Cellekulturteknikker og praksis for å unngå forurensning av sopp og bakterier i forskningscellekulturlaboratoriet

Summary

Denne protokollen presenterer viktige cellekulturteknikker og praksis som skal brukes i forskningscellekulturlaboratoriet for å unngå forurensning av sopp og bakterier. Innenfor kategorien bakterier vil det bli lagt spesiell vekt på å forhindre mykoplasmaforurensning.

Abstract

Cellekultur er en delikat ferdighet som er nødvendig for å dyrke menneske-, dyre- og insektceller, eller annet vev, i et kontrollert miljø. Målet med protokollen er å understreke de riktige teknikkene som brukes i et forskningslaboratorium for å forhindre forurensning fra sopp og bakterier. Spesiell vekt legges på å unngå mykoplasmaforurensning, en stor bekymring i cellekulturrommet på grunn av sin lille størrelse og resistens mot de fleste antibiotika som brukes til cellekultur. De samme teknikkene sikrer kontinuerlig vekst og opprettholder sunne celler. For både nye og erfarne cellekulturbrukere er det viktig å konsekvent følge disse beste praksisene for å redusere risikoen for forurensning. En gang i året bør laboratorier gjennomgå beste praksis for cellekultur og følge opp med en diskusjon eller tilleggsopplæring om nødvendig. Å iverksette tidlige tiltak for å forhindre forurensning i utgangspunktet vil spare tid og penger, sammenlignet med å rydde opp etter at forurensning oppstår. Universell beste praksis holder cellekulturer sunne, og reduserer dermed behovet for å stadig tine nye celler, kjøpe dyre cellekulturmedier og redusere mengden inkubatordekontaminering og nedetid.

Introduction

Cellekultur har mange bruksområder i forskningslaboratoriet. Siden opprinnelsen til cellekultur i begynnelsen av det 20. århundre har cellelinjer bidratt til å fremme vitenskapen. Cellelinjer har flere fordeler; Ulike cellelinjer kan hjelpe forskere med å studere cellebiologi, produsere baculovirus for videre studier, eller produsere store mengder av et protein av interesse, for å nevne noen¹. Noen andre bruksområder inkluderer å studere vevsvekst, bidra til å fremme vaksineutvikling, toksikologisk forskning, studere rollen som gener i friske organismer og syke modeller, og produksjon av hybridcellelinjer ^2,3. Cellelinjer kan også muliggjøre legemiddelproduksjon³. Riktig aseptisk teknikk er nødvendig når du arbeider med cellelinjer; Praksisene og teknikkene som er skissert i dette manuskriptet gjelder for forskningslaboratorier der cellekulturarbeid utføres. Andre laboratorieinnstillinger diskuteres ikke.

Forurensning er ofte den primære bekymringen når du utfører cellekulturarbeid. I sammenheng med dette papiret refererer forurensning generelt til sopp og bakterier. Det overordnede målet med metoden som er skissert i denne artikkelen, er å beskrive de beste fremgangsmåtene for å unngå kontaminering grundig. Alle laboratoriemedlemmer bør følge disse praksisene når de arbeider i et forskningslaboratoriums cellekulturrom. Laboratorier bør sikre at alle arbeidstakere er aktive deltakere i å bruke disse beste praksisene for å forhindre forurensning. Kunnskapen om riktig praksis og teknikker vil bidra til å sikre at cellekulturer forblir levedyktige, sunne og fri for forurensning. Utviklingen av denne teknikken er basert på litteraturforskning, syv års erfaring med å jobbe med cellekulturer, og behovet for en metode som både nybegynnere og erfarne cellekulturarbeidere kan referere til årlig.

Det er behov for en klar, standardisert teknikk som alle forskningscellekulturlaboratorier bør følge. Mye av litteraturen om cellekulturforurensning diskuterer påvisning av mykoplasma, aseptiske teknikker, forurensningskilder, eliminering av forurensninger og forebygging ved bruk av antibiotika og regelmessig testing 4,5,6,7,8. Selv om denne informasjonen er nyttig, er det ingen videoer til stede i litteraturen som demonstrerer de riktige cellekulturteknikkene man bør følge. Fordelen med praksisen som presenteres over alternative teknikker er et fokus på å forhindre forurensning før det skjer, i stedet for å oppdage og korrigere feil senere. Videre er en grundig demonstrasjon av aseptiske teknikker, en diskusjon om forebygging av sopp og bakterievekst, og informasjon om luftstrøm i biosikkerhetskabinettet verdifullt for både nybegynnere og erfarne cellekulturarbeidere.

