Summary
该协议提供了一种快速确定柑橘品种中花粉相容性和不相容性的方法。
Abstract
柑橘使用基于S-RNase的自不相容性来拒绝自花粉，因此需要附近的传粉树才能成功授粉和施肥。然而，确定合适的品种作为授粉媒介是一个耗时的过程。为了解决这个问题，我们开发了一种利用琼脂糖凝胶电泳和苯胺蓝染色来鉴定授粉相容柑橘品种的快速方法。花粉相容性是通过提取总DNA并使用特定引物进行基于PCR的基因分型测定来确定的 S基因型 。此外，在手动授粉后3-4天收集样式，并进行苯胺蓝染色。最后，用荧光显微镜观察花粉管的生长状态。花粉相容性和不相容性可以通过分别观察花粉管生长是正常还是抑制来确定。该方法具有简便性和成本效益，是确定不同柑橘品种花粉相容性和不相容性以建立不同品种间不相容性群和不相容关系的有效工具。这种方法为成功选择合适的授粉者树木提供了必要的信息，从而有助于建立新的果园和为育种计划选择合适的亲本。
Introduction
自不相容性（SI）是一种遗传控制机制，存在于大约40%的被子植物物种中。在这个过程中，雌蕊排斥具有相同SI基因型的植物的花粉，从而防止自施肥1，2。马家柚子是中国金那水省的地方品种，具有大而粉红色的果实、丰富的果汁含量、酸甜的味道和厚皮的优良品质3.虽然SI促进异交，但它对果实的产量和质量产生负面影响4，并且需要具有不同SI基因型的合适授粉树，以获得可靠的坐果率和高产量。目前SI主要有两种类型，以芸苔科为代表的孢子体自不相容性（SSI）和以蔷薇科、木瓜科、芸香科和茄科5，6，7，8为代表的配子体自不相容性（GSI）。
柑橘是世界上最重要的水果作物之一。基于S-RNase的GSI系统存在于许多柑橘种质中，并对坐果率产生负面影响9。在该系统中，SI 由 S 位点控制，S 位点是具有两个携带雌蕊 S 行列式和花粉 S 行列式7 的复杂等位基因的单个多态性位点。雌性决定簇是S核糖核酸酶（S-RNase），雄性决定簇是S位点F-box（SLF）7。雌蕊的细胞分泌S-RNase蛋白。非自身S-RNase被SLF蛋白识别，这导致非自身S-RNase被26S蛋白酶体途径泛素化和降解。相反，自身S-RNA酶能够积累并抑制花粉管（PT）的生长，因为它们逃避SLF蛋白，因此被阻止泛素化10，11，12，13。
在这里，我们报告了一种体内技术，该技术可用于识别S基因型以及花粉相容性和不相容性的程度。该协议涉及从叶子中提取总DNA，并使用S特异性引物预测S基因型。此外，苯胺蓝染色和荧光显微镜检查，然后是人工授粉，为相容性和不相容性提供了证据。半体内授粉程序涉及在实验室14，15中手动授粉花朵，也已适应评估自相容性和不相容性的程度。然而，我们也使用田间授粉，然后是花朵的袋子，以避免不需要的花粉污染，使花粉管在自然条件下发育。该协议简单明了，为成功选择合适的传粉媒介树提供了必要的信息。
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Protocol
1.苯胺蓝染色的制备
- 为实验准备以下试剂和工具：传粉刷、镊子、铅笔、硫酸盐纸、授粉袋、拉链袋、回形针、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、离心管、镊子、滴胶器、载玻片、盖玻片、手术刀和聚乙二醇。
- 制备含有0.02%MgSO4，0.01%KNO 3，0.03%Ca（NO 3）2，0.01%H 3 BO 3，20%PEG-4000和15%蔗糖的体外发芽培养基。用KOH将pH调节至6.0-6.2。使用磁力搅拌器，因为PEG-4，000难以溶解。
- 准备Carnoy固定溶液，它是无水乙醇和冰醋酸以3：1的比例混合。制备FAA固定溶液，其为40%甲醛，80%乙醇和冰醋酸（1：8：1）。制备4M氢氧化钠（NaOH）和苯胺蓝溶液，其在0.1M K3PO 4中为0.1%苯胺蓝。 使用琥珀色瓶子储存苯胺蓝溶液，因为它对光敏感。
2. 花粉采集
- 提前了解实验树（本研究中的马家柚树）的开花期。从开花期开始到开花高峰期收集成熟的未开封的花朵，并将它们放入拉链袋中。花朵可以在4°C的冰箱中储存24小时。
- 把花带到实验室。使用镊子收集花药，并将它们放入含有滤纸的培养皿中。收集20至30朵花的花药。
- 将含有花药的培养皿放入28°C烤箱中24小时，直到花粉粒干燥。详细的花卉组织见胡等人9。
- 将干燥的花粉放入 1.5 mL 离心管中。将花粉保存在装有变色硅胶（干燥剂）的密封拉链袋中。关闭袋子，并在袋子上贴上花粉品种的名称和储存日期。干燥的花粉可以在-20°C冰箱中储存96周16。
3. 体外 花粉萌发试验
