Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Een biggenperinataal asfyxiemodel om hartletsel en hemodynamiek te bestuderen na hartstilstand, reanimatie en de terugkeer van spontane circulatie

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64788
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3,4, 5, 6,7, 6,7, 8,9, 10,11, 1,2, 2
1Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo, 2Department of Neonatal Intensive Care, Division of Pediatric and Adolescent Medicine, Oslo University Hospital Rikshospitalet, 3Department of Pediatric Research, Division of Paediatric and Adolescent Medicine, Oslo University Hospital Rikshospitalet, 4Department of Pediatrics, Vestfold Hospital Trust, 5Department of Anesthesiology, Oslo University Hospital Rikshospitalet, 6Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, 7Centre for the Studies of Asphyxia and Resuscitation, Neonatal Research Unit, Royal Alexandra Hospital, 8Division of Paediatric and Adolescent Medicine, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, 9Department of Paediatrics and Adolescent Health, University of Botswana, 10Department of Pediatric Research, Oslo University Hospital, University of Oslo, 11Department of Pediatrics, Robert H Lurie Medical Research Center, Northwestern University Chicago

Summary

Dit biggenmodel omvat chirurgische instrumentatie, verstikking tot de hartstilstand, reanimatie en observatie na reanimatie. Het model maakt meerdere bemonstering per dier mogelijk en door gebruik te maken van continue invasieve arteriële bloeddruk, ECG en niet-invasieve cardiale outputmonitoring, biedt het kennis over hemodynamiek en cardiale pathofysiologie bij perinatale asfyxie en neonatale cardiopulmonale reanimatie.

Abstract

Neonatale biggen zijn op grote schaal gebruikt als translationele modellen voor perinatale asfyxie. In 2007 hebben we een beproefd biggen-asfyxiemodel aangepast door een hartstilstand te introduceren. Dit stelde ons in staat om de impact van ernstige asfyxie op belangrijke uitkomsten te bestuderen, waaronder de tijd die nodig is voor de terugkeer van spontane circulatie (ROSC), evenals het effect van borstcompressies volgens alternatieve protocollen voor cardiopulmonale reanimatie. Vanwege de anatomische en fysiologische overeenkomsten tussen biggen en menselijke pasgeborenen, dienen biggen als goede modellen in studies van cardiopulmonale reanimatie en hemodynamische monitoring. In feite heeft dit hartstilstandmodel bewijs geleverd voor de ontwikkeling van richtlijnen door onderzoek naar reanimatieprotocollen, pathofysiologie, biomarkers en nieuwe methoden voor hemodynamische monitoring. Met name de incidentele bevinding dat een aanzienlijk deel van de biggen pulsloze elektrische activiteit (PEA) heeft tijdens een hartstilstand, kan de toepasbaarheid van het model vergroten (d.w.z. het kan worden gebruikt om pathofysiologie te bestuderen die verder reikt dan de perinatale periode). De modelgeneratie is echter technisch uitdagend en vereist verschillende vaardigheden, toegewijd personeel en een fijne balans van de maatregelen, inclusief de chirurgische protocollen en het gebruik van sedativa / analgetica, om een redelijke overlevingskans te garanderen. In dit artikel wordt het protocol in detail beschreven, evenals ervaringen met aanpassingen aan het protocol door de jaren heen.

Introduction

Perinatale asfyxie wordt veroorzaakt door gecompromitteerde gasuitwisseling (hypoxemie en hypercapnie) voor, tijdens en/of na de geboorte. Het resulteert in een verminderde bloedtoevoer (ischemie) naar vitale organen en daaropvolgende gemengde respiratoire en metabole acidose. Perinatale asfyxie is een veel voorkomende geboortecomplicatie die jaarlijks wereldwijd 580.000 kindersterfte veroorzaakt1. Het verminderen van dit aantal is essentieel om de sterfte bij pasgeborenen en kinderen jonger dan 5 jaar te verminderen, zoals vermeld in de Duurzame Ontwikkelingsdoelstelling nummer 3.2 van de Verenigde Naties (d.w.z. neonatale sterfte <12 per 1.000 levendgeborenen en sterfte onder de 5 jaar <25 per 1.000 levendgeborenen)2.

Klinisch presenteert asfyxie zich als hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE), ademhalingsdepressie en circulatoir falen bij het pasgeboren kind3 (d.w.z. symptomen en tekenen van hypoxie-ischemie van vitale organen)4. Bijgevolg kan een verstikt kind behandeling nodig hebben voor encefalopathie, inclusief aanvallen, en geavanceerde ademhalings- en bloedsomloopondersteuning. Wereldwijd hebben elk jaar maar liefst 10 miljoen baby's een vorm van interventie nodig, zoals tactiele stimulatie, en 6-7 miljoen baby's hebben geassisteerde beademing nodig bij de geboorte5. Perinatale asfyxie legt dus een enorme druk op het gezondheidszorgsysteem, met bijbehorende sociaaleconomische implicaties. Om de wereldwijde ziektelast die wordt toegeschreven aan perinatale asfyxie te verminderen, zijn onze onderzoeksgroepen van mening dat de volgende aandachtsgebieden in wetenschappelijke studies moeten worden onderzocht: preventie, inclusief het verbeteren van prenatale en verloskundige zorg en follow-up; prognostische biomarkers; en geoptimaliseerde reanimatie en stabilisatie van de verloskamer6.

Pasgeboren biggen en menselijke zuigelingen op korte termijn zwangerschap hebben vergelijkbare anatomie en pathofysiologie7. Hoewel geen enkel diermodel van perinatale asfyxie en hartstilstand het volledige aspect van mislukte perinatale overgang kan creëren die leidt tot verstikking en hartstilstand, zijn biggen goede translationele modellen.

Al in de jaren 1970 ontwikkelden we een hypoxiemodel bij volwassen varkens8. Het werd met succes verfijnd door onderzoeksgroepen9, waardoor een biggenmodel van perinatale asfyxie 10,11,12,13,14,15,16,17,18 werd verkregen. In 2007 werden de eerste experimenten met hartstilstand bij biggen uitgevoerd aan het Instituut voor Chirurgisch Onderzoek van het Oslo University Hospital11,13,15,16. Het arrestatiemodel heeft bewijs geleverd voor richtlijnontwikkeling 10,13,15,16,19,20, evenals enorme mogelijkheden voor fysiologische studies en het testen van apparatuur / diagnostische hulpmiddelen 14,21, reanimatieprotocollen (gerandomiseerde gecontroleerde studies)13,15,16,22, en bloed- en weefselbiomarkers 10,12,20. Het model is dus veelzijdig gebleken en één enkele experimentele reeks wordt traditioneel gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te beantwoorden. Dit is belangrijk en in overeenstemming met de drie V's (reductie, vervanging en verfijning) van proefdieronderzoek23 (d.w.z. het principe van het verminderen van het aantal dieren dat wordt geofferd voor wetenschappelijke doeleinden).

In het volgende protocol wordt het biggenmodel van perinatale asfyxie in detail beschreven, inclusief het induceren, definiëren en vaststellen van een hartstilstand. Het model is verfijnd om de blootstelling aan sedativa en chirurgische ingrepen te minimaliseren en omvat mechanische beademing, verstikking, reanimatie, observatie na reanimatie en het verzamelen van monsters van bloed, urine en hersenvocht. Onze groepen verzamelen ook traditioneel weefsels van vitale organen postmortaal, maar de procedure van weefselverzameling wordt niet in detail beschreven in dit protocol. Het model simuleert een hypoxische belediging met gemengde respiratoire en metabole acidose, die de biochemie van verstikte menselijke pasgeborenen weerspiegelt. Door de biggen nauwlettend te volgen met invasieve bloeddruk (BP) en hartslag (HR), pulsoximetrie (PO), elektrocardiogram (ECG), impedantiecardiografie (ICG) en nabij-infraroodspectroscopie (NIRS) beoordelingen, kan de fysiologie van perinatale asfyxie, met een bijzondere focus op het hart, in detail worden bestudeerd.