Bakterier og sopp er de to vanligste typene miljøgifter. Innenfor bakteriekategorien er mykoplasma en stor bekymring på grunn av sin lille størrelse og evne til å spre seg mens den forblir ubemerket. De er selvreplikerende organismer uten stiv cellevegg som er avhengige av eukaryote celler for å vokse. De har reduserte metabolske evner og kan formere seg sterkt mens de forblir ukjente i rutinemessig visuell inspeksjon av cellekulturer og regelmessig mikroskopisk analyse, selv om transmisjonselektronmikroskopi kan oppdage mykoplasma ^9,10. Videre kan de passere gjennom mikrobiologiske filtre¹⁰. Cellekulturmedium gir mykoplasma næringsstoffer, men dessverre påvirker ikke supplering av medier med antibiotika mykoplasma¹⁰. Man bør merke seg at det generelt ikke er nødvendig å supplere media med antibiotika; Riktige teknikker bør være tilstrekkelig for å holde forurensning i sjakk. Infeksjon med mykoplasma fører ikke til umiddelbar celledød, men det er bekymringsfullt for forskere da det påvirker datareproduserbarhet og kvalitet.

Alt laboratoriepersonell bør strengt overholde god cellekulturpraksis. Kulturer bør testes for mykoplasma etter at de er nylig kjøpt, mens de for tiden dyrkes, før kryopreservering, og når de tines fra flytende nitrogen ^2,10. Ulike tester er tilgjengelige på markedet ved bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR), enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) eller immunfarging. ³ Litteraturen indikerer at "humane isolater representerer en stor prosentandel av mykoplasmaforurensningene som finnes i cellekultur"⁵. Selv om mer enn 200 mykoplasmaarter er beskrevet, står omtrent seks av disse for de fleste infeksjoner. Disse seks artene er M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale og Acholeplasma laidlawii 10. Som med andre typer forurensning, bringer luft og aerosoler disse inn i cellekulturer⁵. Dette gjentas i andre artikler siden "den menneskelige operatøren er potensielt den største faren i laboratoriet"⁷. Selv om dette gjøres gjennom menneskelig feil, kan risikoen elimineres hvis en standard prosedyre følges. Utskilling fra personell er ikke begrenset til bare mykoplasmaforurensning; Cellekulturer i ett laboratorium er vanligvis infisert med de samme mykoplasmaartene, noe som indikerer at forurensning sprer seg fra en kolbe til en annen på grunn av feil cellekulturteknikker¹⁰.

Forebygging av krysskontaminering er også en annen grunn til at riktige cellekulturteknikker bør følges. Det bemerkes at minst 15%-18% av cellelinjer over hele verden kan være krysskontaminert eller feilidentifisert^11,12. I tillegg til å teste cellelinjer for mykoplasmaforurensning, bør de også testes for krysskontaminering¹⁰. For menneskelige cellelinjer er cellelinjeautentisering ved en billig DNA-basert teknikk kalt STR-profilering (Short Tandem Repeat) den gjeldende internasjonale referansestandarden, da det er en enkel måte å bekrefte cellelinjeidentitet 2,10,13,14. STR kan identifisere feilmerkede eller krysskontaminerte cellelinjer, men det kan ikke oppdage feil vevopprinnelse^10,13,14. Gyldigheten av forskningsdata kan bli kompromittert hvis cellelinjer er feilmerket, feilaktig identifisert eller forurenset¹³. I likhet med andre typer forurensning kan krysskontaminering oppstå på grunn av dårlig teknikk som forårsaker at aerosoler sprer seg, feilaktig kontakt som fører til feil celletype som kommer inn i en kolbe, eller bruker samme medieflaske og reagenser med forskjellige cellelinjer¹⁰. Ingen deling av medieflasker skal forekomme; Deling av en flaske media mellom to forskjellige cellelinjer kan tillate at disse cellepopulasjonene blandes, noe som fører til at den raskere voksende celletypen helt tar over kolben. Denne erstatningen er ikke merkbar og fører til feilmerking og feilidentifikasjon². En cellelinje kan også forveksles med en annen hvis kulturer forveksles under håndtering eller merking¹⁰. Nøye oppmerksomhet bør rettes mot å holde reagenser, media og kolber skilt fra hverandre. Hvert laboratoriemedlem skal ha sine egne medieflasker; Ingen deling skal skje mellom laboratoriemedlemmer. Cellelinjer selv bør kjøpes fra en kvalifisert cellebank og leverandør. Laboratorier bør ikke dele celler. Studier viser at selv om STR- og mykoplasmatester brukes regelmessig, har mange forskningsartikler i litteraturen allerede brukt feilidentifiserte eller forurensede cellelinjer¹⁵. Å sile gjennom forskningen for å finne disse problematiske artiklene og informere leserne om denne saken med tilbakevirkende kraft er tungvint. Forebygging er den beste måten å sikre at dette problemet ikke oppstår i utgangspunktet.

