Summary
Здесь мы представляем эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов двух клеточных линий рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит).
Abstract
Клеточные линии рыб являются перспективными моделями in vitro для оценки экотоксичности; однако обычные монослойные культивальные системы (2D-культура) имеют хорошо известные ограничения (например, долговечность культуры и поддержание некоторых клеточных функций in vivo ). Таким образом, были предложены 3D-культуры, такие как сфероиды, поскольку эти модели могут воспроизводить тканеподобные структуры, лучше захватывая условия in vivo . В этой статье описывается эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов с двумя клеточными линиями рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит). Протокол состоит из покрытия ячеек в 96-луночную пластину со сверхнизким дном и сверхнизкой насадкой. После 5 суток при орбитальном встряхивании (70 об/мин) образуется один сфероид на лунку. Сформированные сфероиды имеют стабильный размер и форму, и этот метод позволяет избежать образования нескольких сфероидов в яме; Таким образом, нет необходимости вручную подбирать сфероиды одинаковых размеров. Легкость, скорость и воспроизводимость этого сфероидного метода делают его полезным для высокопроизводительных испытаний in vitro .
Introduction
Сфероиды представляют собой небольшие сферы клеток, образующиеся при культивировании клеток в тесном межклеточном контакте в 3D-культуре. Способность сфероидов имитировать тканевую среду in vivo уже была изучена в различных клеточных линиях и первичных клетках 1,2. Однако, несмотря на то, что сфероиды хорошо разработаны для исследований токсичности для млекопитающих, разработка сфероидов для исследований токсичности для позвоночных, не относящихся к млекопитающим (например, рыб), все еще продолжается3. Для клеточных линий рыб сфероиды были разработаны различными методами, такими как орбитальное встряхивание (OS) с использованием различных типов лунок 3,4,5,6,7 и метод магнитной левитации с использованием магнитных наночастиц 8. Однако некоторые из этих методов культивирования сфероидов могут иметь больше недостатков, чем другие.
Например, гирационные методы в больших микропланшетах (24-луночные пластины) могут генерировать большое количество сфероидов, различающихся по размеру и форме; Действительно, было продемонстрировано формирование многосфероидной структуры7. Это требует интенсивных усилий по подбору сфероидов аналогичного размера и формы для эксперимента. Метод 3D-культивирования висячей капли обычно используется для получения сфероидов клеточных линий млекопитающих 1,2,9,10,11, при этом можно генерировать отдельные сфероиды на каплю, избегая проблем, описанных выше. Однако, хотя модифицированный метод висячего падения (висячая капля + орбитальное встряхивание) способен генерировать сфероиды ZFL с помощью недорогого метода, он имеет свои недостатки12. Образовавшиеся клеточные агрегаты не могут долго сохраняться в каплях; Таким образом, их нужно переносить на скважинные пластины. Этот процесс требует интенсивного обращения и длительных периодов работы в вытяжке с ламинарным потоком, поскольку он выполняется по каплям с помощью микропипетки12. Кроме того, для полного формирования сфероидов ZFL этому методу требуется 10 дней (5 дней в висячей капле + 5 дней в ОС)12. Эти недостатки могут ограничить применение 3D-сфероидов рыб для тестирования токсичности, особенно с учетом потенциальных применений для определения приоритетов химических веществ и устойчивости продукта.
Таким образом, в данной статье описан протокол 3D-культивирования, способный генерировать одиночные сфероиды клеточных линий ZFL (D. rerio normal hepatocyte) и ZEM2S (эмбрион D. rerio blastula phase) на основе комбинированного использования 96-луночных пластин со сверхнизким креплением (ULA-пластины) и орбитального шейкера (диаметр вращения 22 мм). Применяемый метод прост и воспроизводим и может генерировать большое количество сфероидов одинакового размера и формы за короткий период (5 дней). Преимущества этого метода могут способствовать применению 3D-моделей рыб для исследований токсичности в водной среде как в промышленности, так и в научных кругах, а также прогрессу внедрения альтернативных методов тестирования экотоксичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Основные этапы генерации 3D-сфероидов клеточных линий ZFL и ZEM2S на 96-луночном планшете с круглым дном представлены на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе, и Таблицу 1 для растворов и питательных сред, используемых в этом протоколе.
