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Bioengineering

CRISPR SunTag-p65-HSF1 सक्रियण प्रणाली का उपयोग करके बेज वसा जीव विज्ञान और चयापचय की जांच

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64849
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल बेज वसा जीव विज्ञान की जांच के लिए एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में एडिपोसाइट्स (एडिपोएसपीएच) में सीआरआईएसपीआर सनटैग-पी 65-एचएसएफ 1 (एसपीएच) के उपयोग को प्रस्तुत करता है। एएवी-ले जाने वाले एसजीआरएनए के विवो इंजेक्शन में अंतर्जात पीआरडीएम 16 जीन को लक्षित करना बेज वसा के विकास को प्रेरित करने और थर्मोजेनिक जीन कार्यक्रम को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है।

Abstract

नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) तकनीक ने जीव विज्ञान में क्रांति को प्रेरित किया है, और हाल के उपकरणों को मूल रूप से वर्णित जीन संपादन से परे लागू किया गया है। CRISPR सक्रियण (CRISPRA) प्रणाली अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए अलग-अलग प्रतिलेखन मॉड्यूल के साथ उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय Cas9 (dCas9) प्रोटीन को जोड़ती है। SunTag-p65-HSF1 (SPH) एक हाल ही में विकसित CRISPRA तकनीक है जो सनटैग एक्टिवेटर्स के साथ सहक्रियात्मक सक्रियण मध्यस्थों (SAM) के घटकों को जोड़ती है। यह प्रणाली एक अनुकूलित एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को डिजाइन करके एकल या कई जीनों के ओवरएक्प्रेशन की अनुमति देती है। इस अध्ययन में, पहले से विकसित एसपीएच माउस का उपयोग एडिपोसाइट्स (एडिपोनेक्टिन क्रे वंश) में एसपीएच व्यक्त करने वाले सशर्त माउस को उत्पन्न करने के लिए किया गया था, जिसका नाम एडिपोएसपीएच था। सफेद-से-बेज वसा (ब्राउनिंग) फेनोटाइप को प्रेरित करने के लिए, एक एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) जिसमें एसजीआरएनए होता है जो अंतर्जात पीआरडीएम 16 जीन (भूरे और बेज वसा के विकास से संबंधित एक अच्छी तरह से स्थापित प्रतिलेखन कारक) को लक्षित करता है, को इंगुइनल व्हाइट एडीपोज ऊतक (आईडब्ल्यूएटी) में इंजेक्ट किया गया था। इस माउस मॉडल ने अंतर्जात Prdm16 की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया और थर्मोजेनिक जीन प्रोग्राम को सक्रिय किया। इसके अलावा, इन विट्रो एसपीएच-प्रेरित पीआरडीएम 16 ओवरएक्प्रेशन ने बेज एडिपोसाइट्स की ऑक्सीजन की खपत को बढ़ाया, जो पिछले पीआरडीएम 16 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के परिणामों को दर्शाता है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल वसा ऊतक जीव विज्ञान की जांच के लिए एक बहुमुखी, लागत प्रभावी और समय प्रभावी माउस मॉडल का वर्णन करता है।

Introduction

बेज (या ब्राइट) एडिपोसाइट्स अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) -व्यक्त करने वाले और माइटोकॉन्ड्रियल समृद्ध एडिपोसाइट्स हैं जो सफेद वसा ऊतक (डब्ल्यूएटी) डिपो के भीतर रहते हैं। बेज वसा ठंड के संपर्क और अन्य उत्तेजनाओं के जवाब में एडिपोसाइट्स पूर्वजों या परिपक्व सफेद एडिपोसाइट्स के उप-समूह से उभरता है। बेज एडिपोसाइट्स ऊर्जा को यूसीपी 1-निर्भर यास्वतंत्र तरीके से गर्मी में परिवर्तित कर सकते हैं। इसके थर्मोजेनिक कार्य के बावजूद, बेज वसा अन्य साधनों से चयापचय स्वास्थ्य में भी सुधार कर सकता है, जैसे कि एडिपोकिन का स्राव और विरोधी भड़काऊ और एंटी-फाइब्रोटिक गतिविधियां। चूहों और मनुष्यों में अध्ययन से पता चला है कि बेज वसा का प्रेरण पूरे शरीर के ग्लूकोज और लिपिड होमियोस्टैसिस3 में सुधार करता है। हालांकि, हालांकि बेज वसा जीव विज्ञान का हमारा ज्ञान हाल के वर्षों में तेजी से विकसित हुआ है, इसके अधिकांश चयापचय लाभ और संबंधित तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं।

नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) को पहली बार यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एक उपकरण के रूप में वर्णित किया गया था जो कैस 9 प्रोटीन 4,5 की न्यूक्लियस गतिविधि के माध्यम से जीनोम में एक विशिष्ट साइट पर डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न करने में सक्षम था। कैस 9 को एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र को लक्षित करने के लिए सिंथेटिक सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) द्वारा निर्देशित किया जाता है, जिससे डीएनए डीएसबी होता है। संपादन उद्देश्यों के लिए न्यूक्लियस कैस 9 का उपयोग करने के अलावा, CRISPR-Cas9 तकनीक अनुक्रम-विशिष्ट जीन विनियमन उपकरण6 के रूप में उपयोग करने के लिए विकसित हुई है। उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय कैस 9 प्रोटीन (डीसीएएस 9) के विकास और जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने में सक्षम ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूल के सहयोग ने सीआरआईएसपीआर सक्रियण (सीआरआईएसपीआरए) उपकरणों को जन्म दिया है। कई CRISPRA सिस्टम उभरे हैं, जैसे VP647,8, सहक्रियात्मक सक्रियण मध्यस्थ (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13, और SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, जो SAM और SunTag एक्टिवेटर्स के घटकों को जोड़ती है। यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि एन 2 ए न्यूरोब्लास्ट्स और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स में न्यूरोजेनिक जीन की प्रेरित अभिव्यक्ति अन्य सीआरआईएसपीआरए सिस्टम14 की तुलना में एसपीएच का उपयोग करके अधिक है, जो एसपीएच को एक आशाजनक सीआरआईएसपीआरए उपकरण के रूप में प्रदर्शित करती है।