- 将 300 μL 液体培养基倒入细胞培养皿或 2 mL 离心管的盖子中，并在授粉刷的帮助下均匀撒上花粉。将花粉在28°C的潮湿黑暗环境中孵育12小时。
- 取下 1，000 μL 移液器吸头尖端的顶部 1 mm。使用移液器用少量培养液吸收花粉并将其移动到显微镜载玻片的中心。用盖玻片盖住它。使用10倍物镜用倒置显微镜观察标本。
- 对每个重复使用大致相同的花粉密度进行三个独立的重复17。目视管理花粉量，确保整个培养皿被花粉覆盖，并且每个培养皿的花粉量几乎相等。
- 发芽的花粉产生一个花粉管，其长度约为其直径的两倍。计算 20 个视野的发芽率，给出所有花粉场中发芽花粉的百分比。
4. 授粉
- 选择晴朗无风的日子授粉。选择10个即将开放的完全发育的芽，小心地剥开花瓣，注意不要擦伤它们。
- 使用授粉刷将足够数量的活花粉散布到柱头表面，并注意不要损坏雌蕊。对于自花授粉，请使用来自同一植物/栽培品种的花粉。对于异花授粉，请使用来自不同基因型的植物的花粉。
- 用硫酸盐纸袋覆盖授粉的花朵。使用回形针密封袋子并防止基因典型不同的花粉授粉。
- 在标签上写下物种名称以及授粉的次数和时间。将标签挂在授粉花朵附近的树枝上。
5. 取样、固定和保存
- 授粉后约3-4天取出授粉袋，并将授粉的花收集在拉链袋中。
- 立即从花朵上取下花瓣、容器和卵巢，并将融合到样式的柱头浸入含有新鲜制备的固定溶液的离心管中。将柱头和样式在固定剂溶液中在4°C孵育过夜。
- 第二天，丢弃固定剂溶液，并在95%乙醇中清洗柱头和样式两到三次。
- 将样式转移到70%乙醇溶液中。确保样品完全浸入溶液中。此阶段的样式可以在4°C下储存1-2个月。
6. 苯胺蓝染色
- 用蒸馏水洗涤储存在70%乙醇中的样式样品三到四次。浸入4M NaOH溶液中，密封并在65°C水浴中孵育60分钟。在此步骤中，样式的颜色从黄白色更改为橙红色。
- 将风格浸泡在蒸馏水中30分钟。丢弃蒸馏水，用蒸馏水清洗样式三到四次或直到样式的颜色变黄。
- 将样品放入10mL管中，加入苯胺蓝直到样品浸渍，并在黑暗中染色12小时。
- 用荧光显微镜观察花粉管的生长。
7. 荧光显微镜
- 在观察标本之前，将载玻片放在平坦的桌子上，并在载玻片表面加入两到三滴聚乙二醇。
- 用蒸馏水清洗要观察的样式。用手术刀沿纵轴将其分成两半。将样式的一半放在载玻片上，并用盖玻片盖住。
- 将载玻片放在孔径上方的显微镜载物台上，并使用10倍物镜进行可视化。使用 DAPI 滤光片（激发波长：325-375 nm;发射波长：435-485 nm）。观察每种授粉的五种风格。观察花粉管生长。
8. 基于PCR的 S 基因型鉴定
- 使用 CTAB 方法18 从柱头样本中提取基因组 DNA。
- 将收集的叶子放入 2 mL 离心管中，并在液氮中快速冷冻。以 1：1：3：5 的比例制备 HCl：EDTA：NaCl：H2O 缓冲液和比例为 24：1 的氯仿异戊醇混合物
- 将 10 mL 制备的缓冲液、0.2 g CTAB 和 200 μL 巯基乙醇加入 50 mL 离心管中，并将它们放入 65 °C 的水浴中 5 分钟，直到溶液变得清澈透明。
- 将刀片放入研钵中，加入冷冻样品，加入液氮，研磨。将研磨的样品放入 2 mL 离心管中，加入 600 μL CTAB 混合物，将其置于 65 °C 的水浴中 60 分钟，每 30 分钟倒置混合一次。
- 加入 700 μL 氯仿异戊醇混合物 （24：1），倒置混合 10 分钟。在24°C下以12，000× g 离心10分钟，移液上清液，并转移到1.5mL离心管中。
- 加入 60 μL 5 M NaCl 溶液和 1 mL 无水乙醇，倒置混合。在-20°C下冷冻30分钟，并在24°C和9，000× g 下离心5分钟。
- 弃去上清液，加入1mL的70%乙醇溶液，在室温下放置1-2小时。在24°C，9，000× g 下离心5分钟，弃去上清液，吸出过量的乙醇溶液，风干5分钟。
- 加入 100 μL 无菌水溶解，用分光光度计测量 DNA 浓度，并在 -4 °C 冰箱中冷冻以长期储存。
- 配置 RT-PCR 反应系统。为 10 μL 制备以下反应混合物，其中含有 5 μL 2x PCRMix、0.25 μL 正向和反向引物、1 μL DNA （100 ng/ μL） 和 3.5 μL H2O。
- 按照 表1设置PCR程序。所有亚型的PCR程序为95°C5分钟32x（95°C30秒，55°C30秒，72°C1分钟）和72°C5分钟。在 1.5% TAE-琼脂糖凝胶上分离产品并拍照9.使用基因组DNA验证指定的S基因型。
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Representative Results