1. Питательная среда для клеточных культур и монослойные культуры
- Выращивайте обе клеточные линии (ZFL, ZEM2S) в виде монослоев в инкубаторе при 28 ° C без CO2 и субкультивируйте их с соотношением субкультивирования 1: 3, когда они достигают ~ 80% слияния.
- Начните с колбы T75 с клетками рыбок данио-рерио при слиянии ~ 80%, культивируемых, как описано выше.
- Удалите всю среду и промойте клетки, добавив 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (0,01 М) в колбу для культуры с помощью пипетки.
- С помощью пипетки добавляют 3 мл 1x трипсина-0,5 мМ ЭДТА (0,05% [об./об.]) в колбы для культивирования и инкубируют при 28 ° C в течение 3 мин для отделения клеток от колбы.
- Осторожно постучите по колбе, чтобы освободить клетки, а затем остановите расщепление трипсина, добавив в колбу 3 мл полной питательной среды.
- С помощью пипетки перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 100 × г в течение 5 мин.
- После образования гранул осторожно удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл полной среды для соответствующей используемой клеточной линии (ZFL или ZEM2S) и ресуспендируйте с помощью микропипетки. Возьмем аликвоту для подсчета ячеек.
2. Подсчет клеток с помощью теста на исключение красителя трипанового синего
- Добавьте 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл красителя трипанового синего в микропробирку, чтобы подсчитать клетки и оценить их жизнеспособность. Смешайте клеточную суспензию и краситель с помощью пипетки.
- Затем перенесите 10 мкл этой смеси (клеточная суспензия + трипановый синий) в камеру Нойбауэра и подсчитайте клетки в четырех больших квадратах (квадрантах: Q), расположенных по углам камеры, считая жизнеспособными клетки, которые не принимают трипановый синий. Рассчитайте количество жизнеспособных клеток, используя уравнение (1):
(1) - Чтобы рассчитать окончательное количество клеток в клеточной суспензии, умножьте количество клеток, определенное с помощью уравнения (1), на 2 (коэффициент разбавления из-за использования трипанового синего).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать автоматизированную систему подсчета ячеек.
(1)3. Обшивка ячеек в ULA-пластинах
- После расчета номера ячейки отрегулируйте суспензию ячейки на пластину 200 мкл этой суспензии на лунку 96-луночной УЛА-пластины с круглым дном с количеством ячеек, необходимым для каждой линии ячейки, как указано ниже:
- Планшет 7 000 жизнеспособных клеток ZFL / лунка; таким образом, для всей ULA-пластины используют 700 000 клеток в 20 мл полной среды.
- Планшет 3 500 жизнеспособных клеток ZEM2S /лунка; таким образом, для всей ULA-пластины используют 350 000 клеток в 20 мл полной среды.
- Приготовьте клеточную суспензию с отрегулированной концентрацией клеток в среднем резервуаре и перемешайте ее с помощью многоканальной микропипетки, стараясь не образовывать пену или пузырьки. С помощью многоканальной микропипетки добавьте 200 мкл скорректированной клеточной суспензии в каждую лунку ULA-планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть запечатана парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы избежать испарения питательной среды из 96-луночной пластины.
4. Формирование сфероида
- Инкубируйте ULA-пластину на орбитальном шейкере при 70 об/мин в течение 5 дней в инкубаторе с температурой 28 °C. Позвольте сфероидам сформироваться в течение 5 дней орбитального встряхивания (рис. 2), достигнув среднего размера ~ 225 мкм в диаметре (сфероиды ZFL) и ~ 226 мкм в диаметре (сфероиды ZEM2S)12.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 5 дней инкубации (максимальная цикличность) сфероиды готовы к использованию. - Для поддержания сфероидов в культуре более 5 дней удаляют 100 мкл отработанной среды каждые 5 дней и добавляют 100 мкл свежей полной питательной среды с помощью многоканальной микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не аспирировать сфероиды во время этого процесса.