यहां, हमने एडिपोनेक्टिन क्रे वंश (एडिपोएसपीएच) का उपयोग करके विशेष रूप से एडिपोसाइट्स में एसपीएच व्यक्त करने के लिए एक सशर्त माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए पहले से विकसित एसपीएच माउस14 का लाभ उठाया। एंडोजेनस पीआरडीएम 16 जीन को लक्षित करने वाले जीआरएनए को ले जाने वाले एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) का उपयोग करके, थर्मोजेनिक जीन प्रोग्राम की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए इंगुइनल डब्ल्यूएटी (आईडब्ल्यूएटी) के ब्राउनिंग (सफेद से बेज रूपांतरण) को प्रेरित किया गया था। इसके अलावा, इन विट्रो पीआरडीएम 16 ने ऑक्सीजन की खपत को बढ़ाया। इसलिए, यह प्रोटोकॉल वसा ऊतक के भीतर बेज वसा विकास के तंत्र की खोज के लिए एक बहुमुखी एसपीएच माउस मॉडल प्रदान करता है।

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Protocol

पशु अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए कैंपिनास गाइड विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल सीईयूए # 5810-1/2021) के अनुसार किया गया था।

1. आणविक क्लोनिंग

  1. एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) का डिजाइन
    1. https://chopchop.cbu.uib.no/ या किसी अन्य उपयुक्त उपकरण पर उपलब्ध चोपचॉप का उपयोग करके सीआरआईएसपीआर सक्रियण के लिए एसजीआरएनए डिजाइन करें। Prdm16 जीन को लक्षित करने वाले sgRNA को डिजाइन करने के लिए निम्न मापदंडों का उपयोग करें: लक्ष्य: Prdm16; में: मस्कुलस; उपयोग करना: Crispr / Cas9; के लिए: सक्रियण.
      नोट: 200 बीपी अपस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट (टीएसएस) क्षेत्र में फैले रुचि के प्रत्येक क्षेत्र के लिए एसजीआरएनए डिजाइन करें। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में उपयोग किए गए पीआरडीएम 16 को लक्षित करने वाला एसजीआरएनए टीएसएस के 154 बीपी अपस्ट्रीम को बांधता है।
    2. वेक्टर बैकबोन पीएएवी-यू 6-जीआरएनए-सीबीएच-एमचेरी में एसएसीआई प्रतिबंध साइट से मेल खाने के लिए एसजीआरएनए में ओवरहैंग जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। शामिल करें: 5'- (एन 20) एजीसीटी -3 ' (एन = न्यूक्लियोटाइड)। उदाहरण के लिए, Prdm16 जीन को लक्षित करने वाला अनुक्रम 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGG-3' है, और ओवरहैंग के साथ 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3 है।
    3. https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html पर उपलब्ध उपकरण का उपयोग करके 3 'एसजीआरएनए रिवर्स पूरक अनुक्रम प्राप्त करें। उदाहरण के लिए, Prdm16 जीन को लक्षित करने वाला 3 'sgRNA अनुक्रम 3'- TCGAGCTCGACGCCTTTTCCCC-5' है।
  2. एकल-फंसे हुए पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की एनीलिंग
    1. प्रत्येक 5' और 3' एकल-फंसे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (स्टॉक एकाग्रता: 100 μM), T4 लिगेज बफर के 1 μL, T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज (PNK) के 0.5 μL (1 ×10 4 इकाइयों / mL), और H2O के 6.5 μL को 10 μL की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में जोड़ें। निम्नलिखित स्थितियों के तहत थर्मोसाइकलर का उपयोग करके पूरक एकल-फंसे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को नष्ट करें: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट की रैंप-डाउन दर।
      नोट: पीएनके एंजाइम को पीएनके बफर के साथ आपूर्ति की जाती है और इसमें फॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक पर्याप्त एटीपी नहीं होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रतिक्रिया को सरल बनाने के लिए, टी 4 लिगेज बफर (पीएनके बफर के बजाय) का उपयोग करें। टी 4 लिगेज बफर फॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया के लिए फॉस्फेट की उचित मात्रा (1 एमएम एटीपी) प्रदान करता है। पीएनके एंजाइम बाद में बंधाव प्रतिक्रिया के लिए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 5 'अंत फॉस्फोराइलेशन प्रदान करता है।
  3. "एनाल्ड एसजीआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का बंधाव"
    1. प्लास्मिड पीएवी-यू 6-जीआरएनए-सीबीएच-एमचेरी के 25 एनजी को एनाल्ड एसजीआरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 2 μL, Saci एंजाइम के 1 μL, 10x T4 डीएनए लिगेज बफर के 2 μL, T4 DNA लिगेज के 1 μL (1-3 u / μL) (सामग्री की तालिका देखें) और H2O को 10 μL की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में जोड़ें।
    2. निम्नलिखित स्थितियों के तहत एक थर्मोसाइकलर का उपयोग करके प्रतिक्रिया मिश्रण को इंजेक्ट करके बंधाव करें: 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के 15 चक्र और 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ना।
  4. कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के बाद परिवर्तन
    1. सक्षम ई. कोलाई डीएच10बी कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) को हीट शॉक (45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके लिगेशन उत्पाद के 4 μL के साथ बदलें और 100 μg / mL एम्पीसिलिन युक्त एगर प्लेट पर फैलाएं।
    2. पीसीआर मास्टर मिक्स का उपयोग करके कॉलोनी पीसीआर द्वारा रूपांतरित कॉलोनियों की पुष्टि करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कॉलोनी चुनें और मास्टर मिश्रण के 5 μL, सार्वभौमिक प्राइमर के 0.1 μL (स्टॉक एकाग्रता: 100 μM), sgRNA रिवर्स प्राइमर के 0.1 μL (स्टॉक एकाग्रता: 100 μM) (तालिका 1), और H 2 O के 5 μL के साथ मिलाएं। निम्नलिखित परिस्थितियों में थर्मोसाइकलर का उपयोग करके पीसीआर चलाएं: प्रारंभिक विकृतीकरण (2मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस), इसके बाद विकृतीकरण के 35 चक्र (20 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस), एनीलिंग (30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस), विस्तार (30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस), और एक अंतिम बढ़ाव चरण (5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) होता है। 30 मिनट के लिए 90 वी पर 0.5 x टीएई बफर में एगारोस (1.5%) जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके डीएनए को हल करें।
      नोट: सकारात्मक क्लोन ~ 280 बीपी का बैंड देते हैं।
    3. सार्वभौमिक प्राइमर (तालिका 1, पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण के लिए सकारात्मक नमूने जमा करें।
  5. प्लास्मिड शुद्धिकरण
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, प्लास्मिड शुद्धिकरण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक सकारात्मक क्लोन से प्लास्मिड को शुद्ध करें।
      नोट: आयन-विनिमय राल या सेल अभिकर्मक में उपयोग के लिए उपयुक्त किसी अन्य किट का उपयोग करके प्लास्मिड को शुद्ध करें।
    2. 100 μg / mL एम्पीसिलिन युक्त एक मानक जीवाणु विकास माध्यम का उपयोग करके सकारात्मक क्लोन (200 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे) को इनक्यूबेट करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर जीवाणु कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। निर्माता के किट निर्देशों के अनुसार अगले चरणों का पालन करें।

