Summary
このプロトコルは、柑橘類の品種における花粉の適合性と非適合性を決定するための迅速な方法を提供します。
Abstract
柑橘類はS-RNaseベースの自己不適合を使用して自家花粉を拒絶するため、受粉と受精を成功させるには近くの花粉症の木が必要です。ただし、花粉症として機能するのに適した品種を特定することは、時間のかかるプロセスです。この問題を解決するために、我々は、アガロースゲル電気泳動とアニリンブルー染色を利用した受粉適合柑橘類品種を迅速に同定する方法を開発しました。花粉の適合性は、全DNAを抽出し、特異的プライマーを用いてPCRベースのジェノタイピングアッセイを行うことにより、 S 遺伝子型の同定に基づいて決定されます。さらに、手動受粉の3〜4日後にスタイルを収集し、アニリンブルー染色を行います。最後に、花粉管の成長状況を蛍光顕微鏡で観察する。花粉の適合性と非適合性は、花粉管の成長が正常であるか抑制されているかをそれぞれ観察することによって確立できます。この方法は、その単純さと費用対効果のために、異なる柑橘類品種の花粉適合性および非適合性を決定して、異なる品種間の非適合性グループおよび非適合性関係を確立するための効果的なツールである。この方法は、適切な花粉媒介者の木の選択を成功させるために不可欠な情報を提供し、したがって、新しい果樹園の設立と繁殖プログラムのための適切な親の選択を容易にします。
Introduction
自己不適合(SI)は、被子植物種の約40%に存在する遺伝的に制御されたメカニズムです。このプロセスでは、雌しべは同じSI遺伝子型を持つ植物からの花粉を拒絶し、したがって自家受精を防ぎます1,2。Ma jia pummeloは、中国の金蘇省の地元の品種で、大きくてピンク色の果実、豊富な果汁、甘酸っぱい味、厚い皮の優れた品質を備えています3。SIは交配を促進しますが、果物の収量と品質に悪影響を及ぼし4、信頼性の高い結実率と高収量のために、異なるSI遺伝子型を持つ適切な花粉症の木を必要とします。現在、SIには、アブラナ科に代表される胞子体自己不適合(SSI)と、バラ科、パパベラ科、ミカン科、ナス科に代表される配偶体自己不適合(GSI)の2つの主要なタイプがあります5,6,7,8。
柑橘類は世界で最も重要な果物作物の一つです。S-RNaseベースのGSIシステムは、多くの柑橘類のアクセッションに見られ、結実率に悪影響を及ぼします9。このシステムでは、SIは、雌しべS決定基と花粉S決定基7を運ぶ2つの複雑な対立遺伝子を持つ単一の多型遺伝子座であるS遺伝子座によって制御されます。雌の決定基はSリボヌクレアーゼ(S-RNase)であり、雄の決定基はS遺伝子座Fボックス(SLF)7です。雌しべの細胞はS-RNaseタンパク質を分泌します。非自己S-RNaseはSLFタンパク質によって認識され、26Sプロテアソーム経路による非自己S-RNaseのユビキチン化と分解につながります。対照的に、自己S-RNaseは、SLFタンパク質を回避し、したがってユビキチン化を妨げるため、花粉管(PT)の成長を蓄積して阻害することができます10,11,12,13。
本稿では、S遺伝子型や花粉の適合性・不適合度を特定するのに役立つin vivo技術について報告する。このプロトコルでは、葉から全DNAを抽出し、S特異的プライマーを使用してS遺伝子型を予測します。さらに、アニリンブルー染色とそれに続く手受粉による蛍光顕微鏡検査は、適合性と非適合性の程度の証拠を提供します。実験室での花の手動受粉を含む半生体内受粉手順14,15も、自己適合性および非適合性の程度を評価するために適応されています。しかし、私たちはまた、花粉管が自然条件で発達できるように、望ましくない花粉による汚染を避けるために、野外受粉とそれに続く花の袋詰めを使用しました。このプロトコルはシンプルでわかりやすく、適切な花粉症の木をうまく選択するために必要な情報を提供します。
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Protocol
1.アニリンブルー染色の準備
- 実験用の試薬とツールを準備します:花粉媒介者ブラシ、ピンセット、鉛筆、硫酸塩紙、受粉バッグ、ジップロックバッグ、ペーパークリップ、ホルムアルデヒド、氷酢酸、無水エタノール、遠心管、鉗子、接着剤スポイト、スライドガラス、カバーガラス、メス、およびポリエチレングリコール。
