Summary
Questo protocollo presenta l'uso di CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) negli adipociti (AdipoSPH) come strategia alternativa al virus adeno-associato (AAV) per studiare la biologia del grasso beige. L'iniezione in vivo di sgRNA portatori di AAV mirati al gene endogeno Prdm16 è sufficiente per indurre lo sviluppo di grasso beige e migliorare il programma genico termogenico.
Abstract
La tecnologia CRISPR (Clustered regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ha provocato una rivoluzione in biologia e strumenti recenti sono stati applicati ben oltre l'editing genetico originariamente descritto. Il sistema di attivazione CRISPR (CRISPRa) combina la proteina Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) con moduli di trascrizione distinti per indurre l'espressione genica endogena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) è una tecnologia CRISPRa di recente sviluppo che combina componenti di mediatori di attivazione sinergica (SAM) con gli attivatori SunTag. Questo sistema consente la sovraespressione di geni singoli o multipli progettando un RNA a guida singola personalizzato (sgRNA). In questo studio, un topo SPH precedentemente sviluppato è stato utilizzato per generare un topo condizionale che esprime SPH negli adipociti (linea di adiponectina Cre), chiamato AdipoSPH. Per indurre un fenotipo di grasso bianco-beige (imbrunimento), un virus adeno-associato (AAV) che trasporta sgRNA mirato al gene endogeno Prdm16 (un fattore di trascrizione ben consolidato correlato allo sviluppo del grasso bruno e beige) è stato iniettato nel tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT). Questo modello murino ha indotto l'espressione di Prdm16 endogeno e ha attivato il programma genico termogenico. Inoltre, la sovraespressione di Prdm16 indotta da SPH in vitro ha migliorato il consumo di ossigeno degli adipociti beige, fenocopiando i risultati di un precedente modello murino transgenico Prdm16. Pertanto, questo protocollo descrive un modello murino versatile, economico ed efficiente in termini di tempo per studiare la biologia del tessuto adiposo.
Introduction
Gli adipociti beige (o brite) sono adipociti disaccoppianti che esprimono la proteina 1 (UCP1) e ricchi di mitocondri che risiedono all'interno di depositi di tessuto adiposo bianco (WAT). Il grasso beige emerge da un sottogruppo di progenitori adipocitari o adipociti bianchi maturi in risposta all'esposizione al freddo e ad altri stimoli 1,2. Gli adipociti beige possono convertire l'energia in calore in modo UCP1-dipendente o indipendente3. Indipendentemente dalla sua funzione termogenica, il grasso beige può anche migliorare la salute metabolica con altri mezzi, come la secrezione di adipochine e attività antinfiammatorie e antifibrotiche. Studi su topi e umani hanno dimostrato che l'induzione del grasso beige migliora il glucosio di tutto il corpo e l'omeostasi lipidica3. Tuttavia, sebbene la nostra conoscenza della biologia del grasso beige si sia evoluta rapidamente negli ultimi anni, la maggior parte dei suoi benefici metabolici e dei relativi meccanismi non sono ancora completamente compresi.
Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) sono state descritte per la prima volta nelle cellule eucariotiche come uno strumento in grado di generare una rottura del doppio filamento (DSB) in un sito specifico del genoma attraverso l'attività nucleasica della proteina Cas9 4,5. Cas9 è guidato da un RNA sintetico a guida singola (sgRNA) per colpire una specifica regione genomica, portando a un DSB del DNA. Oltre a utilizzare la nucleasi Cas9 per scopi di editing, la tecnologia CRISPR-Cas9 si è evoluta per essere utilizzata come strumento di regolazione genica specifico per sequenza6. Lo sviluppo di una proteina Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) e l'associazione di moduli trascrizionali in grado di migliorare l'espressione genica ha dato origine a strumenti di attivazione di CRISPR (CRISPRa). Sono emersi diversi sistemi CRISPRa, come VP647,8, mediatore di attivazione sinergica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 e SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, che combina i componenti degli attivatori SAM e SunTag. Recentemente è stato dimostrato che l'espressione indotta di geni neurogeni nei neuroblasti N2a e negli astrociti primari è maggiore utilizzando SPH rispetto ad altri sistemi CRISPRa14, dimostrando SPH come un promettente strumento CRISPRa.