Den enkle virkningen av å sprøyte gjenstander med 70% EtOH kan drepe organismer; 70% EtOH virker ved å denaturere proteiner og oppløse lipider i de mest forurensende organismer, inkludert bakterier og sopp¹⁶. Studier har vist at 70% er den mest effektive konsentrasjonen; overflateproteiner koagulerer ikke raskt med 70% EtOH slik at de kan komme inn i cellen, mens vannet det inneholder er nødvendig for denatureringsprosessen av proteiner. På grunn av konsentrasjonsforskjellen mellom vann og alkohol på hver side av celleveggen, kommer 70% EtOH inn i cellen for å denaturere både enzymatiske og strukturelle proteiner. Hvis muggvekst observeres i kolber, må hele inkubatoren dekontamineres ved først å sprøyte den med 70% EtOH og tørke den tørr, etterfulgt av en 16 timers inkubasjon over natten ved 60 ° C¹⁷. Dette dreper de fleste mugg og eventuelle bakterier.

Den største fordelen med forebyggende praksis over alternative teknikker for å eliminere forurensning etter at den oppstår, er at ved å forhindre forurensning tidlig, kan laboratoriearbeidere være sikre på at deres cellekulturer er sunne, og det vil ikke være høye kostnader forbundet med dekontaminering av inkubatorer eller kassering av cellekulturer. Eliminering av mykoplasmaforurensninger etter for eksempel er ikke effektiv⁷. Å ta seg tid tidlig for å sikre at laboratoriepersonell er riktig opplært, cellekulturrommet er selvstendig, og en standardprosedyre brukes, vil spare tid og penger.

Protocol

1. Forberedelser

1. Generelt
   1. Bruk en ren laboratoriefrakk som bare skal brukes i cellekulturrommet og ingen andre deler av laboratoriet.
      MERK: Laboratoriefrakken trenger ikke å være steril.
   2. Bruk nye hansker som ikke har rørt noen andre overflater. Pass på at hanskene sitter tett. Nitril, pulverfrie hansker er best.
      MERK: Hanskene trenger ikke å være sterile.
   3. For å forberede deg på arbeid, spray hanskene, laboratoriefrakkhylsene og interiøret i det biologiske sikkerhetsskapet med 70% EtOH. Tørk arbeidsflaten og glasspanelet tørt med et lofritt papirhåndkle.
      MERK: Bruk av 70% EtOH dreper bakterier med høyeste effektivitet¹⁶. Papirhåndkleet trenger ikke å være sterilt.
   4. Hold vannbad inne i cellekulturrommet og bruk bare disse til oppvarming av kulturmedier eller tining av celler. Tøm og vask vannbadene en gang i uken, i henhold til produsentens instruksjoner for rengjøring.
2. Inne i det biologiske sikkerhetsskapet
   1. Begrens antall gjenstander som bringes inn i skapet. Ikke avbryt luftstrømmen inne i det biologiske sikkerhetsskapet ved å blokkere grillene foran eller bak.
      MERK: Se figur 1 for en forklaring på hvordan luft strømmer inne i et skap.
   2. Spray alle gjenstandene som er plassert inne i skapet med 70% EtOH og tørk dem tørre. Begynn med å spraye toppen av medieflasken og jobbe ned. På samme måte, med et rent papirhåndkle, tørk det tørt, og arbeid deg gradvis til bunnen. Ikke gå opp mot hetten igjen.
   3. Hvis skapet er stort nok til å imøtekomme serologiske pipetter, kan de plasseres inne, ellers kan de lagres i en beholder montert på utsiden av skapet. Sjekk hver side av den innkapslede pipetten for hull, rifter eller punkteringer i emballasjen før bruk. Ikke riv av innpakningen. Riv i stedet endene av innpakningen forsiktig, sett den serologiske pipetten inn i et pipettehjelpemiddel og fjern innpakningen i én væskebevegelse.
   4. Ikke hold musepekeren over åpne flasker eller kolber; Nå over åpne flasker eller kolber, eller åpne gjenstander over toppen av allerede åpnede gjenstander i det biologiske sikkerhetsskapet.
      MERK: Luftstrømmen inne i kabinettet presser ned på arbeidsflaten, slik at eventuell forurensning på hylsen, for eksempel, kan komme inn i cellekulturer.
   5. Ikke hell væsker. I stedet legger du dem til ved hjelp av en serologisk pipette. Etter å ha supplert mediet, bland innholdet grundig og start flasken. Sørg også for å inkludere en etikett for hva mediet ble supplert med.