2. एएवी पैकेजिंग

नोट: एएवी पैकेजिंग पिछले प्रकाशनों15,16 के अनुसार मामूली संशोधनों के साथ किया गया था।

  1. प्लेट 293टी कोशिकाएं (सामग्री की तालिका देखें) 175 सेमी2 फ्लास्क (प्रति फ्लास्क 5 × 10 6 कोशिकाओं को सीडिंग) में डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 25 मिलीलीटर का उपयोग करके जिसमें10 % भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) होता है। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 50% -70% संगम तक न पहुंच जाएं।
  2. 14 μL पॉलीथाइलनिमाइन (1 μg /μL) को 150 mM NaCl के 1 मिलीलीटर के साथ मिलाएं। AAV उत्पादन के लिए आवश्यक तीन प्लास्मिड को 1: 1: 1 मोलर अनुपात में मिलाएं (यानी, pAdDeltaF6 का 17.7 μg, AAV2/8 का 7.9 μg ( सामग्री की तालिका देखें), और 150 mM NaCl के 1 mL में चरण 1 से क्लोन एसजीआरएनए का 5.9 μg। पॉलीथाइलेनिमाइन: एनएसीएल मिश्रण को डीएनए (प्लास्मिड का मिश्रण) युक्त ट्यूब में बूंद द्वारा स्थानांतरित करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: pAdDeltaF6 एक हेल्पर प्लास्मिड है और pCapsid pAAV2/8 एक पैकेजिंग प्लास्मिड है जो प्रतिकृति (प्रतिनिधि) और कैप्सिड (कैप) जीन को व्यक्त करता है। एएवी का उत्पादन करने के लिए दोनों प्लास्मिड आवश्यक हैं।
  3. अभिकर्मक से पहले, सेल विकास माध्यम को 18 एमएल डीएमईएम के साथ बदलें जिसमें 1% एफबीएस और एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन (0.5 ग्राम / एल) होता है। प्रत्येक कल्चर फ्लास्क में 2 एमएल पॉलीथाइलेनिमाइन: डीएनए मिश्रण जोड़ें और सीओ 2 इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. 5 घंटे के बाद, 10% एफबीएस और एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन (0.5 ग्राम / एल) के साथ पूरक डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें।
  5. इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद, सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कल्चर फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें। 10 (175 सेमी2) सेल कल्चर फ्लास्क से 293 टी कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में इकट्ठा करें और डीएमईएम (सामग्री की तालिका देखें) को 30 एमएल तक जोड़ें।
  6. 293 टी कोशिकाओं वाले प्रत्येक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 3 एमएल क्लोरोफॉर्म जोड़ें और 5 मिनट के लिए उच्च गति पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिलाएं। 5 M NaCl और भंवर के 7.6 मिलीलीटर को जोड़कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज।
  7. जलीय चरण को एक नई शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 50% (वी / वी) पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) 8000 के 9.4 एमएल जोड़ें। 10 सेकंड के लिए उच्च गति पर एक भंवर मिक्सर के साथ मिलाएं और नमूने को 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखें।
  8. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली को 10 मिनट तक सूखने दें।
  9. 1.4 एमएल एचईपीईएस (50 एमएम, पीएच 8) जोड़ें और उच्च गति पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके 5 मिनट के लिए मिलाएं। 1 M MgCl2 का 3.5 μL, DNase I का 14 μL (20 इकाइयाँ/μL), और RNase A (10 μg/μL) का 1.4 μL जोड़ें। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें, और फिर नमूने को नए 1.5 एमएल ट्यूबों (प्रत्येक ट्यूब में 700 μL) में स्थानांतरित करें।
  10. प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में क्लोरोफॉर्म के 700 μL जोड़ें और 10 सेकंड के लिए उच्च गति पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिलाएं। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और जलीय चरण को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस चरण को 3x दोहराएँ।
  11. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 30 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें। फिर, जलीय चरण के 300 μL को 0.5 एमएल अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फिल्टर को 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 × ग्राम पर घुमाएं। फ्लो-थ्रू निकालें और फ़िल्टर को फिर से तब तक स्पिन करें जब तक कि पूरा वॉल्यूम फ़िल्टर से गुजर न जाए।
  12. डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 300 μL डालकर फ़िल्टर को धो लें और पाइपिंग द्वारा घोल को मिलाएं। 25 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए फिल्टर को सेंट्रीफ्यूज करें। इस धोने के चरण 4x को दोहराएं।
  13. 25 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए फिल्टर को सेंट्रीफ्यूज करें। फ़िल्टर को एक नई ट्यूब में उल्टा रखें, और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए स्पिन करें।

3. क्यूपीसीआर द्वारा एएवी का अनुमापन।

  1. एएवी अनुमापन के लिए एक मानक वक्र तैयार करें और फ्रिपोंट एट अल .15 द्वारा मूल अध्ययन के अनुसार एएवी टिटर निर्धारित करें।

4. एएवी के विवो इंजेक्शन में इंगुइनल सफेद वसा ऊतक (आईडब्ल्यूएटी)

  1. शल्य चिकित्सा के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरण और आपूर्ति को अलग करें और प्रत्येक विशिष्ट सामग्री के लिए अनुशंसित के अनुसार उन्हें निष्फल करें।
  2. इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पंजे और पूंछ पर जोरदार दबाव डालकर और रिफ्लेक्स की जांच करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें। सर्जरी के दौरान आंखों के सूखेपन से बचने के लिए माउस की आंखों पर मरहम लगाएं।
  3. एनेस्थेटाइज्ड माउस को लापरवाह स्थिति में रखें और फ्लैंक पर एक छोटे से क्षेत्र को शेव करें, आईडब्ल्यूएटी इंजेक्शन के लिए कूल्हे के जोड़ों के समीपस्थ, शेवर के साथ। 5 मिनट के लिए डिपिलेटरी क्रीम लगाएं। त्वचा की जलन से बचने के लिए पानी के साथ अवशिष्ट क्रीम निकालें।
  4. एक साफ धुंध और 70% अल्कोहल के साथ त्वचा पर एंटीसेप्टिक समाधान (पोविडोन-आयोडीन) लगाने के तीन वैकल्पिक राउंड का उपयोग करके त्वचा को कीटाणुरहित करें। प्रत्येक उपयोग के बाद धुंध को हटा दें।
  5. त्वचा पर एक एंटीसेप्टिक समाधान का अंतिम आवेदन करें। फिर, जोड़ों के समीपस्थ क्षेत्र में निष्फल कैंची के साथ 1-2 सेमी चीरा लगाएं, और वसा डिपो को उजागर करने के लिए बल का उपयोग करके त्वचा को खुला रखें। डब्ल्यूएटी को दोनों तरफ की त्वचा से जुड़ा हुआ पाया जा सकता है, जो शुरुआत से पीठ पर और नीचे वृषण की ओर फैला हुआ है।
    नोट: सर्जरी या सीवन प्रक्रियाओं के दौरान संदूषण से बचने के लिए ड्रेप का उपयोग करें।
  6. चीरे के माध्यम से बल का उपयोग करके, धीरे से वसा डिपो को ऊपर की ओर खींचें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इंजेक्शन सही स्थान और गहराई पर है।
    नोट: सावधान रहें कि ऊतक को उसके मूल स्थान से न हटाएं।
  7. माइक्रोलीटर सिरिंज (गेज: 33; बिंदु शैली: 4; कोण: 12; लंबाई: 10) (सामग्री की तालिका देखें) को एएवी के 2.5 μL (5.6 ×10 10 वायरल जीनोम [VG]/μL) के साथ भरें (जिसमें अंतर्जात Prdm16 जीन को लक्षित करने वाला एसजीआरएनए होता है)। ध्यान से सुई को आईडब्ल्यूएटी में 30 ° -45 ° कोण पर डालें। पूरे आईडब्ल्यूएटी वसा पैड को सजातीय रूप से संक्रमित करने के लिए ऊतक के विभिन्न स्थानों में इंजेक्शन 5x दोहराएं। आईडब्ल्यूएटी को संक्रमित करने के लिए 15 μL की कुल मात्रा की सिफारिश की जाती है।
    नोट: सिरिंज के सम्मिलन की गहराई वसा पैड जमा की मोटाई पर निर्भर करती है। इंजेक्शन खींचने के लिए नो-टच तकनीक का उपयोग करें।
  8. 4/0 मोनोफिलामेंट सीवन का उपयोग करके मुंडा त्वचा चीरा बंद करें। माउस को एक हीट पैड पर रखें जब तक कि चेतना वापस न आ जाए। हर 10-15 मिनट में जानवर की निगरानी करें जब तक कि वह पूरी तरह से ठीक न हो जाए। जानवर के होश में आने के बाद, लोकोमोटर प्रोफाइलिंग का निरीक्षण करें, जो रैखिक होना चाहिए और इसमें संकट, या दर्द का कोई संकेत नहीं होना चाहिए।
  9. सर्जरी के बाद 48 घंटे के भीतर 3 दिनों (2x / दिन) के लिए ट्रामाडोल हाइड्रोक्लोराइड (5 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करके पोस्टऑपरेटिव दर्द नियंत्रण करें।
    नोट: संकट और असुविधा के संकेतों के लिए देखें और पानी और भोजन के सेवन की निगरानी करें। एक पूर्वव्यापी तरीके से एनाल्जेसिक की एक प्रभावी खुराक दें, अधिमानतः सर्जरी से पहले या शुरुआत में।
  10. उपचार अवधि के दौरान भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ माउस को पिंजरे में रखें। उपचार अवधि के बाद, माउस को इच्छामृत्यु करने के लिए आगे बढ़ें। इस अध्ययन में, इच्छामृत्यु को इंजेक्शन एनेस्थेटिक्स (इंट्रापरिटोनियल) के 3 गुना उत्प्रेरण खुराक (300-360 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड + 30-40 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन हाइड्रोक्लोराइड) के ओवरडोज द्वारा किया गया था।
    नोट: एनेस्थीसिया से पूरी तरह से ठीक होने तक जानवरों को अलग-अलग पिंजरों में रखने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