Het model is technisch uitdagend, omdat een zeer fijne balans in de medicijnen, chirurgische ingrepen en de methode voor het induceren van een hartstilstand vereist is om een redelijke overlevingskans te garanderen. Het uitvoeren van de experimenten vereist een grondige voorbereiding en een toegewijd en goed functionerend team. Ook de selectie van proefdieren lijkt een belangrijke rol te spelen bij het waarborgen van succesvolle experimenten. In dit artikel beschrijven we het protocol in detail en onze ervaringen ermee.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door de Noorse Autoriteit voor voedselveiligheid (goedkeuring nr. 25030) en de experimenten werden uitgevoerd volgens Europese, Noorse en institutionele voorschriften. De replicatie van dit model vereist het verkrijgen van ethische goedkeuring voor de dierproeven in overeenstemming met institutionele en nationale regelgeving en ervoor zorgen dat de experimenten worden uitgevoerd volgens de drie Rs23. Al het personeel dat met de dieren omgaat, moet gecertificeerd zijn met de functies A, B en D overeenkomstig artikel 23 en artikel 24 van de EU-richtlijn 2010/63/EU24, of gelijkwaardig. Houd de dieren tijdens het hele experiment nauwlettend in de gaten en pas de anesthesie, beademingsinstellingen, temperatuur en dierpositionering aan om het welzijn van de dieren te garanderen. Beoordeel het model en de toepassing ervan regelmatig kritisch en verfijn waar nodig en mogelijk.

OPMERKING: De biggen die in deze studie werden gebruikt, waren 12-36 uur oud, wogen 1,7-2,3 kg, hadden een gelijke geslachtsverdeling, waren van gemengd Noors landras, Duroc en Yorkshire-ras en waren genetisch ongemodificeerd. Stap 1 en stap 2 van het protocol omvatten algemene anesthesie- en gegevensbemonsteringsprocedures die gedurende het hele experiment van toepassing zijn, en stappen 3-10 beschrijven de experimentele procedures, inclusief de voorbereiding van de dieren, chirurgische interventie, verstikking tot hartstilstand, reanimatie en observatie na reanimatie.

1. Anesthesieprotocol (TIJD: geldt voor het hele experiment)

  1. Induceer anesthesie met een bolus van IV fentanyl (50 μg/kg) en pentobarbital (15-20 mg/kg) in een perifere veneuze katheter in een oorader.
    LET OP: Fentanyl is schadelijk bij inademing of inname en irriteert de ogen en de huid. Het is ook een beperkt medicijn. Het aanbod en gebruik ervan moet worden gecontroleerd en gereguleerd volgens de voorschriften voor beperkte geneesmiddelen. Pentobarbital is schadelijk bij inname en irriteert de ogen en de huid.
  2. Handhaaf anesthesie met IV fentanyl (50 μg / kg / h) tot verstikking, en stop dan tijdens verstikking en herstel opnieuw bij 25 μg / kg / h na de terugkeer van spontane circulatie (ROSC).
    OPMERKING: De hooggedoseerde fentanyl-anesthesie die in dit model wordt gebruikt, komt voort uit tientallen jaren van verfijning van het model in een gezamenlijke inspanning van neonatologen en pediatrische anesthesiologen. Hoge dosis fentanyl-anesthesie is geassocieerd met cardiovasculaire en hemodynamische stabiliteit25,26 bij menselijke volwassenen en pasgeborenen. Een studie bij pasgeboren biggen toonde echter aan dat fentanylgebruik geassocieerd was met verminderde HR en cardiale output (CO) en verhoogde gemiddelde arteriële druk (MAP), linkerventrikel einddiastolische druk en totale perifere weerstandsindex27.
  3. Bewaak het welzijn van de big gedurende het hele experiment. Controleer de spierspanning en beoordeel de vitale functies om ervoor te zorgen dat de big grondig wordt verdoofd. Als de big tekenen van angst vertoont, dien dan extra IV-fentanyl of IV-pentobarbital toe volgens klinisch oordeel.

2. Gegevensbemonstering en registraties (TIJD: geldt voor het hele experiment)

  1. Druk voor elke big een papieren registratieformulier (CRF) af. De CRF bevat informatie over de HR, BP (inclusief MAP), zuurstofsaturatie (SpO2), regionale cerebrale zuurstofverzadiging (NIRS), temperatuur, extra medicatie en rillingen.
  2. Geef de big op de CRF een ID-nummer en noteer het gewicht en geslacht van de big op de voorpagina.
  3. Maak de registraties elke 5 minuten tijdens de stabilisatieperiode en net voor de inductie van asfyxie. Na de inductie van asfyxie, maak de eerste registratie na 10 minuten en vervolgens elke 5 minuten tot hartstilstand. Als ROSC wordt bereikt, maak de registraties dan zo snel mogelijk na ROSC, elke 5 minuten voor het eerste uur na ROSC en vervolgens elke 30 minuten voor de rest van de observatieperiode.
  4. Geef op de CRF aan wanneer de verschillende exemplaren moeten worden verzameld.
    1. Verzamel volledig bloed en plasma aan het begin van de stabilisatie, net voor de inductie van verstikking, bij hartstilstand, bij ROSC, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min en 540 min na ROSC, en aan het einde van het onderzoek (570 min).
      OPMERKING: Het is belangrijk om te berekenen hoeveel bloed uit elke big kan worden getrokken. Er kan bijvoorbeeld minder bloed worden afgenomen van kleinere biggen, instabiele biggen en biggen die wat bloedverlies hebben opgelopen door de nekoperatie. Het is ook van vitaal belang om het hemoglobine (Hb) van de zuur-base status gedurende het hele experiment te bekijken. In deze studie werden biggen met Hb <6 g/dl uitgesloten.
    2. Urine verzamelen op 240 min na ROSC en aan het einde van het onderzoek (570 min).
    3. Neem de zuur-base status aan het begin van de stabilisatie, net voor de inductie van asfyxie, 10 minuten na de inductie van asfyxie, en vervolgens elke 5 minuten tot hartstilstand. Neem de zuur-base status bij hartstilstand, bij ROSC, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min en 540 min na ROSC, en aan het einde van het onderzoek (570 min).
    4. Verzamel hersenvocht (CSF) aan het einde van het onderzoek (570 min).
  5. Verzamel volledig bloed en plasma van de centrale arteriële katheter.
    1. Trek 2 ml bloed uit de centrale arteriële katheter op in een gehepariniseerde spuit en leg opzij.
    2. Trek vervolgens 2,5 ml bloed op in een nieuwe gehepariniseerde spuit. Plaats 0,5 ml van het laatst getrokken volbloed in een microcentrifugebuis en vries in vloeibare stikstof.
    3. Plaats de resterende 2 ml in een EDTA-injectieflacon van de juiste grootte en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.700 x g bij 4 °C. Pipetteer het plasma (dat zich scheidt van de buffy coat en erytrocyten als de bovenste laag) in microcentrifugebuizen en vries het in vloeibare stikstof.
    4. Zuig nog eens 0,2 ml bloed uit de centrale arteriële katheter op in een nieuwe gehepariniseerde spuit. Plaats de spuit in de zuur-base machine (zie Tabel met materialen) en vul de relevante informatie in (de ID, het tijdstip en de temperatuur van de big).
    5. Duw het bloed dat in de eerste gehepariniseerde spuit is opgezogen terug in de arteriële katheter. Spoel de arteriële katheter met gehepariniseerde normale zoutoplossing om ervoor te zorgen dat al het bloed wordt teruggebracht naar de bloedsomloop van de big.
  6. Verzamel urine door suprapubische aspiratie van urine.
    1. Lokaliseer de oriëntatiepunten: het gebied tussen het op twee na laagste en op een na laagste paar tepels, ongeveer 2 cm onder de navelstreng en een paar millimeter lateraal naar de middellijn.
    2. Gebruik een spuit van 10 ml met een canule van 23 G. Verplaats de canule verticaal ongeveer 1 cm en zuig op totdat de spuit zich vult met urine. Doe de urine in een cryogene buis en vries in vloeibare stikstof.
  7. Verzamel CSF door een lumbaalpunctie.
    1. Plaats de big op zijn zij en trek de achterpoten omhoog naar de borst. Lokaliseer de oriëntatiepunten: tussen de spinale tags ter hoogte van de iliacale top van de big.
    2. Verplaats een canule van 21 G iets craniaal tussen de spinale tags totdat de liquor tevoorschijn komt. Doe de liquor in microcentrifugebuizen en vries in vloeibare stikstof.
    3. Verzamel continue ECG- en invasieve arteriële BP-gegevens (zie stap 6 en stap 7) met behulp van software voor gegevensverzameling en -analyse (zie materiaaltabel). Voer NIRS uit (zie stap 7) met een in de handel verkrijgbare NIRS-machine (zie Materiaaltabel).