2. Arbeide med adherente cellelinjer

1. Hvis det er behov for en plastkolbe, spray hele posen og legg den inne i skapet.
2. Bruk autoklaverte glasspipetter eller sterile engangspipetter av plast til å aspirere mediet eller vaskeløsningene. Fjern metallhetten forsiktig fra oppbevaringsbeholderen. Isoler en glasspipette ved å riste beholderen forsiktig i vinkel. Når du kommer inn i beholderen, unngå å berøre andre pipetter.
   MERK: Håndter kun den valgte pipetten fra den ene enden.
3. Sett raskt på lokkene på flaskene så snart som mulig. Plasser hettene på arbeidsflaten opp ned slik at felgen ikke berører arbeidsflaten. Ikke ta tak i hetten fra toppen eller bunnen; Berør i stedet hettene fra sidene.
4. Når du aspirerer væsker, bruk en vakuumfellekolbe som ligger utenfor skapet i en sekundær beholder på gulvet.
   MERK: Ikke kast flytende avfall i biohazard-avfallsposer, da posene vil lekke. Avfall vil bli opprettet mens du arbeider inne i skapet. Å bevege hendene inn og ut av skapet for ofte vil forstyrre luftstrømmen. La avfall ligge inne i skapet midlertidig. Plasser den til siden slik at den ikke forstyrrer arbeidet.
5. Spray hanskene sjenerøst med 70 % EtOH når de blir tørre. Gni hendene sammen slik at hanskene ikke drypper våte.
6. Hvis en serologisk pipette feilaktig berører noe i skapet, ikke nøl med å kaste det ut. Start på nytt med en ren serologisk pipette i stedet for å bruke en som kan være forurenset.

4. Kontroll og lagring av celler

1. Før du plasserer celler i inkubatoren, må du kontrollere hvordan de ser ut under mikroskopet. Hvis cellene har blitt grundig suspendert, bør enkeltceller observeres.
2. Ikke snakk, nys, host eller pust tungt inn i kuvøsene. Åpne og lukk inkubatordørene raskt. Å la dørene stå åpne lenger enn nødvendig, kan tillate forurensninger som er tilstede i luften å komme inn i inkubatorene.
   MERK: Bruk av maske mens du arbeider i cellekulturrommet kan hjelpe siden mykoplasma kan være tilstede i menneskets munn. Unngå bruk av mobiltelefoner i cellekulturrommet, da det ikke anbefales å snakke.
3. Sørg for at korkene på alle flaskene er tett lukket før du tar flaskene ut av skapet.
4. Oppbevar cellekulturmedier i mørket ved 4 °C når det ikke er i bruk, siden det er lysfølsomt.
5. Spray det indre av skapet med 70% EtOH igjen etter at cellekulturarbeidet er fullført, og tørk overflaten tørr med et papirhåndkle. Tøm avfallsposene for biofare. Gjenta denne prosessen og bytt hanskene når du bytter til en annen cellelinje.

5. Arbeid med suspensjonscellelinjer

1. For opphengsceller dyrket i glassflasker, sørg for at hanskene sprayes grundig med 70% EtOH, berør deretter aluminiumsfolien med de våte hanskene og spray bare bunnen av kolben før du plasserer den inne i skapet.
2. Når du tar en prøve for celletelling, fjern bare ett 1,5 ml rør fra beholderen. Ikke berør andre rør. Plasser hetten opp ned på arbeidsflaten. Ikke berør innsiden av felgen. Håndter den forsiktig fra sidene og bytt den ut når den er ferdig.
3. Fjern forsiktig det dobbeltbrettede stykket aluminiumsfolie som dekker hele kolbens hals. Håndter glasskolben bare nedenfra - ikke berør den fra nakken - når folien er av. Bruk en 1 ml serologisk pipette for å ta en prøve for celletelling.
4. Ikke la media dryppe ned på siden av kolbene; hvis det gjør det, spray et papirhåndkle med 70% EtOH og rengjør det med en gang.
5. Sørg for at korker og aluminiumsfolie strammes før du fjerner flasker eller kolber fra de biologiske sikkerhetsskapene.

6. Cell inkubasjon

1. Bruk separate inkubatorer for forskjellige celletyper for å forhindre krysskontaminering av de forskjellige celletypene.

7. Innsamling av flytende avfall

1. Samle flytende avfall i en vakuumfellekolbe plassert utenfor skapet på gulvet i en sekundær beholder merket 'Avfall'.
   MERK: Slangen er koblet til et høyeffektivt partikkelabsorberende (HEPA) filter, som skiftes ut månedlig.

