Summary
هنا ، نقدم بروتوكول ثقافة 3D فعال وسهل وسريع لتشكيل كرويات من خطين خلويين من الزرد (Danio rerio): ZEM2S (الجنين) و ZFL (خلايا الكبد الطبيعية).
Abstract
تعتبر خطوط الخلايا السمكية نماذج مخبرية واعدة لتقييم السمية الإيكولوجية. ومع ذلك ، فإن أنظمة الاستزراع أحادية الطبقة التقليدية (ثقافة 2D) لها قيود معروفة (على سبيل المثال ، طول عمر الثقافة والحفاظ على بعضها في الوظائف الخلوية في الجسم الحي ). وهكذا ، تم اقتراح ثقافات 3D ، مثل الكروية ، لأن هذه النماذج يمكنها إعادة إنتاج الهياكل الشبيهة بالأنسجة ، واستعادة الظروف في الجسم الحي بشكل أفضل. توضح هذه المقالة بروتوكول ثقافة 3D فعال وسهل وسريع لتشكيل كرويات مع اثنين من خطوط خلايا الزرد (Danio rerio): ZEM2S (الجنين) و ZFL (خلايا الكبد الطبيعية). يتكون البروتوكول من طلاء الخلايا في لوحة مستديرة القاع ، منخفضة للغاية ، 96 بئرا. بعد 5 أيام تحت الاهتزاز المداري (70 دورة في الدقيقة) ، يتم تشكيل كروي واحد لكل بئر. تقدم الأجسام الكروية المشكلة حجما وشكلا ثابتين ، وتتجنب هذه الطريقة تكوين كرويات متعددة في البئر ؛ وبالتالي ، ليس من الضروري اختيار كرويات ذات أحجام مماثلة. إن سهولة وسرعة وقابلية استنساخ هذه الطريقة الكروية تجعلها مفيدة للاختبارات عالية الإنتاجية في المختبر .
Introduction
الكرويات هي كرات صغيرة من الخلايا تتشكل عندما يتم استزراع الخلايا في اتصال وثيق من خلية إلى خلية في ثقافة 3D. تمت بالفعل دراسة قدرة الكائنات الكروية على تقليد بيئة الأنسجة في الجسم الحي في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا والخلايا الأولية 1,2. ومع ذلك ، على الرغم من أن الكرويات متطورة بشكل جيد لدراسات سمية الثدييات ، إلا أن تطوير الكرويات لدراسات السمية مع الفقاريات غير الثديية (مثل الأسماك) لا يزال جاريا3. بالنسبة لخطوط خلايا الأسماك ، تم تطوير كرويات من خلال مجموعة متنوعة من الطرق المختلفة ، مثل الاهتزاز المداري (OS) باستخدام أنواع مختلفة من ألواح الآبار3،4،5،6،7 ، وطريقة الرفع المغناطيسي باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية8. ومع ذلك ، قد يكون لبعض طرق الاستزراع هذه للكرويات عيوب أكثر من غيرها.
على سبيل المثال ، قد تولد الطرق الدورانية في الألواح الدقيقة الكبيرة (24 صفيحة بئر) عددا كبيرا من الأجسام الكروية التي تختلف في الحجم والشكل ؛ في الواقع ، تم إثبات تكوين هيكل متعدد كروي7. وهذا يتطلب جهودا مكثفة لاختيار كرويات ذات حجم وشكل مماثلين للتجربة. تستخدم طريقة ثقافة 3D المعلقة بشكل شائع لتوليد كرويات من خطوط خلايا الثدييات1،2،9،10،11 ، حيث يمكن إنشاء كرويات مفردة لكل قطرة ، وتجنب المشاكل الموضحة أعلاه. ومع ذلك ، على الرغم من أن طريقة الإسقاط المعلقة المعدلة (قطرة معلقة + اهتزاز مداري) قادرة على توليد كرويات ZFL باستخدام طريقة غير مكلفة ، إلا أن لها عيوبها12. لا يمكن الحفاظ على المجاميع الخلوية المتكونة لفترات طويلة في القطرات. وبالتالي ، يجب نقلها إلى لوحات الآبار. تتطلب هذه العملية معالجة مكثفة وفترات طويلة من العمل في غطاء التدفق الصفحي ، حيث يتم تنفيذها بالتنقيط باستخدام micropipette12. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب هذه الطريقة 10 أيام لتشكيل كرويات ZFL بالكامل (5 أيام في قطرة معلقة + 5 أيام في نظام التشغيل)12. هذه العيوب يمكن أن تحد من تطبيق كرويات الأسماك 3D لاختبار السمية ، لا سيما بالنظر إلى التطبيقات المحتملة لتحديد الأولويات الكيميائية واستدامة المنتج.