3. Voorbereiding (TIJD: weken tot maanden, zo lang als nodig is)

  1. Verkrijg ethische goedkeuring voor de dierproeven.
  2. Neem contact op met een boer en organiseer de selectie van biggen (leeftijd: 12-36 uur, gelijke geslachtsverdeling, gewicht: 1,7-2,3 kg), leveringsdatum en transportregelingen.
    OPMERKING: Het selecteren van biggen van hetzelfde ras (in deze studie een mix van Noors landras, Duroc en Yorkshire) en boerderij, idealiter uit hetzelfde nest en binnen een smalle leeftijdscategorie, is belangrijk voor het verminderen van biologische en fysiologische variantie.
  3. Zorg ervoor dat personeel beschikbaar is op de ingestelde datum(s).
  4. Controleer of alle benodigde apparatuur beschikbaar is en of alle instrumenten en observatieapparatuur werken. Controleer de houdbaarheidsdatum van het verstikkingsgas (8% O 2, 92% N2) en of het niet leeg is.
  5. Richt het lab en alle apparatuur zo in dat het klaar is voor de ontvangst van de biggen. Kalibreer alle benodigde apparatuur.
  6. Voer een schatting van de steekproefgrootte uit in het geval van een gerandomiseerde gecontroleerde studie en bereid de randomisatie van de biggen voor.

4. Ontvangst van biggen (TIJD: van 10 min tot 2 uur, afhankelijk van het aantal biggen)

  1. Organiseer het transport van de binnenlandse biggen van de boerderij naar de chirurgische faciliteit op de dag van de experimenten. Bedek de "vloer" van de container met fijne houtsnippers en warmwaterkruiken om de temperatuur van de biggen te handhaven. Maak braamgaten in de container om de circulatie van lucht te garanderen.
  2. Vraag informatie van de boer over de leeftijd en het gewicht van de biggen. Controleer hun gewicht bij aankomst.
  3. Meet de SpO2 en HR door een pulsoximeter (PO)-sonde (zie materiaaltabel) op de achterpoot van de big te plaatsen terwijl de big rustig en op zijn gemak is in de container.
  4. Bereid alle instrumenten voor en zet de verwarming op de elektrische verwarmingsmatrassen op de operatietafel aan.
  5. Laat de biggen rusten in de container totdat iedereen in het team klaar is voor de inductie van anesthesie en chirurgische ingreep.

5. Inductie van anesthesie, intubatie en mechanische ventilatie (TIJD: 15 min)

  1. Bereid de apparatuur voor op IV-toegang en intubatie.
  2. Breng de PO-sonde aan op een achterpoot voor de bewaking van oxygenatie en HR tijdens de inductie van anesthesie en intubatie.
  3. Zorg ervoor dat die persoon de ingebakerde big stil en kalm houdt. Zorg ervoor dat persoon twee een perifere intraveneuze katheter in een oorader inbrengt. Spoel de katheter met ongeveer 1 ml normale zoutoplossing om de plaatsing te bevestigen. Zet de katheter vast met tape.
  4. Injecteer een bolusdosis fentanyl en pentobarbital in de oorader (zoals beschreven in stap 1.1). Spoel de katheter met 1 ml normale zoutoplossing. Controleer of de big verdoofd is door de ontwenningsreflexen te beoordelen.
  5. Zorg ervoor dat die persoon de big in rugligging plaatst. Open de mond en trek de tong eruit met een gaasje van 10 cm x 10 cm. Houd het strottenhoofd in een rechte lijn.
  6. Zorg ervoor dat persoon twee de laryngoscoop gebruikt (zie tabel met materialen) om de tong op te tillen. Ga naar voren met de laryngoscoop om de epiglottis op te tillen en de stembanden te visualiseren. Breng de endotracheale buis (ETT, zie Tabel met materialen) door de stembanden.
    OPMERKING: Het gebruik van een ETT met manchetten kan de voortgang van de ETT door de stembanden uitdagender maken. Als intubatie moeilijk is, is het vooral belangrijk om de vitale functies van de big in de gaten te houden. Als de vitale functies vallen, plaats dan een masker over de snuit van de big, sluit het masker aan op een zelfopblazende zak en ventileer de big handmatig totdat de vitale functies normaliseren. Probeer vervolgens opnieuw te intuberen. Als het nog steeds een uitdaging is, overweeg dan om een extra dosis pentobarbital te geven. In zeldzame gevallen (bijv. afwijking van de bovenste luchtwegen) moet een tracheostoma worden uitgevoerd. Met ervaren personeel is intubatie echter meestal gemakkelijk uit te voeren.
  7. Sluit de ETT aan op een zelfopblazende zak (zie Materiaaltabel) en start de handmatige ventilatie.
  8. Bevestig de juiste ETT-plaatsing door 1) bilaterale en symmetrische borststijging bij beademing, 2) bilaterale en symmetrische ademgeluiden over de longvelden zonder geluid van luchttoevoer via de overbuikheid, 3) SpO2 - en HR-reacties en 4) condensatie in de ETT. De verlopen CO2 kon bij twijfel ook (semi)kwantitatief worden gemeten.
  9. Blaas de ETT-manchet op. Zet de ETT vast op een diepte van 12-13 cm (voor een big van 2 kg) met tape die in de lengterichting in tweeën is gespleten. Drapeer de tape rond het deel van de ETT onmiddellijk distaal naar de voortanden en ga verder rond de snuit.
  10. Blijf de big handmatig ventileren totdat deze wordt overgebracht naar de chirurgische interventietafel waar deze is aangesloten op een mechanische ventilator. Sluit op de tafel de ETT aan op de mechanische ventilator (zie Materiaaltabel) met de volgende instellingen: P Insp = 15-20 cm H 2 O, Peep= 5,0 cm H2O, Flow Insp = 8,0 L/min, Frequentie = 30 bpm enT Insp = 0,34 s.
    OPMERKING: Als de big SpO 2 <90% heeft, kunnen de PInsp en frequentie worden verhoogd totdat de SpO2 ≥90% is. Aanvullende zuurstof kan worden gebruikt als het reanimatieprotocol niet de vergelijking van verschillende FiO2s omvat.
  11. Plaats een rectale thermometer en zet deze vast met chirurgische tape rond de staart van de big.
  12. Handhaaf de temperatuur van de big (38,5-39,0 °C) met warme dekens/handdoeken die als een nest om de big zijn gedrapeerd, door de temperatuur van het verwarmingsmatras onder de big aan te passen en/of door rubberen/latex handschoenen te vullen met heet kraanwater en deze in de handdoeken rondom de big te leggen. Let op de temperatuur van de big tijdens de chirurgische ingreep en voer indien nodig temperatuurstabiliserende maatregelen uit.

6. Chirurgische ingreep (TIJD: 20 min)

  1. Bereid alle benodigde apparatuur voor en vul alle katheters met een normale zoutoplossing (figuur 1). Noteer het tijdstip waarop de chirurgische ingreep begint op de CRF.
  2. Steriliseer de huid van de verdoofde big met 5 mg / ml gekleurd chloorhexidine met behulp van 3-5 chirurgische sponzen.
  3. Maak een 2,5 cm lange huidincisie aan de rechterkant van de nek van de big met behulp van een scalpel.
  4. Gebruik ooglidoprolmechanismen om de huid aan beide zijden van de incisie in te trekken.
  5. Gebruik een slagadertang om de interne halsader te ontleden en bloot te leggen (figuur 2).
  6. Plaats twee nylon 3-0 hechtdraden onder de halsader om deze stabiel te houden.
  7. Houd een van de hechtingen in de ene hand en de centrale veneuze katheter in de andere (figuur 3). Breng de centrale veneuze katheter in en trek de naald terug.
  8. Bind een van de hechtdraden die werd gebruikt om de ader rond de ader (en de katheter) vast te houden in het gebied waar de katheter zich in de ader bevindt (figuur 4).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de hechtdraad niet te strak om de katheter is gebonden en dat de knoop proximaal is aan de distale punt van de katheter.
  9. Spoel met 1 ml normale zoutoplossing om de juiste plaatsing van de katheter te bevestigen.
  10. Sluit de huid met absorbeerbare 4-0 hechtingen.
  11. Verbind fentanyl 50 μg/kg/h en een uitgebalanceerde koolhydraat-elektrolytoplossing (10 mg/ml glucose, zie materiaaltabel) met de centraal veneuze katheter.
  12. Maak een 2,5 cm lange huidincisie aan de linkerkant van de nek van de big met behulp van een scalpel. Maak de incisie iets medialer dan de incisie aan de rechterkant van de nek.
  13. Gebruik ooglidoprolmechanismen om de huid aan beide zijden van de incisie in te trekken.
  14. Gebruik vervolgens een slagadertang om de gemeenschappelijke halsslagader (mediaal naar de sternocleidomastoïde spier) te ontleden en bloot te leggen.
  15. Plaats twee nylon 3-0 hechtdraden onder de gemeenschappelijke halsslagader om deze stabiel te houden.
  16. Houd een van de hechtingen in de ene hand en de centrale arteriële katheter in de andere. Breng de centrale arteriële katheter in en trek de naald terug.
  17. Bind een van de hechtdraden die werd gebruikt om de slagader rond de slagader (en de katheter) vast te houden in het gebied waar de katheter zich in de slagader bevindt.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de hechtdraad niet te strak om de katheter is gebonden en dat de knoop proximaal is aan de distale punt van de katheter.
  18. Spoel met 1 ml normale zoutoplossing om de juiste plaatsing van de katheter te bevestigen.
  19. Gebruik absorbeerbare 4-0 hechtingen om de kathetervleugels aan de huid te bevestigen en de huid te sluiten.
  20. Maak verbinding met invasieve arteriële BP-monitoring (zie Materiaaltabel) en begin met opnemen met behulp van de software voor gegevensverzameling en -analyse.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de invasieve arteriële BP-transducer op hartniveau is gekalibreerd om correcte BP-metingen te krijgen.
  21. Dek af met een transparante dressing. Nu is de centrale arteriële katheter op zijn plaats.
  22. Noteer op de CRF het tijdstip waarop de operatie eindigde.