5. Измерение размера (диаметра) и формы (индекса округлости) сфероидов
- Приобретите изображения.
- Под микроскопом с инвертированным светом с системой захвата изображений получают изображение определенного масштаба.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения шкалы используйте калибровочное предметное стекло микроскопа или предметное стекло Нойбауэра (в котором известны размеры квадрантов). - Под микроскопом и с помощью той же линзы объектива, которая использовалась для получения изображения масштаба, получают изображения полностью сформированных сфероидов (т.е. 5-дневных сфероидов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения должны быть сделаны с использованием одной и той же системы захвата изображений, так как разрешение изображения важно для определения размера и формы сфероидов, и оно может отличаться в зависимости от типа систем.
- Под микроскопом с инвертированным светом с системой захвата изображений получают изображение определенного масштаба.
- Установите масштаб.
- С помощью программного обеспечения ImageJ откройте изображение заданного масштаба (нажмите Файл | открыть).
- Выберите прямой селектор на панели инструментов и с помощью мыши перетащите линию через расширение заданного масштаба на изображении.
- Установите масштаб, выбрав «Анализировать» | Установите масштаб и дождитесь открытия окна «Установить масштаб ».
- В окне «Задать масштаб» заполните поле «Известное расстояние» известным расстоянием (мкм), соответствующим прямой; Заполните поле Единица длины мкм для мкм. Нажмите кнопку ОК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Масштаб в пикселях/мкм отображается в нижней части окна.
- Установите параметры измерения.
- В программном обеспечении ImageJ выберите Analyze | Установите измерения , чтобы открыть окно Установка измерений .
- В окне «Задать измерения » установите флажки для нужных измерений (т. е. дескрипторы «Площадь » и « Форма »). Нажмите кнопку ОК.
- Получите диаметр и округлость сфероидов.
- Откройте изображение сфероида (Файл | Открытый).
- Выберите инструмент выделения от руки на панели инструментов и с помощью мыши выделите внешнюю сторону сфероида, как показано на рисунке 3A.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить или уменьшить масштаб изображения, нажмите клавишу Ctrl и используйте мышь для прокрутки вниз или вверх или нажмите клавишу Ctrl и используйте клавиши со стрелками вверх или вниз на клавиатуре. - Выберите Анализ | Измерение, чтобы открыть окно Результаты, в котором отображаются измеренные значения.
- Используя значение площади , рассчитайте размер (диаметр) сфероидов, используя уравнение (2):
(2) - Индекс цикличности указывается в окне «Результаты» как «Circ.» и автоматически рассчитывается программным обеспечением с использованием уравнения (3):
(3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс цикличности 1,0 представляет собой идеальную сфероидальную форму, а значение, близкое к 0,0, указывает на вытянутую форму13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этим методом формируются одиночные сфероиды на лунку со стабильным размером и формой. На рисунке 2 показан процесс формирования одиночных сфероидов ячеек ZFL и ZEM2S в лунке ULA-пластины при орбитальном встряхивании (70 об/мин). Клеточные линии ZFL и ZEM2S по-разному ведут себя в 3D-культуре. Клеточная линия ZEM2S обладает особенностями, которые придают способность легко формировать сфероидальную форму с первого дня орбитального встряхивания (рис. 2E), в то время как клеточной линии ZFL требуется 5 дней, чтобы достичь желаемой сфероидальной формы (рис. 2A-C). Сфероиды, полученные с помощью этого метода, также показали стабильность формы в более длительные периоды культивирования (периоды >5 дней), как показано на рисунке 2D (16-дневный сфероид ZFL) и рисунке 2H (10-дневный сфероид ZEM2S). Диаметр и округлость сфероидов определяли путем измерения их проецируемой площади на полученных изображениях с использованием программного обеспечения для обработки и анализа научных изображений13 (рис. 3). В таблице материалов указано программное обеспечение, используемое для обработки и анализа изображений. Клетки ZFL имеют тенденцию образовывать крупные клеточные агрегаты (средний размер 319 ± 23,33 мкм) в первый день орбитального встряхивания, которое уменьшается со временем до 5-го дня (225,62 ± 19,20 мкм) (рис. 4A), увеличивая циркулярность с течением времени в культуре (рис. 4B). В отличие от клеток ZFL, клеточная линия ZEM2S образует небольшие сфероиды с первого дня (202,64 ± 5,78 мкм), которые постепенно увеличиваются до 5-го дня (226,63 ± 4,80 мкм) (рис. 4C). На рисунке 4E показаны различные модели роста клеточных линий ZFL и ZEM2S в 3D-культуре. Мы рекомендуем использовать сфероиды ZFL и ZEM2S на пятый день, потому что они достигают более высокой сфероидальной формы (индекс цикличности 0,80 ± 0,01 и 0,83 ± 0,00 соответственно) (рис. 4B, D), что указывает на большую стабильность этой 3D-модели.