وبالتالي ، تصف هذه المقالة بروتوكول ثقافة 3D قادر على توليد كرويات مفردة من خطوط خلايا ZFL (D. rerio normal hepatocyte) و ZEM2S (جنين مرحلة D. rerio blastula) بناء على الاستخدام المشترك ل 96 بئرا ، لوحات ربط منخفضة للغاية (لوحات ULA) وشاكر مداري (قطر دوران 22 مم). الطريقة المطبقة بسيطة وقابلة للتكرار ، ويمكن أن تولد أعدادا كبيرة من الأجسام الكروية ذات الحجم والشكل المماثل في فترة قصيرة (5 أيام). يمكن أن تدعم مزايا هذه الطريقة تطبيق نماذج الأسماك 3D لدراسات السمية المائية في كل من الصناعة والأوساط الأكاديمية ، وكذلك التقدم المحرز في تنفيذ طرق بديلة لاختبار السمية البيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم عرض الخطوات الرئيسية لتوليد كرويات ثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا ZFL و ZEM2S في لوحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا في الشكل 1.
ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول والجدول 1 للحلول ووسائط الثقافة المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. ثقافة الخلية الثقافات المتوسطة وأحادية الطبقة
- قم بزراعة كلا خطي الخلايا (ZFL ، ZEM2S) كطبقة أحادية في حاضنة عند 28 درجة مئوية بدون CO2 ، واستزراعهما بنسبة زراعة فرعية تبلغ 1: 3 عندما يصلان إلى التقاء ~ 80٪.
- ابدأ بقارورة T75 من خلايا الزرد عند التقاء ~ 80٪ ، مستزرعة كما هو موضح أعلاه.
- قم بإزالة الوسط الكامل واغسل الخلايا بإضافة 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (0.01 م) إلى دورق الاستزراع بمساعدة ماصة.
- بمساعدة ماصة ، أضف 3 مل من 1x trypsin-0.5 mM EDTA (0.05٪ [v / v]) إلى قوارير الاستزراع ، واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا عن القارورة.
- اضغط برفق على القارورة لتحرير الخلايا ، ثم أوقف هضم التربسين بإضافة 3 مل من وسط الاستزراع الكامل إلى القارورة.
- باستخدام ماصة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
- بعد تكوين الحبيبات ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأضف 1 مل من الوسط الكامل لخط الخلية المعني المستخدم (ZFL أو ZEM2S) ، وأعد التعليق باستخدام ماصة ميكروية. خذ قسمة لحساب الخلايا.
2. عد الخلايا مع اختبار استبعاد صبغة التريبان الزرقاء
- أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية و 10 ميكرولتر من صبغة التريبان الزرقاء إلى أنبوب دقيق لحساب الخلايا وتقييم صلاحيتها. امزج تعليق الخلية وصبغها باستخدام ماصة.
- بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولتر من هذا الخليط (تعليق الخلية + تريبان الأزرق) إلى غرفة نيوباور وعد الخلايا في المربعات الأربعة الكبيرة (الأرباع: Q) الموضوعة في زوايا الغرفة ، مع الأخذ في الاعتبار الخلايا التي لا تمتص التريبان الأزرق قابلة للحياة. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام المعادلة (1):
(1) - لحساب رقم الخلية النهائي في تعليق الخلية ، اضرب رقم الخلية المحدد باستخدام المعادلة (1) في 2 (عامل التخفيف بسبب استخدام تريبان الأزرق).
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نظام عد الخلايا الآلي.
(1)3. طلاء الخلية في لوحات ULA
- بعد حساب رقم الخلية ، اضبط تعليق الخلية على لوحة 200 ميكرولتر من هذا التعليق لكل بئر من لوحة ULA ذات القاع المستدير ذات 96 بئرا مع عدد الخلايا المطلوبة لكل خط خلية ، كما هو موضح أدناه:
- لوحة 7000 خلية ZFL قابلة للحياة / بئر ؛ وبالتالي ، بالنسبة للوحة ULA بأكملها ، استخدم 700000 خلية في 20 مل من الوسط الكامل.
