है कि 70% सबसे प्रभावी एकाग्रता है; सतह प्रोटीन 70% ईटीओएच के साथ तेजी से जमा नहीं होते हैं ताकि वे कोशिका में प्रवेश कर सकें, जबकि इसमें मौजूद पानी प्रोटीन की विकृत प्रक्रिया के लिए आवश्यक है। सेल की दीवार के दोनों ओर पानी और अल्कोहल की एकाग्रता अंतर के कारण, 70% ईटीओएच एंजाइमेटिक और संरचनात्मक प्रोटीन दोनों को विकृत करने के लिए सेल में प्रवेश करता है। यदि फ्लास्क में मोल्ड वृद्धि देखी जाती है, तो पूरे इनक्यूबेटर को पहले 70% ईटीओएच के साथ छिड़काव करके और इसे सूखने से दूषित किया जाना चाहिए, इसके बाद 60 डिग्री सेल्सियस17 पर 16 घंटे रात भर इनक्यूबेशन किया जाना चाहिए। यह अधिकांश मोल्ड और किसी भी बैक्टीरिया को मारता है।
संदूषण को खत्म करने की वैकल्पिक तकनीकों पर रोकथाम प्रथाओं का मुख्य लाभ यह है कि संदूषण को जल्दी रोकने से, प्रयोगशाला कार्यकर्ता यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि उनकी सेल संस्कृतियां स्वस्थ हैं और इनक्यूबेटरों के परिशोधन या सेल संस्कृतियों को त्यागने से जुड़ी कोई उच्च लागत नहीं होगी। उदाहरण के लिए, माइकोप्लाज्मा दूषित पदार्थों काउन्मूलन कुशल नहीं है। प्रयोगशाला कर्मियों को ठीक से प्रशिक्षित करने के लिए समय लेने के लिए, सेल कल्चर रूम स्व-निहित है, और एक मानक प्रक्रिया का उपयोग किया जाता है जो समय और धन बचाएगा।
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Protocol
1. तैयारी
- सामान्य
- केवल सेल कल्चर रूम में पहनने के लिए नामित एक साफ लैब कोट पहनें और प्रयोगशाला के अन्य हिस्सों में नहीं।
नोट: लैब कोट को बाँझ होने की आवश्यकता नहीं है। - नए दस्ताने पहनें जिन्होंने किसी अन्य सतह को नहीं छुआ है। सुनिश्चित करें कि दस्ताने कसकर फिट होते हैं। नाइट्राइल, पाउडर मुक्त दस्ताने सबसे अच्छे हैं।
नोट: दस्ताने बाँझ होने की आवश्यकता नहीं है। - काम की तैयारी के लिए, दस्ताने, लैब कोट आस्तीन, और जैविक सुरक्षा कैबिनेट के इंटीरियर को 70% ईटीओएच के साथ स्प्रे करें। काम करने वाली सतह और ग्लास पैनल को लिंट-फ्री पेपर टॉवल से पोंछें।
नोट: 70% ईटीओएच का उपयोग उच्चतम दक्षता16 के साथ बैक्टीरिया को मारता है। पेपर टॉवल को बाँझ होने की आवश्यकता नहीं है। - सेल कल्चर रूम के अंदर पानी के स्नान रखें और इनका उपयोग केवल वार्मिंग कल्चर मीडिया या पिघलने वाली कोशिकाओं के लिए करें। सफाई के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, सप्ताह में एक बार पानी के स्नान को छानें और धो लें।
- केवल सेल कल्चर रूम में पहनने के लिए नामित एक साफ लैब कोट पहनें और प्रयोगशाला के अन्य हिस्सों में नहीं।
- जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर।
- कैबिनेट में लाई गई वस्तुओं की संख्या सीमित करें। सामने या पीछे की ग्रिल को अवरुद्ध करके जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एयरफ्लो को बाधित न करें।
नोट: कैबिनेट के अंदर हवा कैसे बहती है, इसकी व्याख्या के लिए चित्र 1 देखें। - कैबिनेट के अंदर रखी सभी वस्तुओं को 70% ईटीओएच के साथ स्प्रे करें और उन्हें सूखा दें। मीडिया की बोतल के शीर्ष पर स्प्रे करके शुरू करें और नीचे काम करें। इसी तरह, एक साफ पेपर तौलिया के साथ, इसे सूखने से पोंछ लें, धीरे-धीरे नीचे की ओर काम करें। टोपी की ओर वापस मत जाओ।
- यदि कैबिनेट सीरोलॉजिकल पिपेट को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़ा है, तो उन्हें अंदर रखा जा सकता है, अन्यथा उन्हें कैबिनेट के बाहर लगाए गए एक रिसेप्टेक में संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग करने से पहले पैकेजिंग में छेद, आँसू या पंचर के लिए संलग्न पिपेट के दोनों ओर जांच ें। रैपिंग को न तोड़ें। इसके बजाय, रैपिंग के सिरों को धीरे से छीलें, सीरोलॉजिकल पिपेट को पिपेट सहायता में डालें, और एक द्रव गति में रैपिंग को हटा दें।
- खुली बोतलों या फ्लास्क पर न मंडराएं; खुली बोतलों या फ्लास्क पर पहुंचें, या जैविक सुरक्षा कैबिनेट में पहले से खुली वस्तुओं के शीर्ष पर आइटम खोलें।