Рисунок 1: Ключевые шаги по созданию 3D-сфероидов клеточных линий ZFL и ZEM2S в 96-луночном планшете с круглым дном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Одиночные сфероиды клеточных линий ZFL и ZEM2S, сформированные в 96-луночных ULA-пластинах с круглым дном при орбитальном встряхивании. Клеточный агрегат ZFL образуется в первые сутки ОС (А). Клеточный агрегат увеличивает свою цикличность на третий день (B) и достигает адекватной сфероидальной формы на 5-й день (C). (D) 16-дневный сфероид ZFL в ULA-пластине. Клеточная линия ZEM2S образует сфероиды с первого дня ОС (E). Сфероид ZEM2S сохраняет свою форму и увеличивается в размерах на третий день (F), а его максимальная округлость достигается на 5-й день (G). (H) 10-дневный сфероид ZEM2S в ULA-тарелке. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: ОС = орбитальное сотрясение; ULA = сверхнизкое крепление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Определение размера и циркулярности сфероидов с помощью программного обеспечения для обработки и анализа научных изображений. После настройки программного обеспечения для измерения выбранной области на основе известного масштаба выберите внешнюю сторону сфероида, чтобы определить его площадь и округлость (A). Площадь сфероида используется для определения его размера путем вычисления диаметра d, а программное обеспечение предоставляет круглость сфероида по формуле, в которой используются выбранные площадь и периметр (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Воспроизводимость метода 3D-сфероидов, показанная сфероидами одинакового размера (диаметр) и круглостью (сфероидальная форма). Измеренный размер сфероидов клеточных линий ZFL(A) и ZEM2S(B). Измерен индекс циркулярности сфероидов ZFL (C) и ZEM2S (D). Характер роста сфероидов ZFL и ZEM2S (E). Данные являются репрезентативными для трех технических реплик из разных партий ячеек. Цифры над каждой точкой указывают среднее значение троек для дней 1, 3 и 5. Данные показали среднее ± стандартное отклонение (n = 10). Эта цифра была изменена по сравнению с Souza et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение формирования сфероидов ZFL и ZEM2S, выполненное при двух скоростях вращения (70 и 100 об/мин). Сфероид ZFL (A) и сфероид ZEM2S (B) образовались после 5 дней орбитального встряхивания при 100 об/мин (масштабные черты представляют 100 мкм). Характер роста сфероидов ZFL (C) и сфероидов ZEM2S (D) формировался при 70 и 100 об/мин. Индекс цикличности сфероидов ZFL (E) и сфероидов ZEM2S (F) формируется при 70 и 100 об/мин. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (n = 10). *указывает на статистическую значимость (p < 0,05). Н.С.: Незначимая разница (Т-критерий) между сфероидами, образовавшимися на 5-й день при 70 и 100 об/мин. Эта цифра была изменена по сравнению с Souza et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Клеточная целостность и жизнеспособность сфероидов ZFL и ZEM2S (возраст 5 дней), образованных орбитальным встряхиванием в круглодонной колодце со сверхнизким прикреплением. Окрашивание клеточных мембран лектином Alexa Fluor 594 (красный) и ядер DAPI (синий) демонстрирует клеточную целостность в ядре сфероида ZEM2S (A) и сфероида ZFL (B). Флуоресценция резоруфина (красного), образованного восстановлением аламарсинего, демонстрирует жизнеспособные клетки в ядре