7. Stabilisatie (TIJD: Minimaal 1 uur, maar zo lang als nodig is om de big na de operatie te stabiliseren en voor het personeel om zich voor te bereiden op de inductie van verstikking)

  1. Sluit de big aan op de ECG-bewakingsapparatuur (zie materiaaltabel).
    1. Scheer en verwijder het haar indien nodig voordat u de elektroden plaatst. Plaats twee elektroden aan elke kant van de thorax - aan de mediale kant van elke bovenste ledemaat. Plaats de derde elektrode aan de linkerkant van de navelstreng.
    2. Sluit de kabels aan op de elektroden en begin met opnemen met behulp van de software voor gegevensverzameling en -analyse.
  2. Sluit de big aan op een niet-invasief CO-bewakingsapparaat (zie materiaaltabel).
    1. Scheer en verwijder het haar indien nodig voordat u de elektroden plaatst (zie materiaaltabel). Plaats de eerste elektrode bovenop het hoofd van de big, net achter de ogen, de tweede aan de linkerkant van de nek, de derde aan de linkerkant van de buik, midaxillair ter hoogte van de navelstreng en de vierde elektrode op de linkerdij.
    2. Vul de relevante informatie op het apparaat in en begin met opnemen. Vanwege het beperkte interne geheugen past u de bemonsteringsfrequentie aan op basis van de duur van het experiment.
  3. Sluit de big aan op NIRS-monitoring.
    1. Scheer en verwijder het haar indien nodig voordat u de elektroden plaatst. Plaats de NIRS-elektroden (zie materiaaltabel) op de bovenkant van de kop van de big, achter de niet-invasieve CO-elektrode, en zet ze vast met niet-transparante tape ter bescherming tegen licht.
  4. Sluit de big aan op extra bewakingsapparatuur indien van toepassing en voer echocardiografie uit als dit deel uitmaakt van het experimentele protocol.
  5. Plaats de big in een comfortabele positie, bij voorkeur liggend.
  6. Voer de metingen en registraties uit en noteer op de CRF tijdens de stabilisatieperiode (zie stap 2).
  7. Observeer de big met betrekking tot temperatuur, SpO2, HR, BP en rillingen tijdens de stabilisatieperiode. Pas de mechanische ventilatorinstellingen en de temperatuur van de big aan en geef indien nodig extra anesthesie.

8. Inductie van verstikking en hartstilstand (TIJD: 15-60 min, varieert tussen biggen)

OPMERKING: Alle betrokken personeelsleden moeten hun rol kennen voordat de inductie van verstikking plaatsvindt.

  1. Bepaal een tijdstip om de verstikking te starten (op basis van de duur van de stabilisatie en beschikbaarheid van personeel) en schrijf dit op de CRF.
  2. Noteer de fysiologische metingen van de big op de CRF en neem bloedmonsters vlak voor de inductie van asfyxie.
  3. Stop de fentanyl IV vlak voor het begin van verstikking.
  4. Om de verstikking te starten, draait u de zuurstofknop op de mechanische ventilator naar 100% en schakelt u de zuurstofslang op de ventilator naar het verstikkingsgas (8% O 2, 92% N2).
  5. Verlaag de ventilatorsnelheid met 10 inflaties/min.
  6. Zorg ervoor dat de SpO2 van de big daalt om er zeker van te zijn dat de inductie succesvol is.
  7. Verlaag na 10 minuten verstikking de beademingssnelheid met nog eens 10 inflaties / min.
  8. Neem na 10 minuten verstikking en daarna elke 5 minuten de zuur-basestatus en noteer de fysiologische metingen van de big op de CRF. Ga door tot een hartstilstand.
  9. Verlaag na 20 minuten verstikking de beademingssnelheid met nog eens 10 inflaties / min.
  10. Na 30 minuten verstikking klemt u de ETT vast met een arteriële tang.
  11. Wanneer de MAP onder de 20 mm Hg zakt, start dan de continue auscultatie van het hart.
    OPMERKING: Hartstilstand wordt gedefinieerd als een niet-hoorbare hartslag door auscultatie en / of het verlies van arteriële lijnpulsatie. Houd er rekening mee dat pulsloze elektrische activiteit (PEA) op het ECG kan optreden.
  12. Zorg ervoor dat die persoon het hart ausculteert. Roep hardop wanneer de hartslag niet meer hoorbaar is (hartstilstand) tijdens het verwijderen van de ETT-klem. Zorg ervoor dat persoon twee de verstikkingsgasslang op de ventilator terugschakelt naar de zuurstofuitlaat. Noteer de tijd van hartstilstand op de CRF en start een timer.
  13. Stel de FiO 2 in zoals toegewezen door protocol (in deze studie werden de biggen gerandomiseerd om een FiO2 van 0,21 of 1,0 te ontvangen). Stel de ventilatorinstellingen als volgt in: P Insp = 30 cm H 2 O,Peep = 5,0 cmH2O, Flow Insp = 8,0 L/min, Frequentie = 40 bpm en TInsp = 0,34 s.
  14. Neem bloedmonsters van het tijdstip van de hartstilstand, zoals beschreven in stap 2.5.

9. Cardiopulmonale reanimatie (CPR) (TIJD: 0-15 min)

OPMERKING: Reanimatie kan worden uitgevoerd volgens richtlijnen28 van het International Liaison Committee on Resuscitation (ILCOR), met een verhouding van 3:1 borstcompressie tot beademing of verschillende verhoudingen van borstcompressies tot beademingen, afhankelijk van het doel van het onderzoek.

  1. Als u de door ILCOR aanbevolen 3:1-reanimatie gebruikt, voert u de volgende stappen uit.
    1. Ventileer de big mechanisch gedurende 30 s na een hartstilstand. Start vervolgens de borstcompressies en streef naar een verhouding van 3: 1 borstcompressie tot beademing.
      OPMERKING: Omdat de ventilator de beademingen uitvoert en niet een persoon, kunnen de borstcompressies en beademingen soms gelijktijdig / ongecoördineerd zijn.
    2. Comprimeer de borstkas tot een diepte van 1/3 van de thoracale anteroposterieure diameter, laat volledige borstkas terugdeinzen en gebruik de twee-duim omringende handen techniek. Streef naar het genereren van een systolische arteriële druk ≥20 mm Hg.
    3. Dien adrenaline (0,02-0,03 mg/kg) IV toe na 30 s borstcompressies en vervolgens elke 3 minuten reanimatie (maximaal vier doses). Spoel met 1 ml normale zoutoplossing na elke toediening van adrenaline.
  2. Bepaal ROSC door de arteriële BP-traceringen en het ECG te observeren en te bevestigen door cardiale auscultatie. De definitie van ROSC is een stabiele, niet-ondersteunde HR ≥100 bpm.
  3. Ga door met de reanimatie-inspanningen tot ROSC of gedurende maximaal 15 minuten. Als reanimatie niet binnen 15 minuten succesvol is, stop dan met reanimatie-inspanningen, vermeld het tijdstip van overlijden en noteer op de CRF.
  4. Als reanimatie-inspanningen succesvol zijn, noteer dan op de CRF het tijdstip van ROSC, de duur van de reanimatie in seconden en het aantal toegediende adrenalinedoses.
  5. Neem bloedmonsters en CRF-registraties zo snel mogelijk na ROSC en ga door met de registraties zoals beschreven in stap 2 gedurende nog eens 9,5 uur (570 min).