8. Opprydding

1. Fjern posen for biologisk fare og vask glassflaskene så snart som mulig. Hold en glassvaskprotokoll ved vasken. Se tilleggsfil 1 for vaskeprotokoll.
2. Autoklav cellekulturglasset i stedet for å sende det til et glassvaskeanlegg. Hold det atskilt fra glass i hovedområdet av laboratoriet.
   MERK: SF-9-celler etterlater en kant av døde celler på siden av kolber hvis glasset ikke skrubbes godt. Se tilleggsfil 1 for autoklavprotokollen.

9. Organisering

1. Organiser cellekulturrommet slik at alle forsyningene er plassert i ett område, og minimerer dermed behovet for laboratoriemedlemmer å forlate rommet på jakt etter forsyninger.
2. Merk alle plastflasker som brukes til å høste celler og gjenbrukes i cellekultur etterpå som "Kun til bruk i cellekultur". Bruk de utpekte cellekulturflasker for en bestemt celletype. Oppbevar flaskene i cellekulturrommet for enkel tilgang.

10. Identifisering av bakterier, sopp og mykoplasmaforurensning

MERK: Hvis du ikke følger arbeidsflyten ovenfor, kan det føre til bakterie-, sopp- og mykoplasmaforurensning.

1. Alltid før du begynner arbeidet, observer flasker for tung turbiditet, ekstra vekst i form av fuzzy baller og tette akkumuleringer av celler på siden, som alle er indikatorer på forurensning.
   MERK: Et erfarent øye kan fortelle forskjellen mellom turbiditet forårsaket av mikrobiell forurensning versus de faktiske cellene. Mens celler får det normalt klare mediet til å virke overskyet, forårsaker bakteriell forurensning tung turbiditet med hvit farge.
   1. Identifiser muggforurensning visuelt ved å merke utseendet på runde, uklare baller som flyter i mediet (se figur 2).
   2. Identifiser bakteriell kontaminering visuelt hvis mediet er uklart, hvitt eller turbulent (se figur 2).
   3. Identifiser mykoplasmaforurensning ved å gjøre en månedlig mykoplasma-test. En PCR-basert test instruerer brukerne til å ta en 1,5 ml prøve av celler, utføre en celletelling ved hjelp av 10 μL, fortynne til 0,08 x 10⁶ celler / ml, spinne ned cellene, lyse cellene ved hjelp av bufferen i settet, og spinne ned en siste gang. Supernatanten ruges med primere som forsterker en rekke mykoplasmaarter. Kjør en DNA-gel for å visualisere båndene. Ingen bånd betyr at mykoplasma ikke er identifisert.
      MERK: Denne store forurensningen kan være tilstede i menneskets munn. Det er god praksis å teste for mykoplasmaforurensning i celler etter tining av dem og før du bruker dem til eksperimenter. Etterpå må du overvåke cellene for mykoplasmaforurensning en gang i måneden. Mange selskaper tilbyr mycoplasma test kits. Velg en som passer.

Representative Results

Hvis de riktige cellekulturteknikkene og praksisene som er skissert i denne artikkelen, ikke følges, kan forurensning av sopp og bakterier forekomme i forskningscellekulturlaboratoriet. Figur 2 viser kolber som inneholder forurensning i både suspensjon og adherent kultur.

Når du ikke følger aseptiske teknikker, kan muggforurensning oppstå 2-3 dager senere. Runde fuzzy baller som flyter i media er merkbare i suspensjonsceller, mens muggvekst i festede celler kan observeres som store, uregelmessige, hvite eller grønne flekker.

For bakterier observeres forurensning dagen etter. Mediene er turbulente, hvite og overskyet. Den hvite fargen er typisk for bakterieceller, som multipliserer mye raskere enn cellelinjer. Et erfarent øye er i stand til å fortelle forskjellen mellom ikke-forurensede medier og forurensede medier. For festede celler kan man sammenligne en flaske uåpnede medier med en kolbe for å sjekke om det ses turbulens i kolben.

Inne i det biologiske sikkerhetsskapet bør antall gjenstander holdes på et minimum. Unngå å plassere gjenstander på bak- og frontgrillene (se figur 3). I dette skapet er et sett med pipetter, spisser, autoklaverte glasspipetter, en pipettehjelp og markører inne. Arbeidsområdet i midten er oversiktlig. Å holde skap organisert på denne måten er en god idé. I tillegg bør operatøren ha på seg en ren laboratoriefrakk og hansker før arbeidet påbegynnes. En sprayflaske med 70 % EtOH bør oppbevares i nærheten, slik at operatøren kan spraye hanskene ofte. Huden er dekket av hansker eller en laboratoriefrakk. Operatøren bør justere stolen slik at armene er i 90° vinkel når de arbeider inne i skapet, og gjenstandene skal være innen rekkevidde inne i skapet (se figur 4).