对于这里进行的实验，选择成熟的花朵，收集花药，在烤箱中干燥，花粉在28°C下发芽12小时。花粉活力和发芽率如图 1所示进行量化。
人工授粉柑橘，采用苯胺蓝染色和荧光显微镜评估花粉相容性和不相容性。相容的花粉可以在柱头表面发芽并产生正常的花粉管，该花粉管可以生长并最终导致卵巢受精。相比之下，不相容的花粉管通过大约三分之二的样式生长，然后停止生长（图2）。
为了鉴定S基因型，从植物中提取了总DNA。根据S位点的序列设计特异性引物，可用于扩增PCR反应中的部分S位点。使用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。检测到扩增的条带（在500-1，000 bp之间）。鉴定出相应的S基因型（图3）。通过该方法鉴定了63种柚子种质资源7的S基因型。我们小组使用这种方法鉴定了不同柑橘物种中的21种S单倍型19（表2）。
图1：不同的花粉萌发率。 花粉的发芽和生长。（A）活花粉具有较高的发芽率，可以生长正常的花粉管。（B）无活力或活力较差的花粉发芽率要低得多，很少有花粉管可以生长。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：授粉后雌蕊中花粉管的荧光显微镜图像。 （A）具有许多生长花粉管的自相容雌蕊。（B）自不相容的雌蕊与花粉管生长在样式内停滞。缩写：Pt = 花粉管;VB = 维管束。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：来自马家柚树的 S-RNase 基因的特异性扩增。 PCR扩增和凝胶电泳后发现，两个扩增的条带S10 和S16 最亮。这些数据表明，马家桫椤的基因型为S10 和S16。 请点击此处查看此图的大图。
表 1： 该反应系统用于基于PCR的 S 基因型鉴定。 请按此下载此表格。
表 2： 我们小组鉴定的柑橘中21种 S 基因型的引物列表。 请按此下载此表格。
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Discussion
在水果作物中，单性生殖和SI都是重要的性状，因为它们为无籽水果铺平了道路 - 这一性状受到消费者的高度赞赏。自不相容性促进了对自花粉的排斥，从而防止了近亲繁殖20。在柑橘中，柚子是一种自我不相容的品种7。几乎40%的被子植物物种表现出SI21。这种性状阻碍了坐果，降低了产量，给种植者带来了巨大的经济损失。为了解决这个问题，农民在整个果园中种植传粉树。然而，选择合适的传粉媒介树木是一项具有挑战性的任务，需要耗时的实验室实验。为了解决这些问题，我们开发了一种快速识别SI基因型的方法，并确定不同柑橘品种的花粉相容性和不相容性，以促进传粉树的准确选择。此外，花粉活力和发芽率也可以使用本协议中描述的 体外 方法确定。
有一些关于在日本李子和杏中使用不同方法的组合确定SI基因型和自（in）相容性和相互（in）相容性的报道22，23。S特异性引物的开发依赖于S基因型的鉴定。在柑橘中，对来自64种柚子种质的柱头和花粉的转录组分析已经确定了9种S-RNA酶在样式中特异性表达的S-RNA酶和S-RNase的一种变体。另外12对S特异性引物后来由Liang等人7和Wei等人19在柑橘中开发。然而，相对于梨和苹果，在柑橘4中鉴定出的S基因型较少。鉴定基于PCR的S基因型是一个关键步骤，因为它为兼容/不兼容的组合提供了基础。此协议也存在一些限制。某些柑橘品种的S基因型不能用这种方法鉴定。这一发现表明，需要进一步扩展柑橘中的S基因型文库。此外，S特异性引物无法区分具有高度相似S序列的栽培品种的S基因型，因此无法非特异性扩增相似的S序列。
总之，由于其成本效益和易用性，该方法是确定不同柑橘品种的花粉相容性和不相容性的有效工具。该协议可用于选择合适的传粉者树和育种研究计划。它可以应用于芸香科的几个物种（例如， 柑橘三叶柑 橘和 Fortunella japonica），以选择传粉树。
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Disclosures
作者声明他们没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目得到了中国国家自然科学基金（32122075，32072523）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
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