नोट: कैबिनेट के अंदर एयरफ्लो काम की सतह पर नीचे धकेलता है, इसलिए आस्तीन पर मौजूद कोई भी संदूषण, उदाहरण के लिए, सेल संस्कृतियों में प्रवेश कर सकता है। - तरल पदार्थ न डालें। इसके बजाय, उन्हें सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके जोड़ें। मीडिया को पूरक करने के बाद, सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं और बोतल को प्रारंभिक करें। इसके अलावा, मीडिया के साथ पूरक होने के लिए एक लेबल शामिल करना सुनिश्चित करें।
- कैबिनेट में लाई गई वस्तुओं की संख्या सीमित करें। सामने या पीछे की ग्रिल को अवरुद्ध करके जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एयरफ्लो को बाधित न करें।
2. अनुयायी सेल लाइनों के साथ काम करना
- यदि प्लास्टिक फ्लास्क की आवश्यकता है, तो पूरे बैग को स्प्रे करें और इसे कैबिनेट के अंदर रखें।
- मीडिया या धोने के घोल को एस्पिरेट करने के लिए आटोक्लेव ग्लास पिपेट या डिस्पोजेबल बाँझ प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें। भंडारण कंटेनर से धातु की टोपी को सावधानी पूर्वक हटा दें। कंटेनर को एक कोण पर धीरे से हिलाकर एक ग्लास पिपेट को अलग करें। कंटेनर में पहुंचने पर, किसी भी अन्य पिपेट को छूने से बचें।
नोट: चुने हुए पिपेट को केवल एक छोर से संभालें। - जितनी जल्दी हो सके बोतलों पर कैप को बदलें। काम की सतह पर कैप को उल्टा रखें ताकि रिम काम की सतह को न छुए। टोपी को ऊपर या नीचे से न पकड़ें; इसके बजाय, टोपियों को किनारों से स्पर्श करें।
- तरल पदार्थ को एस्पिरेट करते समय, फर्श पर एक माध्यमिक कंटेनर में कैबिनेट के बाहर स्थित वैक्यूम ट्रैप फ्लास्क का उपयोग करें।
नोट: बायोहाज़र्ड अपशिष्ट बैग में कोई तरल अपशिष्ट न फेंकें क्योंकि बैग लीक हो जाएंगे। कैबिनेट के अंदर काम करते समय कचरा पैदा किया जाएगा। हाथों को अक्सर कैबिनेट के अंदर और बाहर ले जाने से हवा का प्रवाह बाधित होगा। अस्थायी रूप से कैबिनेट के अंदर कोई भी कचरा छोड़ दें। इसे साइड में रखें ताकि यह काम को बाधित न करे। - उदारतापूर्वक दस्ताने को 70% ईटीओएच के साथ स्प्रे करें जब भी वे सूख जाते हैं। हाथों को आपस में रगड़ें ताकि दस्ताने गीले न टपकें।
- यदि कोई सीरोलॉजिकल पिपेट गलती से कैबिनेट में किसी चीज को छू लेता है, तो उसे बाहर फेंकने में संकोच न करें। दूषित होने वाले पिपेट का उपयोग करने के बजाय एक साफ सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ नए सिरे से शुरू करें।
4. कोशिकाओं की जाँच और भंडारण
- इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखने से पहले, यह देखने के लिए जांचें कि वे माइक्रोस्कोप के नीचे कैसे दिखते हैं। यदि कोशिकाओं को पूरी तरह से निलंबित कर दिया गया है, तो एकल कोशिकाओं को देखा जाना चाहिए।
- इनक्यूबेटरों में न बोलें, छींकें, खांसें या भारी सांस न लें। जल्दी से इनक्यूबेटर के दरवाजे खोलें और बंद करें। दरवाजे को आवश्यकता से अधिक समय तक खुला छोड़ने से हवा में मौजूद दूषित पदार्थों को इनक्यूबेटरों में प्रवेश करने की अनुमति मिल सकती है।
नोट: सेल कल्चर रूम में काम करते समय मास्क पहनने से मदद मिल सकती है क्योंकि माइकोप्लाज्मा मानव मुंह में मौजूद हो सकता है। सेल कल्चर रूम में सेल फोन के उपयोग से बचें, क्योंकि बात करने की सिफारिश नहीं की जाती है। - सुनिश्चित करें कि कैबिनेट से बोतलों को हटाने से पहले सभी बोतलों पर कैप कसकर बंद हैं।
- सेल कल्चर मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें जब उपयोग में नहीं है क्योंकि यह प्रकाश संवेदनशील है।
- सेल कल्चर का काम पूरा होने के बाद फिर से 70% ईटीओएच के साथ कैबिनेट के इंटीरियर को स्प्रे करें और पेपर टॉवल से सतह को सूखा पोंछ ें। बायोहैज़र्ड कचरा अपशिष्ट बैग खाली करें। इस प्रक्रिया को दोहराएं और एक अलग सेल लाइन पर स्विच करते समय दस्ताने बदलें।
5. सस्पेंशन सेल लाइनों के साथ काम करना
- ग्लास फ्लास्क में उगाए गए निलंबन कोशिकाओं के लिए, सुनिश्चित करें कि दस्ताने 70% ईटीओएच के साथ अच्छी तरह से स्प्रे किए गए हैं, फिर गीले दस्ताने के साथ एल्यूमीनियम पन्नी को स्पर्श करें और कैबिनेट के अंदर रखने से पहले फ्लास्क के केवल निचले हिस्से को स्प्रे करें।