10. Post-ROSC observatie (TIJD: 9,5 uur)

  1. Herstel de fentanyl IV-infusie, aanvankelijk bij 25 μg/kg/h, en titreer volgens de klinische effecten/vereisten.
    OPMERKING: Tijdens en na verstikking is de stofwisseling verminderd, vandaar de lagere dosis fentanyl IV. Sommige biggen kunnen echter hogere infusiesnelheden nodig hebben en daarom is het belangrijk om de vitale functies en reflexen van de big te observeren.
  2. Houd de big gedurende 9,5 uur zorgvuldig in de gaten. Pas de mechanische ventilatorinstellingen naar wens aan om de SpO 2 ≥90% te houden en normocapnia (temperatuurgecorrigeerde partiële druk van CO 2 (pCO 2) van 5-7,5 kPa) te handhaven.
  3. Houd de temperatuur van de big op 38,5-39,0 °C en voer temperatuurcorrigerende maatregelen uit zoals aangegeven.
    OPMERKING: De biggen hebben de neiging om onderkoeld te raken tijdens en na verstikking.
  4. Neem monsters en CRF-registraties op vooraf bepaalde tijdstippen zoals voorgeschreven door de CRF (stap 2).
  5. Bij 9,5 uur post-ROSC-observatie euthanaseert u de big (stap 11).
    OPMERKING: Sommige biggen overleven mogelijk niet de hele 9,5 uur post-ROSC-observatie. Als de big tekenen van aanzienlijk leed en een verslechterende toestand vertoont, voer dan eerder euthanasie uit.

11. Euthanasie (TIJD: 10 min)

  1. Bereid de dissectietafel voor met de nodige chirurgische apparatuur, injectieflacons om de weefselmonsters op te slaan en vloeibare stikstof om de monsters in te vriezen.
  2. Verzamel de monsters aan het einde van het onderzoek (570 min) zoals beschreven in stap 2.
  3. Dien IV pentobarbital 150 mg/kg toe. Voer dissectie uit, plaats de orgaanmonsters in gemarkeerde cryogene buizen en vries in vloeibare stikstof. Bewaar een hersenhelft in formaline indien gewenst.
  4. Plaats de monsters van het experiment (volbloed, plasma, urine, liquor en orgaanmonsters) in een vriezer van −80 °C of bewaar ze op een andere manier zoals voorgeschreven door de geplande analyses.

Figure 1
Figuur 1: Steriele tafel met chirurgische hulpmiddelen. De chirurgische hulpmiddelen worden voorbereid en opgeslagen op een steriele tafel voor het begin van de nekoperatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Inwendige halsader. De interne halsader nadat deze vrij en bloot is ontleed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Inbrengen van de centraal veneuze katheter. De hechtdraden worden vlak voor het inbrengen van de centraal veneuze katheter vastgehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Hechtingen om de centraal veneuze katheter vast te zetten. De hechtingen worden rond de ader (en de katheter) gebonden om de katheter in de ader vast te zetten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Nadat de biggen zijn geïnstrumenteerd en gestabiliseerd, worden ECG- en BP-metingen continu verzameld met behulp van een data-acquisitie- en analysesoftware. De hemodynamische veranderingen tijdens verstikking zijn goed te zien in de software (figuur 5). De BP daalt geleidelijk tijdens verstikking tot een hartstilstand wanneer de BP = 0. Nadat ROSC is bereikt, neemt de BP toe en na enige tijd normaliseert deze weer. De BP- en ECG-gegevens kunnen worden gebruikt voor verschillende soorten analyses, bijvoorbeeld de berekening van de coronaire perfusiedruk tijdens reanimatie en veranderingen in BP- en ECG-ritme en morfologie voor, tijdens en/of na verstikking.

Het volume van de hartinfarct en de cardiale index worden continu gecontroleerd met impedantiecardiografie (een niet-invasieve cardiale outputmeting)21. Om hartletsel te bestuderen, worden myocardiale markers van oxidatieve stress en anaëroob metabolisme gemeten19. Daarnaast kunnen cardiale enzymen, waaronder cardiale troponine T, in het plasma worden gemeten (resultaten nog niet gepubliceerd).

De verstikking verandert de fysiologie van de big. Figuur 6 toont een voorbeeld van hoe HR (figuur 6A), MAP (figuur 6B), pH (figuur 6C), pCO2 (figuur 6D), baseoverschot (figuur 6E) en lactaat (figuur 6F) gedurende het experiment veranderen. Zoals verwacht nemen MAP, pH en base-overmaat af tijdens verstikking, terwijl pCO2 en lactaat toenemen (gemengde respiratoire en metabole acidose). Tegen het einde van het experiment normaliseren de waarden.

Historisch gezien werden experimenten uitgevoerd met tracheostomabiggen 11,13,15,16,19 (d.w.z. met een lekvrije luchtweg). Om chirurgische stress te beperken, werden de biggen endotracheaal geïntubeerd met niet-geboeide ETT's in experimenten uit 2019. In die experimenten21 werden met name lagere ROSC-percentages waargenomen. Daarom vergeleken we in recente experimenten ROSC-percentages met behulp van niet-geboeide versus gemanchette ETT's. Bij gebruik van niet-gemanchette ETT's bereikten 7/19 biggen ROSC en bij gebruik van ETT's met manchetten bereikten 5/5 biggen ROSC (p = 0,012) (niet-gepubliceerde resultaten). Deze bevinding ondersteunt het belang van een lekvrije luchtweg in dit model.

Figure 5
Figuur 5: Continue gegevensbemonstering met behulp van de software voor gegevensverzameling en -analyse. Een voorbeeld van hoe continue data sampling eruit ziet in de data acquisitie en analyse software. (A) BP voor het hele experiment. (B) Beat-to-beat complexen van BP en ECG. Verschillende delen van het experiment zijn gemarkeerd in paneel (A): 1) start van verstikking, 2) hartstilstand en reanimatie, 3) ROSC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Veranderingen in cardiovasculaire en metabole variabelen gedurende het experiment. Een demonstratie van hoe verschillende variabelen veranderen gedurende het experiment. De zes tijdspunten die worden weergegeven zijn als volgt: net voor het begin van hypoxie (baseline), 10 min hypoxie, hartstilstand, ROSC, 120 min na ROSC en het einde van het onderzoek (570 min na ROSC). (A) Hartslag (HR), (B) gemiddelde arteriële druk (MAP), (C) pH, (D) partiële druk van CO 2 (pCO2), (E) base overmaat en (F) lactaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit biggenmodel is tijdrovend en technisch uitdagend, met verschillende kritische stappen. Een fijne balans in de medicijnen, chirurgische ingrepen en de methode voor het induceren van een hartstilstand is vereist om een redelijke overlevingskans te garanderen. Omdat het protocol van relatief lange duur is en verschillende kritische stappen omvat, vereist het uitvoeren van de experimenten een grondige voorbereiding en een toegewijd en goed functionerend team, en de experimenten moeten worden uitgevoerd in faciliteiten die ervaring hebben met groot dieronderzoek. Onze onderzoeksteams hebben experimenten uitgevoerd op één tot drie biggen parallel. Het wordt aanbevolen om ten minste twee mensen te allen tijde aanwezig te hebben tijdens de experimenten en ten minste drie personen als de experimenten tegelijkertijd met drie biggen moeten worden uitgevoerd.