Qui, abbiamo sfruttato un topo SPH14 sviluppato in precedenza per generare un modello murino condizionale che esprime SPH specificamente negli adipociti utilizzando il lignaggio dell'adiponectina Cre (AdipoSPH). Utilizzando un virus adeno-associato (AAV) che trasporta il gRNA che ha come bersaglio il gene endogeno Prdm16, l'imbrunimento (conversione da bianco a beige) di WAT inguinale (iWAT) è stato indotto per aumentare l'espressione del programma genico termogenico. Inoltre, la sovraespressione in vitro di Prdm16 ha aumentato il consumo di ossigeno. Pertanto, questo protocollo fornisce un versatile modello murino SPH per esplorare i meccanismi di sviluppo del grasso beige all'interno del tessuto adiposo.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida dell'Università di Campinas per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (protocollo CEUA #5810-1/2021).
1. Clonazione molecolare
- Progettazione di RNA guida singola (sgRNA)
- Progetta sgRNA per l'attivazione di CRISPR usando CHOPCHOP, disponibile su https://chopchop.cbu.uib.no/ o qualsiasi altro strumento adatto. Utilizzare i seguenti parametri per progettare sgRNA che ha come bersaglio il gene Prdm16: Target: Prdm16; In: Mus musculus; Utilizzo: Crispr / Cas9; Per: Attivazione.
NOTA: Progettare sgRNA per ogni regione di interesse distribuiti su una regione di 200 bp upstream transcription start site (TSS). Ad esempio, l'sgRNA che prende di mira Prdm16 utilizzato in questo studio lega 154 bp a monte di TSS. - Aggiungere sporgenze allo sgRNA in modo che corrispondano al sito di restrizione SacI nella dorsale vettoriale pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (vedi Tabella dei materiali). Includere: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleotidi). Ad esempio, la sequenza che ha come bersaglio il gene Prdm16 è 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', e con sporgenze è 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Ottenere la sequenza di complemento inverso 3' sgRNA usando lo strumento disponibile a https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Ad esempio, la sequenza 3' di sgRNA che ha come bersaglio il gene Prdm16 è 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Progetta sgRNA per l'attivazione di CRISPR usando CHOPCHOP, disponibile su https://chopchop.cbu.uib.no/ o qualsiasi altro strumento adatto. Utilizzare i seguenti parametri per progettare sgRNA che ha come bersaglio il gene Prdm16: Target: Prdm16; In: Mus musculus; Utilizzo: Crispr / Cas9; Per: Attivazione.
- Ricottura di oligonucleotidi complementari a singolo filamento
- Aggiungere 1 μL di ogni oligonucleotide a singolo filamento da 5' e 3' (concentrazione stock: 100 μM), 1 μL di tampone T4 ligasi, 0,5 μL di polinucleotide chinasi T4 (PNK) (1 × 104 unità/ml) e 6,5 μL di H2O ad un volume finale di reazione di 10 μL. Ricottura degli oligonucleotidi complementari a singolo filamento utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni: 37 °C per 30 minuti e 95 °C per 5 minuti, seguiti da una velocità di discesa di 5 °C/min.
NOTA: L'enzima PNK viene fornito con tampone PNK e non contiene ATP sufficiente per la reazione di fosforilazione (vedere Tabella dei materiali). Per semplificare la reazione, utilizzare il tampone T4 ligasi (invece del tampone PNK). Il tampone T4 ligasi fornisce la quantità appropriata (1 mM ATP) di fosfato per la reazione di fosforilazione. L'enzima PNK fornisce 5' fosforilazione finale degli oligonucleotidi per la successiva reazione di legatura.
- Aggiungere 1 μL di ogni oligonucleotide a singolo filamento da 5' e 3' (concentrazione stock: 100 μM), 1 μL di tampone T4 ligasi, 0,5 μL di polinucleotide chinasi T4 (PNK) (1 × 104 unità/ml) e 6,5 μL di H2O ad un volume finale di reazione di 10 μL. Ricottura degli oligonucleotidi complementari a singolo filamento utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni: 37 °C per 30 minuti e 95 °C per 5 minuti, seguiti da una velocità di discesa di 5 °C/min.
- Legatura degli oligonucleotidi sgRNA ricotti
- Aggiungere 25 ng di plasmide pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry a 2 μL di oligonucleotidi sgRNA ricotti, 1 μL di enzima SacI, 2 μL di 10x tampone T4 DNA ligasi, 1 μL di T4 DNA ligasi (1-3 u/μL) (vedi Tabella dei materiali) e H2O ad un volume di reazione finale di 10 μL.
- Eseguire la legatura incubando la miscela di reazione utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni: 15 cicli di 37 °C per 5 min e 25 °C per 5 min, seguiti da mantenimento a 4 °C.
- Trasformazione seguita da reazione a catena della polimerasi di colonia (PCR)
- Trasformare le cellule competenti di E. coli DH10B (vedi Tabella dei materiali) con 4 μL di prodotto di legatura mediante shock termico (42 °C per 45 s) e distribuirle su una piastra di agar contenente 100 μg/ml di ampicillina.
- Confermare le colonie trasformate mediante PCR di colonia utilizzando la miscela master PCR (vedere Tabella dei materiali). Prelevare la colonia e miscelare con 5 μL di miscela madre, 0,1 μL di primer universale (concentrazione stock: 100 μM), 0,1 μL di primer inverso sgRNA (concentrazione stock: 100 μM) (Tabella 1) e 5 μL di H 2 O. Eseguire la PCR utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale (94 °C per2min), seguito da 35 cicli di denaturazione (94 °C per 20 s), ricottura (60 °C per 30 s), estensione (72 °C per 30 s) e una fase finale di allungamento (72 °C per 5 min). Risolvere il DNA utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio (1,5%) in tampone TAE 0,5x a 90 V per 30 minuti.
NOTA: I cloni positivi danno una banda di ~280 bp. - Inviare campioni positivi per il sequenziamento Sanger utilizzando primer universale (Tabella 1, File supplementare 1).
- Purificazione plasmidica
- Purificare il plasmide da un clone positivo utilizzando un kit di purificazione del plasmide (vedi Tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Purificare il plasmide utilizzando resina a scambio anionico o altro kit adatto all'uso nella trasfezione cellulare. - Incubare il clone positivo (12 ore a 37 °C con agitazione a 200 giri/min) utilizzando un terreno di coltura batterica standard contenente 100 μg/ml di ampicillina.
- Centrifugare le cellule batteriche a 6.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Seguire i passaggi successivi in base alle istruzioni del kit del produttore.
- Purificare il plasmide da un clone positivo utilizzando un kit di purificazione del plasmide (vedi Tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
2. Imballaggio AAV
NOTA: L'imballaggio AAV è stato eseguito secondo le pubblicazioni precedenti15,16 con modifiche minori.
- Placcare le cellule 293T (vedi tabella dei materiali) in un matraccio da 175 cm2 (semina 5 × 106 cellule per pallone) utilizzando 25 ml di terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S). Incubare a 37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità fino a quando le cellule raggiungono il 50% -70% di confluenza.
- Mescolare 14 μL di polietilenimina (1 μg/μL) con 1 mL di 150 mM NaCl. Miscelare i tre plasmidi necessari per la produzione di AAV in un rapporto molare 1:1:1 (cioè 17,7 μg di pAdDeltaF6, 7,9 μg di AAV2/8 (vedi Tabella dei materiali) e 5,9 μg di sgRNA clonato dalla fase 1 in 1 mL di 150 mM NaCl. Trasferire la miscela polietilenimina:NaCl goccia a goccia nel tubo contenente il DNA (miscela di plasmidi) e incubare per 20 minuti a 25 °C.
NOTA: pAdDeltaF6 è un plasmide Helper e pCapsid pAAV2/8 è un plasmide di packaging che esprime i geni di replicazione (Rep) e Capside (cap). Entrambi i plasmidi sono necessari per produrre AAV. - Prima della trasfezione, sostituire il terreno di crescita cellulare con 18 ml di DMEM contenente l'1% di FBS e L-alanil-L-glutammina (0,5 g/L). Aggiungere 2 mL della miscela polietilenimina:DNA a ciascun matraccio di coltura e incubare le cellule in un incubatore di CO 2 (37 °C, 5% CO2, 95% umidità).
- Dopo 5 ore, aggiungere 5 ml di DMEM integrato con 10% FBS e L-alanil-L-glutammina (0,5 g / L).
- Dopo 3 giorni di incubazione, staccare le cellule dal pallone di coltura usando un raschietto cellulare. Raccogliere le 293T cellule da 10 (175 cm2) palloni di coltura cellulare in provette coniche da 50 mL e aggiungere DMEM (vedi Tabella dei materiali) fino a 30 ml.
- Aggiungere 3 ml di cloroformio a ciascun tubo conico da 50 mL contenente le celle 293T e mescolare utilizzando un miscelatore a vortice ad alta velocità per 5 minuti. Risospendere le cellule aggiungendo brevemente 7,6 ml di 5 M NaCl e vortice. Centrifugare a 3.000 × g e 4 °C per 5 min.
- Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo conico e aggiungere 9,4 ml di polietilenglicole (PEG) 8000 al 50% (v/v). Mescolare con un miscelatore a vortice ad alta velocità per 10 s e mettere i campioni sul ghiaccio per 1 ora.
- Centrifugare a 3.000 × g a 4 °C per 30 min. Rimuovere il surnatante e lasciare asciugare il pellet per 10 minuti.
- Aggiungere 1,4 mL di HEPES (50 mM, pH 8) e mescolare per 5 minuti utilizzando un miscelatore a vortice ad alta velocità. Aggiungere 3,5 μL di 1 M MgCl2, 14 μL di DNasi I (20 unità/μL) e 1,4 μL di RNasi A (10 μg/μL). Incubare a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti, quindi trasferire i campioni in nuove provette da 1,5 ml (700 μL in ciascuna provetta).
- Aggiungere 700 μL di cloroformio a ciascun tubo da 1,5 mL e mescolare utilizzando un miscelatore a vortice ad alta velocità per 10 s. Centrifugare a 3.000 × g a 4 °C per 5 minuti e trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo. Ripetere questo passaggio 3x.
- Far evaporare il cloroformio per 30 minuti in un armadio di biosicurezza. Quindi, trasferire 300 μL della fase acquosa in un tubo di ultracentrifugazione da 0,5 mL (vedi Tabella dei materiali). Centrifugare il filtro a 14.000 × g a 25 °C per 5 minuti. Rimuovere il flusso continuo e ruotare nuovamente il filtro fino a quando l'intero volume non è passato attraverso il filtro.
- Lavare il filtro aggiungendo 300 μL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) e miscelare le soluzioni mediante pipettaggio. Centrifugare il filtro per 5 minuti a 14.000 × g a 25 °C. Ripetere questa fase di lavaggio 4x.
- Centrifugare il filtro per 8 minuti a 14.000 × g a 25 °C. Posizionare il filtro capovolto in un nuovo tubo e ruotare per 2 minuti a 1.000 × g a 25 °C.
3. Titolazione dell'AAV mediante qPCR
- Preparare una curva standard per la titolazione AAV e determinare il titolo AAV secondo lo studio originale di Fripont et al.15.
4. Iniezione in vivo di AAV nel tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT)
- Separare gli strumenti chirurgici e le forniture necessarie per la chirurgia e sterilizzarli come raccomandato per ogni materiale specifico.
- Anestetizzare il topo con 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina mediante iniezione intraperitoneale. Confermare l'anestesia applicando una forte pressione sulla zampa e sulla coda e controllando un riflesso. Applicare un unguento sugli occhi del topo per evitare secchezza oculare durante l'intervento chirurgico.
- Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina e radere una piccola area sui fianchi, prossimale alle articolazioni dell'anca per iniezioni iWAT, con un rasoio. Applicare la crema depilatoria per 5 min. Rimuovere la crema residua con acqua per evitare ustioni cutanee.
- Disinfettare la pelle usando tre cicli alternati di applicazione di soluzione antisettica (povidone-iodio) sulla pelle con una garza pulita e alcool al 70%. Scartare la garza dopo ogni utilizzo.
- Eseguire un'applicazione finale di una soluzione antisettica sulla pelle. Quindi, praticare un'incisione di 1-2 cm con forbici sterilizzate nella zona prossimale delle articolazioni e tenere la pelle aperta usando una pinza per esporre il deposito di grasso. Il WAT può essere trovato attaccato alla pelle su entrambi i lati, estendendosi dall'inizio sul retro e giù verso il testicolo.
NOTA: Utilizzare tende per evitare la contaminazione durante l'intervento chirurgico o le procedure di sutura. - Utilizzando una pinza, attraverso l'incisione, tirare delicatamente il deposito di grasso verso l'alto per assicurarsi che l'iniezione sia nella posizione e nella profondità corrette.
NOTA: Fare attenzione a non rimuovere il tessuto dalla sua posizione originale. - Riempire la siringa da microlitri (calibro: 33; stile puntuale: 4; angolo: 12; lunghezza: 10) (vedere Tabella dei materiali) con 2,5 μL (5,6 × 1010 genomi virali [VG]/μL) dell'AAV (contenente lo sgRNA che ha come bersaglio il gene endogeno Prdm16). Inserire con cautela l'ago con un angolo di 30°-45° nell'iWAT. Ripetere l'iniezione 5 volte in diverse posizioni del tessuto per infettare in modo omogeneo l'intero cuscinetto adiposo iWAT. Si raccomanda un volume totale di 15 μL per infettare l'iWAT.
NOTA: La profondità di inserimento della siringa dipende dallo spessore del deposito del cuscinetto adiposo. Utilizzare la tecnica no-touch per redigere l'iniezione. - Chiudere l'incisione cutanea rasata utilizzando punti di sutura monofilamento 4/0. Posizionare il mouse su un termoforo fino a quando la coscienza non viene riacquistata. Monitorare l'animale ogni 10-15 minuti fino a quando non si riprende completamente. Dopo che l'animale ha ripreso conoscenza, osservare il profilo locomotore, che dovrebbe essere lineare e non avere segni di angoscia o dolore.
- Eseguire il controllo del dolore postoperatorio entro 48 ore dopo l'intervento chirurgico somministrando tramadolo cloridrato (5 mg / kg) per via intraperitoneale per 3 giorni (2 volte / die).
NOTA: Osservare i segni di angoscia e disagio e monitorare l'assunzione di acqua e cibo. Somministrare una dose efficace di analgesico in modo preventivo, preferibilmente prima o all'inizio dell'intervento. - Tenere il topo in una gabbia con libero accesso al cibo e all'acqua durante il periodo di guarigione. Dopo il periodo di guarigione, procedere all'eutanasia del topo. In questo studio, l'eutanasia è stata eseguita da un sovradosaggio di anestetici iniettabili (intraperitoneali) da 3 volte la dose induttrice (300-360 mg / kg di ketamina cloridrato + 30-40 mg / kg di xilazina cloridrato) seguita da decapitazione.
NOTA: Si raccomanda vivamente di tenere gli animali alloggiati in gabbie individuali fino al completo recupero dall'anestesia.
5. Differenziazione in vitro di cellule vascolari stromali (SVF) in adipociti beige
- Eseguire l'isolamento e la placcatura di SVF primari dall'iWAT dei topi AdipoSPH secondo Aune et al.17. SVF da seme derivati da topi AdipoSPH iWAT in una piastra a 6 pozzetti contenente terreno completo (DMEM contenente 3,1 g/L di glucosio, 0,5 g/L di L-alanil-L-glutammina, 10% FBS e 2,5% P/S) per 1-2 ore.
NOTA: La frazione SVF contiene una miscela di diversi tipi di cellule. In questa fase, non è possibile definire il numero di cellule progenitrici seminate che danno origine agli adipociti. - Aspirare il substrato, lavare il pozzetto 2 volte utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) e sostituirlo con un mezzo completo fresco. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2, 95% di umidità fino a quando le cellule raggiungono il 70%-80% di confluenza.
- Indurre la differenziazione (giorno 0) trattando le cellule con il mezzo di induzione (Tabella 2).
NOTA: Il cocktail farmacologico del mezzo di induzione è necessario per migliorare la differenziazione degli adipociti beige e per l'espressione del programma genico termogenico17. - Dopo 2 giorni (giorno 2), sostituire il mezzo di induzione con il mezzo di mantenimento (Tabella 2).
- Dopo 2 giorni (giorno 4), sostituire il mezzo di mantenimento con un nuovo mezzo di mantenimento (Tabella 2) per 2 o 3 giorni.
- Cambiare il mezzo di mantenimento ogni 48 ore fino a quando i preadipociti non sono completamente differenziati in adipociti (tipicamente 6 giorni dopo l'aggiunta del mezzo di induzione). Gli adipociti maturi possono essere osservati usando la microscopia ottica, poiché le cellule differenziate sembrano essere cariche di goccioline lipidiche.
6. Infezione in vitro da AAV di SVF
NOTA: SVF derivati da topi AdipoSPH iWAT sono stati infettati con sgRNA-Prdm16 portatori di AAV come precedentemente descritto da Wang et al.18 con alcune modifiche.
- Far crescere le cellule su una piastra di coltura a 6 pozzetti con terreno completo fino a quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza, come precedentemente descritto nei passaggi 5.1-5.3.
- Mescolare 5,6 × 1010 VG/μL di sgRNA-Prdm16 portatori di AAV con 2 mL di terreno completo e bromuro di esadimetrina (8 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali). Trasduci le celle sostituendo il mezzo completo e aggiungendo il mezzo completo contenente AAV. Incubare le cellule trasdotte per 12 ore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2.
- Dividere e seminare le cellule come descritto nella fase 5 per la proliferazione cellulare e la differenziazione in adipociti beige.
NOTA: Per il saggio sul consumo di ossigeno, il seme 4.0 × 104 cellule (dal punto 6.2) per pozzetto con mezzo di induzione in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Le fasi successive della proliferazione e della differenziazione cellulare vengono eseguite come descritto nella fase 5. Il test del consumo di ossigeno viene eseguito quando le cellule raggiungono l'80% -100% di confluenza e sono completamente differenziate, come precedentemente riportato19.
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Representative Results
I topi AdipoSPH sono stati sviluppati allevando ceppi murini SPH e Adipoq-Cre. Entrambi i ceppi di topo erano in uno sfondo ibrido C57BL6J-DBA/2J (secondo il fornitore commerciale; vedi Tabella dei materiali). Il lignaggio dei topi SPH è stato originariamente descritto da Zhou et al.14.
