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Biology

Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

El presente estudio describe un protocolo para monitorizar los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) durante la infección viral utilizando un sistema de análisis celular en tiempo real (RTCA).

Abstract

Las células endoteliales recubren la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos, creando una barrera semipermeable que regula el intercambio de líquidos y solutos entre la sangre o la linfa y sus tejidos circundantes. La capacidad de un virus para cruzar la barrera endotelial es un mecanismo importante que facilita la diseminación del virus en el cuerpo humano. Se ha informado que muchos virus alteran la permeabilidad endotelial y/o causan la ruptura de la barrera de las células endoteliales durante la infección, lo que puede causar fugas vasculares. El estudio actual describe un protocolo de análisis celular en tiempo real (RTCA, por sus siglas en inglés), que utiliza un analizador celular comercial en tiempo real para monitorear la integridad endotelial y los cambios en la permeabilidad durante la infección por el virus del Zika (ZIKV, por sus siglas en inglés) de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, por sus siglas en inglés). Las señales de impedancia registradas antes y después de la infección por ZIKV se tradujeron a valores de índice celular (IC) y se analizaron. El protocolo RTCA permite la detección de efectos transitorios en forma de cambios morfológicos celulares durante una infección viral. Este ensayo también podría ser útil para estudiar los cambios en la integridad vascular de los HUVEC en otras configuraciones experimentales.

Introduction

Las células endoteliales (CE) recubren la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos. Están conectados por uniones adherentes y estrechas, creando una barrera semipermeable entre la sangre o la linfa y los tejidos circundantes 1,2. Las uniones endoteliales intactas célula-célula son fundamentales para regular el transporte de macromoléculas, solutos y fluidos, cruciales para las actividades fisiológicas de los tejidos y órganos correspondientes3. La barrera endotelial es dinámica y modulada por estímulos específicos4. La alteración o pérdida de la función de la barrera endotelial es un sello distintivo de la fisiopatología de la enfermedad en la inflamación aguda y crónica en la patogénesis de muchas enfermedades 5,6,7, incluida la infección viral 8,9,10,11. En el caso de los flavivirus, se encontró que la proteína no estructural NS1 puede alterar la permeabilidad endotelial, por ejemplo, a través de la interrupción de la capa endotelial similar al glicocálix como resultado del aumento de la expresión y activación de catepsina L, sialidasas y endoglicosidasa heparinasa9. En el estado de enfermedad, la integridad de la monocapa endotelial se ve afectada y las uniones célula-célula se interrumpen, lo que puede conducir a lesiones y disfunciones endoteliales12 y, finalmente, a manifestaciones patológicas generalizadas en múltiples sistemas de órganos13,14. La infección viral de las CE da lugar a cambios en las vías de señalización celular y en el perfil de expresión génica celular, lo que puede afectar a las funciones de barrera de líquidos, causar alteraciones de las CE e inducir fugas vasculares10,15. Se ha descubierto que la infección por el virus del Zika (ZIKV) en las CE altera la integridad de la unión, lo que provoca cambios en la permeabilidad vascular y conduce a una disfunción de la barrera endotelial, lo que resulta en fugas vasculares10,15. Los estudios han demostrado que el ZIKV está relacionado con defectos congénitos graves; Sin embargo, no se sabe mucho sobre el mecanismo exacto por el cual esto ocurre16,17. Por lo tanto, comprender los cambios en la barrera endotelial durante una infección es fundamental para comprender el mecanismo de la enfermedad.