Bijzonder kritieke en technisch uitdagende onderdelen van de experimenten omvatten het volgende: 1) ervoor zorgen dat alle apparatuur werkt en dat alle tools voor gegevensbemonstering beschikbaar, werkend en gekalibreerd zijn; 2) goede en bevredigende mechanische ventilatie, met name vóór verstikking en tijdens reanimatie; 3) chirurgische ingreep; 4) de inductie van verstikking; 5) het vaststellen van een hartstilstand; 6) reanimatie; en 7) de bemonstering van monsters, vooral op tijdkritische punten zoals hartstilstand en ROSC. De meest kritische stappen in het protocol zijn de inductie van verstikking en het vaststellen van een hartstilstand. In de eerste experimenten werd CO2 toegevoegd aan het verstikkingsgas om de gemengde respiratoire en metabole acidose van perinatale asfyxie nauw na te bootsen 10,11,13,14,15,16,20. In latere experimenten 7,21,22 waarbij CO2-gas niet beschikbaar was, werd echter ook waargenomen dat de vermindering van de mechanische ventilatiesnelheid gevolgd door de klemming van de ETT na 20-30 minuten ook resulteerde in gemengde respiratoire en metabole acidose. Hoge CO2-niveaus bij een hartstilstand zijn niet alleen belangrijk voor het nabootsen van de klinische situatie, maar kunnen ook de ROSC beïnvloeden. De reden hiervoor kan zijn dat een hartstilstand lijkt op te treden bij een specifieke pH en de pH afhankelijk is van zowel lactaat als CO2. Aangezien hypercapnie gemakkelijker wordt omgekeerd dan lactaatacidose, kan voornamelijk respiratoire versus metabole acidose bepalen hoe snel de biggen herstellen van de verstikking. Andere biggenmodellen van perinatale asfyxie of HIE starten vaak de reoxygenatie / reanimatie vóór de hartstilstand, meestal volgens MAP-waarden of de duur van de verstikking (bijv. 45 min asfyxie 29, 2 uur asfyxie 30, MAP van 20 mmHg 31, MAP van 30-35 mmHg 30, MAP 70% onder baseline29,32). Het voordeel van dit model is dat door het induceren van een hartstilstand, het mogelijk is om neonatale reanimatie en monstergegevens te bestuderen voor, tijdens en vlak na een hartstilstand. Met name de incidentele bevinding dat een aanzienlijk deel van de biggen PEA 7,33 heeft tijdens een hartstilstand kan de toepasbaarheid van het model buiten het perinatologieveld34 vergroten.

In de loop der jaren is het model verfijnd om de blootstelling van biggen aan sedativa en chirurgische ingrepen te minimaliseren en de gegevensbemonstering en registraties te verbeteren. Eerdere protocollen 10,11,13,14,15,16,20 omvatten de inductie van anesthesie met sevofluraan. Dit is nu verlaten, omdat het huidige protocol betrekking heeft op het rechtstreeks vaststellen van IV-toegang via een oorader en IV-medicijnen. Dit is mogelijk omdat biggenleed eenvoudig wordt vermeden door de big in een handdoek te wikkelen voordat de perifere intraveneuze katheter wordt ingebracht door een getrainde provider. Midazolam werd ook gebruikt in de eerste experimentele protocollen; de subjectieve beoordeling van de onderzoeker (R.S.) die de overgrote meerderheid van de autopsies uitvoerde, was echter dat de hersenen tijdens de autopsie in een slechtere toestand verkeerden als midazolam als een continue infusie werd gebruikt. Daarom gebruiken we nu alleen fentanyl IV om de anesthesie in stand te houden. Midazolam kan in bolusdoses worden gebruikt als de big tekenen van angst vertoont en fentanyl en/of pentobarbital geen effect vertonen; we hebben het echter bijna nooit hoeven toedienen.

In termen van andere verfijningen werden de biggen in eerdere experimenten getracheostomeerd met een goed beveiligde endotracheale buis die door een subglottische incisie werd geplaatst. Deze procedure zorgt voor een lekvrije luchtweg, maar veroorzaakt chirurgische stress voor de big. Aan de andere kant, vanwege de grotere bovenste luchtwegen van de big, wordt endotracheale intubatie geassocieerd met aanzienlijke lekkage bij het gebruik van niet-geboeide ETTs. Daarom zijn we begonnen met het gebruik van cuffed ETTs, wat heeft geresulteerd in nul lekkage en aanzienlijk hogere ROSC-percentages, vergelijkbaar met experimenten met tracheostomabiggen. Verder zijn er enkele aanpassingen gedaan met betrekking tot de gegevenssteekproeven. Sommige van de vorige experimenten 7,19,22,33,35,36 betroffen het gebruik van een stroomsonde geplaatst rond de linker gemeenschappelijke halsslagader. Deze stroomsonde is de laatste jaren niet direct beschikbaar op ons instituut in Oslo. Ons laboratorium in Edmonton maakt nog steeds gebruik van een carotisstroomsonde en het gebruik ervan kan waardevolle aanvullende hemodynamische gegevens aan het model leveren. Een paar eerdere experimenten betroffen ook het gebruik van een drukvolumekatheter die in de linkerkamer werd geplaatst door deze door een van de halsslagaders te verplaatsen. De toediening van borstcompressies verstoorde de drukvolumekatheterregistraties en veroorzaakte in sommige gevallen zelfs katheterfalen en breuk. Zo werd het gebruik ervan verlaten in het arrestatiemodel. Onlangs zijn niet-invasieve CO-monitoren aan het protocol toegevoegd en we richten ons op het optimaliseren van de ECG-signalen tijdens hartstilstand en reanimatie, omdat ze waardevolle informatie kunnen geven over de ECG-morfologie en PEA. Ten slotte is de post-ROSC-observatietijd verlengd van 4 uur naar 9,5 uur, omdat 4 uur te kort is om histopathologische veranderingen, celdood en veranderingen in sommige biomarkers te kunnen detecteren.

Een van de belangrijkste beperkingen van dit model, en het gebruik van biggen in het algemeen als translationeel model, is dat in tegenstelling tot reanimatie in de verloskamer, de postnatale cardio-pulmonale overgang al heeft plaatsgevonden bij de biggen. Het is onwaarschijnlijk dat de biggen open foetale cardiovasculaire shunts en hoge longdrukken hebben, zoals het geval zou zijn bij een verstikte pasgeborene. Hoewel een studie van Fugelseth et al.37, die een eerdere versie van dit biggenasfyxiemodel (geen hartstilstand) gebruikte, aantoonde dat vasculaire shunts waarschijnlijk tijdens verstikking in de biggen zullen heropenen, kunnen hun reacties op ventilatie en hemodynamische ondersteuning verschillen. Daarom zijn fysiologische metingen niet altijd representatief voor een menselijke pasgeborene in transitie. Sommige anatomische verschillen tussen biggen en pasgeborenen zijn ook aanwezig, zoals de grotere bovenste luchtwegen in de biggen, die ETT-lekkage veroorzaken (wat betekent dat het belangrijk is om ETT's met manchetten te gebruiken) en een hogere basale temperatuur.

Ondanks deze beperkingen is er een lange traditie in de wereldwijde onderzoeksgemeenschap van het gebruik van biggen als een translationeel model voor perinatale asfyxie. Het varken is vergelijkbaar met mensen in termen van anatomie, fysiologie, histologie, biochemie en ontsteking38, en afgezien van lagere geboortegewichten op termijn (1,5-2,5 kg), heeft de pasgeboren big een vrij vergelijkbare grootte als de menselijke pasgeborene. De grootte en anatomie maken instrumentatie, monitoring, beeldvorming en het verzamelen van biologische exemplaren vergelijkbaar met de menselijke pasgeborene mogelijk. Dit model maakt ook reanimatiestudies mogelijk, omdat borstcompressies relatief eenvoudig op dezelfde manier kunnen worden uitgevoerd als bij menselijke pasgeborenen, en varkens cardiale anatomie en fysiologie hebben die lijken op die van mensen39, inclusief de coronaire bloedverdeling, de bloedtoevoer naar het geleidingssysteem, het histologische uiterlijk van het myocard en de biochemische en metabole reacties op ischemisch letsel40. Een andere belangrijke factor is dat de pasgeboren big een vergelijkbare perinatale hersenontwikkeling heeft als de menselijke pasgeborene41, en verstikking resulteert in een biochemische respons met hypercapnie en gemengde respiratoire en metabole acidose, die lijkt op die van de verstikte pasgeborene.

Kortom, dit model van perinatale asfyxie is technisch uitdagend en tijdrovend. Het biedt echter waardevolle informatie over de fysiologische en hemodynamische veranderingen tijdens perinatale asfyxie, maakt neonatale reanimatiestudies mogelijk en biedt waardevolle informatie over de fysiologische veranderingen voor, tijdens en na een hartstilstand, die ook van belang kunnen zijn voor andere onderzoeksgebieden in de geneeskunde naast perinatologie.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten die relevant zijn voor dit artikel openbaar te maken.