- सेल गिनती के लिए एक नमूना लेते समय, इसके कंटेनर से केवल एक 1.5 एमएल ट्यूब निकालें। किसी भी अन्य ट्यूब को न छुएं। काम करने की सतह पर टोपी को उल्टा रखें। अंदर के रिम को न छुएं। इसे किनारों से देखभाल के साथ संभालें और समाप्त होने के बाद इसे बदल दें।
- एल्यूमीनियम पन्नी के डबल-मुड़े हुए टुकड़े को ध्यान से हटा दें जो फ्लास्क की पूरी गर्दन को कवर करता है। कांच फ्लास्क को केवल नीचे से संभालें- पन्नी बंद होने के बाद इसे गर्दन से न छुएं। सेल गिनती के लिए एक नमूना लेने के लिए 1 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
- फ्लास्क के किनारे मीडिया को टपकने न दें; यदि ऐसा होता है, तो 70% ईटीओएच के साथ एक पेपर तौलिया स्प्रे करें और इसे तुरंत साफ करें।
- सुनिश्चित करें कि जैविक सुरक्षा अलमारियों से बोतलों या फ्लास्क को हटाने से पहले कैप और एल्यूमीनियम पन्नी को कस दिया जाए।
6. सेल इनक्यूबेशन
- विभिन्न सेल प्रकारों के क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों के लिए अलग-अलग इनक्यूबेटर का उपयोग करें।
7. तरल अपशिष्ट संग्रह
- 'अपशिष्ट' लेबल वाले द्वितीयक कंटेनर में फर्श पर कैबिनेट के बाहर स्थित वैक्यूम ट्रैप फ्लास्क में तरल अपशिष्ट एकत्र करें।
नोट: नली एक उच्च दक्षता कण अवशोषण (एचईपीए) फिल्टर से जुड़ा हुआ है, जिसे मासिक आधार पर प्रतिस्थापित किया जाता है।
8. सफाई
- बायोहाज़र्ड अपशिष्ट बैग को हटा दें और ग्लास फ्लास्क को जल्द से जल्द धो लें। सिंक के पास ग्लास-वॉशिंग प्रोटोकॉल रखें। वाशिंग प्रोटोकॉल के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।
- ग्लास वॉशिंग सुविधा में भेजने के बजाय सेल कल्चर ग्लासवेयर को ऑटोक्लेव करें। इसे लैब के मुख्य क्षेत्र में ग्लासवेयर से अलग रखें।
नोट: एसएफ -9 कोशिकाएं फ्लास्क के किनारे मृत कोशिकाओं का एक रिम छोड़ती हैं यदि ग्लास को अच्छी तरह से स्क्रब नहीं किया जाता है। आटोक्लेव प्रोटोकॉल के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें।
9. संगठन
- सेल कल्चर रूम को व्यवस्थित करें ताकि सभी आपूर्ति एक क्षेत्र में स्थित हों, जिससे प्रयोगशाला के सदस्यों को आपूर्ति की तलाश में कमरा छोड़ने की आवश्यकता कम हो जाए।
- कोशिकाओं की कटाई के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी प्लास्टिक की बोतलों को लेबल करें और बाद में सेल कल्चर में पुन: उपयोग करें जिसे 'सेल कल्चर उपयोग के लिए' के रूप में लेबल करें। एक विशिष्ट सेल प्रकार के लिए निर्दिष्ट सेल कल्चर बोतलों का उपयोग करें। आसान पहुंच के लिए सेल कल्चर रूम में बोतलों को स्टोर करें।
10. बैक्टीरिया, कवक और माइकोप्लाज्मा संदूषण की पहचान करना
नोट: ऊपर दिए गए वर्कफ़्लो का पालन नहीं करने से बैक्टीरिया, कवक और माइकोप्लाज्मा संदूषण हो सकता है।
- हमेशा काम शुरू करने से पहले, फ्लास्क का निरीक्षण करें, भारी मैलापन, फजी गेंदों के रूप में अतिरिक्त वृद्धि, और साइड में कोशिकाओं के घने संचय, जो सभी संदूषण के संकेतक हैं।
नोट: एक अनुभवी आंख माइक्रोबियल संदूषण बनाम वास्तविक कोशिकाओं के कारण टर्बिडिटी के बीच अंतर बता सकती है। जबकि कोशिकाएं सामान्य रूप से स्पष्ट मीडिया को बादल दिखाई देने का कारण बनती हैं, जीवाणु संदूषण सफेद रंग के साथ भारी मैलापन का कारण बनता है।- मीडिया में तैरती गोल, फजी गेंदों की उपस्थिति को ध्यान में रखते हुए मोल्ड संदूषण की पहचान करें ( चित्र 2 देखें)।
- यदि मीडिया बादल, सफेद या अशांत है तो नेत्रहीन रूप से जीवाणु संदूषण की पहचान करें ( चित्र 2 देखें)।
- मासिक माइकोप्लाज्मा परीक्षण करके माइकोप्लाज्मा संदूषण की पहचान करें। एक पीसीआर-आधारित परीक्षण उपयोगकर्ताओं को कोशिकाओं का 1.5 एमएल नमूना लेने, 10 μL का उपयोग करके सेल गिनती करने, 0.08 x 106 कोशिकाओं / mL तक पतला करने, कोशिकाओं को घुमाने, किट में निहित बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को घुमाने और एक अंतिम बार स्पिन करने का निर्देश देता है। सतह पर तैरनेवाला प्राइमरों के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो माइकोप्लाज्मा प्रजातियों की एक श्रृंखला को बढ़ाते हैं। बैंड की कल्पना करने के लिए एक डीएनए जेल चलाएं। कोई बैंड का मतलब नहीं है कि माइकोप्लाज्मा की पहचान नहीं की गई है।