En la actualidad, las CE se utilizan como un importante sistema experimental modelo vascular in vitro para diversos procesos fisiológicos y patológicos 18,19,20,21. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se han utilizado ampliamente como un sistema celular primario no inmortalizado para estudiar el endotelio vascular y la biología vascular in vitro 22,23,24,25. Los HUVEC se aislaron por primera vez para cultivo in vitro a principios de la década de 1970 de la vena umbilical del cordón umbilical humano26. Los HUVEC tienen una morfología similar a la de un adoquín que se hace proliferar fácilmente en el laboratorio. Debido al esfuerzo cortante después de mantenerse durante largos períodos en estado confluente, se observa un alargamiento de la forma de la célula. Los HUVEC pueden caracterizarse por la presencia de cuerpos de Weibel y Palade (WPB), vesículas pinocíticas, pequeñas cantidades de fibrillas ubicadas cerca del núcleo, mitocondrias con formas tubulares que rara vez muestran ramificaciones, un núcleo elipsoide con un patrón granular fino de cromatina condensada y de uno a tres nucléolos presentes en cada núcleo27. Aunque los HUVEC muestran numerosas características morfológicas, la identificación de los HUVEC no puede lograrse únicamente mediante un examen óptico. Los ensayos, como la tinción por inmunofluorescencia de la cadherina endotelial vascular (EV), se utilizan comúnmente para la monitorización de la integridad vascular en los HUVEC 28,29,30,31.

Este estudio describe el protocolo de análisis celular en tiempo real (RTCA) de la infección de HUVECs. El sistema RTCA utiliza placas especializadas recubiertas de oro que contienen microelectrodos que proporcionan una superficie conductora para la unión de la celda. Cuando las células se adhieren a la superficie del microelectrodo, se forma una barrera que impide el flujo de electrones a través de los microelectrodos. La medición de la impedancia generada por los microelectrodos se puede utilizar para obtener información sobre algunos procesos celulares, incluidas las uniones celulares, la proliferación y la migración32. El ensayo reportado es un ensayo celular basado en impedancia que, junto con un analizador celular en tiempo real, proporciona una medición continua de la proliferación de células vivas, los cambios morfológicos (como el encogimiento celular) y la calidad de la unión celular de una manera no invasiva y sin etiquetas. En este estudio, el analizador celular en tiempo real se utiliza para monitorizar la integridad endotelial y los cambios morfológicos de los HUVEC durante la infección por ZIKV. Brevemente, el instrumento mide el flujo de electrones transmitido en placas especializadas de microtitulación recubiertas de microelectrodos de oro en presencia de un medio de cultivo (solución conductora de electricidad). La adherencia celular o los cambios en el número y la morfología de las células perturban el flujo de electrones y causan variaciones de impedancia que pueden ser capturadas por el instrumento (Figura suplementaria 1). La diferencia entre el crecimiento, la proliferación y la adherencia de HUVEC antes y después de la infección por ZIKV se registra en tiempo real mediante una señal de impedancia eléctrica y luego se traduce en el valor del índice celular (IC). El valor de IC de la preinfección se utiliza como referencia para la normalización del valor de IC. Los cambios en los valores de IC reflejan cambios morfológicos celulares o pérdida de adherencia celular tras la infección33. Los resultados del estudio muestran que el protocolo RTCA permite la detección de efectos transitorios o cambios morfológicos celulares durante la infección viral en comparación con un ensayo de punto final, como la tinción por inmunofluorescencia de VE-cadherina. El método RTCA podría ser útil para analizar los cambios en la integridad vascular de HUVEC tras la infección por otros virus.

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Protocol

1. Preparación celular

  1. Preparación de HUVECs
    1. Cultivar 7,5 x 105 células HUVEC/ml en un matraz de cultivo celular de 75cm2 (recubierto con 20 μg/ml de colágeno tipo 1) que contenga 12 ml de medio de células endoteliales (MEC) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS), un suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS) al 0,01 % que contenga factores de crecimiento, hormonas y proteínas necesarias para el cultivo de HUVEC, y 0,01% de penicilina-estreptomicina (P/S). Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 (Figura 1).

2. Configuración del experimento RTCA

  1. Ejecución de verificación de resistencias en RTCA
    1. Haga doble clic en el icono del software RTCA en el escritorio para iniciar la aplicación. Aparecerá una ventana de inicio de sesión, escriba el nombre de usuario y la contraseña para iniciar sesión.
    2. Coloque una placa de resistencia RTCA de 96 pocillos con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.
    3. En la pestaña Notas de experiencia del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo (placa de control de calidad).
    4. En la pestaña Diseño en la pestaña Celda del software RTCA, resalte todos los pozos y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos (atenuados).
    5. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Step_1. Introduzca Barridos: 10 e Intervalo: 30 s. Haga clic en Aplicar. Haga clic en Iniciar/Continuar en la esquina superior izquierda del software para iniciar la ejecución de verificación.
      NOTA: Asegúrese de que la conexión de los pozos a la estación RTCA sea correcta observando "Placa escaneada. Conexiones OK" en la parte inferior de la página.
  2. Ejecución de verificación de resistencias para el análisis de datos
    1. En la pestaña Índice de celda , compruebe los datos al finalizar la ejecución. Todos los valores de IC deben ser inferiores a 0,063.
    2. En la parte inferior de la pestaña Índice de celda , compruebe los datos de escaneo sin procesar. Los datos de escaneo sin procesar deben mostrar patrones de valores repetidos de 40,0 ± 2,0 (filas A y H), 67,5 ± 2,5 (filas B y G), 93,6 ± 2,9 (filas C y F) y 117,6 ± 3,2 (filas D y E).
    3. Para detener la ejecución de la verificación, haga clic en Placa > Placa de liberación. La placa de resistencia RTCA de 96 pocillos ya está lista para ser retirada de la estación RTCA.
  3. Obtención de lectura de antecedentes en RTCA
    1. Lave la placa de microelectrodo de oro especializada recubierta de colágeno tipo 1 (recubierta con 20 μg/ml de colágeno tipo 1) con 60 μl/pocillo de solución salina equilibrada de Hank (HBSS; con bicarbonato de sodio, sin cloruro de calcio ni sulfato de magnesio) 2 veces.
    2. Deseche el HBSS restante y agregue 50 μL/pocillo de ECM. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada que contiene ECM con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.
    3. En la pestaña Exp Notes del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo (formato de 96 pocillos).
    4. En la pestaña Diseño en la pestaña Celda del software RTCA, resalte los pozos que se utilizarán y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos (atenuados).
    5. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Step_1 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software para obtener una lectura de fondo.
      NOTA: Asegúrese de que la conexión de los pocillos sea correcta observando "Placa escaneada. Conexiones OK" en la parte inferior de la página.
    6. Una vez que se obtiene la lectura de fondo, la placa de microelectrodo de oro especializada ahora está lista para la siembra celular y lista para ser retirada de la estación RTCA.
  4. Preparación de HUVEC en la placa especializada de microelectrodos de oro
    1. Siembre los HUVEC en la placa de microelectrodos de oro especializada con 50 μL/pocillo de medio acondicionado, 1 x 104 células/pocillo (medio acondicionado: ECM suplementado con 10% de FBS, 0,01% de ECGS y 0,01% de P/S). Vuelva a colocar la placa en la estación RTCA con el pocillo A1 hacia adentro para la incubación nocturna en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Se realizó un recuento celular en la suspensión celular con un factor de dilución de dos utilizando un hemocitómetro.
    2. En la pestaña Programación , haga clic en Agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_2 y cambie los Barridos: 601 e Intervalo: 2 min. Haga clic en Aplicar. Haga clic en Step_2 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software.
    3. Después de 20 h de incubación y cuando los valores de IC en la pestaña Gráfico de pocillos muestran una meseta, la placa está lista para la infección. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Abortar paso.
    4. La placa de microelectrodo de oro especializada ahora está lista para ser retirada de la estación RTCA para los pasos posteriores.