Sviluppo di adipociti beige in vivo attraverso la sovraespressione di Prdm16 mediata da AdipoSPH
Per valutare la capacità del modello descritto in questo studio di sviluppare adipociti beige in vivo, l'AAV portatore del gene sgRNA targeting Prdm16 è stato iniettato nell'iWAT di topi AdipoSPH. Prdm16 è un fattore di trascrizione ben consolidato che determina lo sviluppo e la funzione degli adipociti beige20,21. È importante ricordare che qui abbiamo scelto uno sgRNA precedentemente testato e validato che ha come bersaglio il gene14 Prdm16 endogeno. AAV che trasporta uno sgRNA vuoto è stato usato come controllo. A 10 giorni dall'iniezione di AAV, iWAT è stato raccolto per analisi istologiche e di espressione genica (Figura 1A). Come previsto, le immagini di immunofluorescenza di iWAT da topi AdipoSPH hanno dimostrato l'espressione di dCas9 sia nel gruppo di controllo che in quello Prdm16 (Figura 1B). Inoltre, l'espressione di mCherry ha confermato il successo dell'infezione da AAV di iWAT sia nel gruppo di controllo che in quello Prdm16 (Figura 1B). L'espressione di Prdm16 indotta da SPH ha chiaramente indotto un accumulo diffuso di adipociti beige multiloculari in iWAT (Figura 1B). Inoltre, la PCR quantitativa (qPCR) ha rivelato un aumento dell'espressione di Prdm16 e del programma genico termogenico (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a e Cidea) nel gruppo Prdm16 rispetto al controllo (Figura 1C).
Promozione dello sviluppo di adipociti beige e miglioramento del consumo di ossigeno in vitro mediante la sovraespressione di Prdm16 mediata da AdipoSPH
Successivamente, è stata studiata l'idoneità di questo modello per lo studio della biologia degli adipociti beige in vitro . A tal fine, i preadipociti derivati dall'iWAT di topi AdipoSPH sono stati trasdotti con AAV che trasporta la sequenza di sgRNA che ha come bersaglio Prdm16. A sette giorni dalla differenziazione, gli adipociti beige sono stati utilizzati per l'analisi dell'espressione genica e del consumo di ossigeno (Figura 2A). Lo sgRNA vuoto è stato usato come controllo. Vale la pena notare che la rimozione del codone STOP da parte della CRE ricombinasi e l'attivazione del macchinario SPH erano sotto il controllo del promotore/potenziatore dell'adiponectina, con conseguente attivazione del gene endogeno Prdm16 negli adipociti maturi. L'analisi dell'espressione genica ha confermato l'aumentata espressione del gene endogeno Prdm16 e dei geni termogenici nel gruppo di sovraespressione Prdm16 rispetto al controllo (Figura 2B). Per confermare che gli adipociti beige indotti da SPH erano funzionalmente termogenici, è stato eseguito un saggio respirometrico ad alta risoluzione sugli adipociti primari. L'analisi e l'interpretazione dei dati respirometrici è stata eseguita come recentemente descritto22. L'espressione di Prdm16 indotta da SPH ha determinato un consumo basale e massimo di ossigeno superiore a quello delle cellule di controllo (Figura 2C). È importante sottolineare che i dati hanno indicato una maggiore respirazione disaccoppiata (oligomicina-insensibile) nel gruppo Prdm16 rispetto a quella nel gruppo di controllo (Figura 2C, Tabella 3). Nel loro insieme, questi risultati hanno rivelato che l'espressione indotta da SPH di Prdm16 endogeno ricapitola il fenotipo di imbrunimento e aumenta i tassi di consumo di ossigeno osservati nei topi Tg Prdm16 convenzionali.
Figura 1: Sviluppo di grasso beige mediante iniezione di virus adeno-associato (AAV) mirato al gene Prdm16 endogeno nel tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT) di topi AdipoSPH. (A) Illustrazione schematica del disegno sperimentale in vivo degli adipociti beige (creato utilizzando Biorender.com). (B) Immagini istologiche (colorazione con ematossilina ed eosina [H&E]) di iWAT. Barra di scala = 50 μm. (C) PCR quantitativa (qPCR) di Prdm16 e geni termogenici (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α e Cidea; n = 3). I dati sono presentati come media ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 per Prdm16 versus control (CTR) mediante il test t di Student spaiato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Differenziazione degli adipociti beige indotti da SPH mediante sovraespressione di Prdm16. (A) Illustrazione schematica del disegno sperimentale in vitro degli adipociti beige (creato utilizzando Biorender.com). (B) Espressione genica relativa di Prdm16 e geni termogenici (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α e Cidea; n = 3). (C) Tasso di consumo di ossigeno (OCR), n = 6. I dati sono presentati come media ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 per Prdm16 versus controllo (CTR) da (B) test t di Student spaiati e (C) anova a due vie ripetute, seguito dal test di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Sequenziamento Sanger dell'sgRNA Prdm16. (A) Illustrazione schematica che dimostra l'allineamento di oligonucleotidi complementari Prdm16 a singolo filamento. (B) Sequenziamento Sanger dello sgRNA Prdm16 utilizzando primer universale. Clicca qui per scaricare questo file.
| Gene | Specie | Inoltrare | Inverso | |||||
| Espressione genica | Prdm16 | topo | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| UCP1 | topo | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | topo | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | topo | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | topo | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTCCCCATTTCT | |||||
| 36B4 | topo | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Clonazione molecolare | sequenza sgRNA Prdm16 | topo | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| primer universale | topo | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate nello studio.
| Medio | Composizione | |||
| Supporto completo | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con L-Glutammina | |||
| 10% di siero bovino fetale (FBS) | ||||
| 2,5% di penicillina/streptomicina | ||||
| Mezzo di induzione | Supporto completo | |||
| Indometacina, concentrazione finale 125 μM (0,125 M stock in etanolo). NOTA: L'indometacina deve essere riscaldata a 90 °C per 10 secondi per essere sciolta. | ||||
| Insulina, concentrazione finale 20 nM (1 mM di stock, aggiungere 1 μL di HCl per solubilizzare (5,73 mg/ml). Conservare le scorte a -20 °C. | ||||
| Desametasone, concentrazione finale 2 μg/mL (2 mg/mL di materiale madre in etanolo) | ||||
| 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), concentrazione finale 500 μM (0,25 M stock in 0,5 M KOH ) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-tironina (T3), concentrazione finale 1 nM (10 μM di brodo, sciogliere T3 in 1 M HCl ed EtOH 1:4 in magazzino). | ||||
| Rosiglitazone, concentrazione finale 1 μg/mL (1 mg/mL di materiale madre in etanolo) | ||||
| Mezzi di manutenzione | Supporto completo | |||
| Insulina, concentrazione finale 20 nM (1 mM stock). Aggiungere 1 μL di HCl per solubilizzare (5,73 mg/ml). | ||||
| Rosiglitazone, concentrazione finale 1 μg/mL (1 mg/mL di materiale madre in etanolo) | ||||
Tabella 2: Composizione dei mezzi utilizzati nello studio.
| Parametri | CTR | PRDM16 | p-valore | ||
| Nessun consumo di ossigeno mitocondriale (pMoles/min/μg proteina) | 8.19 ± 1.40 | 10.80 ± 1.83 | 0.01 | ||
| Respirazione basale (pMoles/min/μg proteina) | 28.82 ± 5.20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Respirazione massima (pMoles/min/μg proteina) | 63.81 ± 9.80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Capacità respiratoria di riserva (pMoles/min/μg proteina) | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| Oligo insensibile (pMoles/min/μg proteina) | 8.27 ± 2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| Oligosensibile (pMoles/min/μg proteina) | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| Efficienza di accoppiamento | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| RCR cellulare | 7.70 ± 1.46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tabella 3: Parametri respiratori degli adipociti beige indotti da SPH.
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Discussion
Una delle applicazioni non-editing più utili della tecnologia CRISPR è l'interrogazione della funzione genica attraverso l'attivazione di geni endogeni utilizzando i sistemi CRISPRa6. SPH è un potente CRISPRa che è stato originariamente descritto per indurre la conversione degli astrociti in neuroni attivi prendendo di mira diversi geni neurogeni14. In questo studio, AdipoSPH ha dimostrato di essere uno strumento adatto per studiare la biologia del grasso beige attivando l'espressione di Prdm16 endogeno negli adipociti. La sovraespressione di Prdm16 indotta da SPH negli adipociti porta all'attivazione del programma genico termogenico e induce il fenotipo di brunimento, fenocopiando un precedente modello di topi Prdm16 transgenici (Tg) modello23. Prdm16 è stato scelto in questo studio come bersaglio per indurre adipociti beige sulla base del ruolo centrale di questo fattore di trascrizione nella regolazione della differenziazione del grasso bruno e beige, nonché della regolazione del programma genico termogenico (ad esempio, migliorando l'espressione di Ucp1) negli adipociti differenziati. Tuttavia, il modello attuale consente la sovraespressione di qualsiasi gene endogeno a discrezione dei ricercatori e lo scopo dello studio.