- 0.02%MgSO4、0.01%KNO 3、0.03%Ca(NO 3)2、0.01% H 3 BO 3、20%PEG-4000、および15%スクロースを含むin vitro発芽培地を調製します。KOHでpHを6.0〜6.2に調整します。PEG-4,000は溶解しにくいためマグネチックスターラーを使用してください。
- 無水エタノールと氷酢酸を3:1の比率で混合したCarnoyの固定液を調製します。40%ホルムアルデヒド、80%エタノール、および氷酢酸(1:8:1)であるFAA固定溶液を調製します。4 M 水酸化ナトリウム(NaOH)および0.1 M K3PO 4中の0.1%アニリンブルーであるアニリンブルー溶液を調製する。 アニリンブルー溶液は感光性であるため、琥珀色のボトルを使用して保管してください。
2.花粉収集
- 実験木(本研究ではMa jia pummelo)の開花期を事前に把握しておく。開花期の初めから開花ピーク期までの成熟した未開封の花を集め、ジップロックバッグに入れます。花は冷蔵庫で4°Cで24時間保存できます。
- 花を研究室に持って行きます。ピンセットを使って葯を集め、ろ紙の入ったペトリ皿に入れます。20から30の花から葯を集めます。
- 葯の入ったペトリ皿を28°Cのオーブンに24時間入れ、花粉粒が乾くまで24時間入れます。花の詳細な構成については、Hu et al.9を参照してください。
- 乾燥した花粉を1.5mLの遠沈管に入れます。花粉は、色が変わるシリカゲル(乾燥剤)が入った気密ジップロックバッグに入れて保管してください。袋を閉じて、花粉の種類の名前と保管日を袋にラベル付けします。乾燥した花粉は、-20°Cの冷蔵庫で96週間保存できます16。
3. 体外 花粉発芽試験
- 300 μLの液体培地を細胞培養皿または2 mL遠沈管のキャップに注ぎ、受粉ブラシを使用して花粉を均等に振りかけます。加湿された暗い環境で28°Cで12時間花粉をインキュベートします。
- 1,000 μLピペットチップの上部1 mmを取り外します。ピペットを使用して少量の培養液で花粉を吸収し、顕微鏡スライドの中央に移動します。カバーガラスで覆います。10倍対物レンズを使用して倒立顕微鏡で標本を観察します。
- 各反復17についてほぼ同じ花粉密度を使用して3つの独立した反復を実行する。花粉の量を視覚的に管理し、ペトリ皿全体が花粉で覆われていること、および各ペトリ皿にほぼ同じ量の花粉があることを確認します。
- 発芽した花粉は、直径の約2倍の長さの花粉管を生成します。20の視野から発芽率を計算し、すべての花粉畑で発芽した花粉の割合を示します。
4.受粉
- 受粉のために風のない晴れた日を選択してください。開こうとしている完全に発達した芽を10個選び、花びらを注意深く剥がし、傷つけないように注意してください。
- 受粉ブラシを使用して、十分な量の生存可能な花粉を柱頭の表面に広げ、雌しべを傷つけないように注意してください。自家受粉には、同じ植物/栽培品種からの花粉を使用します。他家受粉には、異なる遺伝子型を持つ植物からの花粉を使用してください。
- 受粉した花を硫酸塩紙袋で覆います。ペーパークリップを使用してバッグを密封し、遺伝子型的に異なる花粉による受粉を防ぎます。
- 種の名前と受粉の数と時間をラベルに書いてください。受粉した花の近くの枝にラベルを掛けます。
5.サンプリング、固定、保存
- 受粉後約3〜4日で受粉バッグを取り出し、受粉した花をジップロックバッグに集めます。
- すぐに花から花びら、容器、卵巣を取り除き、スタイルに融合した柱頭を、新しく調製した固定液を入れた遠心チューブに浸します。柱頭とスタイルを固定液で4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、固定液を廃棄し、柱頭とスタイルを95%エタノールで2〜3回洗浄します。
- スタイルを70%エタノール溶液に移します。サンプルが溶液に完全に浸されていることを確認してください。この段階でのスタイルは、4°Cで1〜2か月間保存できます。
6.アニリンブルー染色
- 70%エタノールに保存されたスタイルサンプルを蒸留水で3〜4回洗浄します。4 M NaOH溶液に浸して密封し、65°Cの水浴中で60分間インキュベートします。この手順では、スタイルの色が黄白色からオレンジ赤色に変わります。
- スタイルを蒸留水に30分間浸します。蒸留水を捨て、蒸留水で3〜4回、またはスタイルの色が黄色になるまでスタイルを洗います。
- サンプルを10 mLチューブに入れ、サンプルが浸されるまでアニリンブルーを加え、暗所で12時間染色します。
- 花粉管の成長を蛍光顕微鏡で観察します。
7. 蛍光顕微鏡
- 標本を観察する前に、スライドを平らなテーブルに置き、スライドの表面に2〜3滴のポリエチレングリコールを加えます。
- 観察するスタイルを蒸留水で洗います。メスを使用して、縦軸に沿って2つの半分に分割します。スライドガラスの上にスタイルの半分を置き、カバーガラスで覆います。
- スライドを顕微鏡のステージの開口部の上に置き、10倍の対物レンズを使用して視覚化します。DAPIフィルター(励起:325-375 nm、発光:435-485 nm)を使用します。受粉の種類ごとに5つのスタイルを観察します。花粉管の成長を観察します。
8. PCRベースの S 遺伝子型の同定
- CTABメソッド18を使用して、柱頭サンプルからゲノムDNAを抽出します。
- 採取した葉を2mLの遠沈管に入れ、液体窒素中で急速凍結する。HCl:EDTA:NaCl:H2Oバッファーを1:1:3:5の比率で調製し、クロロホルムイソアミルアルコール混合物を24:1の比率で調製します。
- 調製したバッファー10 mL、CTAB0.2 g、メルカプトエタノール200 μLを50 mL遠沈管に加え、溶液が透明透明になるまで65°Cの水浴に5分間入れます。
- ブレードを乳鉢に入れ、凍結したサンプルを加え、液体窒素を加えて粉砕します。粉砕したサンプルを2 mLの遠沈管に入れ、600 μLのCTAB混合物を加え、65°Cの水浴に60分間入れ、30分ごとに逆さまに混合します。
- 700 μLのクロロホルムイソアミルアルコール混合物(24:1)を加え、逆さまに10分間混合します。24°Cで12,000 x g で10分間遠心分離し、上清をピペットで移動し、1.5 mL遠沈管に移します。
- 60 μLの5 M NaCl溶液と1 mLの無水エタノールを加え、逆さまに混合します。-20°Cで30分間凍結し、24°Cで9,000 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、70%エタノール溶液1mLを加え、室温で1〜2時間放置する。24°C、9,000 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、余剰のエタノール溶液を吸引し、5分間風乾します。
- 滅菌水100μLを加えて溶解し、分光光度計でDNA濃度を測定し、-4°Cの冷凍庫で凍結して長期保存します。
- RT-PCR反応システムを構成します。5 μLの2x PCRMix、0.25 μLのフォワードプライマーとリバースプライマー、1 μLのDNA(100 ng/μL)、および3.5 μLのH2Oを含む10 μLの以下の反応混合物を調製します。
- 表1に従ってPCRプログラムを設定します。すべてのアイソフォームのPCRプログラムは、95°Cで5分32倍(95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで1分)および72°Cで5分間でした。1.5%TAE-アガロースゲルで生成物を分離し、写真9.ゲノムDNAを使用して、指定されたS遺伝子型を確認します。
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Representative Results
ここで行われた実験では、成熟した花を選び、葯を集めてオーブンで乾燥させ、花粉を28°Cで12時間発芽させました。花粉生存率と発芽率を 図1に示すように定量化した。
柑橘類は手作業で受粉し、花粉の適合性と不適合性をアニリンブルー染色と蛍光顕微鏡を使用して評価しました。互換性のある花粉は柱頭の表面で発芽し、成長し、最終的に卵巣の受精につながる可能性のある正常な花粉管を生成する可能性があります。対照的に、互換性のない花粉管は、スタイルの約3分の2で成長し、その後成長を停止しました(図2)。
S遺伝子型を同定するために、植物から全DNAを抽出した。特異的プライマーは、PCR反応においてS遺伝子座の一部を増幅するのに有用なS遺伝子座の配列に基づいて設計した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動を用いて分析した。増幅されたバンドが検出された(500〜1,000bpの間)。対応するS遺伝子型が同定されました(図3)。この方法により、63個のプンメロ生殖質資源7のS遺伝子型を同定した。私たちのグループは、この方法を使用して、さまざまな柑橘類種で21のSハプロタイプを特定しました19(表2)。