3. Infección viral en HUVECs

  1. Dilución de virus
    1. El cultivo de la madre ZIKV se mantiene a -80 °C. Para este estudio, se debe retirar el stock de virus guardado en los viales criogénicos y diluir el stock de ZIKV con MEC sin suero en tubos de centrífuga de 1,5 ml para lograr una multiplicidad de infecciones (MOI) de 0,1 y 1.
      NOTA: El stock de ZIKV se preparó previamente realizando la propagación en células Vero y cosechando el sobrenadante34 del ZIKV.
  2. Infección de la monocapa celular
    1. Retire y deseche el medio acondicionado (ECM suplementado con 10% de FBS, 0.01% de ECG y 0.01% de P/S) de cada pocillo. Enjuague cada pocillo con 60 μL de HBSS 2x. Inserte el HBSS con la ayuda del costado del pozo; No dispare la monocapa de la célula.
    2. Trabajando de la dilución más alta a la más baja, agregue 40 μL de cada muestra de virus diluida en ECM sin suero en el pocillo. Triplicar el pocillo para cada dilución y mantener seis pocillos sin infección (control negativo y trombina control positivo). No dispare a la monocapa de la célula; En su lugar, agregue el virus diluido con la ayuda del costado del pocillo. Utilice una punta de pipeta nueva para cada inserción.
      NOTA: Se eligió la trombina como control positivo, ya que puede aumentar rápidamente la permeabilidad endotelial de los HUVEC.
    3. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 para permitir la adsorción del virus. Agite la placa 5 veces cada 15 minutos para permitir la adsorción del virus en toda la monocapa celular.
  3. Adición del medio de cultivo celular superpuesto
    1. Después de 1 h de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta.
    2. Lavar las células infectadas con 60 μL de HBSS 2x. Cubra el pocillo con ECM suplementado con un 2% de FBS. Para los pocillos de control positivo, diluir la trombina a 20 U/ml con MEC suplementada con FBS al 2% y recubrir los pocillos con medio de MEC que contenga trombina. No dispare a la monocapa de la célula; En su lugar, agregue medios superpuestos con la ayuda del lado del pozo.
  4. Colocación de la placa de microelectrodo de oro especializada infectada de nuevo en la estación RTCA
    1. En la pestaña Programación , haga clic en Agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_3 y cambie los Barridos: 3.601 y el Intervalo: 2 min. Haga clic en Aplicar.
    2. Haga clic en Aceptar en la ventana emergente que aparece. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada infectada con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivo celular.
    3. Haga clic en Step_3 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software.

4. Análisis de datos y exportación de datos

  1. Adición de información experimental de cada pozo
    1. En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Celda (Figura 2A). Para ingresar la información de la celda de destino y determinar el tipo de pocillo para cada pozo, resalte el pocillo y escriba el nombre, el número y el color de la celda de destino en la parte inferior del software. Haga clic en Aplicar (Figura 2B).
    2. Para seleccionar y determinar el tipo de pozo para cada pozo en la pestaña Celda , resalte el pozo, seleccione el tipo de pozo (muestra, control positivo o control negativo) y haga clic en Establecer.
    3. En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Tratamiento (Figura 2C). Para ingresar la información del tratamiento, resalte el pocillo y escriba el nombre del tratamiento, la concentración del tratamiento, la unidad y el color. Haga clic en Aplicar (Figura 2D).
    4. Para seleccionar y determinar el tipo de pocillo para cada pocillo en la pestaña Tratamiento , resalte el pozo, seleccione el tipo de pocillo (muestra, control positivo o control negativo) y haga clic en Establecer.
      NOTA: Para cada selección, se pueden resaltar varios pozos al mismo tiempo.
  2. Normalización del valor de IC
    1. Haga clic con el botón derecho a la derecha de la pestaña Análisis de datos y seleccione Índice de celda normalizado en el cuadro desplegable Eje Y (Figura 3A). En la sección Eje X en la parte inferior, seleccione el tiempo normalizado como el último punto de tiempo medido donde se retiró la placa de microelectrodo de oro especializada para la infección (Figura 3B).
      NOTA: El proceso de normalización llevado a cabo por el software elimina la mayor parte de la variabilidad debida a las diferencias en la siembra y adhesión de los pozos, siempre y cuando el punto de normalización elegido sea anterior a la adición del virus y/o al tratamiento. Por lo tanto, el punto de tiempo óptimo de normalización debe ser el último punto de tiempo antes de la adición del virus y/o del tratamiento. El punto de tiempo para normalizar se puede comprobar en la pestaña Programación en Step_2. El tiempo total indicado es el punto de tiempo para normalizar (Figura 3C).
  3. Representación gráfica de los datos obtenidos mediante el software RTCA
    1. En la pestaña Análisis de datos , seleccione los pozos que se agregarán al gráfico resaltando los pozos y haciendo clic en << Agregar. El índice de celda normalizado con respecto al gráfico de tiempo ya está listo para copiarse y exportarse. Asegúrese de marcar la casilla de verificación Promedio .
  4. Exportación de datos con el software RTCA
    1. En la esquina superior izquierda del software RTCA, haga clic en Placa > Exportar información del experimento.... Marque la casilla para seleccionar los datos que se van a exportar. Haga clic en Aceptar.
      NOTA: Los datos sin procesar (valores de CI sin procesar) se pueden exportar cuando la opción Índice de celda > Todo está marcada.
    2. Seleccione la carpeta para guardar el archivo de exportación. Haga clic en GUARDAR. Aparecerá una ventana emergente que indica la exportación de la información experimental. Una vez finalizada la exportación, aparecerá otra ventana que indica que la información del experimento exportado está lista para ser vista.

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Representative Results

Antes de la infección por ZIKV, el IC registrado para la monocapa de HUVEC cultivada en una placa de microtitulación especializada recubierta de microelectrodos de oro estaba por encima de 8, lo que sugiere fuertes propiedades de adherencia. Las placas o pocillos con un índice de IC inferior a 8 deben desecharse. A continuación, los HUVEC se infectaron con ZIKV a un MOI de 0,1 y 1, y se registró la impedancia celular durante 7 días. El valor de IC de los HUVEC infectados con ZIKV P6-740 a un MOI de 0,1 (línea azul claro) comenzó a disminuir a las 15 h después de la infección (HPI), en comparación con el control de infección negativo (línea marrón; Figura 4). En cuanto a los HUVEC infectados con una dosis más alta de ZIKV P6-740 a un MOI de 1 (línea azul), el valor de IC comenzó a disminuir ya a 11 HPI. A los 24 HPI, hubo una disminución del 5% y del 7% en el valor normalizado del IC (0,949, 0,929) cuando los CE se infectaron con el ZIKV con un MOI de 0,1 y 1, respectivamente. Se registró una reducción del 50% en el valor normalizado de IC a 96 HPI y a 66,75 HPI tras la infección por ZIKV con un MOI de 0,1 y 1, respectivamente. El valor normalizado de IC alcanzó su punto más bajo en 107 HPI, donde hubo una reducción del 51% y 60% (0,4915, 0,3984) tras la infección por ZIKV con un MOI de 0,1 y 1, respectivamente. Se encontró que el valor de IC normalizado tenía un aumento del 4% y del 13% desde 107 HPI en adelante hasta el final del experimento a 168 HPI (0,5128, 0,4571). La línea negra muestra los efectos de la trombina utilizada como control positivo, donde los valores de IC se mantuvieron bajos durante todo el experimento, imitando la disrupción de las uniones estrechas e indujeron fuga vascular35.

Figure 1
Figura 1: Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). La figura está en un aumento de 40x para ver la tasa de confluencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Capturas de pantalla de la pestaña Celda y Tratamiento en la pestaña Diseño del software RTCA. (A) En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Celda . (B) Para ingresar la información de la celda de destino y determinar el tipo de pocillo para cada pozo, resalte el pocillo y escriba el nombre, el número y el color de la celda de destino en la parte inferior del software. Haga clic en Aplicar. (C) Haga clic en la pestaña Diseño en la pestaña Tratamiento . (D) Para ingresar la información del tratamiento, resalte el pocillo y escriba el nombre del tratamiento, la concentración del tratamiento, la unidad y el color. Haga clic en Aplicar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Capturas de pantalla de la pestaña Análisis de datos en el software RTCA para la normalización del índice de celdas. (A) En el cuadro desplegable Eje Y , seleccione Índice de celda normalizado. (B) En la sección Eje X , seleccione el tiempo de normalización. (C) Captura de pantalla de la pestaña Programación en el software RTCA. El tiempo de normalización se indica en el Step_2 tiempo total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Gráfico normalizado del índice celular frente al tiempo de la infección por el virus del Zika (ZIKV) en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). La placa de microelectrodo de oro especializada se recubrió con 20 μg/mL de colágeno tipo 1. Los HUVECs se sembraron a una densidad de 1.0 x 104 células/pocillo. Para la infección se utilizó ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1). Azul claro: ZIKV P6-740 (MOI: 0,1); azul: ZIKV P6-740 (MOI: 1); negro: trombina como control positivo (20 U/mL); Marrón: Control negativo de infecciones. Cada punto de datos significa el promedio y se analizó por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Dibujo esquemático de la técnica utilizada en la impedancia eléctrica del biosensor basada en el RTCA. Una vista lateral de la placa del pozo; En el fondo de los pozos hay terminales negativos y positivos chapados en oro. A medida que el instrumento mide CI en el micropocillo que contiene medios de cultivo que permiten conducir la electricidad, el electrón fluye del terminal negativo al positivo. Cuando se trata de un control en blanco, el flujo de electrones es suave, por lo que no se registra impedancia. Cuando las células se siembran, y a medida que más y más células se adhieren al fondo del pozo, la impedancia en el flujo de electrones está presente y registrada por la computadora. Usando este valor de impedancia, el instrumento lo convierte en un valor CI, indicando el número de celdas adheridas al fondo del pocillo (adhesión). Creado con BioRender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La infección viral citocida en células permisivas suele asociarse a cambios sustanciales en la morfología celular y la biosíntesis36. Los cambios morfológicos celulares inducidos por el virus, como el encogimiento celular, el agrandamiento celular y/o la formación de sincitios, también se conocen como efectos citopáticos (CPE), característicos de ciertas infecciones virales37. En los CE, el CPE se describió como la destrucción de las células y la ruptura de las uniones estrechas entre cada CE, lo que provoca la ruptura de la barrera endotelial 38,39. Los CPE en los HUVEC pueden describirse como desprendimiento de células monocapa y flotación del recipiente de cultivo de tejidos. Los cambios morfológicos de las células infectadas, como el desprendimiento y la flotación de las células adherentes, se pueden detectar continuamente mediante el método RTCA. Esta técnica se basa en la impedancia eléctrica, que permite la monitorización de las células en tiempo real hasta cada pocos segundos. Permite cuantificar la proliferación celular, los cambios morfológicos y, en el caso de los HUVEC, se puede utilizar para monitorizar los cambios en la integridad endotelial y la función de barrera celular40 tras la estimulación.

En este estudio, el paso crítico es la configuración del experimento, donde se utiliza la placa de resistencia de 96 pocillos. Esto es para garantizar que todas las conexiones del analizador estén bien conectadas a la placa. En RTCA, el valor de impedancia medido se convierte en un valor de IC para diferenciar las diferencias en el número de células, el grado de adhesión, la morfología celular y la viabilidad celular41. La caída de la impedancia registrada por el analizador RTCA, que se traduce en una caída en el valor de IC, sugiere un número celular reducido, un grado de adhesión más débil y cambios sustanciales en la morfología celular42. Por lo tanto, también es importante probar la idoneidad de las líneas celulares y el número óptimo de células que se utilizarán en el experimento RTCA. Es fundamental determinar si se puede lograr el índice de IC deseado antes de la ejecución de las pruebas en las células utilizando el sistema RTCA. Además, esto también ayuda a determinar si el sistema RTCA es adecuado para monitorear el crecimiento celular y los perfiles de muerte celular de tipos celulares seleccionados. En nuestro estudio, se observó una fuerte caída en los valores de IC cuando los HUVEC se infectaron con ZIKV P6-740 en MOI de 0,1 y 1. La fuerte caída en el valor de IC, lo que sugiere que los cambios morfológicos celulares de HUVEC ocurrieron después de la infección, y esto condujo a la interrupción de las uniones estrechas y la integridad vascular de la CE.