5. बेज एडिपोसाइट्स में स्ट्रोमल संवहनी कोशिकाओं (एसवीएफ) का इन विट्रो भेदभाव

  1. औने एट अल.17 के अनुसार एडिपोएसपीएच चूहों के आईडब्ल्यूएटी से प्राथमिक एसवीएफ का अलगाव और चढ़ाना करें। एडीपोएसपीएच चूहों से प्राप्त बीज एसवीएफ को 1-2 घंटे के लिए पूर्ण माध्यम (डीएमईएम युक्त 3.1 ग्राम / एल ग्लूकोज, 0.5 ग्राम / एल एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन, 10% एफबीएस, और 2.5% पी / एस) युक्त 6-वेल प्लेट में प्राप्त किया जाता है।
    नोट: एसवीएफ अंश में विभिन्न सेल प्रकारों का मिश्रण होता है। इस चरण में, बीज वाले पूर्वज कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित करना संभव नहीं है जो एडिपोसाइट्स को जन्म देते हैं।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें, फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (1x पीबीएस) का उपयोग करके अच्छी तरह से 2x धोएं, और ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
  3. प्रेरण माध्यम के साथ कोशिकाओं का इलाज करके विभेदन (दिन 0) को प्रेरित करें (तालिका 2)।
    नोट: बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव को बढ़ाने और थर्मोजेनिक जीन प्रोग्राम17 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरण माध्यम की दवा कॉकटेल आवश्यक है।
  4. 2 दिनों (दिन 2) के बाद, प्रेरण माध्यम को रखरखाव माध्यम से बदलें (तालिका 2)।
  5. 2 दिनों (दिन 4) के बाद, रखरखाव माध्यम को 2 से 3 दिनों के लिए ताजा रखरखाव माध्यम (तालिका 2) से बदल दें।
  6. रखरखाव माध्यम को हर 48 घंटे में बदलें जब तक कि प्रीडिपोसाइट्स पूरी तरह से एडिपोसाइट्स में विभेदित न हो जाएं (आमतौर पर प्रेरण माध्यम को जोड़ने के 6 दिन बाद)। परिपक्व एडिपोसाइट्स को प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है, क्योंकि विभेदित कोशिकाएं लिपिड बूंदों से भरी हुई दिखाई देती हैं।

6. एसवीएफ के इन विट्रो एएवी संक्रमण

नोट: एडिपोएसपीएच चूहों आईडब्ल्यूएटी से प्राप्त एसवीएफ एएवी-ले जाने वाले एसजीआरएनए-पीआरडीएम 16 से संक्रमित थे जैसा कि पहले वांग एट अल .18 द्वारा कुछ संशोधनों के साथ वर्णित किया गया था।

  1. कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम के साथ 6-वेल कल्चर प्लेट पर तब तक बढ़ाएं जब तक कि कोशिकाएं 70% -80% संगम तक न पहुंच जाएं, जैसा कि पहले चरण 5.1-5.3 में वर्णित है।
  2. AAV-ले जाने वाले SGRNA-Prdm16 के 5.6 ×10 10 VG/μL को 2 mL पूर्ण मध्यम और हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड (8 μg/mL) के साथ मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। पूर्ण माध्यम को प्रतिस्थापित करके और एएवी युक्त पूर्ण माध्यम को जोड़कर कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। ट्रांसड्यूस ्ड कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 95% आर्द्रता और 5% सीओ 2 पर 12 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. सेल प्रसार और बेज एडिपोसाइट्स में भेदभाव के लिए चरण 5 में वर्णित कोशिकाओं को विभाजित और बीज दें।
    नोट: ऑक्सीजन खपत परख के लिए, बीज 4.0 × 104 कोशिकाएं (चरण 6.2 से) 24-वेल सेल कल्चर प्लेट में प्रेरण माध्यम के साथ प्रति अच्छी तरह से। सेल प्रसार और भेदभाव के बाद के चरण चरण 5 में वर्णित के रूप में किए जाते हैं। ऑक्सीजन की खपत परख तब की जाती है जब कोशिकाएं 80% -100% संगम तक पहुंच जाती हैं और पूरी तरह से विभेदित होती हैं, जैसा किपहले बताया गया था।

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Representative Results

एडिपोएसपीएच चूहों को एसपीएच और एडिपोक-क्रे माउस उपभेदों के प्रजनन द्वारा विकसित किया गया था। दोनों माउस उपभेद एक हाइब्रिड C57BL6J-DBA / 2J पृष्ठभूमि में थे (वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता के अनुसार; सामग्री की तालिका देखें)। एसपीएच माउस वंश मूल रूप से झोउ एट अल .14 द्वारा वर्णित किया गया था।

विवो बेज एडिपोसाइट्स विकास में एडिपोएसपीएच-मध्यस्थता पीआरडीएम 16 ओवरएक्प्रेशन के माध्यम से
विवो में बेज एडिपोसाइट्स विकसित करने के लिए इस अध्ययन में वर्णित मॉडल की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, पीआरडीएम 16 जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए को ले जाने वाले एएवी को एडिपोएसपीएच चूहों के आईडब्ल्यूएटी में इंजेक्ट किया गया था। Prdm16 एक अच्छी तरह से स्थापित प्रतिलेखन कारक है जो बेज एडिपोसाइट्स विकास और कार्य20,21 को निर्धारित करता है। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि यहां हमने अंतर्जात Prdm16 जीन14 को लक्षित करने वाले पहले से परीक्षण और मान्य एसजीआरएनए को चुना। एक खाली एसजीआरएनए ले जाने वाले एएवी का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। एएवी इंजेक्शन के 10 दिनों के बाद, आईडब्ल्यूएटी को हिस्टोलॉजिकल और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (चित्रा 1 ए) के लिए काटा गया था। जैसा कि अपेक्षित था, एडिपोएसपीएच चूहों से आईडब्ल्यूएटी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों ने नियंत्रण और पीआरडीएम 16 समूहों (चित्रा 1 बी) दोनों में डीसीएएस 9 की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, एमचेरी अभिव्यक्ति ने नियंत्रण और पीआरडीएम 16 समूहों (चित्रा 1 बी) दोनों में आईडब्ल्यूएटी के एएवी संक्रमण की सफलता की पुष्टि की। SPH-प्रेरित Prdm16 अभिव्यक्ति ने स्पष्ट रूप से आईडब्ल्यूएटी (चित्रा 1 बी) में मल्टीओकुलर बेज एडिपोसाइट्स के व्यापक संचय को प्रेरित किया। इसके अलावा, मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) ने नियंत्रण की तुलना में पीआरडीएम 16 समूह में पीआरडीएम 16 और थर्मोजेनिक जीन प्रोग्राम (यूसीपी 1, कॉक्स 8 बी, पीपीएआरसी 1 ए और सिडिया) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का खुलासा किया (चित्रा 1 सी)।