Mange arter av mykoplasma kan identifiseres pålitelig ved hjelp av en PCR-basert analyse. Figur 5 viser resultatet av negativ mykoplasmatest. Båndet til venstre viser molekylvektstandardene for DNA. De fire båndene til høyre er positive kontroller. Ingen bånd vises under de testede celletypene fordi mykoplasma ikke ble påvist.

Hvis mediet inneholder pH-indikatorer, vil det være rødt for den optimale pH-verdien til celler ved 7,4. Når cellene vokser, vil mediet endre farge fra rødt til gult³. Denne fargeendringen kan også oppstå hvis bakterier tar over kolben og gror igjen (figur 6). Den gule fargen indikerer at pH er lav. Å observere en ny, uåpnet flaske media ved siden av en kolbe er en objektiv måte å observere forurensning i festede celler. For suspensjonskulturer kan brukeren nøye observere kolben for eventuelle vekster som flyter i mediet eller om en tykk ring av overgrodde bakterieceller er tilstede rundt innsiden av glasskolben. For begge celletyper kan en liten prøve tas og observeres under mikroskopet. Hvis andre vekst eller celleformer observeres, spesielt hvis cellene beveger seg, er dette en indikator på forurensning (figur 7). En grundig rensing av hemocytometeret bør utføres før celletelling, da denne typen rusk bare kan være tilstede på hemocytometeret og ikke i cellekulturene selv.

Lukten kan være en annen indikator på forurensning i en inkubator. Bakteriell overvekst har en typisk lukt som en erfaren cellekulturbruker vil legge merke til. Lukten faller alltid sammen med en forurenset kolbe, selv om en infisert kolbe ikke alltid får hele inkubatoren til å lukte.

Muggsoppforurensning har en tendens til å være mer utbredt i HEK 293 S-celler dyrket i suspensjon. Bakteriell forurensning er mer vanlig i SF-9-celler. Dette kan skyldes at RIC-celler dyrkes med fuktighet, og dermed fører til fuktakkumulering i inkubatorene. SF-9-celler dyrkes uten fuktighet, så miljøet er tørrere. Forurensningsgraden i adherente kulturer er mindre enn forurensningsgraden i suspensjonskulturer. Dette kan skyldes den mindre kolbestørrelsen, kolbens ikke-gjenbrukbare natur eller den ventilerte hetten i stedet for bruk av aluminiumsfolie.

Mycoplasma kan ikke observeres med det blotte øye eller med et vanlig lysmikroskop, selv om spesialisert transmisjonselektronmikroskopi kan oppdage mykoplasma. Et mykoplasmaidentifikasjonssett bør brukes til å teste cellekulturer månedlig. Mange arter av mykoplasma kan identifiseres pålitelig ved hjelp av en PCR-basert analyse. En kort beskrivelse av hvordan denne PCR-testen utføres finner du i protokolldelen, og mer informasjon om mykoplasma finner du i diskusjonsdelen.

Figur 1: Hvordan luft strømmer i et biosikkerhetsskap. Biologiske sikkerhetsskap trekker forurenset luft fra selve rommet og fra skapet gjennom grillene foran og bak. Denne luften går under metallarbeidsflaten, mot baksiden av skapet, og opp til toppen av enheten der et HEPA-filter er plassert. Der passerer luften gjennom filteret og blir filtrert. Denne rene luften presser ned på arbeidsflaten. På grunn av hvordan strømmen av filtrert luft presses ned inne i skapet, er det god praksis å ikke svinge. For eksempel er det uønsket å ha en hylse på toppen av en åpen flaske og risikere at potensielle forurensninger blir presset inn i mediet. Antall gjenstander som bringes inn i skapet, bør holdes på et minimum, og gjenstander skal ikke plasseres på front- eller bakgrillene for ikke å forstyrre luftstrømmen. Hvis du beveger armene inn og ut av kabinettet for raskt, kan det også forstyrre luftstrømmen. Laget for NuAire, Inc., av Jeff Kaphingst, Jeff the Designer, LLC. Brukt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Ikke-forurenset suspensjon og adherente celler og celler forurenset med mugg eller bakterier. Det første bildet til venstre inneholder insektceller (SF-9-celler) som ikke er forurenset. Det andre bildet viser en annen kolbe av disse cellene forurenset med mugg. Den tredje kolben var forurenset av bakterier, som det kan noteres av det tykke, hvite, overskyede utseendet. Den andre og tredje kolben ble forurenset fordi ingen av de riktige cellekulturteknikkene og praksisene ble fulgt. Alle kolber ble tilberedt samme dag. Vekst ble observert neste dag for bakteriell forurensning og 2 dager senere for muggforurensning. Ikke-forurensede adherente celler er vist (Hek293-celler) sammen med mugg og bakteriell forurensning i adherente kulturer. Muggforurensning er vist i den andre linjen i en rund petriskål. Bildet er tatt fra toppen av fatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Organisering av cellekulturkabinett. Inne i det biologiske sikkerhetsskapet skal mengden gjenstander holdes på et minimum. Plassering av gjenstander på baksiden og frontgrillene bør unngås. I dette skapet er et sett med pipetter, spisser, autoklaverte glasspipetter, en pipettehjelp og markører inne. Arbeidsområdet i midten er oversiktlig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Den riktige måten for en operatør å arbeide under strømningshetten. En operatør bør ha på seg en ren laboratoriefrakk og hansker før arbeidet påbegynnes. En sprayflaske med 70 % EtOH bør oppbevares i nærheten, slik at operatøren kan spraye hanskene ofte. Huden er dekket av hanskene eller laboratoriefrakken. Operatøren bør justere stolen slik at armene er i 90° vinkel når de arbeider inne i skapet. Elementer bør være innen rekkevidde inne i skapet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Negativt mykoplasmatestresultat. Mange arter av mykoplasma kan identifiseres pålitelig ved hjelp av en PCR-basert analyse. Båndet til venstre viser molekylvektstandardene for DNA. De fire båndene til høyre er positive kontroller. Ingen bånd vises under de testede celletypene fordi mykoplasma ikke ble påvist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Normal mediefarge endres fra rød til gul. Cellekulturmedier endrer fargen fra rød til gul hvis pH-indikatorer er til stede. Den gule fargen indikerer at pH er lav og mediet skal byttes ut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Forurensninger observert under lysmikroskopet. Hvis andre vekst eller celleformer observeres under lysmikroskopet mens du utfører celletelling, kan dette være en indikator på forurensning. Det skal bemerkes at en grundig rensing av hemocytometeret bør utføres før celletelling, da denne typen rusk bare kan være tilstede på hemocytometeret og ikke i cellekulturene selv. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Vedlegg Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Mens forurensning er en av de viktigste bekymringene når du utfører cellekulturarbeid, vil praksis og teknikker som er skissert i dette manuskriptet bidra til å redusere risikoen. De kritiske trinnene inkluderer bruk av et rent laboratoriebelegg, som bare brukes i cellekulturrommet, ved bruk av rene, pulverfrie hansker som sprayes med 70% EtOH ofte og som endres når du bytter mellom cellelinjer, oppfordrer hver enkelt til ikke å dele medieflasker, rengjør skapet grundig før og etter endt arbeid, Pent utpakking av serologiske pipetter, unngå langvarig nær kontakt med åpne flasker eller kolber, ikke dele medieflasker mellom flere cellelinjer, og raskt åpne og lukke inkubatordører. I tillegg sikrer vasking og autoklavering av eget glass kvalitetskontroll, og reduserer dermed sannsynligheten for å introdusere forurensninger utenfra. Kvalitetskontrollmetoder inkluderer bruk av autoklavtape for å indikere om sterilisatoren har nådd riktig temperatur på 121 °C, regelmessig forebyggende vedlikehold av utstyret og visuell inspeksjon av kolben for å sikre at den har blitt skrubbet ordentlig¹⁸. Et annet viktig poeng er å bruke separate inkubatorer for forskjellige celletyper for å sikre at forurensning fra en celletype ikke overføres til andre, og for å sikre at krysskontaminering med celler ikke forekommer.

Bakterie- og soppinfeksjoner er de to vanligste inntrengerne i cellekulturer. En av de viktigste forurensningene, M. orale, er den vanligste mykoplasmaarten i munnen og "representerer også det vanligste isolatet som står for 20%-40% av alle mykoplasmainfeksjoner i cellekulturer"⁴. Laboratoriepersonell er med andre ord den viktigste kilden til denne forurensningen. Det er alltid en bekymring i cellekulturrommet siden mykoplasma er en liten, saktevoksende mikroorganisme som mangler en stiv cellevegg som kan passere gjennom 0,45 μm filtre⁴. Studier viser at forekomsten av mykoplasmaforurensning er 15%-35% av kontinuerlige cellelinjer hos mennesker eller dyr⁴. Videre viser statistikk at ca 5% til 30% av verdens cellelinjer er forurenset med mykoplasmer⁶. Dessverre er mykoplasma resistent mot de fleste antibiotika som brukes til cellekultur, og infeksjon kan påvirke cellefysiologi og metabolisme ^4,6. Selv om forurensning ikke bremser cellemetabolismen, kan det forurense sluttproduktet⁶. Infeksjoner kan holde seg uten at laboratoriemedlemmer merker celleskader. Hvis forurensning oppstår, er kostnaden for tining av nye celler, tiden brukt på å forplante de nye kulturer, de dyre mediene som har blitt bortkastet, dekontaminering av inkubatorer og hvor mye tid kolleger bruker på å vente på å starte sine eksperimenter igjen, enorm. Vårt laboratorium anslår at den totale tapte tiden står for 2 uker, og den totale kostnaden forbundet med forurensning av et typisk humant pattedyrcelleproteinuttrykk på 8 L er $ 1,400. Praksisene og teknikkene som er skissert i dette manuskriptet, gir gode forebyggende tiltak for å redusere tilleggskostnader, tapte celler og nedetid.

Endringer av denne praksisen anbefales ikke. Alle laboratoriemedlemmer bør trenes før de jobber i cellekulturrommet og deretter motta oppfriskningstrening hvert år⁷. Lab-medlemmer bør også organisere cellekulturrommet slik at alle nødvendige forsyninger er i ett område, og dermed minimere behovet for laboratoriemedlemmer å forlate cellekulturrommet på jakt etter forsyninger.

Begrensninger av teknikkene som presenteres observeres hvis forurensning kommer fra eksterne kilder som serum, inkubatorer, funksjonsfeil autoklaver, skitne laboratoriefrakker eller kilden til cellene. Feilsøking av teknikken kan være nødvendig hvis forurensning oppstår til tross for streng overholdelse av denne protokollen. Mange eksterne faktorer kan bidra til denne typen forurensning. Lab-medlemmer må være forsiktige og sjekke eksterne kilder. For eksempel kan partiet av føtalt bovint serum (FBS) kjøpt fra leverandøren ha blitt forurenset med mykoplasma. Sammenlignet med 1950-tallet er dette nå en sjelden forekomst, men det kan fortsatt skje⁶. Alle medieflasker skal kastes ut hvis det oppdages forurensning, og protokollen startes på nytt ved å tine nye celler og bruke nye medier. Forurensningen kan allerede ha vært tilstede inne i inkubatoren hvis det er mugg eller bakterier; De andre kolbene inne i samme inkubator bør kontrolleres for å se om bakterie- eller muggvekst observeres. Alle forurensede kolber skal kastes ut og inkubatoren dekontamineres. Hvis det ikke oppdages forurensning, bør autoklaven kontrolleres for funksjonsfeil; Glasset kan ikke ha blitt autoklavert riktig i utgangspunktet. Autoklavbåndet kan endre farge til tross for at autoklaven ikke når 121 °C. Etterpå bør utløpsdatoer på antibiotikaløsningene som brukes, kontrolleres; Nye løsninger må kanskje kjøpes. Til slutt bør kilden til cellene vurderes; Var de fra en pålitelig laboratorieleverandør eller lånt fra et annet laboratorium? Celler skal alltid kjøpes fra en pålitelig laboratorieleverandør og skal aldri lånes fra et annet laboratorium. Til slutt bør laboratoriefrakker vaskes for å sikre renslighet¹⁹. Dekontaminering av inkubatorer bør vurderes når en kolbe har blitt forurenset. Bakterieceller eller muggsporer må ikke få formere seg og fortsette å spre forurensning.

Eksisterende metoder reflekterer over eliminering av forurensning. Metodene som er skissert i dette manuskriptet, fokuserer på forebygging snarere enn eliminering av forurensning. Det finnes flere prosedyrer for bruk av antibiotika for å fjerne mykoplasma²⁰. Bruk av antibiotika er imidlertid risikabelt, da de kanskje ikke eliminerer infeksjonen fullstendig og "kan tillate resistente organismer å utvikle seg"¹². Faktisk ble "72% av kulturer dyrket kontinuerlig i antibiotika vist å være mykoplasma-positive, mens bare 7% dyrket i fravær av antibiotika ble infisert"¹². Disse dataene understreker ideen om at mens bruk av antibiotika anbefales og kan være nyttig, er overforbruk eller fullstendig avhengighet av antibiotika ikke gunstig. Videre kan bruk av antibiotika for å fjerne forurensning bare tillate problemet å vedvare. Antibiotiske løsninger er ikke nødvendige; Hvis teknikkene i dette papiret følges, bør forurensning forhindres.

Praksisene og teknikkene som er skissert i dette manuskriptet, kan brukes i fremtiden for å opprettholde et aseptisk miljø når du utfører den månedlige mykoplasmatesten og når du lager hjemmelagde kompetente bakterieceller. Begge protokollene krever et rent miljø, som ligner på cellekulturarbeid, slik at sluttproduktet ikke er forurenset.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques