Summary
여기에서 우리는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)의 스페로이드 형성을 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
어류 세포주는 생태 독성 평가를 위한 시험관 내 모델이 유망합니다. 그러나, 종래의 단층 배양 시스템(2D 배양)은 잘 알려진 한계(예를 들어, 배양 수명 및 일부 생체내 세포 기능의 유지)를 갖는다. 따라서, 스페로이드와 같은 3D 배양이 제안되었는데, 그 이유는 이러한 모델이 조직과 같은 구조를 재현할 수 있고, 생체 내 조건을 더 잘 재포착할 수 있기 때문이다. 이 기사에서는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)을 사용하여 스페로이드를 형성하기 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 둥근 바닥, 초저 부착, 96웰 플레이트에 세포를 도금하는 것으로 구성됩니다. 오비탈 쉐이킹(70 rpm) 하에서 5일 후, 웰 당 단일 스페로이드가 형성된다. 형성된 스페로이드는 안정적인 크기와 모양을 나타내며, 이 방법은 웰에서 여러 스페로이드가 형성되는 것을 방지합니다. 따라서 비슷한 크기의 스페로이드를 직접 고를 필요가 없습니다. 이 스페로이드 분석법의 용이성, 속도 및 재현성은 고처리량 in vitro 테스트에 유용합니다.
Introduction
스페로이드는 3D 배양에서 세포가 세포 간 밀접하게 접촉하여 배양될 때 형성되는 작은 세포 구체입니다. 생체 내 조직 환경을 모방하는 스페로이드의 능력은 이미 다양한 세포주와 일차 세포에서 연구되었습니다 1,2. 그러나, 스페로이드가 포유류 독성 연구를 위해 잘 개발되어 있지만, 비포유류 척추동물(예: 어류)을 이용한 독성 연구를 위한 스페로이드의 개발은 아직 진행 중이다3. 어류 세포주의 경우, 스페로이드는 다양한 유형의 웰 플레이트 (3,4,5,6,7)를 사용하는 궤도 쉐이킹 (orbital shaking, OS) 및 자성 나노 입자8를 이용한 자기 부상 방법(2)과 같은 다양한 방법으로 개발되었다. 그러나 스페로이드에 대한 이러한 배양 방법 중 일부는 다른 방법보다 더 많은 단점을 가질 수 있습니다.
예를 들어, 대형 마이크로플레이트(24웰 플레이트)의 선회 방법은 크기와 모양이 다른 많은 수의 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 실제로, 다중 스페로이드 구조 형성이 입증되었습니다7. 이를 위해서는 실험을 위해 비슷한 크기와 모양의 스페로이드를 직접 선택하려는 많은 노력이 필요합니다. 행드롭 3D 배양 방법은 포유 동물 세포주 1,2,9,10,11의 스페로이드를 생성하는데 통상적으로 사용되며, 이에 의해 한 방울 당 단일 스페로이드가 생성될 수 있어, 상술한 문제를 피할 수 있다. 그러나, 변형된 행잉 드롭 방법(행잉 드롭 + 오비탈 쉐이킹)은 저렴한 방법을 사용하여 ZFL 스페로이드를 생성할 수 있지만, 그 단점이 있다12. 형성된 세포 응집체는 방울에서 장기간 유지 될 수 없습니다. 따라서 우물 판으로 옮겨야합니다. 이 공정은 층류 후드에서 강렬한 취급과 장기간의 작업을 필요로 하는데, 이는 마이크로피펫(micropipette)(12)을 사용하여 적가(dropwise)하기 때문이다. 또한, 이 방법은 ZFL 스페로이드를 완전히 형성하는 데 10일이 걸립니다(행잉 드롭에서 5일 + OS에서 5일)12. 이러한 단점은 특히 화학적 우선 순위 지정 및 제품 지속 가능성에 대한 잠재적 응용 분야를 고려할 때 독성 테스트를 위한 3D 어류 스페로이드의 적용을 제한할 수 있습니다.
따라서 이 기사에서는 96웰, 초저부착 플레이트(ULA-plates) 및 궤도 쉐이커(회전 직경 22mm)의 조합을 기반으로 ZFL(D. rerio normal hepatocyte) 및 ZEM2S(D. rerio blastula phase embryo) 세포주의 단일 스페로이드를 생성할 수 있는 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 적용된 방법은 간단하고 재현 가능하며 단기간(5일)에 유사한 크기와 모양의 스페로이드를 대량으로 생성할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 산업계와 학계 모두에서 수생 독성 연구를 위한 어류 3D 모델의 적용과 생태 독성 테스트를 위한 대체 방법의 구현 진행을 지원할 수 있습니다.
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Protocol
둥근 바닥 96웰 플레이트에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 3D 스페로이드를 생성하는 주요 단계는 그림 1에 나와 있습니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용된 용액 및 배양 배지에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
1. 세포 배양 배지 및 단층 배양
- 두 세포주(ZFL, ZEM2S)를CO2 없이 28°C의 인큐베이터에서 단층으로 성장시키고 ~80% 합류에 도달하면 1:3의 계대배양 비율로 계대배양합니다.
- 위에서 설명한 대로 배양된 ~80% 합류점에서 제브라피쉬 세포의 T75 플라스크로 시작합니다.
- 완전한 배지를 제거하고, 피펫의 도움으로 배양 플라스크에 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(0.01 M)를 첨가하여 세포를 세척한다.
- 피펫을 사용하여 3mL의 1x 트립신-0.5mM EDTA(0.05%[v/v])를 배양 플라스크에 넣고 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 28°C에서 3분 동안 배양합니다.
- 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 방출한 다음 플라스크에 완전한 배양 배지 3mL를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다.
- 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15mL 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 펠렛 형성 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 사용중인 각 세포주 (ZFL 또는 ZEM2S)에 대한 완전한 배지 1mL를 첨가하고, 마이크로 피펫을 사용하여 재현탁한다. 세포 계수를 위해 부분 표본을 가져 가십시오.
2. 트리판 블루 염료 배제 테스트를 통한 세포 계수
- 세포 현탁액 10μL와 트리판 블루 염료 10μL를 마이크로튜브에 추가하여 세포 수를 세고 생존력을 평가합니다. 세포 현탁액을 혼합하고 피펫을 사용하여 염색합니다.
- 그런 다음 이 혼합물(세포 현탁액 + 트리판 블루) 10μL를 노이바우어 챔버로 옮기고 트리판 블루를 흡수하지 않는 세포를 생존 가능한 것으로 간주하여 챔버 모서리에 배치된 4개의 큰 사각형(사분면: Q)의 세포를 계수합니다. 방정식 (1)을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.
(1개) - 세포 현탁액의 최종 세포 수를 계산하려면 식 (1)을 사용하여 결정된 세포 번호에 2(트리판 블루 사용으로 인한 희석 계수)를 곱합니다.
알림: 또는 자동 세포 계수 시스템을 사용할 수 있습니다.
(1개)3. ULA 플레이트의 셀 도금
- 세포 수를 계산한 후, 세포 현탁액을 각 세포주에 필요한 세포 수로 96-웰 둥근 바닥 ULA 플레이트의 웰당 200 μL의 플레이트로 조정하고, 아래와 같이 한다.
- 플레이트 7,000 생존 가능한 ZFL 세포/웰; 따라서 전체 ULA 플레이트에 대해 20mL의 완전 배지에 700,000개의 세포를 사용합니다.
- 플레이트 3,500 생존 가능한 ZEM2S 세포/웰; 따라서 전체 ULA 플레이트에 대해 20mL의 완전 배지에 350,000개의 세포를 사용합니다.
- 배지 저장소에서 조정된 농도의 세포로 세포 현탁액을 준비하고 거품이나 기포가 형성되지 않도록 주의하면서 다채널 마이크로피펫을 사용하여 혼합합니다. 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 조정된 세포 현탁액 200μL를 ULA 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
알림: 플레이트는 96웰 플레이트에서 배양 배지가 증발하는 것을 방지하기 위해 파라필름 또는 접착 밀봉 호일로 밀봉해야 합니다.
4. 스페로이드 형성
- ULA 플레이트를 28°C 인큐베이터에서 5일 동안 70 rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션한다. 스페로이드가 5일 동안 궤도 흔들림을 통해 형성되도록 하여 평균 직경 ~225μm(ZFL 스페로이드) 및 직경 ~226μm(ZEM2S 스페로이드)에 도달합니다12.
참고: 5일간의 배양(최대 원형도) 후 스페로이드를 사용할 준비가 된 것입니다. - 스페로이드를 5일 이상 배양 상태로 유지하려면 5일마다 사용한 배지 100μL를 제거하고 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 신선하고 완전한 배양 배지 100μL를 추가합니다.
알림: 이 과정에서 스페로이드를 흡인하지 않도록 주의하십시오.
5. 스페로이드의 크기(직경)와 형상(원형지수) 측정
- 이미지를 획득합니다.
- 이미징 캡처 시스템이 있는 도립 광학 현미경에서 정의된 스케일의 이미지를 얻습니다.
참고: 현미경 사용 stage, 보정 슬라이드 또는 Neubauer 슬라이드(사분면 크기를 알고 있음)를 사용하여 스케일을 얻습니다. - 현미경으로 스케일 사진을 얻는 데 사용된 것과 동일한 대물 렌즈를 사용하여 완전히 형성된 스페로이드(즉, 5일 된 스페로이드)의 이미지를 얻습니다.
참고: 이미지 해상도는 스페로이드의 크기와 모양을 결정하는 데 중요하며 시스템 유형에 따라 다를 수 있으므로 모든 이미지는 동일한 이미징 캡처 시스템을 사용하여 촬영해야 합니다.
- 이미징 캡처 시스템이 있는 도립 광학 현미경에서 정의된 스케일의 이미지를 얻습니다.
- 스케일을 설정합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정의된 스케일의 이미지를 엽니다( 파일 | 열기 클릭).
- 도구 모음에서 직선 선택기 를 선택하고 마우스를 사용하여 이미지에서 정의된 비율의 확장을 가로질러 선을 끕니다.
- Analyze(분석) | 배율을 설정하고 배율 설정 창이 열릴 때까지 기다립니다.
- 배율 설정 창에서 알려진 거리의 공백을 직선에 해당하는 알려진 거리(μm)로 채웁니다. 길이 단위를 μm의 UM으로 채웁니다. 확인을 클릭합니다.
참고: 픽셀/μm 단위의 배율은 창 하단에 표시됩니다.
- 측정 매개변수를 설정합니다.
- ImageJ 소프트웨어에서 분석 | 측정값 설정 - 측정값 설정 창을 엽니다.
- Set measurements(측정 설정) 창에서 원하는 측정에 대한 상자(예: Area 및 Shape 설명자)를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
- 스페로이드의 지름과 원형도를 구합니다.
- 스페로이드 그림 열기(파일 | 열기).
- 도구 모음에서 자유형 선택 도구를 선택하고 그림 3A와 같이 마우스를 사용하여 스페로이드의 바깥쪽을 선택합니다.
참고: 이미지를 확대 또는 축소하려면 Ctrl 키를 누르고 마우스를 사용하여 아래 또는 위로 스크롤하거나 Ctrl 키를 누르고 키보드의 위쪽 또는 아래쪽 화살표 키를 사용합니다. - 분석 | 측정을 클릭하여 측정값이 표시되는 결과 창을 엽니다.
- 면적 값을 사용하여 방정식 (2)를 사용하여 스페로이드의 크기(직경)를 계산합니다.
(2개) - 순환성 지수는 결과 창에 "Circ."로 표시되며 방정식 (3)을 사용하여 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다.
(3)
참고: 원형도 지수 1.0은 완벽한 구상 형상을 나타내고, 값이 0.0에 가까울수록 길쭉한 형상을 나타낸다13.
(2개)
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Representative Results
안정된 크기 및 형상을 갖는 웰 당 단일 스페로이드가 이 방법에 의해 형성된다. 그림 2는 궤도 진탕(70rpm) 하에서 ULA 플레이트의 웰에서 ZFL 및 ZEM2S 세포의 단일 스페로이드 형성 과정을 보여줍니다. ZFL 및 ZEM2S 세포주는 3D 배양에서 서로 다른 거동을 보입니다. ZEM2S 세포주는 궤도 진탕 첫날부터 구상 모양을 쉽게 형성할 수 있는 능력을 부여하는 특징을 나타내는 반면(그림 2E), ZFL 세포주는 원하는 구상 모양에 도달하는 데 5일이 걸립니다(그림 2A-C). 이 방법으로 생성된 스페로이드는 그림 2D(16일령 ZFL 스페로이드) 및 그림 2H(10일령 ZEM2S 스페로이드)에서 입증된 바와 같이 더 긴 배양 기간(기간 >5일)에서도 형태 측면에서 안정성을 보여주었습니다. 스페로이드의 직경과 원형도는 과학적 이미지13을 처리하고 분석하기 위한 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지에서 투영된 영역을 측정하여 결정되었습니다(그림 3). 재료 표는 이미지 처리 및 분석에 사용되는 소프트웨어를 나타냅니다. ZFL 세포는 안와 진탕 첫날에 큰 세포 응집체(평균 크기 319 ± 23.33 μm)를 형성하는 경향이 있으며, 이는 5일째(225.62 ± 19.20 μm)까지 시간이 지남에 따라 감소하며(그림 4A), 배양에서 시간이 지남에 따라 원형성을 향상시킵니다(그림 4B). ZFL 세포와 달리 ZEM2S 세포주는 첫날(202.64 ± 5.78 μm)부터 작은 스페로이드를 형성하며, 이는 5일째(226.63 ± 4.80 μm)까지 점진적으로 증가합니다(그림 4C). 도 4E는 3D 배양에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 상이한 성장 패턴을 보여준다. ZFL 및 ZEM2S 스페로이드는 더 높은 스페로이드 모양(각각 0.80 ± 0.01 및 0.83 ± 0.00)에 도달하기 때문에 5일째에 사용하는 것이 좋습니다(그림 4B, D), 이는 이 3D 모델의 안정성이 더 높음을 나타냅니다.
그림 1: 둥근 바닥 96웰 플레이트에서 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 3D 스페로이드를 생성하는 주요 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 궤도 진탕 하에 둥근 바닥 96웰 ULA 플레이트에 형성된 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 단일 스페로이드. ZFL 세포 응집체는 OS(A)의 첫날에 형성됩니다. 세포 응집체는 3일째(B)에 원형성을 증가시키고 5일째(C)에 적절한 구상 모양에 도달합니다. (D) ULA 플레이트의 16일 된 ZFL 스페로이드. ZEM2S 세포주는 OS(E)의 첫날부터 스페로이드를 형성합니다. ZEM2S 스페로이드는 3일째(F)에 모양을 유지하고 크기가 증가하며, 5일째(G)에 최대 원형도에 도달합니다. (H) ULA 플레이트에 담긴 10일 된 ZEM2S 스페로이드. 스케일 바 = 100 μm. 약어: OS = 궤도 흔들림; ULA = 초저 부착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 과학 이미지 처리 및 분석을 위한 소프트웨어를 사용하여 스페로이드의 크기와 원형도를 결정합니다. 알려진 스케일을 기반으로 선택한 영역을 측정하도록 소프트웨어를 설정한 후 스페로이드의 바깥쪽을 선택하여 면적과 원형도(A)를 결정합니다. 스페로이드의 면적은 지름 d를 계산하여 크기를 결정하는 데 사용되며, 소프트웨어는 선택한 면적과 둘레를 사용하는 공식(B)으로 스페로이드의 원형도를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 균일한 크기의 스페로이드(직경)와 원형도(스페로이드 모양)로 나타난 3D 스페로이드 방법의 재현성. ZFL(A) 및 ZEM2S(B) 세포주의 스페로이드 크기를 측정했습니다. ZFL(C) 및 ZEM2S(D) 스페로이드의 측정된 원형도 지수. ZFL 및 ZEM2S 스페로이드의 성장 패턴(E). 데이터는 서로 다른 셀 배치의 세 가지 기술 복제를 나타냅니다. 각 점 위의 숫자는 1일, 3일, 5일에 대한 삼중의 평균을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n=10)로 표시되었습니다. 이 수치는 Souza et al.12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 두 가지 회전 속도(70rpm 및 100rpm)에서 수행된 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드 형성 간의 비교. ZFL 스페로이드(A) 및 ZEM2S 스페로이드(B)는 100rpm에서 5일간의 오비탈 쉐이킹 후에 형성되었다(스케일 바는 100μm를 나타냄). ZFL 스페로이드(C)와 ZEM2S 스페로이드(D)의 성장 패턴은 70 및 100rpm에서 형성되었습니다. 70 및 100rpm에서 형성된 ZFL 스페로이드(E) 및 ZEM2S 스페로이드(F)의 원형도 지수. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n=10)로 나타내었다. *통계적 유의성을 나타냅니다(p < 0.05). NS: 70 및 100 rpm에서 5일째에 형성된 스페로이드 간의 유의하지 않은 차이(T-검정). 이 수치는 Souza et al.12에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 둥근 바닥 초저 부착 웰 플레이트에서 궤도 흔들림에 의해 형성된 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드(5일 전)의 세포 무결성 및 생존성. Lectin Alexa Fluor 594(빨간색)에 의한 세포막 염색과 DAPI(파란색)에 의한 핵은 ZEM2S 스페로이드(A) 및 ZFL 스페로이드(B)의 코어에서 세포 무결성을 입증합니다. Alamarblue의 감소에 의해 형성된 레조루핀(빨간색)의 형광은 ZEM2S(C) 및 ZFL(D) 스페로이드의 코어에서 생존 가능한 세포를 보여줍니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처한 직교면을 나타냅니다. ZEM2S(E) 및 ZFL 세포주(F)의 3D 배양(스페로이드) 및 2D 배양에서의 MTT 생존율 분석. 데이터는 570 nm에서 측정된 흡광도의 평균± 표준편차로 나타났다. ns: Welch의 t-검정에 의한 유의하지 않은 차이. 이 수치는 Souza et al. (2021)12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: ZFL 및 ZEM2S 재배를 위한 솔루션. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 단일 ZFL 스페로이드를 형성하는 데 사용된 3D 스페로이드 분석법 비교. * 테스트 된 매개 변수에 대한 최상의 결과. ᅡ 선택된 파라미터는 종래의 행잉 드롭 방법에서 검증된 최상의 결과이다. b 궤도 쉐이킹으로 물고기 스페로이드를 형성하기 위해 Baron et al.3 에서 선택한 매개변수. c 테스트된 매개변수에 동일하게 적합한 변형. 약어: HD = 행잉 드롭; OS = 궤도 흔들림; ULA = 초저 부착; 폴리-HEMA = 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트). 이 표는 Souza et al.12에서 수정되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이것은 제브라피쉬 간 및 배아 세포주의 스페로이드를 생성하기 위한 간단하고 쉽고 빠른 방법입니다. 이 방법은 스페로이드 형성과 관련된 과학적 연구에서 보고된 문제와 3D 스페로이드 분석의 데이터 정확도 불확실성을 극복하기 위해 기존 3D 스페로이드 방법을 수정하여 개발했습니다. 예를 들어, 보고된 문제는 취급의 어려움, 스페로이드 생성의 시간 소모적인 특성, 분석을 수행하기 위해 유사한 크기 및 모양의 스페로이드를 선택해야 하는 필요성, 행잉 드롭 방법 3,7,12에서 스페로이드를 드롭에서 마이크로플레이트로 옮기는 과정의 어려움에 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 CO2가 없는 조건에서 ZFL 및ZEM2S 세포주의 배양을 권장합니다. 두 세포주 모두에 대해 이러한 프로토콜에서 제안된 배양 배지 조성 및CO2 없는 환경은 문헌에 널리 보고되어 있다. ZFL 세포주는 일반적으로 중탄산나트륨을 첨가하거나 첨가하지 않고CO2 14,15,16,17,18,19,20을 함유하거나 첨가하지 않고 L-15 및 RPMI 배지에서 배양한다. ZEM2S 세포주는 생물 자원 센터의 지시에 따라 배양되고, 그 배양 배지는CO2가 없는 배양을 위해 제형화되었습니다. 따라서,CO2 및 공기 혼합물은 이러한 유형의 배양 배지(21)를 사용할 때 세포에 해로울 수 있다.
본 어류 스페로이드 프로토콜은 ZFL 스페로이드를 형성하기 위한 최상의 파라미터를 결정하기 위해 여러 파라미터(즉, 다양한 세포 밀도, 궤도 흔들림 속도[70 또는 100 rpm], 다양한 96웰 플레이트[평평한 바닥 또는 둥근 바닥])를 평가한 후 개발되었습니다. 또한, 다른 3D 배양 방법(즉, 행잉 드롭 방법 및 오비탈 쉐이킹 방법과 결합된 행잉 드롭 방법)과의 비교가 이루어졌으며, 이는 둥근 바닥 ULA 플레이트의 오비탈 쉐이킹이 최고의 성능(즉, 쉽고, 빠르고, 재현 가능한 방법)을 가짐을 나타냅니다. 표 2 는 ZFL 스페로이드를 형성하기 위해 평가된 다른 3D 배양 방법의 파라미터와 성능을 보여줍니다.