बेज एडिपोसाइट्स विकास को बढ़ावा देना और एडिपोएसपीएच-मध्यस्थता पीआरडीएम 16 ओवरएक्प्रेशन द्वारा विट्रो में ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि
इसके बाद, विट्रो में बेज एडिपोसाइट्स जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल की उपयुक्तता की जांच की गई। इसके लिए, एडिपोएसपीएच चूहों के आईडब्ल्यूएटी से प्राप्त प्रीडिपोसाइट्स को एएवी के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था, जिसमें पीआरडीएम 16 को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए अनुक्रम थे। भेदभाव के सात दिनों के बाद, जीन अभिव्यक्ति और ऑक्सीजन की खपत के विश्लेषण के लिए बेज एडिपोसाइट्स का उपयोग किया गया था (चित्रा 2 ए)। खाली एसजीआरएनए का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। यह ध्यान देने योग्य है कि सीआरई रिकोम्बिनेस द्वारा स्टॉप कोडन को हटाने और एसपीएच मशीनरी की सक्रियता एडिपोनेक्टिन प्रमोटर / एन्हांसर के नियंत्रण में थी, जिसके परिणामस्वरूप परिपक्व एडिपोसाइट्स में अंतर्जात पीआरडीएम 16 जीन की सक्रियता हुई। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण ने नियंत्रण की तुलना में Prdm16 ओवरएक्प्रेशन समूह में अंतर्जात Prdm16 जीन और थर्मोजेनिक जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की पुष्टि की (चित्रा 2B)। यह पुष्टि करने के लिए कि एसपीएच-प्रेरित बेज एडिपोसाइट्स कार्यात्मक रूप से थर्मोजेनिक थे, प्राथमिक एडिपोसाइट्स पर एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति परख का प्रदर्शन किया गया था। श्वसनमिति डेटा विश्लेषण और व्याख्या हाल ही में वर्णित22 के रूप में की गई थी। SPH-प्रेरित Prdm16 अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में उच्च बेसल और अधिकतम ऑक्सीजन की खपत हुई (चित्रा 2 सी)। महत्वपूर्ण रूप से, डेटा ने नियंत्रण समूह (चित्रा 2 सी, तालिका 3) की तुलना में पीआरडीएम 16 समूह में बढ़े हुए अयुग्मित श्वसन (ऑलिगोमाइसिन-असंवेदनशील) का संकेत दिया। एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चला कि अंतर्जात Prdm16 की SPH-प्रेरित अभिव्यक्ति ब्राउनिंग फेनोटाइप को पुन: उत्पन्न करती है और पारंपरिक Prdm16 Tg चूहों में देखी गई ऑक्सीजन की खपत दर को बढ़ाती है।

Figure 1
चित्रा 1: एडिनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के इंजेक्शन द्वारा बेज वसा का विकास जो एडिपोएसपीएच चूहों के इंगुइनल व्हाइट एडीपोज ऊतक (आईडब्ल्यूएटी) में अंतर्जात पीआरडीएम 16 जीन को लक्षित करता है। (ए) विवो बेज एडिपोसाइट्स प्रयोगात्मक डिजाइन (Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया) का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) आईडब्ल्यूएटी की हिस्टोलॉजिकल (हेमटोक्सीलिन और ईओसिन [एच एंड ई] धुंधला) छवियां। स्केल बार = 50 μm. (C) Prdm16 का मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और थर्मोजेनिक जीन (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a, और Cidea; n = 3)। डेटा को एसईएम ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * पी < 0.05; ** पी < पीआरडीएम 16 बनाम नियंत्रण (सीटीआर) के लिए अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पीआरडीएम 16 ओवरएक्प्रेशन द्वारा एसपीएच-प्रेरित बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव। (ए) इन विट्रो बेज एडिपोसाइट्स प्रयोगात्मक डिजाइन का योजनाबद्ध चित्रण (Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया)। (बी) Prdm16 और थर्मोजेनिक जीन (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a, और Cidea; n = 3) की सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति। (सी) ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर), एन = 6। डेटा को एसईएम ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; (बी) अप्रकाशित छात्र के टी-टेस्ट और (सी) दो-तरफा दोहराए जाने वाले एनोवा द्वारा पीआरडीएम 16 बनाम नियंत्रण (सीटीआर) के लिए पी < 0.001, इसके बाद टुकी का परीक्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: Prdm16 sgRNA का सेंगर अनुक्रमण। (ए) एकल-फंसे पूरक Prdm16 ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के संरेखण को प्रदर्शित करने वाला योजनाबद्ध चित्रण। (बी) सार्वभौमिक प्राइमर का उपयोग करके पीआरडीएम 16 एसजीआरएनए का सेंगर अनुक्रमण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जीन प्रजातियां आगे उल्टा
जीन अभिव्यक्ति Prdm16 चूहा CAGCACGGTGAAGCCATTC GCGTGCATCCGCTTGTG
Ucp1 चूहा TCTCAGCCGGCTTAATGACTG GGCTTGCATCTCTGACCTTCAC
Ppargc1a चूहा AGCCGTGACCACTGACAACGAG GCTGCATGGTTCTGGTGCTAAG
Cox8b चूहा GAACCATGAAGCCACACACT GCGAAGTTCACAGTGGTTCC
Cidea चूहा ATCACAACTGGCCTGGTTACG TACTACCCGGTGTCCATCT
36B4 चूहा TCCAGGCTTTGGCATCA CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA
आणविक क्लोनिंग एसजीआरएनए पीआरडीएम 16 अनुक्रम चूहा CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG CCCCTTTTCAGCGCgccg
सार्वभौमिक प्राइमर चूहा GAGGGCCTTTTCCC
ATGATTCCTTCATAT

तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर अनुक्रम।

मध्यम संयोजन
पूरा माध्यम एल-ग्लूटामाइन के साथ डलबेकको का संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम)
भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का 10%
पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन का 2.5%
प्रेरण माध्यम पूरा माध्यम
इंडोमेथासिन, अंतिम एकाग्रता 125 μM (इथेनॉल में 0.125 M स्टॉक)। नोट: इंडोमेथैसिन को भंग होने के लिए 10 सेकंड के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए।
इंसुलिन, अंतिम एकाग्रता 20 एनएम (1 एमएम स्टॉक), घुलनशील (5.73 मिलीग्राम / एमएल) के लिए एचसीएल के 1 μL जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक स्टोर करें।
डेक्सामेथासोन, अंतिम एकाग्रता 2 μg / mL (इथेनॉल में 2 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक)
3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स), अंतिम एकाग्रता 500 μM (0.5 M KOH में 0.25 M स्टॉक)
3,3',5-ट्राइओडो-एल-थायरोनिन (टी 3), अंतिम एकाग्रता 1 एनएम (10 μM स्टॉक, 1 M HCl में T3 को भंग करें और EtOH 1: 4 स्टॉक करने के लिए)।
रोज़िग्लिटाज़ोन, अंतिम एकाग्रता 1 μg / mL (इथेनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक)
रखरखाव माध्यम पूरा माध्यम
इंसुलिन, अंतिम एकाग्रता 20 एनएम (1 एमएम स्टॉक)। घुलनशीलता (5.73 मिलीग्राम / एमएल) के लिए एचसीएल के 1 μL जोड़ें।
रोज़िग्लिटाज़ोन, अंतिम एकाग्रता 1 μg / mL (इथेनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक)

तालिका 2: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मीडिया की संरचना।

पैरामीटर सीटीआर PRDM16 पी-वैल्यू
कोई माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत नहीं (pMoles / min / μg प्रोटीन) 8.19 ± 1.40 10.80 ± 1.83 0.01
बेसल श्वसन (pmols / min / μg प्रोटीन) 28.82 ± 5.20 52.58 ± 13.73 0.001
अधिकतम श्वसन (pMoles/min/μg प्रोटीन) 63.81 ± 9.80 122.94 ± 22.31 < 0.001
अतिरिक्त श्वसन क्षमता (pmoles / min / μg प्रोटीन) 34.98 ± 11.09 70.36 ± 26.06 0.006
ओलिगो असंवेदनशील (pMoles/min/μg प्रोटीन) 8.27 ± 2.29 15.85 ± 5.48 0.005
ओलिगो संवेदनशील (pMoles/min/μg प्रोटीन) 20.54 ± 5.68 36.72 ± 14.79 0.016
युग्मन दक्षता 71.28 ± 1.51 69.84 ± 3.05 0.163
सेल आरसीआर; 7.70 ± 1.46 7.75 ± 2.43 0.485

तालिका 3: एसपीएच-प्रेरित बेज एडिपोसाइट्स के श्वसन पैरामीटर।

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Discussion

CRISPR तकनीक के सबसे उपयोगी गैर-संपादन अनुप्रयोगों में से एक CRISPRA सिस्टम6 का उपयोग करके अंतर्जात जीन के सक्रियण के माध्यम से जीन फ़ंक्शन की पूछताछ है। एसपीएच एक शक्तिशाली सीआरआईएसपीआरए है जिसे मूल रूप से कई न्यूरोजेनिक जीन14 को लक्षित करके एस्ट्रोसाइट्स के सक्रिय न्यूरॉन्स में रूपांतरण को प्रेरित करने के लिए वर्णित किया गया था। इस अध्ययन में, एडिपोएसपीएच को एडिपोसाइट्स में अंतर्जात पीआरडीएम 16 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करके बेज वसा जीव विज्ञान की जांच के लिए एक उपयुक्त उपकरण के रूप में प्रदर्शित किया गया था। एडिपोसाइट्स में एसपीएच-प्रेरित पीआरडीएम 16 ओवरएक्प्रेशन थर्मोजेनिक जीन प्रोग्राम के सक्रियण की ओर जाता है और ब्राउनिंग फेनोटाइप को प्रेरित करता है, जो पिछले ट्रांसजेनिक (टीजी) पीआरडीएम 16 चूहों के मॉडल23 की नकल करता है। इस अध्ययन में Prdm16 को भूरे और बेज वसा भेदभाव को विनियमित करने में इस प्रतिलेखन कारक की केंद्रीय भूमिका के आधार पर बेज एडिपोसाइट्स को प्रेरित करने के लक्ष्य के रूप में चुना गया था, साथ ही साथ विभेदित एडिपोसाइट्स में थर्मोजेनिक जीन प्रोग्राम (जैसे, यूसीपी 1 अभिव्यक्ति को बढ़ाना) का विनियमन भी शामिल था। फिर भी, वर्तमान मॉडल शोधकर्ताओं के विवेक और अध्ययन के उद्देश्य पर किसी भी अंतर्जात जीन के अतिवृद्धि की अनुमति देता है।

वसा ऊतक जीव विज्ञान की जांच करने वाले पारंपरिक ट्रांसजेनिक मॉडल आनुवंशिक रूप से संशोधित कृन्तकों के विकास पर निर्भर करते हैं जो एडिपोसाइट्स (उदाहरण के लिए, फैबपी 4 या एडिपोनेक्टिन) तक सीमित प्रमोटर / एन्हांसर के नियंत्रण में एक ट्रांसजीन को व्यक्त करते हैं। यद्यपि वर्तमान तकनीक ने इन मॉडलों के विकास की गति को तेज कर दिया है, लेकिन उन्हें विकसित करने की लागत और समय अभी भी वैज्ञानिक समुदाय द्वारा अनुभव किया जाने वाला एक आम मुद्दा है। इसके विपरीत, एडिपोएसपीएच पारंपरिक टीजी चूहों की तुलना में गेन-ऑफ-फंक्शन दृष्टिकोण के लिए एक सस्ता और अधिक बहुमुखी मॉडल है। इसके अलावा, एडिपोएसपीएच लंबे गैर-कोडिंग आरएनए और प्रतिलेख आइसोफॉर्म का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जो टीजी चूहों के मॉडल के लिए विशेष रूप से उपयुक्त नहीं हैं।