сфероидов ZEM2S (C) и ZFL (D). Изображения представляют собой ортогональные плоскости, снятые с помощью конфокального микроскопа. Анализ жизнеспособности МТТ в 3D-культуре (сфероиды) и 2D-культуре клеточной линии ZEM2S (E) и ZFL (F). Данные показали среднее значение поглощения, измеренное на длине волны 570 нм ± стандартным отклонением. ns: незначимая разница по t-критерию Уэлча. Эта цифра была изменена из Souza et al. (2021)12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Решения для выращивания ZFL и ZEM2S. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Сравнение методов 3D-сфероидов, используемых для формирования одиночных сфероидов ZFL. * Наилучший результат для тестируемого параметра. a Выбранный параметр из лучших результатов проверяется в обычном методе подвешивания. b Выбранный из Baron et al.3 параметр для формирования сфероида рыбы с орбитальным встряхиванием. c Варианты, в равной степени подходящие для испытуемого параметра. Сокращения: HD = висячая капля; ОС = орбитальное сотрясение; ULA = сверхнизкое крепление; поли-HEMA = поли (2-гидроксиэтилметакрилат). Эта таблица была изменена по сравнению с Souza et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это простой, легкий и быстрый метод создания сфероидов клеточных линий печени и эмбрионов рыбок данио. Этот метод был разработан этой группой на основе модификаций существующих методов 3D-сфероидов для преодоления проблем, о которых сообщалось в научных исследованиях, связанных с образованием сфероидов, а также неопределенностей в точности данных 3D-сфероидных анализов. Например, проблемы, о которых сообщалось, заключаются в трудностях обработки, трудоемком характере генерации сфероидов, необходимости выбора сфероидов аналогичного размера и формы для проведения анализа, а также в трудностях в процессе переноса сфероидов из капель на микропланшеты в методевисячей капли 3,7,12. Кроме того, этот протокол рекомендует культивирование клеточных линий ZFL и ZEM2S в состоянии, свободном от CO2. Состав питательной среды и среда, свободная от CO2, предложенные в этом протоколе для обеих клеточных линий, широко представлены в литературе. Клеточную линию ZFL обычно культивируют в средах L-15 и RPMI с добавлением бикарбоната натрия или без него и без CO2 14,15,16,17,18,19,20. Клеточная линия ZEM2S культивируется в соответствии с инструкциями биоресурсного центра, а ее питательные среды были разработаны для культур, свободных от CO2; таким образом,СО2 и воздушная смесь могут быть вредными для клеток при использовании этого типа питательных сред21.
Настоящий протокол сфероида рыбы был разработан после оценки нескольких параметров (т.е. различной плотности клеток, скорости орбитального встряхивания [70 или 100 об/мин] и использования различных 96-луночных пластин [плоскодонных или круглодонных]) для определения наилучших параметров для формирования сфероидов ZFL. Кроме того, было проведено сравнение с другими методами 3D-культивирования (т.е. методом подвешивания и методом висячего падения в сочетании с методом орбитального встряхивания), что показало, что орбитальное встряхивание УЛА-пластин с круглым дном имеет наилучшую производительность (т.е. простой, быстрый и воспроизводимый метод). В таблице 2 показаны параметры и производительность других методов 3D-культивирования, оцененных для формирования сфероидов ZFL.