둥근 바닥 ULA 플레이트는 이미 원심분리22 또는 안와 진탕23,24에 이어 인간 세포의 단일 스페로이드를 형성하는 것으로 보고되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 제브라피쉬 세포주의 단일 스페로이드(즉, 96웰 플레이트의 웰당 하나의 스페로이드)를 생성하기 위해 궤도 진탕 하에서 동일한 플레이트의 사용을 제안합니다. 이는 많은 양의 스페로이드를 쉽고 빠르게 형성할 수 있고, 형성된 스페로이드를 동일한 플레이트에서 배양 상태로 유지할 수 있기 때문에 특히 유리합니다. 따라서 화학 물질 노출은 ULA 플레이트에서 직접 수행하여 다양한 유형의 독성 분석을 수행 할 수 있습니다.
ZFL 및 ZEM2S 스페로이드를 형성하기 위한 적절한 궤도 흔들림 속도를 결정하기 위해 70rpm과 100rpm에서 스페로이드의 형성을 비교했습니다. 결과는 이 방법이 70rpm에서 더 잘 수행되고 더 높은 회전 속도가 ZEM2S 스페로이드의 크기와 모양에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다(그림 5D,F). ZFL 스페로이드는 이러한 회전 속도에서 크기와 모양에 큰 차이를 나타내지 않았습니다. 그러나 100rpm에서 더 낮은 원형도 지수가 얻어져 더 높은 회전 속도에서 구상 모양에 부정적인 영향을 미쳤습니다(그림 5C, E).
3,500개의 ZEM2S 세포와 7,000개의 ZFL 세포의 초기 세포 밀도는 배양 5일째(각각 226.63μm 및 225.62μm)에 유사한 크기의 스페로이드를 생성합니다. 산소와 영양분이 스페로이드25의 확산에 의해 운반된다는 점을 감안할 때, 그 직경은 스페로이드 코어의 영양과 세포 무결성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로 괴사를 피하기 위해 최대 100μm의 스페로이드를 사용하는 것이 좋습니다26. 스페로이드 코어의 세포 무결성을 검증하기 위해 컨포칼 현미경으로 DAPI와 Lectin Alexa Fluor 594로 면역염색하여 핵 및 막 무결성을 평가했으며(그림 6A, B) 스페로이드의 무결성을 입증했습니다. 스페로이드 코어의 세포 생존력은 또한 스페로이드를 레사주린(Alamarblue)에 노출시키고 컨포칼 현미경으로 레소루핀의 형광을 분석하여 검증되었습니다(그림 6C,D). 세포가 생존 할 때, resazurin은 세포 대사 기능에 의해 resorufin (형광 물질)으로 환원됩니다. MTT 분석의 성능은 또한 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드와 단층 배양(2D 배양)을 비교하여 세포 생존율에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다(그림 6E, F). 스페로이드가 100μm보다 크지만, 결과는 이 프로토콜이 내부 부분에서도 적절한 영양을 섭취하는 ZFL 및 ZEM2S 세포주의 생존 가능한 스페로이드를 생성한다는 것을 보여줍니다.
ZFL 및 ZEM2S 세포의 세포 밀도와 이 프로토콜에 적용된 궤도 진탕 속도는 웰 간의 변동성이 낮고 크기와 모양이 매우 안정적인 스페로이드를 형성할 수 있게 하여(그림 4) 분석을 수행하는 이전 단계로 적절한 스페로이드를 선택할 필요가 없습니다. 분석 절차에서 스페로이드를 다른 플레이트 또는 튜브/마이크로튜브로 옮겨야 하는 경우 분해 문제 없이 마이크로피펫으로 쉽게 옮길 수 있습니다.
여기에서는 실행 가능한 ZFL 및 ZEM2S 스페로이드를 형성하기 위한 최상의 매개변수를 기반으로 개발된 프로토콜을 시연했습니다. ZFL 및 ZEM2S 세포주는 어류 23,24,27,28,29,30에 대한 화학적 영향을 추정하기 위한 수생 독성 시험에 유용할 수 있습니다. 또한, 발달 종점은 다능성28을 유지하는 ZEM2S 세포주(모반세포기의 섬유아세포)와 같은 어류 배아 세포주를 사용하여 연구할 수도 있습니다. 이로 인해 이러한 제브라피쉬 스페로이드는 물고기 독성 테스트에 잠재적으로 유용할 수 있습니다. 또한 쉬운 어류 스페로이드 방법으로 고처리량 생태 독성 테스트에 사용할 수 있어 산업 및 학계에서의 적용을 지원합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticário의 재정 지원에 대해 생리학 부서 (UFPR)의 다중 사용자 실험실에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
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