- لوحة 3500 خلية ZEM2S قابلة للحياة / بئر ؛ وبالتالي ، بالنسبة للوحة ULA بأكملها ، استخدم 350000 خلية في 20 مل من الوسط الكامل.
- قم بإعداد تعليق الخلية بالتركيز المعدل للخلايا في خزان متوسط واخلطه باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات ، مع الحرص على عدم تكوين رغوة أو فقاعات. باستخدام الماصة الدقيقة متعددة القنوات ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المعدل إلى كل بئر من لوحة ULA.
ملاحظة: يجب أن تكون اللوحة مختومة ببارافيلم أو رقائق لاصقة مانعة للتسرب لتجنب تبخر وسط الاستزراع من لوحة 96 بئرا.
4. تشكيل كروي
- احتضان لوحة ULA على شاكر مداري عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 5 أيام في حاضنة 28 درجة مئوية. اسمح للكرويات بالتشكل على مدار 5 أيام من الاهتزاز المداري (الشكل 2) ، ليصل متوسط حجمها ~ 225 ميكرومتر في القطر (كرويات ZFL) وقطر ~ 226 ميكرومتر (كرويات ZEM2S)12.
ملاحظة: بعد 5 أيام من الحضانة (أقصى دائرية) ، تكون الأجسام الكروية جاهزة للاستخدام. - للحفاظ على الكرويات في الاستزراع لأكثر من 5 أيام ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط المستهلك كل 5 أيام ، وأضف 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الطازج باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات.
ملاحظة: احرص على عدم استنشاق الأجسام الكروية أثناء هذه العملية.
5. قياس الحجم (القطر) والشكل (مؤشر دائري) من كرويات
- الحصول على الصور.
- تحت مجهر ضوئي مقلوب مع نظام التقاط التصوير ، احصل على صورة بمقياس محدد.
ملاحظة: استخدم شريحة معايرة مرحلة المجهر أو شريحة Neubauer (التي تعرف فيها أحجام الربع) للحصول على المقياس. - تحت المجهر وباستخدام نفس العدسة الموضوعية المستخدمة للحصول على صورة المقياس ، احصل على صور للكرويات المشكلة بالكامل (أي كرويات عمرها 5 أيام).
ملاحظة: يجب التقاط جميع الصور باستخدام نفس نظام التقاط التصوير، حيث أن دقة الصورة مهمة لتحديد حجم وشكل الأجسام الكروية، وقد تختلف بين أنواع الأنظمة.
- تحت مجهر ضوئي مقلوب مع نظام التقاط التصوير ، احصل على صورة بمقياس محدد.
- اضبط المقياس.
- باستخدام برنامج ImageJ ، افتح صورة المقياس المحدد (انقر فوق ملف | فتح).
- حدد محدد الخط المستقيم من شريط الأدوات، وباستخدام الماوس، اسحب خطا للخارج عبر امتداد المقياس المحدد في الصورة.
- اضبط المقياس عن طريق تحديد تحليل | اضبط المقياس، وانتظر حتى تفتح نافذة تعيين المقياس .
- في نافذة Set Scale ، املأ فراغ المسافة المعروفة بالمسافة المعروفة (μm) المقابلة للخط المستقيم ؛ املأ وحدة الطول ب um ل μm. انقر فوق موافق.
ملاحظة: يتم عرض المقياس بالبكسل/ميكرومتر في أسفل النافذة.
- اضبط معلمات القياس.
- في برنامج ImageJ، حدد تحليل | تعيين القياسات لفتح نافذة تعيين القياسات .
- في نافذة تعيين القياسات، حدد مربعات القياسات المطلوبة (على سبيل المثال، واصفات المساحة والشكل). انقر فوق موافق.
- الحصول على قطر الكرويات ودائريتها.
- افتح صورة كروية (ملف | فتح).
- حدد أداة التحديد اليدوي في شريط الأدوات ، وباستخدام الماوس ، حدد الجانب الخارجي للكروية ، كما هو موضح في الشكل 3 أ.