नोट: यह प्रमुख संदूषक मानव मुंह में मौजूद हो सकता है। कोशिकाओं को पिघलाने के बाद और प्रयोगों के लिए उनका उपयोग करने से पहले कोशिकाओं में माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए परीक्षण करना अच्छा अभ्यास है। बाद में, महीने में एक बार माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए कोशिकाओं की निगरानी करें। कई कंपनियां माइकोप्लाज्मा टेस्ट किट प्रदान करती हैं। एक चुनें जो उपयुक्त है।
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Representative Results
यदि इस पेपर में उल्लिखित उचित सेल कल्चर तकनीकों और प्रथाओं का पालन नहीं किया जाता है, तो अनुसंधान सेल कल्चर प्रयोगशाला में कवक और बैक्टीरिया द्वारा संदूषण हो सकता है। चित्र 2 निलंबन और अनुयायी संस्कृतियों दोनों में संदूषण युक्त फ्लास्क दिखाता है।
जब सड़न रोकनेवाली तकनीकों का पालन नहीं किया जाता है, तो मोल्ड संदूषण 2-3 दिन बाद हो सकता है। मीडिया में तैरने वाली गोल फजी गेंदें निलंबन कोशिकाओं में ध्यान देने योग्य होती हैं, जबकि संलग्न कोशिकाओं में मोल्ड वृद्धि को बड़े, अनियमित, सफेद या हरे पैच के रूप में देखा जा सकता है।
बैक्टीरिया के लिए, संदूषण अगले दिन देखा जाता है। मीडिया अशांत, सफेद और बादल है। सफेद रंग बैक्टीरिया कोशिकाओं की विशेषता है, जो सेल लाइनों की तुलना में बहुत अधिक तेजी से गुणा करते हैं। एक अनुभवी आंख गैर-दूषित मीडिया और दूषित मीडिया के बीच अंतर बताने में सक्षम है। संलग्न कोशिकाओं के लिए, फ्लास्क में कोई अशांति देखी जाती है या नहीं, यह जांचने के लिए फ्लास्क के साथ बिना खोले गए मीडिया की एक बोतल की तुलना कर सकते हैं।
जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, वस्तुओं की संख्या कम से कम रखी जानी चाहिए। पीछे और सामने की ग्रिल पर आइटम रखने से बचें (चित्र 3 देखें)। इस कैबिनेट में, पिपेट, टिप्स, आटोक्लेव ग्लास पिपेट, एक पिपेट सहायता और मार्करों का एक सेट अंदर है। बीच में कार्य क्षेत्र स्पष्ट है। इस तरह से अलमारियाँ व्यवस्थित रखना एक अच्छा विचार है। इसके अलावा, ऑपरेटर को काम शुरू करने से पहले एक साफ लैब कोट और दस्ताने पहनना चाहिए। 70% ईटीओएच के साथ एक स्प्रे बोतल पास में रखी जानी चाहिए ताकि ऑपरेटर अपने दस्ताने को अक्सर स्प्रे कर सके। त्वचा दस्ताने या लैब कोट से ढकी होती है। ऑपरेटर को अपनी कुर्सी को समायोजित करना चाहिए ताकि कैबिनेट के अंदर काम करते समय उनकी बाहें 90 ° कोण पर हों, और आइटम कैबिनेट के अंदर आसान पहुंच के भीतर होना चाहिए (चित्रा 4 देखें)।
माइकोप्लाज्मा की कई प्रजातियों को पीसीआर-आधारित परख का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से पहचाना जा सकता है। चित्रा 5 एक नकारात्मक माइकोप्लाज्मा परीक्षण के परिणाम दिखाता है। बाईं ओर का बैंड डीएनए के लिए आणविक भार मानकों को दर्शाता है। दाईं ओर चार बैंड सकारात्मक नियंत्रण हैं। परीक्षण किए गए सेल प्रकारों के तहत कोई बैंड दिखाई नहीं देता है क्योंकि माइकोप्लाज्मा का पता नहीं चला था।
यदि मीडिया में पीएच संकेतक होते हैं, तो यह 7.4 पर कोशिकाओं के इष्टतम पीएच मान के लिए लाल होगा। एक बार जब कोशिकाएं बढ़ जाती हैं, तो मीडिया लालसे पीले रंग में बदल जाएगा। यह रंग परिवर्तन तब भी हो सकता है जब बैक्टीरिया फ्लास्क पर कब्जा कर लेते हैं और ओवरग्रो हो जाते हैं (चित्रा 6)। पीला रंग इंगित करता है कि पीएच कम है। फ्लास्क के बगल में मीडिया की एक नई, खुली बोतल का अवलोकन करना संलग्न कोशिकाओं में संदूषण का निरीक्षण करने का एक उद्देश्य तरीका है। निलंबन संस्कृतियों के लिए, उपयोगकर्ता मीडिया में तैरने वाले किसी भी विकास के लिए फ्लास्क का बारीकी से निरीक्षण कर सकता है या क्या ग्लास फ्लास्क के अंदर के चारों ओर अतिविकसित जीवाणु कोशिकाओं की एक मोटी अंगूठी मौजूद है। दोनों सेल प्रकारों के लिए, माइक्रोस्कोप के तहत एक छोटा सा नमूना लिया और देखा जा सकता है। यदि अन्य वृद्धि या कोशिका आकार देखे जाते हैं, खासकर यदि कोशिकाएं चल रही हैं, तो यह संदूषण का एक संकेतक है (चित्रा 7)। सेल गिनती से पहले हेमोसाइटोमीटर की पूरी तरह से सफाई की जानी चाहिए, क्योंकि इस प्रकार का मलबा केवल हेमोसाइटोमीटर पर मौजूद हो सकता है और सेल संस्कृतियों में नहीं।
गंध एक इनक्यूबेटर में संदूषण का एक और संकेतक हो सकता है। बैक्टीरियल अतिवृद्धि में एक विशिष्ट गंध होती है जिसे एक अनुभवी सेल कल्चर उपयोगकर्ता नोटिस करेगा। गंध हमेशा एक दूषित फ्लास्क के साथ मेल खाती है, हालांकि एक संक्रमित फ्लास्क हमेशा पूरे इनक्यूबेटर को गंध का कारण नहीं हो सकता है।
मोल्ड संदूषण निलंबन में उगाए गए एचईके 293 एस कोशिकाओं में अधिक प्रचलित होता है। एसएफ -9 कोशिकाओं में जीवाणु संदूषण अधिक आम है। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि आरआईसी कोशिकाओं को आर्द्रता के साथ उगाया जाता है, जिससे इनक्यूबेटरों में नमी जमा हो जाती है। एसएफ -9 कोशिकाएं नमी के बिना उगाई जाती हैं, इसलिए वातावरण सूखा होता है। अनुयायी संस्कृतियों में संदूषण की दर निलंबन संस्कृतियों में संदूषण की दर से कम है। यह छोटे फ्लास्क आकार, फ्लास्क की गैर-पुन: प्रयोज्य प्रकृति, या एल्यूमीनियम पन्नी के उपयोग के बजाय वेंट कैप के कारण हो सकता है।
माइकोप्लाज्मा को नग्न आंखों से नहीं देखा जा सकता है और न ही नियमित प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ, हालांकि विशेष संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइकोप्लाज्मा का पता लगा सकती है। मासिक रूप से सेल संस्कृतियों का परीक्षण करने के लिए एक माइकोप्लाज्मा पहचान किट का उपयोग किया जाना चाहिए। माइकोप्लाज्मा की कई प्रजातियों को पीसीआर-आधारित परख का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से पहचाना जा सकता है। इस पीसीआर परीक्षण को कैसे किया जाता है, इसके बारे में एक संक्षिप्त विवरण प्रोटोकॉल अनुभाग में पाया जा सकता है, और माइकोप्लाज्मा के बारे में अधिक जानकारी चर्चा अनुभाग में पाई जा सकती है।
चित्रा 1: जैव सुरक्षा कैबिनेट में हवा कैसे बहती है। जैविक सुरक्षा अलमारियाँ कमरे से और कैबिनेट से सामने और पीछे की ग्रिल के माध्यम से दूषित हवा खींचती हैं। यह हवा धातु की काम करने वाली सतह के नीचे, कैबिनेट के पीछे की ओर, और इकाई के शीर्ष तक जाती है जहां एक एचईपीए फिल्टर स्थित है। वहां, हवा फिल्टर से गुजरती है और फ़िल्टर हो जाती है। यह साफ हवा काम की सतह पर नीचे धकेलती है। फ़िल्टर की गई हवा के प्रवाह को कैबिनेट के अंदर नीचे कैसे धकेला जाता है, इसके कारण मंडराना अच्छा अभ्यास है। उदाहरण के लिए, खुली बोतल के शीर्ष पर आस्तीन रखना अवांछनीय है और किसी भी संभावित दूषित पदार्थों को मीडिया में धकेल दिया जाना चाहिए। कैबिनेट के अंदर लाई गई वस्तुओं की संख्या कम से कम रखी जानी चाहिए, और हवा के प्रवाह को बाधित न करने के लिए वस्तुओं को सामने या पीछे की ग्रिल पर नहीं रखा जाना चाहिए। कैबिनेट के अंदर और बाहर बाहों को बहुत जल्दी स्थानांतरित करना भी वायु प्रवाह को परेशान कर सकता है। जेफ कपिंगस्ट, जेफ द डिजाइनर, एलएलसी द्वारा Nuaire, Inc. के लिए बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: गैर-दूषित निलंबन और मोल्ड या बैक्टीरिया से दूषित अनुगामी कोशिकाएं और कोशिकाएं। बाईं ओर की पहली छवि में कीट कोशिकाएं (एसएफ -9 कोशिकाएं) होती हैं जो दूषित नहीं होती हैं। दूसरी छवि मोल्ड से दूषित इन कोशिकाओं का एक और फ्लास्क दिखाती है। तीसरा फ्लास्क बैक्टीरिया से दूषित था, जैसा कि मोटी, सफेद, बादल उपस्थिति से नोट किया जा सकता है। दूसरा और तीसरा फ्लास्क दूषित थे क्योंकि उचित सेल कल्चर तकनीकों और प्रथाओं में से किसी का भी पालन नहीं किया गया था। सभी फ्लास्क एक ही दिन तैयार किए गए थे। बैक्टीरिया संदूषण के लिए अगले दिन और मोल्ड संदूषण के लिए 2 दिन बाद वृद्धि देखी गई। गैर-दूषित अनुयायी कोशिकाओं को अनुयायी संस्कृतियों में मोल्ड और जीवाणु संदूषण के साथ दिखाया गया है (हेक 293 कोशिकाएं)। मोल्ड संदूषण को एक गोल पेट्री डिश में दूसरी पंक्ति में दिखाया गया है। फोटो पकवान के शीर्ष से लिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: सेल संस्कृति कैबिनेट संगठन। जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, वस्तुओं की मात्रा कम से कम रखी जानी चाहिए। पीछे और सामने की ग्रिल पर वस्तुओं को रखने से बचना चाहिए। इस कैबिनेट में, पिपेट, टिप्स, आटोक्लेव ग्लास पिपेट, एक पिपेट सहायता और मार्करों का एक सेट अंदर है। बीच में कार्य क्षेत्र स्पष्ट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रवाह हुड के तहत काम करने के लिए एक ऑपरेटर के लिए सही तरीका। एक ऑपरेटर को काम शुरू करने से पहले एक साफ लैब कोट और दस्ताने पहनना चाहिए। 70% ईटीओएच के साथ एक स्प्रे बोतल पास में रखी जानी चाहिए ताकि ऑपरेटर अपने दस्ताने को अक्सर स्प्रे कर सके। त्वचा दस्ताने या लैब कोट द्वारा कवर की जाती है। ऑपरेटर को अपनी कुर्सी को समायोजित करना चाहिए ताकि कैबिनेट के अंदर काम करते समय उनकी बाहें 90 ° कोण पर हों। आइटम कैबिनेट के अंदर आसान पहुंच के भीतर होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: एक नकारात्मक माइकोप्लाज्मा परीक्षण परिणाम। माइकोप्लाज्मा की कई प्रजातियों को पीसीआर-आधारित परख का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से पहचाना जा सकता है। बाईं ओर का बैंड डीएनए के लिए आणविक भार मानकों को दर्शाता है। दाईं ओर चार बैंड सकारात्मक नियंत्रण हैं। परीक्षण किए गए सेल प्रकारों के तहत कोई बैंड दिखाई नहीं देता है क्योंकि माइकोप्लाज्मा का पता नहीं चला था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: सामान्य मीडिया का रंग लाल से पीले रंग में बदलता है। यदि पीएच संकेतक मौजूद हैं तो सेल कल्चर मीडिया लाल से पीले रंग में बदल जाता है। पीला रंग इंगित करता है कि पीएच कम है और मीडिया को प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 7: प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए दूषित पदार्थ। यदि सेल गणना करते समय प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अन्य वृद्धि या सेल आकार देखे जाते हैं, तो यह संदूषण का संकेतक हो सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेल गिनती से पहले हेमोसाइटोमीटर की पूरी तरह से सफाई की जानी चाहिए क्योंकि इस प्रकार का मलबा केवल हेमोसाइटोमीटर पर मौजूद हो सकता है और सेल संस्कृतियों में नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1: परिशिष्ट कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
जबकि सेल कल्चर कार्य करते समय संदूषण प्राथमिक चिंताओं में से एक है, इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रथाओं और तकनीकों से जोखिमों को कम करने में मदद मिलेगी। महत्वपूर्ण चरणों में एक साफ लैब कोट पहनना शामिल है, जिसका उपयोग केवल सेल कल्चर रूम में किया जाता है, साफ, पाउडर-मुक्त दस्ताने का उपयोग करना जो अक्सर 70% ईटीओएच के साथ छिड़के जाते हैं और जो सेल लाइनों के बीच स्विच करते समय बदल जाते हैं, प्रत्येक व्यक्ति को मीडिया की बोतलों को साझा नहीं करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं, काम खत्म करने से पहले और बाद में कैबिनेट को अच्छी तरह से साफ करते हैं, बड़े करीने से सीरोलॉजिकल पिपेट को खोलना, खुली बोतलों या फ्लास्क के साथ लंबे समय तक निकट संपर्क से बचना, कई सेल लाइनों के बीच मीडिया की बोतलों को साझा नहीं करना और इनक्यूबेटर के दरवाजों को जल्दी से खोलना और बंद करना। इसके अतिरिक्त, अपने स्वयं के ग्लासवेयर को धोना और ऑटोक्लेविंग करना गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करता है, जिससे बाहरी दूषित पदार्थों को पेश करने की संभावना कम हो जाती है। गुणवत्ता नियंत्रण विधियों