利用人工授粉、显微观察和S-基因型分析确定柑橘类植物的自交（不）亲和性及种间（不）亲和性关系

摘要

本方案提供了一种快速测定柑橘品种花粉亲和性与不亲和性的方法。

摘要

柑橘利用基于S-RNase的自交不亲和性来排斥自花花粉，因此需要邻近的授粉树以实现成功授粉和受精。然而，筛选适合作为授粉树的品种是一个耗时的过程。为解决这一问题，我们开发了一种快速鉴定授粉亲和性柑橘品种的方法，该方法结合琼脂糖凝胶电泳与苯胺蓝染色。通过提取总DNA并使用特异性引物进行基于PCR的基因分型分析，可确定S基因型，从而判断花粉亲和性。此外，在人工授粉后3-4天采集花柱，并进行苯胺蓝染色处理。最后，利用荧光显微镜观察花粉管的生长情况。通过观察花粉管是否正常生长或受到抑制，可分别判断为亲和或不亲和。由于该方法操作简便且成本低廉，是确定不同柑橘品种间花粉亲和性与不亲和性的有效工具，可用于建立不亲和性类群及不同品种间的不亲和关系。该方法为合理选择适宜授粉树提供了关键信息，从而有助于新建果园的规划以及育种项目中亲本的优选。

引言

自交不亲和性（SI）是一种由遗传控制的机制，存在于约40%的被子植物物种中。在此过程中，雌蕊会拒绝与自身具有相同SI基因型的花粉，从而防止自花授粉^1,2。马家柚子是中国江苏省的地方品种，具有果实大、果肉粉红、汁多、酸甜适口、果皮厚等优良性状³。尽管自交不亲和性促进了异花授粉，但它会对果实的产量和品质产生负面影响⁴，因此需要配置具有不同SI基因型的适宜授粉树，以保证坐果率和高产。目前，自交不亲和性主要分为两种类型：孢子体型自交不亲和性（SSI），以Brassicaceae科植物为代表；配子体型自交不亲和性（GSI），以Rosaceae、Papaveraceae、Rutaceae和Solanaceae科植物为代表^5,6,7,8。

柑橘是世界上最重要的果树作物之一。基于S-RNase的配子体自交不亲和（GSI）系统存在于许多柑橘种....

方案

1. 茌苯蓝染色的准备工作

1. 准备以下试剂和工具：授粉刷、镊子、铅笔、硫酸纸、授粉袋、自封袋、回形针、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、离心管、镊子、胶头滴管、载玻片、盖玻片、解剖刀和聚乙二醇。
2. 准备 体外 含0.02% MgSO₄的萌发培养基₄，0.01% KNO₃，0.03% Ca(NO₃)₂，0.01% H₃BO₃，20% PEG-4000 和 15% 蔗糖。用 KOH 调节 pH 至 6.0–6.2。由于 PEG-4,000 难以溶解，需使用磁力搅拌器。
3. 配制卡诺氏固定液，即无水乙醇与冰醋酸按3:1比例混合。配制FAA固定液，即40%甲醛、80%乙醇与冰醋酸按1:8:1比例混合。配制4 M氢氧化钠（NaOH）溶液和苯胺蓝溶液，后者为0.1%苯胺蓝溶于0.1 M K₃PO_4. 使用棕色瓶储存苯胺蓝溶液，因其对光敏感。

2. 花粉采集

1. 提前了解实验树木（本研究为马家柚）的开花期。从开花期开始至盛花期采集成熟的未开放花朵，并放入自封袋中。花朵可在4 °C冰箱中保存24小时。
2. 将花朵带回实验室。用镊子采集花药，....

结果

本实验选用成熟花朵，收集花药并在烘箱中干燥，随后将花粉在28°C条件下培养12小时以诱导萌发。花粉活力及萌发率的测定结果如图1所示。

柑橘进行了人工授粉，并通过苯胺蓝染色和荧光显微镜观察评估花粉的亲和性与不亲和性。亲和的花粉能够在柱头表面萌发，并形成正常的花粉管，花粉管能够正常生长并最终进入子房完成受精。相比之下，不亲和的花粉管仅能伸长至花柱的大约三分之二处，随后停止生长（图2）。

为了鉴定 S 基因型，从植物中提取总DNA。根据序列设计特异性引物 S 可用于扩增部分片段的位点 S PCR反应中的位点。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。检测到扩增条带（大小在500-1,000 bp之间）。相应的 S 基因型被鉴定（图3）。通过该方法，我们已鉴定出 S 63 份.......

讨论

在果树作物中，单性结实和自交不亲和性（SI）都是重要性状，因为它们为生产无籽果实铺平了道路——这一性状深受消费者青睐。自交不亲和性可促进植株排斥自花花粉，从而防止近交²⁰。在柑橘类作物中，柚为自交不亲和品种⁷。约40%的被子植物物种表现出自交不亲和性²¹。该性状会阻碍果实发育，降低产量，并给种植者带来巨大的经济损失。为解决这一问题，果农通常在果园中种植授粉树。然而，选择合适的授粉树是一项具有挑战性的任务，需要耗时的实验室实验。为解决这些问题，我们开发了一种快速鉴定SI基因型的方法，并确定不同柑橘品种间花粉亲和性与不亲和性，以促进授粉树的精准选配。此外，还可利用本实验方案中所述的体外（in vitro）方法测定花粉活力和萌发率。

已有部分研究报告采用多种方法相结合的方式对日本李和杏的SI基因型以及自交（不）亲和性与种间（不）亲和性进行鉴定^22,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
苯胺蓝	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
硼酸，H3BO3	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004818
棕色瓶	Labgic Technology Co., Ltd
硝酸钙四水合物，Ca(NO3)2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	80029062
离心管	Labgic Technology Co., Ltd
离心管	Labgic Technology Co., Ltd
CTAB	GEN-VIEW SCIENTIFIC INC	57-09-0(CAS)
滴管	Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
乙二胺四乙酸，EDTA	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009617
镊子	LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
甲醛	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010018
全自动样品快速研磨仪	上海净信工业发展有限公司	Tissuelyser-96
冰乙酸	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10000218
研磨管	上海净信工业发展有限公司
异戊醇	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10003218
异丙醇	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	80109218
标签	M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Leica DMi8	上海徕卡有限公司	21903797
七水合硫酸镁，MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10013018
显微镜盖玻片	浙江世泰工业有限公司
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
回形针	M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
铅笔	M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
授粉刷	上海艺美塑料有限公司
聚乙二醇，PEG 6000	北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司	DH229-1
聚乙二醇，PEG-4000	广州赛国生物科技有限公司	1521GR500
氢氧化钾，KOH	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10017008
硝酸钾，KNO3	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10017218
手术刀	江苏松畅医疗器械有限公司
载玻片	浙江世泰工业有限公司
氢氧化钠，NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019718
蔗糖	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10021418
防油纸	泰州金农网业厂
恒温水浴锅	上海精宏实验设备有限公司	L-909193
三氯甲烷	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
三水合三碱式磷酸三钾，K3PO4	上海凌峰化学试剂有限公司	20032318
Tris-HCl	GEN-VIEW SCIENTIFIC INC	1185-53-1
自封袋	M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-巯基乙醇	GEN-VIEW SCIENTIFIC INC	60-24-2(CAS)