Уже сообщалось, что УЛА-пластины с круглым дном образуют одиночные сфероиды клеток человека с последующим центрифугированием22 или орбитальным встряхиванием23,24. В этом протоколе мы предлагаем использовать ту же пластину, за исключением орбитального встряхивания, для генерации одиночных сфероидов клеточных линий рыбок данио-рерио (т.е. один сфероид на лунку 96-луночной пластины). Это особенно выгодно, потому что он может легко и быстро образовывать большое количество сфероидов, и сформированные сфероиды могут поддерживаться в культуре на одной и той же пластине. Таким образом, химическое воздействие может быть выполнено непосредственно на ULA-пластине для выполнения различных типов анализов токсичности.
Чтобы определить адекватную скорость встряхивания орбиты с образованием сфероидов ZFL и ZEM2S, мы сравнили образование сфероидов при 70 и 100 об/мин. Результаты показывают, что этот метод лучше работает при 70 об/мин, а более высокая скорость вращения может существенно повлиять на размер и форму сфероидов ZEM2S (рис. 5D, F). Сфероиды ZFL не показали существенных различий в размерах и форме при этих скоростях вращения; однако более низкие индексы цикличности были получены при 100 об/мин, что свидетельствует о негативном влиянии сфероидальной формы при более высокой скорости вращения (рис. 5C, E).
Начальная плотность клеток 3,500 клеток ZEM2S и 7,000 клеток ZFL генерирует сфероиды с аналогичными размерами на пятый день в культуре (226,63 и 225,62 мкм соответственно). Учитывая, что кислород и питательные вещества транспортируются путем диффузии в сфероидах25, их диаметр может сильно влиять на питание и клеточную целостность в ядре сфероидов; Как правило, рекомендуется использовать сфероиды размером до 100 мкм, чтобы избежать некротического ядра26. Чтобы проверить клеточную целостность в ядре сфероидов, мы оценили ядерную и мембранную целостность путем иммуноокрашивания DAPI и Lectin Alexa Fluor 594 с помощью конфокальной микроскопии (рис. 6A, B), и была продемонстрирована целостность сфероидов. Клеточная жизнеспособность в ядре сфероидов также была проверена путем воздействия на них резазурина (Alamarblue) и анализа флуоресценции резоруфина с помощью конфокального микроскопа (рис. 6C, D). Когда клетки жизнеспособны, резазурин восстанавливается до резоруфина (флуоресцентного вещества) за счет клеточной метаболической функции. Результаты анализа МТТ также не показали существенной разницы в жизнеспособности клеток по сравнению со сфероидами ZFL и ZEM2S с монослойной культурой (2D-культурой) (рис. 6E, F). Хотя сфероиды больше 100 мкм, результаты показывают, что этот протокол генерирует жизнеспособные сфероиды клеточных линий ZFL и ZEM2S с адекватным питанием даже во внутренней части.
Плотность ячеек ячеек ZFL и ZEM2S и скорость орбитального сотрясения, примененная в этом протоколе, позволили сформировать очень стабильные сфероиды по размеру и форме с низкой вариабельностью среди лунок (рис. 4), что позволило избежать необходимости выбора адекватных сфероидов в качестве предыдущего этапа выполнения анализа. Если процедура анализа требует переноса сфероидов на другие пластины или пробирки/микротрубки, их можно легко перенести с помощью микропипетки без проблем с дезагрегацией.
Здесь мы продемонстрировали протокол, разработанный на основе наилучших параметров для формирования жизнеспособных сфероидов ZFL и ZEM2S. Клеточные линии ZFL и ZEM2S могут быть полезны при тестировании на токсичность в водной среде для оценки химического воздействия на рыб 23,24,27,28,29,30. Кроме того, конечные точки развития также могут быть изучены с использованием клеточных линий эмбрионов рыб, таких как клеточная линия ZEM2S (клетки фибробластов фазы бластулы), которые сохраняют степень плюрипотентности28. Это делает эти сфероиды рыбок данио-рерио потенциально полезными для тестирования токсичности рыб. Кроме того, в качестве простого рыбьего сфероидного метода его можно использовать в высокопроизводительных испытаниях на экотоксичность, поддерживая его применение в промышленности и научных кругах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории кафедры физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