ملاحظة: لتكبير الصورة أو تصغيرها، اضغط على المفتاح Ctrl واستخدم الماوس للتمرير لأسفل أو لأعلى، أو اضغط على المفتاح Ctrl واستخدم مفتاحي الأسهم لأعلى أو لأسفل على لوحة المفاتيح. - حدد تحليل | قياس لفتح نافذة النتائج ، حيث يتم عرض القيم المقاسة.
- باستخدام قيمة المساحة ، احسب حجم (قطر) الأجسام الكروية باستخدام المعادلة (2):
(2) - يتم إعطاء مؤشر التدوير في نافذة النتائج ك "Circ." ، ويتم حسابه تلقائيا بواسطة البرنامج باستخدام المعادلة (3):
(3)
ملاحظة: يمثل مؤشر الدوران 1.0 شكلا كرويا مثاليا ، بينما تشير القيمة القريبة من 0.0 إلى شكل ممدود13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تشكيل كرويات واحدة لكل بئر مع حجم وشكل ثابت بهذه الطريقة. يوضح الشكل 2 عملية تكوين كرويات مفردة لخلايا ZFL و ZEM2S في بئر صفيحة ULA تحت الاهتزاز المداري (70 دورة في الدقيقة). خطوط الخلايا ZFL و ZEM2S لها سلوكيات مختلفة في ثقافة 3D. يقدم خط خلية ZEM2S ميزات تمنح القدرة على تكوين شكل كروي بسهولة منذ اليوم الأول من الاهتزاز المداري (الشكل 2E) ، بينما يتطلب خط خلية ZFL 5 أيام للوصول إلى الشكل الكروي المرغوب فيه (الشكل 2A-C). أظهرت الكرويات الناتجة عن هذه الطريقة أيضا ثباتا من حيث الشكل في فترات أطول من الثقافة (فترات >5 أيام) ، كما هو موضح في الشكل 2D (كروي ZFL عمره 16 يوما) والشكل 2H (كروي ZEM2S عمره 10 أيام). تم تحديد قطر الكرويات ودائريتها عن طريق قياس مساحتها المسقطة في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج لمعالجة وتحليل الصور العلمية13 (الشكل 3). يشير جدول المواد إلى البرنامج المستخدم لمعالجة الصور وتحليلها. تميل خلايا ZFL إلى تكوين مجاميع خلايا كبيرة (متوسط الحجم 319 ± 23.33 ميكرومتر) في اليوم الأول من الاهتزاز المداري ، والذي يتناقص بمرور الوقت حتى اليوم 5 (225.62 ± 19.20 ميكرومتر) (الشكل 4 أ) ، مما يعزز الدائرية بمرور الوقت في الثقافة (الشكل 4 ب). على عكس خلايا ZFL ، يشكل خط خلايا ZEM2S كرويات صغيرة من اليوم الأول (202.64 ± 5.78 ميكرومتر) ، والتي تزداد تدريجيا حتى اليوم الخامس (226.63 ± 4.80 ميكرومتر) (الشكل 4C). يوضح الشكل 4E أنماط النمو المختلفة في خطوط خلايا ZFL و ZEM2S في ثقافة ثلاثية الأبعاد. نوصي باستخدام كرويات ZFL و ZEM2S في اليوم الخامس لأنها تصل إلى شكل كروي أعلى (مؤشر دائري 0.80 ± 0.01 و 0.83 ± 0.00 ، على التوالي) (الشكل 4B ، D) ، مما يشير إلى استقرار أكبر لهذا النموذج ثلاثي الأبعاد.