Convencionalmente, los CPE causados por la infección viral de células in vitro se estiman en función de la observación microscópica de las células infectadas. Además, algunos otros ensayos, como el ensayo de placa, permiten la visualización de los CPE (como el desprendimiento celular) y se utilizan para medir la extensión de los CPE42. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones, ya que solo proporcionan información sobre puntos de tiempo discretos de los cambios morfológicos celulares (ensayos de punto final). Otros ensayos, como la tinción por inmunofluorescencia, se basan en combinaciones de anticuerpos específicos marcados con un fluoróforo para visualizar los cambios morfológicos43. Aunque el ensayo de inmunofluorescencia tiene una amplia capacidad que permite la visualización de muchos componentes en cualquier tipo de tejido o célula, esta técnica no permite el monitoreo y la detección en tiempo real durante la infección viral. Por el contrario, el sistema RTCA registra los cambios morfológicos celulares en tiempo real durante la infección viral, lo que permite capturar efectos transitorios, como fugas vasculares transitorias, que podrían pasar desapercibidos en los ensayos de punto final. Por ejemplo, los ensayos de punto final no detectarían los datos y los cambios morfológicos a partir de 60 HPI, 80 HPI y 100 HPI. Además de la RTCA, la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) es otro método comúnmente utilizado para monitorear las interacciones de célula a célula, donde se mide la resistencia eléctrica a través de la monocapa celular. Sin embargo, el TEER requiere varias mediciones repetidas a lo largo del tiempo para monitorear las actividades de las células vivas y, a menudo, se realiza en un número menor de muestras o pocillos a la vez. Como resultado, TEER suele tener un rendimiento más bajo en comparación con RTCA, que puede ejecutar hasta 96 pozos simultáneamente44.

A pesar de sus beneficios, el sistema RTCA tiene varias limitaciones. La principal limitación del sistema RTCA es el costoso equipo y los consumibles. Las placas especializadas de microelectrodos de oro utilizadas por el sistema RTCA son relativamente costosas, de un solo uso y desechables45. Además, los cambios morfológicos celulares no pueden ser visualizados y capturados en una grabadora (cámara), ni el ensayo puede capturar la acumulación del antígeno del virus o los cambios en la proteína de la superficie celular, como la VE-cadherina en los HUVECs46. Como resultado, el RTCA no puede visualizar los cambios morfológicos celulares que proporcionarían información útil adicional para dilucidar la patogénesis de la enfermedad. Durante el establecimiento del ensayo o del modelo, sería útil una verificación adicional de la tinción, como la tinción de VE-cadherina para los HUVEC, para validar las mediciones obtenidas. Además, el sistema RTCA se limita a las líneas celulares adherentes, ya que requiere la unión de células en el fondo de los pocillos para que se registre la impedancia. Por lo tanto, el ensayo reportado no se puede utilizar para líneas celulares no adherentes46.

En conclusión, hemos descrito un protocolo de análisis celular en tiempo real utilizando el instrumento RTCA para monitorizar los cambios en las células endoteliales tras la infección por ZIKV en formato de 96 pocillos. Este método ofrece varias ventajas sobre los ensayos convencionales de punto final, ya que permite un enfoque no invasivo y no intensivo en marcaje para monitorizar continuamente los cambios morfológicos celulares en tiempo real. Este ensayo también se puede utilizar para analizar los cambios en la integridad vascular de otras líneas celulares en diferentes configuraciones experimentales.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019) y la financiación en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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References

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Biología Número 195 Células endoteliales de la vena umbilical humana Infección viral Basado en impedancia Análisis celular en tiempo real Células endoteliales Barrera Intercambio de fluidos Intercambio de solutos Diseminación de virus Permeabilidad endotelial Interrupción de la barrera celular endotelial Fuga vascular Analizador celular en tiempo real Infección por el virus del Zika (ZIKV) Índice celular (IC) Efectos transitorios Cambios morfológicos celulares Integridad vascular
Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia
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Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

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