में यह इंगित करने के लिए आटोक्लेव टेप का उपयोग करना शामिल है कि क्या स्टरलाइज़र 121 डिग्री सेल्सियस के उचित तापमान तक पहुंच गया है, उपकरण का नियमित निवारक रखरखाव, और फ्लास्क का निरीक्षण करना यह सुनिश्चित करने के लिए किइसे ठीक से स्क्रब किया गया है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु यह सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों के लिए अलग-अलग इनक्यूबेटरों का उपयोग करना है कि एक सेल प्रकार से संदूषण दूसरों को स्थानांतरित नहीं किया जा रहा है और यह भी सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं के साथ क्रॉस-संदूषण न हो।
बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण सेल संस्कृतियों में दो सबसे आम घुसपैठिए हैं। प्रमुख संदूषकों में से एक, एम ओरल, मानव मुंह में सबसे आम माइकोप्लाज्मा प्रजाति है और "सेल संस्कृतियों में सभी माइकोप्लाज्मा संक्रमणों के 20% -40% के लिए सबसे आम पृथक का प्रतिनिधित्व करता है"। दूसरे शब्दों में, प्रयोगशाला कर्मी इस संदूषण का प्रमुख स्रोत हैं। यह सेल कल्चर रूम में हमेशा एक चिंता का विषय होता है क्योंकि माइकोप्लाज्मा एक छोटा, धीमी गति से बढ़ने वाला सूक्ष्मजीव है जिसमें कठोर सेल की दीवार की कमी होती है जो 0.45 μm फिल्टर4 से गुजर सकती है। अध्ययनों से पता चलता है कि माइकोप्लाज्मा संदूषण की घटना निरंतर मानव या पशु कोशिका लाइनोंका 15% -35% है। इसके अलावा, आंकड़े बताते हैं कि दुनिया की लगभग 5% से 30% सेल लाइनें माइकोप्लाज़्मा6 से दूषित हैं। दुर्भाग्य से, माइकोप्लाज्मा सेल कल्चर के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी है, और संक्रमण सेल फिजियोलॉजी और चयापचयको प्रभावित कर सकता है। हालांकि संदूषण सेल चयापचय को धीमा नहीं करता है, यह अंतिम उत्पाद6 को दूषित कर सकता है। संक्रमण प्रयोगशाला के सदस्यों को सेल क्षति को नोटिस किए बिना चारों ओर चिपक सकता है। यदि संदूषण होता है, तो नई कोशिकाओं को पिघलाने की लागत, नई संस्कृतियों का प्रचार करने में बिताया गया समय, महंगा मीडिया जो बर्बाद हो गया है, इनक्यूबेटरों को दूषित करता है, और सहकर्मियों को अपने प्रयोगों को फिर से शुरू करने के लिए इंतजार करने में कितना समय व्यतीत होता है, बहुत अधिक है। हमारी प्रयोगशाला का अनुमान है कि 2 सप्ताह के लिए कुल खोया हुआ समय है और 8 एल के एक विशिष्ट मानव स्तनधारी सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति के संदूषण से जुड़ी कुल लागत $ 1,400 है। इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रथाएं और तकनीकें अतिरिक्त लागत, खोई हुई कोशिकाओं और डाउनटाइम को कम करने के लिए अच्छे निवारक उपाय प्रदान करती हैं।
इन प्रथाओं के संशोधनों की सिफारिश नहीं की जाती है। सभी प्रयोगशाला सदस्यों को सेल कल्चर रूम में काम करने से पहले प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और फिर हर साल पुनश्चर्या प्रशिक्षण प्राप्त करना चाहिए। लैब के सदस्यों को सेल कल्चर रूम को भी व्यवस्थित करना चाहिए ताकि सभी आवश्यक आपूर्ति एक क्षेत्र में हो, जिससे लैब के सदस्यों को आपूर्ति की तलाश में सेल कल्चर रूम से बाहर निकलने की आवश्यकता कम से कम हो।
प्रस्तुत तकनीकों की सीमाएं देखी जाती हैं यदि संदूषण बाहरी स्रोतों जैसे सीरम, इनक्यूबेटर, खराब ऑटोक्लेव, गंदे लैब कोट या कोशिकाओं के स्रोत से आता है। तकनीक का समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है यदि इस प्रोटोकॉल के सख्त पालन के बावजूद संदूषण होता है। कई बाहरी कारक इस प्रकार के संदूषण में योगदान कर सकते हैं। लैब के सदस्यों को विवेकपूर्ण होने और बाहरी स्रोतों की जांच करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, आपूर्तिकर्ता से खरीदे गए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का बहुत कुछ माइकोप्लाज्मा से दूषित हो सकता है। 