एडिपोएसपीएच एएवी के सरल प्रशासन की तुलना में वसा ऊतक जीव विज्ञान की जांच में कई फायदे भी प्रस्तुत करता है, जो गेन-ऑफ-फंक्शन प्रयोगों के लिए एक वर्तमान वैकल्पिक दृष्टिकोणहै। सबसे पहले, एडीपोज ऊतक को दिया गया एएवी एक ट्रांसजीन की कई प्रतियों को पेश करके ओवरएक्प्रेशन को बढ़ावा देता है। इसके विपरीत, अंतर्जात जीन का एसपीएच सक्रियण कार्रवाई के अधिक प्राकृतिक तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरा, एएवी (संवैधानिक प्रमोटरों का उपयोग करके) द्वारा दिए गए ट्रांसजेन आमतौर पर वसा ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर "किसी भी सेल प्रकार" में उनके अतिवृद्धि का परिणाम होते हैं। इसके विपरीत, एंडोजेनस जीन की एडिपोएसपीएच-प्रेरित अभिव्यक्ति एडिपोसाइट्स तक ही सीमित है। तीसरा, पैकेजिंग आकार (~ 4.5 केबी) कुछ ट्रांसजेन26 के लिए एएवी की एक विशिष्ट सीमा है। हालांकि, एएवी-ले जाने वाले एसजीआरएनए को अनुकूलित 20 न्यूक्लियोटाइड के लिए एक सरल और आसान क्लोनिंग रणनीति की आवश्यकता होती है। अंत में, एएवी प्रशासन आमतौर पर प्रणालीगत परिसंचरण तक पहुंचता है और अन्य ऊतकों और अंगों को संक्रमित करता है। यद्यपि कुछ एएवी में विशेष ऊतकों में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति को कम करने के लिए माइक्रोआरएनए होते हैं, जैसे कि यकृत और हृदय25, यह रणनीति अन्य ऊतकों और अंगों में एएवी संक्रमण को रोक नहीं सकती है। इसके विपरीत, एंडोजेनस जीन की एडिपोएसपीएच-प्रेरित अभिव्यक्ति एडिपोसाइट्स तक सीमित है, यहां तक कि प्रणालीगत परिसंचरण में एएवी के कुछ रिसाव पर भी विचार किया जाता है। इस प्रकार, एडिपोएसपीएच एएवी-ले जाने वाले एसजीआरएनए के प्रणालीगत प्रशासन और पूरे शरीर की ऊर्जा होमियोस्टैसिस के वसा ऊतक विनियमन की जांच के लिए भी एक उपयुक्त मॉडल है।

यद्यपि एडिपोएसपीएच मॉडल कुछ फायदे प्रदान करता है, लेकिन इसकी सीमाएं हैं जिन पर विचार करना महत्वपूर्ण है। एएवी वर्तमान में एसजीआरएनए के विवो वितरण में सबसे आम मंच है। हालांकि, एएवी विनिर्माण और प्रतिरक्षात्मक मुद्दों में कुछ चुनौतियांअनसुलझी बनी हुई हैं। इसके अलावा, पूरे वसा ऊतक में इंजेक्शन एएवी की विभिन्न मात्रा और वितरण के परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति की अंतर-और अंतर-ऊतक परिवर्तनशीलता होती है। हम मानते हैं कि एसजीआरएनए वेक्टर क्लोनिंग, एएवी उत्पादन, और आईडब्ल्यूएटी में एएवी का सजातीय प्रशासन इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। अंत में, विभिन्न एसजीआरएनए विशिष्ट रूप से एसपीएच सिस्टम14 में अंतर्जात जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करते हैं। मुख्य सिफारिश जीन ऑफ इंटरेस्ट के ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट (टीएसएस) के 200 बीपी अपस्ट्रीम के भीतर तीन से पांच एसजीआरएनए अनुक्रमों को डिजाइन और परीक्षण करना है। इसलिए, एक लक्ष्य जीन के लिए सबसे अच्छा एसजीआरएनए अनुक्रम परिभाषित करने के लिए आमतौर पर विवो प्रयोगों से पहले श्रमसाध्य इन विट्रो परख की आवश्यकता होती है।

एडीपीओएसपीएच वसा-ऊतक जीव विज्ञान के अन्य पहलुओं की जांच के लिए भी एक आकर्षक मॉडल है। उदाहरण के लिए, एडिपोसाइट्स कई एडिपोकिन28,29 के स्राव को बढ़ावा देते हैं; हालांकि, इनमें से अधिकांश अणुओं के पूरे शरीर के प्रभाव खराब समझे जाते हैं। परिपक्व एडिपोसाइट्स में एकल या कई अंतर्जात जीनों को अतिरंजित करके और उनके स्थानीय या प्रणालीगत प्रभावों की जांच करके इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए एडिपोएसपीएच एक उपयुक्त मॉडल है। इस प्रकार, एडिपोएसपीएच वसा ऊतक के जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने सभी प्रयोगात्मक समर्थन के लिए एडिपोएसपीएच चूहों की पीढ़ी के लिए सेंट्रो मल्टीडिसिप्लिनर पैरा इन्वेस्टिगाओ बायोलोजिका ना अरिया डा सिएनसिया एम एनिमिस डी लेबरेटोरियो (सेमिब), यूनिकैंप, इंमुनोमेटाबोलिज्म और सेल सिग्नलिंग लेबोरेटरी और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ऑन फोटोनिक्स एप्लाइड टू सेल बायोलॉजी (इनफाबिक) से प्राप्त समर्थन के लिए धन्यवाद दिया। हम साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (एफएपीईएसपी) से वित्तीय सहायता का धन्यवाद करते हैं: 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
AAVpro 293T Cell Line Takarabio 632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter Merckmillipore UFC510008 100 KDa
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement Gibco 10565-018 high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors Fisher Scientific 17-467-496
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) Fisher Scientific 08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Insulin Sigma-Aldrich I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8225
Maxiprep purification kit  Qiagen 12162
Microliter syringe Hamilton 80308 Model 701
NEB 10-beta/Stable  New England Biolabs C3019H E. coli competent cells
pAAV2/8  Addgene  112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry Addgene  91947
pAdDeltaF6  Addgene  112867
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 23966 Linear, MW 25000
Povidone-iodine Rioquímica 510101303 Antiseptic
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408
SacI enzyme New England Biolabs R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps Fisher Scientific 22-079-741
Syringe Hamilton 475-40417
T4 DNA Ligase Promega M180B
T4 DNA ligase buffer  New England Biolabs B0202S
T4 PNK enzyme kit New England Biolabs M0201S
Tramadol Hydrochloride SEM 43930
Vidisic Gel  Bausch + Lomb  99620

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References

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CRISPR SunTag-p65-HSF1 सक्रियण प्रणाली का उपयोग करके बेज वसा जीव विज्ञान और चयापचय की जांच
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Valdivieso-Rivera, F. B., de Oliveira Furino, V., Sponton, C. H. Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System. J. Vis. Exp. (191), e64849, doi:10.3791/64849 (2023).

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