図1:花粉発芽率の違い。 花粉の発芽と成長(A)生存可能な花粉は発芽率が高く、正常な花粉管を成長させることができます。(B)生存不能または生存率の低い花粉は発芽率がはるかに低く、花粉管はほとんど成長できません。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:受粉後の雌しべの花粉管の蛍光顕微鏡画像。 (A)多数の成長する花粉管を備えた自己適合性の雌しべ。(B)スタイル内で花粉管の成長が阻止された自己不適合の雌しべ。略語:Pt =花粉管;VB =血管束。スケールバー= 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Ma jia pummelo由来のS-RNase遺伝子の特異的増幅。PCR増幅およびゲル電気泳動の後、2つの増幅バンドS10およびS16が最も明るいことがわかった。これらのデータは、Ma jia pummeloの遺伝子型がS10およびS16であったことを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: PCRベースの S 遺伝子型同定に使用される反応系。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 2: 私たちのグループによって同定された柑橘類の21 S 遺伝子型のプライマーのリスト。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
果物作物では、単為結果性とSIの両方が種なし果実への道を開くため、重要な形質です-消費者から高く評価されている形質です。自己不適合は自家花粉の拒絶を促進し、したがって近親交配を防ぎます20。柑橘類の中で、プメロは自己不適合品種です7。すべての被子植物種のほぼ40%がSI21を示します。この特性は結実を妨げ、収量を低下させ、生産者に莫大な経済的損失をもたらします。この問題を解決するために、農家は果樹園全体に花粉症の木を含めます。しかし、適切な花粉症の木の選択は、時間のかかる実験室実験を必要とする困難な作業です。これらの問題を解決するために、花粉症の木の正確な選択を容易にするために、SI遺伝子型を特定し、異なる柑橘類品種の花粉の適合性と非互換性を決定するための迅速な方法を開発しました。さらに、花粉生存率および発芽率は、このプロトコルに記載されている in vitro 方法を使用して決定することもできる。
梅と杏の22,23では,SI遺伝子型と自己(非)適合性および相互適合性の決定に関する報告があります。S特異的プライマーの開発は、S遺伝子型の同定に依存しています。柑橘類では、64のプンメロアクセッションからの柱頭と花粉のトランスクリプトーム分析により、スタイルに特異的に発現する9つのS-RNaseとS-RNaseの1つのバリアントが特定されました。さらに12対のS特異的プライマーが、後にLiangら7およびWeiら19によって柑橘類で開発された。ただし、ナシやリンゴと比較して、柑橘類4で確認されているS遺伝子型は少なくなっています。PCRベースのS遺伝子型の同定は、互換性/非互換性の組み合わせの基礎を提供するため、重要なステップです。このプロトコルにはいくつかの制限もあります。一部の柑橘類品種のS遺伝子型は、この方法では識別できません。この知見は、柑橘類におけるS遺伝子型ライブラリーのさらなる拡大が必要であることを示している。さらに、S特異的プライマーは、S配列が非常に類似している品種のS遺伝子型を区別できないため、類似のS配列を非特異的に増幅します。
全体として、その費用対効果と使いやすさのために、この方法は、さまざまな柑橘類の品種に対する花粉の適合性と非互換性を判断するための効果的なツールです。このプロトコルは、適切な花粉症の木の選択や育種研究プログラムに使用できます。ミカン科のいくつかの種(例えば、 カンキツトリフォリアータ や フォーチュネラジャポニカ)に適用して、花粉症の木を選択できます。
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Disclosures
著者は、開示するものは何もないと宣言しています。
Acknowledgments
このプロジェクトは、中国国家自然科学財団(32122075、32072523)によって財政的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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