1950 के दशक की तुलना में, यह अब एक दुर्लभ घटना है, लेकिन यह अभी भीहो सकता है। यदि कोई संदूषण देखा जाता है तो सभी मीडिया बोतलों को बाहर फेंक दिया जाना चाहिए, और प्रोटोकॉल को नई कोशिकाओं को पिघलाकर और नए मीडिया का उपयोग करके फिर से शुरू किया जाना चाहिए। संदूषण पहले से ही इनक्यूबेटर के अंदर मौजूद हो सकता है यदि यह मोल्ड या बैक्टीरिया है; एक ही इनक्यूबेटर के अंदर अन्य फ्लास्क को यह देखने के लिए जांचना चाहिए कि क्या बैक्टीरिया या मोल्ड वृद्धि देखी जाती है। सभी दूषित फ्लास्क को बाहर फेंक दिया जाना चाहिए और इनक्यूबेटर को दूषित किया जाना चाहिए। यदि कोई संदूषण नहीं पाया जाता है, तो आटोक्लेव को खराबी त्रुटियों के लिए जांचकी जानी चाहिए; ग्लासवेयर को पहले स्थान पर ठीक से आटोक्लेव नहीं किया गया हो सकता है। ऑटोक्लेव टेप 121 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंचने के बावजूद रंग बदल सकता है। बाद में, उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक समाधानों पर समाप्ति तिथियों की जांच की जानी चाहिए; नए समाधान खरीदने की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, कोशिकाओं के स्रोत पर विचार किया जाना चाहिए; क्या वे एक विश्वसनीय प्रयोगशाला आपूर्तिकर्ता से थे या किसी अन्य प्रयोगशाला से उधार लिए गए थे? कोशिकाओं को हमेशा एक विश्वसनीय प्रयोगशाला आपूर्तिकर्ता से खरीदा जाना चाहिए और कभी भी किसी अन्य प्रयोगशाला से उधार नहीं लिया जाना चाहिए। अंत में, लैब कोट कोउनकी स्वच्छता सुनिश्चित करने के लिए धोया जाना चाहिए। जब भी फ्लास्क दूषित हो जाता है तो इनक्यूबेटरों के परिशोधन पर विचार किया जाना चाहिए। बैक्टीरिया कोशिकाओं या मोल्ड बीजाणुओं को गुणा करने और संदूषण फैलाने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।
मौजूदा तरीके संदूषण के उन्मूलन पर प्रतिबिंबित करते हैं। इस पांडुलिपि में उल्लिखित विधियां संदूषण के उन्मूलन के बजाय रोकथाम पर ध्यान केंद्रित करती हैं। माइकोप्लाज्मा20 को हटाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने के संबंध में कई प्रक्रियाएं मौजूद हैं। हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग जोखिम भरा है क्योंकि वे संक्रमण को पूरी तरह से खत्म नहीं कर सकते हैं और "प्रतिरोधी जीवों को विकसित करने की अनुमति दे सकते हैं"। वास्तव में, "एंटीबायोटिक दवाओं में लगातार उगाई गई संस्कृतियों में से 72% को माइकोप्लाज्मा-पॉजिटिव दिखाया गया था, जबकि एंटीबायोटिक दवाओं की अनुपस्थिति में उगाए गए केवल 7% संक्रमित थे"। यह डेटा इस विचार पर जोर देता है कि जबकि एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग की सिफारिश की जाती है और सहायक हो सकती है, एंटीबायोटिक दवाओं पर अति प्रयोग या पूर्ण निर्भरता फायदेमंद नहीं है। इसके अलावा, संदूषण को हटाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग केवल समस्या को जारी रखने की अनुमति दे सकता है। एंटीबायोटिक समाधान आवश्यक नहीं हैं; यदि इस पेपर में तकनीकों का पालन किया जाता है, तो संदूषण को सफलतापूर्वक रोका जाना चाहिए।
इस पांडुलिपि में उल्लिखित प्रथाओं और तकनीकों का उपयोग भविष्य में मासिक माइकोप्लाज्मा परीक्षण करते समय और घर का बना सक्षम जीवाणु कोशिकाओं को बनाते समय एक सड़न रोकनेवाला वातावरण बनाए रखने के लिए किया जा सकता है। दोनों प्रोटोकॉल को सेल कल्चर काम के समान एक स्वच्छ वातावरण की आवश्यकता होती है, ताकि अंतिम उत्पाद दूषित न हो।
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Disclosures
लेखक के कोई परस्पर विरोधी हित नहीं हैं।
Acknowledgments
यह काम हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (एचएचएमआई) से फंडिंग की बदौलत संभव हो पाया है। हम पांडुलिपि को पढ़ने और उनके निरंतर समर्थन के लिए प्रयोगशाला के प्रमुख, जू चेन को धन्यवाद देना चाहते हैं, डोना टालेंट को उनके सहायक संपादन और टिप्पणियों के लिए, और रॉकफेलर विश्वविद्यालय में सूचना प्रौद्योगिकी विभाग से जेफ हेनेफेल्ड को इस पांडुलिपि के वीडियो घटक के साथ उनकी मदद के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
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