Acknowledgments

We willen graag alle onderzoekers en onderzoekers bedanken die hebben geholpen bij het opzetten, ontwikkelen en verfijnen van dit biggenmodel van perinatale asfyxie en hartstilstand in onze faciliteiten. We willen graag het personeel van de dieronderzoeksfaciliteiten van het Institute for Surgical Research and Institute for Comparative Medicine, University of Oslo, Noorwegen, en onderzoekstechnici van de University of Alberta, Edmonton, Canada, bedanken voor hun samenwerking gedurende de jaren. We danken het Medical Student Research Program aan de Universiteit van Oslo, de Research Council of Norway en de Norwegian SIDS and Stillbirth Society voor de economische steun voor deze publicatie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid-base machine (ABL 800 Flex) Radiometer Medical ApS, Brønshøj, Denmark 989-963
AcqKnowledge 4.0 software for PC Biopac Systems Inc., Goleta, CA, USA ACK100W
Adhesive aperture drape OneMed Group Oy, Helsinki, Finland 1505-01
Adrenaline (1 mg/mL) Takeda AS, Asker, Norway Vnr 00 58 50 Dilute 1:10 in normal saline to 0.1 mg/mL
Arterial cannula 20 G 1,10 mm x 45 mm Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden 682245
Arterial forceps Any
Asphyxia gas, 8% oxygen in nitrogen Linde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norway 110093
Benelyte, 500 mL Fresenius Kabi, Norge AS, Halden, Norway 79011
Biopac ECG and invasive blood pressure modules, Model MP 150 Biopac Systems Inc., Goleta, CA 93117, USA ECG100C, MP150WSW
Box of cardboard for sample storage Syhehuspartner HF, Oslo, Norway 2000076
Cannula , 23G x 1 1/4"- Nr.14 Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain 300700
Cannula, 18G x 2" Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain 301900
Cannula, 21G x 1 1/2"- Nr.2 Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain 304432
Centrifuge (Megafuge 1.0R)  Heraeus instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Germany 75003060
Chlorhexidin colored 5 mg/mL Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway 00 73 24
Combi-Stopper B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4495101
CRF form Self-made
Desmarres eyelid retractor 13 cm x 18 mm Any
Digital Thermometer ama-digit ad 15 th Amarell, Kreuzwertheim, Germany 9243101
ECG electrodes, Skintact Leonhard Lang, Innsbruck, Austria FS-TC1 /10
Electric heating mattress Any
Extension set Codan Medizinische Geräte GmbH & Co KG, Lensahn, Germany 71.4021
Fentanyl (50 µg/mL) Hameln, Saksa, Germany 00 70 16
Fine wood chips Any
Finnpipette F1, 100-1000 µL VWR, PA, USA 613-5550
Fully equipped surgical room
Gas hose Any
Gauze swabs 5 cm x 5 cm Bastos Viegas,.a., Penafiel, Portugal
Heparin, heparinnatium 5000 IE/a.e./mL LEO Pharma AS, Ballerup, Denmark 46 43 27
HighClean Nonwoven Swabs, 10 cm x 10 cm Selefa, OneMed Group Ay, Helsinki, Finland 223003
ICON  Osypka Medical GmbH, Berlin, Germany Portable non-invasive cardiometer
ICON electrodes/ECG electrodes, Ambu WhiteSensor WSP25 Ambu A/S, Ballerup, Denmark WsP25-00-S/50
Infusomat Space medical pump B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 8713050
Invasive blood pressure monitoring system Codan pvb Critical Care GmbH, Forstinning, Germany 74.6604
Laryngoscope SunMed Greenlinen blade No 2  KaWe Medical, Asperg, Germany
Leoni plus mechanical ventilator  Löwenstein Medical SE & Co. KG, Bad Ems, Germany
Liquid nitrogen 230 L Linde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norway 102730
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml Forsyningssenteret, Trondheim, Norway 72.690.001
Microcuff endotracheal tube, size 3.5 Avanos, GA, USA 35162
Needle holder Any
Neoflon, peripheral venous catheter, 24 G 0.7 mm x 19 mm Becton Dickinson Infusion Therapy AB, Helsingborg, Sweden 391350
Neonatal piglets 12-36 h of age As young as possible
NIRS electrodes, FORE-SIGHT Single Non-Adhesive Sensor Kit Small Cas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA 01-07-2000
NIRS machine, FORE-SIGHT Universal, Cerebral Oximeter MC-202, Benchtop regional oximeter FORE-SIGHT Cas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA 01-06-2020 May also use INVOS, Covidien
Normal saline, NaCl 9 mg/mL, 500 mL. Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway Vare nr. 141387 Unmixed
Normal saline, NaCl 9 mg/mL, 500 mL. Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway 141388 For IV blood pressure monitoring, add heparin (0.2 ml heparin 5000 IE/a.e./mL in 500 mL of 0.9% NaCl)
Nunc Cryogenic Tubes 1.8 mL VWR, PA, USA 479-6847
Original Perfusor Line, I Standard PE B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 8723060
Oxygen saturation monitor, MasimoSET, Rad 5 Masimo, Neuchâtel, Switzerland 9196
Oxygen saturation monitor, OxiMax N-65 Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA N65-PDN1
Pentobarbital (100 mg/mL) Norges Apotekerforening, Oslo, Norway Pnr 811602
Pipette tips VWR, PA, USA 732-2383
Plastic container with holes Any Has to allow for circulation of air
Printer labels B-492, hvit, 25 mm x 9 mm, 3000 labels VWR, PA, USA BRDY805911 For nunc tubes
Razor, single use disposable Any
Rubber gloves Any
Rubber hot water bottles Any
Self-inflating silicone pediatric bag 500 ml Laerdal Medical, Stavanger, Norway 86005000
Smallbore T-Port Extension Set B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 471954
Sterile surgical gloves latex, Sempermed supreme Semperit Technische Produkte Ges.m.b.H., Vienna, Austria size 7: 822751701 Different sizes
Stethoscope  Any
Stopcocks, 3-way, Discofix B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 16494C
Stylet size 3.5  Any
SunMed Greenlinen laryngoscope blade No 2  KaWe Medical, Asperg, Germany
Surgical blade, size 15 Swann Morton LTD, Sheffield England 205
Surgical forceps Any
Surgical scissors Any
Surgical sponges, sterile Mölnlycke Health Care, Göteborg, Sweden C0130-3025
Surgical swabs Mölnlycke Health Care, Göteborg, Sweden 159860-00
Surgical tape Micropore 2.5 cm x 9.1 m  3M Norge AS, Lillestrøm, Norway 153.5
Suture, Monsoft Monofilament Nylon 3-0 Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA SN653
Suture, Polysorb Braided Absorbable Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA GL884
Syringe 0.01-1 mL Omnifix F Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 9161406V Used for acid base blood sampling. Flush with heparin
Syringe 10 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616103V
Syringe 2.5 mL BD Plastipak Beckton Dickinson S.A., Madrid, Spain 300185 Used for blood sampling. Flush with heparinized NaCl
Syringe 20 mL Omnifix Luer Loc Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4617207V
Syringe 20 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616200V
Syringe 5 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616057V
Syringe 50 mL Omnifix Luer Lock Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4617509F
Syringe 50 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616502F
Table drape sheet, asap drytop Asap Norway AS, Skien, Norway 83010705
Tape Tensoplast 2.5 cm x 4.5 m  BSN Medical, Essity Medical Solutions, Charlotte, NC, USA 66005305, 72067-00
Timer Any
Towels Any
Transparent IV-fixation Mediplast AB, Malmö, Sweden 60902106
Ultrasound gel Optimu Medical Solutions Ltd. Leeds, UK 1157
Ultrasound machine, LOGIQ e GE Healthcare, GE Medical Systems, WI, USA 5417728-100
Utility drape, sterile OneMed Group Oy, Helsinki, Finland 1415-01
Vacuette K3E K3EEDTA 2mL Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria 454222
Venflon Pro Safety 22 G 0.9 mm x 25 mm Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden 393222
Ventilation mask made to fit tightly around a piglet snout Any Typically cone shaped
Weight Any