الشكل 1: الخطوات الرئيسية لتوليد كرويات ثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا ZFL و ZEM2S في صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: كرويات مفردة من خطوط خلايا ZFL و ZEM2S تشكلت في صفائح ULA مستديرة القاع ذات 96 بئرا تحت الاهتزاز المداري. يتم تشكيل تجميع خلية ZFL في اليوم الأول من نظام التشغيل (A). يزيد مجموع الخلية من دائريته في اليوم الثالث (B) ويصل إلى شكل كروي مناسب في اليوم 5 (C). د: كروي ZFL عمره 16 يوما في صفيحة ULA. يشكل خط خلية ZEM2S كرويات من اليوم الأول لنظام التشغيل (E). يحافظ كروي ZEM2S على شكله ويزداد حجمه في اليوم الثالث (F) ، ويتم الوصول إلى أقصى دائرية له في اليوم 5 (G). (H) كروي ZEM2S عمره 10 أيام في صفيحة ULA. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: OS = الاهتزاز المداري. ULA = مرفق منخفض للغاية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد حجم الأجسام الكروية ودائريتها باستخدام برنامج لمعالجة الصور العلمية وتحليلها. بعد ضبط البرنامج لقياس منطقة محددة بناء على مقياس معروف ، حدد الجانب الخارجي للكرة لتحديد مساحتها ودائريتها (A). يتم استخدام مساحة الكروية لتحديد حجمها عن طريق حساب القطر d ، ويوفر البرنامج دائرية الكروية بواسطة صيغة تستخدم المساحة والمحيط المحددين (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استنساخ الطريقة الكروية ثلاثية الأبعاد التي أظهرتها الكرات ذات الحجم الموحد (القطر) والدائرية (الشكل الكروي). الحجم المقاس للكرويات لخطوط خلايا ZFL (A) و ZEM2S (B). مؤشر الدائرية المقاس للكرويات ZFL (C) و ZEM2S (D). نمط نمو الكرويات ZFL و ZEM2S (E). تمثل البيانات ثلاث نسخ متماثلة تقنية من دفعات خلايا مختلفة. تشير الأرقام الموجودة فوق كل نقطة إلى متوسط النسخ الثلاثية للأيام 1 و 3 و 5. أظهرت البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (ن = 10). تم تعديل هذا الرقم من Souza et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة بين تكوين الأجسام الكروية ZFL و ZEM2S التي يتم إجراؤها بسرعتين دورانيتين (70 و 100 دورة في الدقيقة). تشكلت كروية ZFL (A) وكروية ZEM2S (B) بعد 5 أيام من الاهتزاز المداري عند 100 دورة في الدقيقة (تمثل قضبان المقياس 100 ميكرومتر). تشكل نمط نمو كرويات ZFL (C) و ZEM2S الكروية (D) عند 70 و 100 دورة في الدقيقة. تشكل مؤشر الدائرية للكرويات ZFL (E) و ZEM2S الكروية (F) عند 70 و 100 دورة في الدقيقة. تظهر البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (ن = 10). * يشير إلى دلالة إحصائية (ص < 0.05). NS: فرق غير معنوي (اختبار T) بين الأجسام الكروية التي تشكلت في اليوم 5 عند 70 و 100 دورة في الدقيقة. تم تعديل هذا الرقم من Souza et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: السلامة الخلوية وصلاحية الأجسام الكروية ZFL و ZEM2S (عمرها 5 أيام) التي تشكلت عن طريق الاهتزاز المداري في لوحة بئر مرفق منخفضة للغاية مستديرة القاع. يظهر تلطيخ أغشية الخلايا بواسطة Lectin Alexa Fluor 594 (أحمر) ونوى بواسطة DAPI (أزرق) السلامة الخلوية في قلب كروي ZEM2S (A) و ZFL كروي (B). يوضح مضان الريسوروفين (الأحمر) الذي يتكون من اختزال Alamarblue خلايا قابلة للحياة في قلب كل من الأجسام الكروية ZEM2S (C) و ZFL (D). تمثل الصور مستويات متعامدة تم التقاطها باستخدام مجهر متحد البؤر. مقايسة جدوى MTT في الثقافة ثلاثية الأبعاد (كروية) وثقافة ثنائية الأبعاد لخط خلايا ZEM2S (E) و ZFL (F). أظهرت البيانات كمتوسط امتصاص يقاس عند 570 نانومتر ± الانحراف المعياري. ns: فرق غير معنوي من خلال اختبار Welch's t. تم تعديل هذا الرقم من Souza et al. (2021) 12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: حلول لزراعة ZFL و ZEM2S. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: مقارنة بين الطرق الكروية 3D المستخدمة لتشكيل كرويات ZFL واحدة. * أفضل نتيجة لمعلمة اختبارها. أ المعلمة المحددة من أفضل النتائج التي تم التحقق منها في طريقة الإسقاط المعلقة التقليدية. (ب) المعلمة المختارة من Baron et al.3 لتشكيل سمكة كروية مع اهتزاز مداري. (ج ) اختلافات مناسبة بنفس القدر لمعلمة مختبرة. الاختصارات: HD = قطرة معلقة. نظام التشغيل = الاهتزاز المداري ؛ ULA = مرفق منخفض للغاية ؛ بولي هيما = بولي (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات). تم تعديل هذا الجدول من Souza et al.12. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه طريقة بسيطة وسهلة وسريعة لتوليد كرويات من كبد الزرد وخطوط خلايا الجنين. تم تطوير هذه الطريقة من قبل هذه المجموعة بناء على تعديلات الطرق الكروية ثلاثية الأبعاد الحالية للتغلب على المشكلات المبلغ عنها في الدراسات العلمية المتعلقة بتكوين كروي ، بالإضافة إلى عدم اليقين في دقة البيانات من مقايسات كروية ثلاثية الأبعاد. على سبيل المثال ، تكمن المشاكل المبلغ عنها في صعوبات المناولة ، والطبيعة المستهلكة للوقت لتوليد الكرات ، وضرورة اختيار كرويات من نفس الحجم والشكل لإجراء الفحص ، وكذلك الصعوبات في عملية نقل الكرات من القطرات إلى الألواح الدقيقة في طريقة السقوطالمعلقة 3،7،12. علاوة على ذلك ، يوصي هذا البروتوكول بزراعة خطوط خلايا ZFL و ZEM2S في حالة خالية من ثاني أكسيد الكربون. تم الإبلاغ على نطاق واسع عن تكوين وسط الاستزراع والبيئة الخالية من CO2 المقترحة في هذا البروتوكول لكلا خطي الخلية في الأدبيات. عادة ما يتم استزراع خط خلايا ZFL في وسائط L-15 و RPMI مع أو بدون إضافة بيكربونات الصوديوم وبدون CO2 14،15،16،17،18،19،20. يتم استزراع خط خلية ZEM2S وفقا لتعليمات مركز الموارد الحيوية ، وقد تمت صياغة وسائط الاستزراع الخاصة به للثقافات الخالية من ثاني أكسيد الكربون ؛ وبالتالي ، يمكن أن يكون CO2 وخليط الهواء ضارا بالخلايا عند استخدام هذا النوع من وسائط الثقافة21.
تم تطوير بروتوكول كروية الأسماك الحالي بعد تقييم العديد من المعلمات (أي كثافات الخلايا المختلفة ، وسرعة الاهتزاز المداري [70 أو 100 دورة في الدقيقة] ، واستخدام لوحات مختلفة من 96 بئرا [قاع مسطح أو قاع مستدير]) لتحديد أفضل المعلمات لتشكيل كرويات ZFL. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء مقارنة مع طرق ثقافة 3D الأخرى (أي طريقة الإسقاط المعلق وطريقة الإسقاط المعلق جنبا إلى جنب مع طريقة الاهتزاز المداري) ، مما يشير إلى أن الاهتزاز المداري لألواح ULA ذات القاع المستدير كان له أفضل أداء (أي طريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار). يوضح الجدول 2 معلمات وأداء طرق الثقافة ثلاثية الأبعاد الأخرى التي تم تقييمها لتشكيل كرويات ZFL.
تم الإبلاغ بالفعل عن أن لوحات ULA ذات القاع المستدير تشكل كرويات مفردة للخلايا البشرية تليها الطرد المركزي22 أو الاهتزاز المداري23,24. في هذا البروتوكول ، نقترح استخدام نفس الصفيحة ، باستثناء الاهتزاز المداري لتوليد كرويات مفردة من خطوط خلايا الزرد (أي كروي واحد لكل بئر من صفيحة 96 بئرا). هذا مفيد بشكل خاص لأنه يمكن أن يشكل بسهولة وبسرعة كمية جيدة من الأجسام الكروية ، ويمكن الحفاظ على الكرات المشكلة في الثقافة على نفس اللوحة. وبالتالي ، يمكن إجراء التعرض الكيميائي مباشرة على لوحة ULA لإجراء أنواع مختلفة من فحوصات السمية.
من أجل تحديد سرعة الاهتزاز المداري المناسبة لتشكيل كرويات ZFL و ZEM2S ، قارنا تكوين الكرويات عند 70 و 100 دورة في الدقيقة. أظهرت النتائج أن هذه الطريقة تعمل بشكل أفضل عند 70 دورة في الدقيقة ، ويمكن أن تؤثر سرعة الدوران الأعلى بشكل كبير على حجم وشكل الأجسام الكروية ZEM2S (الشكل 5D ، F). لم تظهر كرويات ZFL اختلافات كبيرة في الحجم والشكل عند سرعات الدوران هذه. ومع ذلك ، تم الحصول على مؤشرات دائرية أقل عند 100 دورة في الدقيقة ، مما يدل على تأثير سلبي في الشكل الكروي بسرعة دوران أعلى (الشكل 5C ، E).
تولد كثافة الخلايا الأولية لخلايا 3,500 ZEM2S و 7,000 خلية ZFL كرويات بأحجام مماثلة في اليوم الخامس في الثقافة (226.63 و 225.62 ميكرومتر على التوالي). بالنظر إلى أن الأكسجين والمواد المغذية يتم نقلها عن طريق الانتشار في الكرات25 ، فإن قطرها قد يؤثر بشدة على التغذية والسلامة الخلوية في قلب الأجسام الكروية. بشكل عام ، يوصى باستخدام كرويات تصل إلى 100 ميكرومتر لتجنب النواة الميتة26. للتحقق من السلامة الخلوية في قلب الأجسام الكروية ، قمنا بتقييم السلامة النووية والأغشية عن طريق التلوين المناعي باستخدام DAPI و Lectin Alexa Fluor 594 بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 6A ، B) ، وتم إثبات سلامة الكائنات الكروية. كما تم التحقق من الصلاحية الخلوية في قلب الأجسام الكروية من خلال تعريضها للريزازورين (Alamarblue) وتحليل مضان الريسوروفين بواسطة مجهر متحد البؤر (الشكل 6C ، D). عندما تكون الخلايا قابلة للحياة ، يتم تقليل resazurin إلى resorufin (مادة الفلورسنت) عن طريق وظيفة التمثيل الغذائي الخلوي. أظهر أداء مقايسة MTT أيضا عدم وجود فرق كبير في صلاحية الخلية مقارنة بكرويات ZFL و ZEM2S مع ثقافة أحادية الطبقة (ثقافة ثنائية الأبعاد) (الشكل 6E ، F). على الرغم من أن الأجسام الكروية أكبر من 100 ميكرومتر ، إلا أن النتائج تظهر أن هذا البروتوكول يولد كرويات قابلة للحياة من خطوط خلايا ZFL و ZEM2S مع التغذية الكافية حتى في الجزء الداخلي منها.
سمحت كثافة الخلايا لخلايا ZFL و ZEM2S وسرعة الاهتزاز المداري المطبقة في هذا البروتوكول بتكوين كرويات مستقرة للغاية في الحجم والشكل ، مع تباين منخفض بين الآبار (الشكل 4) ، وتجنب الحاجة إلى اختيار كرويات كافية كخطوة سابقة لإجراء الفحص. إذا كان إجراء الفحص يتطلب نقل الأجسام الكروية إلى لوحات أو أنابيب / أنابيب دقيقة أخرى ، فيمكن نقلها بسهولة باستخدام ماصة دقيقة دون مشاكل التصنيف.
هنا ، أظهرنا بروتوكولا تم تطويره بناء على أفضل المعلمات لتشكيل كرويات ZFL و ZEM2S قابلة للحياة. قد تكون خطوط خلايا ZFL و ZEM2S مفيدة في اختبار السمية المائية لتقدير التأثيرات الكيميائية على الأسماك23،24،27،28،29،30. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا دراسة نقاط النهاية التنموية باستخدام خطوط خلايا جنين الأسماك ، مثل خط خلايا ZEM2S (خلايا الخلايا الليفية في مرحلة البلاستولا) ، والتي تحتفظ بدرجة من تعدد القدرات28. هذه تجعل هذه الكرويات الزرد مفيدة لاختبار سمية الأسماك. علاوة على ذلك ، كطريقة كروية سهلة للأسماك ، يمكن استخدامها في اختبار السمية البيئية عالية الإنتاجية ، ودعم تطبيقها في الصناعة والأوساط الأكاديمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
في ذكرى الدكتور مارسيو لورينسيني ، مؤلف مشارك في هذا العمل ، باحث ممتاز في مجال مستحضرات التجميل ومكرس لتعزيز أبحاث التجميل في البرازيل. يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمختبر متعدد المستخدمين في قسم علم وظائف الأعضاء (UFPR) لتوافر المعدات وللدعم المالي المقدم من التنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES ، البرازيل) (قانون المالية 001) و Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