I modelli transgenici tradizionali che studiano la biologia del tessuto adiposo si basano sullo sviluppo di roditori geneticamente modificati che sovraesprimono un transgene sotto il controllo di un promotore/potenziatore limitato agli adipociti (ad esempio, Fabp4 o adiponectina)24. Sebbene la tecnologia attuale abbia accelerato il ritmo di sviluppo di questi modelli, i costi e i tempi per svilupparli sono ancora un problema comune vissuto dalla comunità scientifica. Al contrario, AdipoSPH è un modello più economico e più versatile per gli approcci gain-of-function rispetto ai topi Tg tradizionali. Inoltre, AdipoSPH è adatto per lo studio di lunghe isoforme di RNA e trascrizione non codificanti, che non sono particolarmente adatte per i modelli di topi Tg.
AdipoSPH presenta anche diversi vantaggi nello studio della biologia del tessuto adiposo rispetto alla semplice somministrazione di AAV, un approccio alternativo attuale per esperimenti di guadagno di funzione25. In primo luogo, l'AAV somministrato al tessuto adiposo promuove la sovraespressione introducendo diverse copie di un transgene. Al contrario, l'attivazione SPH dei geni endogeni rappresenta un meccanismo d'azione più naturale. In secondo luogo, i transgeni veicolati da AAV (utilizzando promotori costitutivi) normalmente provocano la loro sovraespressione in "qualsiasi tipo di cellula" all'interno del microambiente del tessuto adiposo. Al contrario, l'espressione dei geni endogeni indotta da AdipoSPH è limitata agli adipociti. In terzo luogo, la dimensione della confezione (~ 4,5 kb) è una limitazione tipica di AAV per alcuni transgeni26. Tuttavia, gli sgRNA portatori di AAV richiedono una strategia di clonazione semplice e facile per 20 nucleotidi personalizzati. Infine, la somministrazione di AAV raggiunge tipicamente la circolazione sistemica e infetta altri tessuti e organi. Sebbene alcuni AAV contengano microRNA per mitigare l'espressione di transgeni in particolari tessuti, come il fegato e il cuore25, questa strategia non può prevenire l'infezione da AAV in altri tessuti e organi. Al contrario, l'espressione di geni endogeni indotta da AdipoSPH è limitata agli adipociti, anche considerando una certa perdita di AAV nella circolazione sistemica. Pertanto, AdipoSPH è anche un modello adatto per la somministrazione sistemica di sgRNA portatori di AAV e lo studio della regolazione del tessuto adiposo dell'omeostasi energetica di tutto il corpo.
Sebbene il modello AdipoSPH offra alcuni vantaggi, ha limitazioni che sono importanti da considerare. AAV è attualmente la piattaforma più comune per la consegna in vivo di sgRNA. Tuttavia, alcune sfide nella produzione di AAV e problemi immunologici rimangono irrisolti26,27. Inoltre, diverse quantità e distribuzioni di AAV iniettato in tutto il tessuto adiposo determinano una variabilità intra- e inter-tissutale dell'espressione genica. Riteniamo che la clonazione del vettore sgRNA, la produzione di AAV e la somministrazione omogenea di AAV nell'iWAT siano passi critici per il successo di questo protocollo. Infine, diversi sgRNA attivano distintamente l'espressione di geni endogeni nel sistema SPH14. La raccomandazione principale è quella di progettare e testare da tre a cinque sequenze di sgRNA entro 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione (TSS) del gene di interesse. Pertanto, la definizione della migliore sequenza di sgRNA per un gene bersaglio richiede in genere laboriosi saggi in vitro prima degli esperimenti in vivo.
AdipoSPH è anche un modello interessante per studiare altri aspetti della biologia del tessuto adiposo. Ad esempio, gli adipociti promuovono la secrezione di numerose adipochine28,29; Tuttavia, gli effetti su tutto il corpo della maggior parte di queste molecole rimangono poco conosciuti. AdipoSPH è un modello adatto per affrontare questo problema sovraesprimendo geni endogeni singoli o multipli negli adipociti maturi e studiando i loro effetti locali o sistemici. Pertanto, AdipoSPH è uno strumento unico per studiare la biologia e la fisiologia del tessuto adiposo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il supporto ricevuto dal Centro Multidisciplinare para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, per la generazione di topi AdipoSPH, il Laboratorio di Inmmunometabolismo e Segnalazione Cellulare e l'Istituto Nazionale di Scienza e Tecnologia sulla Fotonica Applicata alla Biologia Cellulare (INFABIC) per tutto il supporto sperimentale. Ringraziamo il sostegno finanziario della Fondazione di ricerca di San Paolo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
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