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perin, J., et al. regional, and national causes of under-5 mortality in 2000-19: An updated systematic analysis with implications for the Sustainable Development Goals. The Lancet Child & Adolescent Health. 6 (2), 106-115 (2022).
  2. United Nations. Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. United Nations. , Geneva, Switzerland. (2015).
  3. Sarnat, H. B., Sarnat, M. S. Neonatal encephalopathy following fetal distress. A clinical and electroencephalographic study. Archives of Neurology. 33 (10), 696-705 (1976).
  4. Volpe, J. J. Neonatal encephalopathy: An inadequate term for hypoxic-ischemic encephalopathy. Annals of Neurology. 72 (2), 156-166 (2012).
  5. Lee, A. C., et al. Neonatal resuscitation and immediate newborn assessment and stimulation for the prevention of neonatal deaths: a systematic review, meta-analysis and Delphi estimation of mortality effect. BMC Public Health. 11, Suppl 3 12 (2011).
  6. Saugstad, O. D. Reducing global neonatal mortality is possible. Neonatology. 99 (4), 250-257 (2011).
  7. Solevåg, A. L., et al. Non-perfusing cardiac rhythms in asphyxiated newborn piglets. PLoS One. 14 (4), 0214506 (2019).
  8. Saugstad, O. D., Aasen, A. O., Hetland, O. Plasma hypoxanthine levels in pigs during acute hypoxemia. A correlation between lactate and base deficit concentrations. European Surgical Research. 10 (5), 314-321 (1978).
  9. Rootwelt, T., Løberg, E. M., Moen, A., Øyasæter, S., Saugstad, O. D. Hypoxemia and reoxygenation with 21% or 100% oxygen in newborn pigs: Changes in blood pressure, base deficit, and hypoxanthine and brain morphology. Pediatric Research. 32 (1), 107-113 (1992).
  10. Dannevig, I., Solevåg, A. L., Sonerud, T., Saugstad, O. D., Nakstad, B. Brain inflammation induced by severe asphyxia in newborn pigs and the impact of alternative resuscitation strategies on the newborn central nervous system. Pediatric Research. 73 (2), 163-170 (2013).
  11. Dannevig, I., Solevåg, A. L., Wyckoff, M., Saugstad, O. D., Nakstad, B. Delayed onset of cardiac compressions in cardiopulmonary resuscitation of newborn pigs with asphyctic cardiac arrest. Neonatology. 99 (2), 153-162 (2011).
  12. Sachse, D., Solevåg, A. L., Berg, J. P., Nakstad, B. The role of plasma and urine metabolomics in identifying new biomarkers in severe newborn asphyxia: A study of asphyxiated newborn pigs following cardiopulmonary resuscitation. PLoS One. 11 (8), 0161123 (2016).
  13. Solevag, A. L., Dannevig, I., Nakstad, B., Saugstad, O. D. Resuscitation of severely asphyctic newborn pigs with cardiac arrest by using 21% or 100% oxygen. Neonatology. 98 (1), 64-72 (2010).
  14. Solevåg, A. L., Dannevig, I., Šaltytė-Benth, J., Saugstad, O. D., Nakstad, B. Reliability of pulse oximetry in hypoxic newborn pigs. The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 27 (8), 833-838 (2014).
  15. Solevåg, A. L., Dannevig, I., Wyckoff, M., Saugstad, O. D., Nakstad, B. Extended series of cardiac compressions during CPR in a swine model of perinatal asphyxia. Resuscitation. 81 (11), 1571-1576 (2010).
  16. Solevag, A. L., Dannevig, I., Wyckoff, M., Saugstad, O. D., Nakstad, B. Return of spontaneous circulation with a compression:ventilation ratio of 15:2 versus 3:1 in newborn pigs with cardiac arrest due to asphyxia. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 96 (6), 417-421 (2011).
  17. Dotinga, B. M., Solberg, R., Saugstad, O. D., Bos, A. F., Kooi, E. M. W. Splanchnic oxygen saturation during reoxygenation with 21% or 100% O2 in newborn piglets. Pediatric Research. 92 (2), 445-452 (2021).
  18. Solberg, R., et al. Resuscitation with supplementary oxygen induces oxidative injury in the cerebral cortex. Free Radical Biology and Medicine. 53 (5), 1061-1067 (2012).
  19. Solevåg, A. L., et al. Myocardial perfusion and oxidative stress after 21% vs. 100% oxygen ventilation and uninterrupted chest compressions in severely asphyxiated piglets. Resuscitation. 106, 7-13 (2016).
  20. Dannevig, I., Solevåg, A. L., Saugstad, O. D., Nakstad, B. Lung injury in asphyxiated newborn pigs resuscitated from cardiac arrest - The impact of supplementary oxygen, longer ventilation intervals and chest compressions at different compression-to-ventilation ratios. The Open Respiratory Medicine Journal. 6 (1), 89-96 (2012).
  21. Berisha, G., Solberg, R., Klingenberg, C., Solevag, A. L. Neonatal impedance cardiography in asphyxiated piglets-A feasibility study. Frontiers in Pediatrics. 10, 804353 (2022).
  22. Solevåg, A. L., et al. Ventilation with 18, 21, or 100% oxygen during cardiopulmonary resuscitation of asphyxiated piglets: A randomized controlled animal trial. Neonatology. 117 (1), 102-110 (2020).
  23. The Three Rs. Norecopa. , Available from: https://norecopa.no/alternatives/the-three-rs (2022).
  24. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX:32010L0063 (2010).
  25. Bovill, J. G., Sebel, P. S., Stanley, T. H. Opioid analgesics in anesthesia: With special reference to their use in cardiovascular anesthesia. Anesthesiology. 61 (6), 731-755 (1984).
  26. Hansen, D. D., Hickey, P. R. Anesthesia for hypoplastic left heart syndrome: Use of high-dose fentanyl in 30 neonates. Anesthesia & Analgesia. 65 (2), 127-132 (1986).
  27. Schieber, R. A., Stiller, R. L., Cook, D. R. Cardiovascular and pharmacodynamic effects of high-dose fentanyl in newborn piglets. Anesthesiology. 63 (2), 166-171 (1985).
  28. Wyckoff, M. H., et al. 2021 International Consensus on Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care Science With Treatment Recommendations: Summary from the Basic Life Support; Advanced Life Support; Neonatal Life Support; Education, Implementation, and Teams; First Aid Task Forces; and the COVID-19 Working Group. Circulation. 145 (9), 645-721 (2022).
  29. Kyng, K. J., et al. A piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Journal of Visualized Experiments. (99), e52454 (2015).
  30. Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of Visualized Experiments. (56), e3166 (2011).
  31. Manueldas, S., et al. Temporal patterns of circulating cell-free DNA (cfDNA) in a newborn piglet model of perinatal asphyxia. PLoS One. 13 (11), 0206601 (2018).
  32. Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain Research. 919 (1), 122-131 (2001).
  33. Patel, S., et al. Pulseless electrical activity: A misdiagnosed entity during asphyxia in newborn infants. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 104 (2), 215-217 (2019).
  34. Best, K., Wyckoff, M. H., Huang, R., Sandford, E., Ali, N. Pulseless electrical activity and asystolic cardiac arrest in infants: Identifying factors that influence outcomes. Journal of Perinatology. 42 (5), 574-579 (2022).
  35. Hidalgo, C. G., et al. Sustained inflation with 21% versus 100% oxygen during cardiopulmonary resuscitation of asphyxiated newborn piglets - A randomized controlled animal study. Resuscitation. 155, 39-47 (2020).
  36. Solevåg, A. L., Schmölzer, G. M., Nakstad, B., Saugstad, O. D., Cheung, P. Y. Association between brain and kidney near-infrared spectroscopy and early postresuscitation mortality in asphyxiated newborn piglets. Neonatology. 112 (1), 80-86 (2017).
  37. Fugelseth, D., Satas, S., Steen, P. A., Thoresen, M. Cardiac output, pulmonary artery pressure, and patent ductus arteriosus during therapeutic cooling after global hypoxia-ischaemia. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 88 (3), 223-228 (2003).
  38. Welsh, M. J., Rogers, C. S., Stoltz, D. A., Meyerholz, D. K., Prather, R. S. Development of a porcine model of cystic fibrosis. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 120, 149-162 (2009).
  39. Cameron, D. E., Tam, V. K. H., Cheng, W., Braxton, M. Studies in the physiology of cardiopulmonary bypass using a swine model. Swine as Models in Biomedical Research. Swindle, M. M., Moody, D. C., Phillips, L. C. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 187-197 (1992).
  40. Barouxis, D., Chalkias, A., Syggelou, A., Iacovidou, N., Xanthos, T. Research in human resuscitation: What we learn from animals. The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 25, Suppl 5 44-46 (2012).
  41. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).

Tags

Geneeskunde Nummer 191
Een biggenperinataal asfyxiemodel om hartletsel en hemodynamiek te bestuderen na hartstilstand, reanimatie en de terugkeer van spontane circulatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenersen, E. O., Olsen, A.,… More

Stenersen, E. O., Olsen, A., Melheim, M., Solberg, R., Dannevig, I., Schmölzer, G., Cheung, P. Y., Nakstad, B., Saugstad, O. D., Rønnestad, A., Solevåg, A. L. A Piglet Perinatal Asphyxia Model to Study Cardiac Injury and Hemodynamics after Cardiac Arrest, Resuscitation, and the Return of Spontaneous Circulation. J. Vis. Exp. (191), e64788, doi:10.3791/64788 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter