Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Abstract

De meeste bacteriën, waaronder mycobacteriën, genereren extracellulaire blaasjes (EV's). Aangezien bacteriële EV's (bEV's) een subset van cellulaire componenten bevatten, waaronder metabolieten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren, hebben verschillende groepen de native of recombinante versies van bEV's geëvalueerd op hun beschermende potentie als subeenheid-vaccinkandidaten. In tegenstelling tot native EV's zijn recombinante EV's moleculair gemanipuleerd om een of meer immunogenen van belang te bevatten. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen verschillende benaderingen onderzocht voor het genereren van recombinante bEV's. Hier rapporteren we echter het ontwerp, de constructie en de verrijking van recombinante mycobacteriële EV's (mEV's) in mycobacteriën. Daarvoor gebruiken we Mycobacterium smegmatis (Msm), een avirulente bodemmycobacterie als modelsysteem. We beschrijven eerst de generatie en verrijking van native EV's van Msm. Vervolgens beschrijven we het ontwerp en de constructie van recombinante mEV's die ofwel mCherry bevatten, een rood fluorescerend reportereiwit, ofwel EsxA (Esat-6), een prominent immunogeen van Mycobacterium tuberculosis. Dit bereiken we door mCherry en EsxA N-termini afzonderlijk te fuseren met de C-terminus van een klein Msm-eiwit Cfp-29. Cfp-29 is een van de weinige overvloedig aanwezige eiwitten van MsmEV's. Het protocol voor het genereren en verrijken van recombinante mEV's uit Msm blijft identiek aan het genereren en verrijken van native EV's van Msm.

Introduction

Ondanks de ontwikkeling en toediening van een breed scala aan vaccins tegen infectieziekten, vindt zelfs tot op de dag van vandaag ~30% van alle menselijke sterfgevallen nog steeds plaats door overdraagbare ziekten. Vóór de komst van het tuberculosevaccin (tbc) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - was tuberculose doodsoorzaak nummer één (~10.000 tot 15.000/100.000 inwoners)2. Met de toediening van BCG en gemakkelijke toegang tot eerste- en tweedelijns anti-tbc-medicijnen, is het aantal tbc-gerelateerde sterfgevallen in 2022 dramatisch gedaald tot ~1 miljoen/jaar in 2022 (d.w.z. ~15-20/100.000 inwoners1). In tbc-endemische populaties van de wereld blijven tbc-gerelateerde sterfgevallen echter ~100-550/100.000 inwoners1. Hoewel experts verschillende redenen erkennen die tot deze scheve cijfers leiden, lijkt BCG-gemedieerde bescherming die zelfs het eerste decennium van het leven niet duurt, de belangrijkste reden te zijn 3,4,5,6,7. Bijgevolg is er, gezien de vernieuwde 'Sustainable Development Goals' van de VN en de 'End TB Strategy' van de WHO, een gezamenlijke wereldwijde inspanning om een veel beter vaccinalternatief voor BCG te ontwikkelen dat misschien levenslange bescherming tegen tuberculose biedt.

Om dat doel te bereiken, evalueren verschillende groepen momenteel gemodificeerde/recombinante BCG-stammen, niet-pathogene en verzwakte mycobacteriële soorten anders dan BCG, en subeenheidkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Doorgaans zijn subeenheidvaccins liposomen die selectief zijn geladen met enkele gezuiverde (~1-6) volledige of afgeknotte immunogene eiwitten van de ziekteverwekker. Echter, vanwege hun onechte vouwen in niet-inheemse conformaties en/of willekeurige niet-functionele interacties tussen de geladen eiwitten, missen subeenheden vaak native en germane epitopen en slagen ze er daarom niet in om het immuunsysteem voldoende te primen14,19,20.

Bijgevolg zijn extracellulaire blaasjes (EV's) van bacteriën in een stroomversnelling gekomen als een veelbelovend alternatief 21,22,23,24,25,26. Doorgaans bevatten bacteriële EV's (bEV's) een subset van hun cellulaire componenten, waaronder enkele delen nucleïnezuren, lipiden en honderden metabolieten en eiwitten27,28. In tegenstelling tot liposomen waar een paar gezuiverde eiwitten kunstmatig worden geladen, bevatten bEV's honderden natuurlijk geladen, native-gevouwen eiwitten met een betere neiging om het immuunsysteem te stimuleren, vooral zonder de boost/hulp van adjuvantia en Toll-like receptor (TLR) agonisten27,28,29. Het is in deze onderzoekslijn dat wij en anderen het nut van mycobacteriële EV's hebben onderzocht als potentiële subunit-boosters voor BCG30. Ondanks de bezorgdheid dat bEV's geen uniforme antigeenbelasting hebben, hebben EV's van verzwakte Neisseria meningitidis mensen met succes beschermd tegen serogroep B-meningokokken31,32.

In ieder geval theoretisch zijn de beste EV's die BCG goed zouden kunnen stimuleren de EV's die zijn verrijkt met pathogene bacteriën. Het verrijken van EV's gegenereerd door pathogene mycobacterium is echter duur, tijdrovend en riskant. Bovendien kunnen door ziekteverwekkers gegenereerde EV's virulenter dan beschermend zijn. Gezien de potentiële risico's rapporteren we hier een goed getest protocol voor de verrijking van EV's gegenereerd door axenisch gekweekte Msm, een avirulente mycobacterie.

Ondanks het feit dat ze coderen voor verschillende orthologen van pathogene eiwitten, missen avirulente mycobacteriën verschillende vaccinantigenen/pathogene eiwitepitopen die nodig zijn om het immuunsysteem voldoende voor te bereiden op bescherming33. Daarom hebben we ook onderzoek gedaan naar het construeren en verrijken van recombinante EV's van Msm door middel van moleculaire engineering, zodat een aanzienlijk deel van elk pathogeen eiwit dat van belang is en wordt uitgedrukt en vertaald in Msm, zijn EV's moet bereiken. We veronderstelden dat een of meer van de top 10 overvloedige eiwitten van Msm EV's, wanneer ze worden gefuseerd met het eiwit van belang, zullen helpen bij een dergelijke translocatie.

Terwijl we begonnen met het standaardiseren van de verrijking van mycobacteriële EV's (mEV's) in ons laboratorium, rapporteerden Prados-Rosales et al. in 2011 voor het eerst de visualisatie en verrijking van mEV's in vitro30. Later, in 2014, publiceerde dezelfde groep een aangepaste versie van hun methode uit 201134. In 2015 rapporteerden Lee et al. ook een onafhankelijk gestandaardiseerde methode voor mEV-verrijking, opnieuw uit axenische culturen van mycobacteriën35. Door beide protocollen 34,35 te combineren en enkele van onze wijzigingen op te nemen na grondige standaardisatie, beschrijven we hier een protocol dat helpt bij het routinematig verrijken van mEV's uit axenische culturen van mycobacteriën36.

Hier beschrijven we in het bijzonder de verrijking van Msm-specifieke EV's, wat een uitbreiding is van een gepubliceerd protocol36 voor de verrijking van mycobacteriële EV's in het algemeen. We beschrijven ook hoe we recombinante mEV's (R-mEV's) kunnen construeren die het mCherry-eiwit bevatten (als een rode fluorescerende reporter) en EsxA (Esat-6)37,38,39, een overheersend immunogeen en een potentiële subeenheid vaccinogeen van Mycobacterium tuberculosis. Het protocol voor het verrijken van de R-mEV's blijft identiek aan het protocol dat we hebben beschreven voor het verrijken van native EV's van Msm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Groeiomstandigheden van Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli en hun derivaten

  1. Media
    1. Middlebrook 7H9 vloeibare bouillon
      1. Bereid 20% Tween-80 bouillonoplossing door het benodigde volume dubbel gedestilleerd water (ddw) in een glazen bekerglas voor te verwarmen tot ~45-50 °C in een magnetron, voeg het vereiste volume Tween-80 toe met behulp van een geschikte maatcilinder en roer continu op een kleine magnetische roerder om de 20% Tween-80 in een uniforme oplossing te brengen. Filtreer de 20% Tween-80 door een 0,22 um verwijderingsfilter en bewaar de lichtgele stockoplossing bij 4 °C.
        OPMERKING: Alle sporen van Tween-80 in de maatcilinder moeten in het bekerglas worden overgebracht voor een nauwkeurige eindconcentratie. Autoclaaf de voorbereide Tween-80-voorraad niet. Filter (gebruik 0,22 μM), steriliseer en bewaar bij 4 °C.
      2. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding van de 7H9 bouillon. Suspendeer 4,7 g 7H9 poeder in 900 ml ddw. Voeg 2 ml glycerol toe, meng de inhoud en autoclaaf bij 121 °C, 15 psi gedurende 20 minuten.
        NOTITIE: Voeg geen Middlebrook ADC-verrijking (ADC) en Tween-80 toe vóór het autoclaveren.
      3. Nadat de geautoclaveerde media zijn afgekoeld tot kamertemperatuur (RT, d.w.z. ~25 oC), voegt u in een standaard A2-type bioveiligheidskast aseptisch 10x voorraad van 100 ml ADC (laatste 1x) en 2,5 ml (laatste 0,05%) 20% Tween-80 toe. Filtreer het mengsel door een wegwerpfiltereenheid van 0,22 μm en bewaar de zeer lichte geelgroene, transparante stockoplossing bij 4 °C.
        OPMERKING: De pH van het medium moet ~6.6 tot 6.8 zijn (als <6.4 of >7.0 is, gooi het dan weg en maak het opnieuw). Bewaren bij 4 °C (3-4 weken stabiel). Het wordt ten zeerste aanbevolen om de 7H9-media (na toevoeging van ADC en Tween-80) twee keer te filteren door twee onafhankelijke wegwerpfiltereenheden van 0,22 μm.
    2. Sauton's (minimale media) vloeibare bouillon
      1. Los L-asparagine (0,4% m/v) en citroenzuur (0,2% m/v) op in 950 ml ddw. Voeg 1 ml vers bereide 1.000x bouillon (in ddw) dibasisch kaliumfosfaat toe (kleurloos; bouillon 10 g/20 ml; laatste 1x 0,5 g/l); magnesiumsulfaat-heptahydraat (kleurloos; voorraad 10 g/20 ml; laatste 1x 0,5 g/l); en ijzerammoniumcitraat (zeer lichtbruin; bouillon 1,6 g/40 ml; laatste 1x 0,04 g/l) en roer goed op een magneetroerder.
        OPMERKING: In het beste geval kunnen de 1.000x aandelen 2 weken oud zijn; indien ouder dan dat, bereid verse bouillons voor; bewaar ze bij RT in het donker (bijv. in een kast/plank). Als het ijzerammoniumcitraat donkerbruin is, gooi het dan weg en maak het vers. Het is het beste om de drie zouten toe te voegen in de volgorde die in stap 1.1.2.1 wordt vermeld. Draai de oplossing elke keer rond voordat u elke zoutoplossing toevoegt.
      2. Meet en noteer de pH met behulp van een pH-meter; Zorg ervoor dat het rond de 3.1 tot 3.2 ligt. Als de pH hoger is dan 3,7, gooi de bouillons dan weg en bereid ze vers voor. Om de pH op 7,4 te brengen, gebruikt u zoveel druppels 10 N natriumhydroxide als nodig is. Controleer de uiteindelijke pH terwijl u de oplossing/media continu roert op een magnetische roerder.
      3. Voeg 4,76 ml glycerol toe, 0,25 ml 20% Tween-80 (laatste 0,005%, zie ook opmerking bij stap 2.2.1.3) en vul dan het volume aan tot 1 L. Filter vervolgens tweemaal de 1 L medium met twee afzonderlijke verwijderingsfilters van 0,22 μm. Bewaar het heldere, kleurloze medium bij 4 °C (stabiel gedurende 2 weken).
        OPMERKING: Pas nadat de pH is aangepast aan 7.4, voeg glycerol toe. Anders worden de media troebel wit. Als het troebel is, gooi het dan weg (probeer het niet te verwarmen) en bereid het vers voor. Gebruik voor alle mEV's-bereidingen vers bereide Sauton's.
    3. Middlebrook 7H11 agar basis
      1. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding. Suspendeer 19 g 7H11 poeder in 900 ml ddw. Voeg 5 ml glycerol toe, draai op een magneetroerder om een uniforme suspensie te verkrijgen (lichtgroen; pH 6,6 tot 6,8; indien >7,2, gooi weg en bereid vers) en autoclaaf bij 121 °C, 15 psi, en gedurende 20 minuten.
        OPMERKING: Voeg geen ADC en 0.05% Tween-80 toe voor het autoclaveren.
      2. Wanneer het medium is afgekoeld tot ~50 oC, voeg dan aseptisch in een bioveiligheidskast van het type A2 100 ml ADC (naar RT gebracht) en 2,5 ml 20% (laatste 0,05%) Tween-80 (naar RT gebracht) toe. Onmiddellijk aseptisch doseren in petrischalen.
        OPMERKING: Platen zijn stabiel bij 4 °C gedurende ten minste 4-6 weken. Zorg ervoor dat de platen een nacht op RT staan voordat u de platen inpakt voor opslag van 4 °C. Anders komt er tijdens de incubatie bij 37 °C vocht vast te zitten in de platen.
    4. Miller Luria Bertani (LB) bouillon en Agar basis
      1. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding. Om LB Bouillon te bereiden, suspendeert u 25 g poeder in 1.000 ml ddw en roert u gedurende 5 minuten zachtjes in een glazen bekerglas op een magneetroerder. Na uniforme suspensie, aliquoteert u de vereiste volumes in mediaflessen (bijv. 300 ml in een mediafles van 500 ml) en autoclaaf. Om LB Agar te bereiden, suspendeert u 40 g poeder in 1.000 ml ddw en autoclaaf (12 g poeder in 300 ml ddw in een glazen mediafles van 500 ml).
  2. Groei-omstandigheden
    OPMERKING: Alle stappen van het bacteriekweekwerk moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast (type A2). Alle culturen moeten worden verwerkt met steriele buisjes, kolven en pipetpunten.
    1. Dag 1
      1. Voeg 1 ml glycerolvoorraad Msm (van -80 oC vriezer) toe aan 2 x 10 ml (in 50 ml steriele conische gecentrifugeerde buisjes) vers geautoclaveerde, gekoelde en voorverwarmde (~37 oC) 7H9 bouillon, draai driemaal, sluit de deksels en incubeer de buisjes een nacht bij 37 °C en 200-220 tpm (incubatorschudder).
        OPMERKING: Om Mycobacterium tuberculosis (Mtb) te kweken, volgt u vergelijkbare stappen, maar incubeert u de buisjes van 50 ml gedurende 4-6 dagen bij 37 °C en 120-150 tpm (couveuseschudder) in BSL3-instellingen. Volg ALLE internationale richtlijnen en bioveiligheidspraktijken van BSL3- en risicogroep 3-pathogenen bij het hanteren en weggooien van Mtb en zijn culturen. Gebruik een bioveiligheidskast van het type B2 voor het hanteren van Mtb en zijn culturen.
    2. Dag 2
      1. Wanneer OD 600 (een600nm; celdensitometer) ~1,0 bereikt, centrifugeert u de Msm-culturen gedurende 10 minuten bij 3.200 × g en RT (tafelcentrifuge). Gooi de supernatanten weg met behulp van steriele pipetpunten van 1 ml.
        OPMERKING: De bovenstaande stap blijft hetzelfde voor Mtb-culturen, behalve dat het aantal dagen 4-7 is. Zorg ervoor dat u de bacteriekorrel niet aanraakt met de pipetpunt.
      2. Wassen: Voeg aan elke Msm-pellet 1 ml voorverwarmde Sauton's (at RT) media toe (stap 1.1.2) en resuspendeer voorzichtig met pipetpunten van 1 ml om een gelijkmatige suspensie te verkrijgen. Gebruik steriele pipetpunten om de volumes aan te vullen tot 10 ml (in elk) met hetzelfde medium. Centrifugeer de suspensies gedurende 10 minuten bij 3.200 × g en RT en gooi de supernatanten weg. Herhaal deze stap nog een keer.
        OPMERKING: De bovenstaande stap blijft hetzelfde voor Mtb-culturen.
      3. Resuspendeer de tweemaal gewassen Msm-cellen in 20 ml (elk) voorverwarmde Sauton's (voorverwarmd in een plaat of shaker-incubator) en meet de optische dichtheid van de cellen bij 600 nm. Inoculeer het vereiste volume Msm-culturen in steriele erlenmeyers van 1 L die ~330 ml steriele Sauton's bevatten, zodat de uiteindelijke OD600 ~0,05 is.
        OPMERKING: Suspensies moeten altijd in een klein volume beginnen. Als het uiteindelijke volume in één stap direct aan de pellet wordt toegevoegd, blijven de cellen over als diffuse pellets (een indicator van slechte resuspensie). De enige manier om het probleem op te lossen, is door de culturen te verlagen en de resuspensie opnieuw uit te voeren zoals aanbevolen. De bovenstaande stap blijft hetzelfde voor Mtb-culturen.
    3. Dag 2/3
      1. Incubeer de cultuur van 330 ml in de incubatorschudder bij 200 tpm en 37 °C totdat de kweek OD600 ~0,3 bereikt. Was vervolgens de cellen één keer (vergelijkbaar met stap 1.2.2.2 maar met hetzelfde volume) en resuspendeer de pellet vervolgens in hetzelfde volume. Verdeel 50 ml van de geresuspendeerde culturen elk in zes steriele erlenmeyers van 1 liter, die elk 280 ml steriele voorverwarmde Sauton's bevatten met 1/10van de normaal gebruikte (0,05%) Tween-80, d.w.z. 0,005% (zie ook de opmerking bij stap 2.2.1.3. om te begrijpen waarom 1/10e). De uiteindelijke OD600 moet ca. 0,05 bedragen.
        OPMERKING: Gebruik voor Mtb-culturen in plaats van erlenmeyers rolflessen (met een inhoud van 1/2/4 liter). Stel het kweekvolume per fles zo in dat wanneer het op het rolapparaat wordt bewaard, de cultuur de opening van de fles niet bereikt. Het werkelijke volume in de rolfles is afhankelijk van de capaciteit van de rolfles.
      2. Incubeer elk van de culturen van 330 ml in de incubatorschudder bij 200 tpm en 37 °C totdat OD600 2,0 tot 2,5 bereikt (~15-18 uur).
        OPMERKING: Zorg er voor Mtb-culturen voor dat de uiteindelijke OD600 ~1.0-1.2 is (duurt ~5-8 dagen).

2. Verrijking van Msm-mEV's door gebruik te maken van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

  1. Dag 4
    1. Centrifugeer de ~2 L Msm-culturen in het midden van de exponentiële fase in 6 x 400 ml steriele centrifugeflessen bij 4 °C gedurende 20 minuten bij ~8.000 × g (vloermodel centrifuge). Verzamel het gebruikte media-/cultuursupernatans in twee voorgekoelde, geautoclaveerde erlenmeyers van 1 liter en bewaar een aliquot van de pellet voor eventuele analytische procedures (zoals SDS-PAGE en western blotting - hier niet beschreven).
      NOTITIE: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in koude (~ 4 °C) om de integriteit van de mEV's beter te behouden. De mEV's zijn vrij stabiel bij RT, maar koeling is een must voor stabiliteit op lange termijn (herhaaldelijk invriezen en ontdooien wordt niet aanbevolen). Tijdens axenische cultuurgroei distantiëren mEV's zich van het oppervlak van Msm/Mtb en hopen ze zich op in de bovenliggende/gebruikte media van de cultuur.
    2. Filtreer het Msm-cultuursupernatans eerst door de 0,45 μm verwijderingsfiltereenheid(en) en vervolgens door de 0,22 μm verwijderingsfiltereenheid(en) om alle sporen van bacteriën te verwijderen.
      OPMERKING: Directe filtratie door de 0.22 μm-filters verstikt vaak de filtereenheden (omdat de bacteriepellet kan worden verstoord tijdens het uitvoeren van stap 2.1.1.). Om Mtb-kweeksupernatanten te genereren, voert u drie filtraties van Mtb-culturen uit (d.w.z. de eerste filtratiestap met een wegwerpfiltereenheid van 0,45 μm; twee opeenvolgende filtratiestappen met wegwerpfiltereenheden van 0,22 μm) voordat de kweekfiltraten naar BSL-2-instellingen worden verplaatst.
  2. Dag 4/5
    1. Gebruik de 30 kDa membraanconcentrators om het Msm-cultuurfiltraat (~2 L) te concentreren tot ~ 38 ml door het kweekfiltraat te centrifugeren bij 4 °C, 20 min en bij 3.200 × g.
      1. Was de concentrators eerst voor met steriel, koud ddw (~15 ml) (wassen op 4 °C, 5 minuten en op 3.200 × g).
      2. Wassen met ~15 ml voorgefilterde, koude Sauton's (zelfde omstandigheden als voor water (2.2.1.1.))) om alle sporen van chemicaliën (gebruikt tijdens de productie) te verwijderen.
      3. Aangezien ~130 centricons (indien slechts één gebruik) technisch vereist zijn om ~2 L kweekfiltraat te concentreren, moet u de centricons indien nodig minstens 3-4 keer hergebruiken. Volg deze stappen: concentreer 15 ml op 0,5 tot 1,0 ml (volg stap 2.2.1), breng het concentraat over in een schone, geautoclaveerde en koude ultracentrifugebuis van 38 ml en breng vervolgens het resterende niet-geconcentreerde kweekfiltraat opnieuw over naar de gebruikte centriconen voor herhalingsconcentratie.
        OPMERKING: Het gebruik van 24, 30 kDa concentrators om 2 L kweekfiltraat te concentreren duurt maximaal 6 uur. Bij het concentreren van het kweekfiltraat wordt de Tween-80 ook geconcentreerd en kan de concentrator blokkeren. Het gebruik van Tween-80 tot 0,005% final (in plaats van 0,05%) in de media van Sauton helpt deze blokkade te voorkomen. De verlaagde concentratie van Tween-80 heeft geen invloed op de uniforme suspensie van Msm tijdens de groei en veroorzaakt geen samenklontering van Msm-cellen. Omdat Mtb-cellen echter klonteren met 0,005% Tween-80, gebruikt u 0,05% Tween-80 voor Mtb-specifieke EV's.
    2. Breng het geconcentreerde Msm-cultuurfiltraat (~38 ml) over in een schone, gewassen (met ddw) en voorgekoelde polypropyleen centrifugebuis van 40-50 ml en onderwerp het aan een centrifugatie in twee stappen, eerst bij 4.000 × g en vervolgens bij 15.000 × g, beide stappen bij 4 °C gedurende 20 minuten (om al het vuil te verwijderen). Gebruik hiervoor een centrifuge van het vloertype.
  3. Dag 5/6
    1. Breng het kweeksupernatans over in een voorgekoelde polypropyleen ultracentrifugebuis van 38,5 ml en draai het gedurende 4 uur bij 4 °C in een ultracentrifuge bij 100.000 × g.
      OPMERKING: Een zwenkbak werkt het beste bij deze snelheid. Zorg ervoor dat u de ultracentrifugebuis tot de rand vult en zorg voor een balans-ultracentrifugebuis van gelijkwaardig gewicht. Als een van beide buizen na het centrifugeren aan de zwenkbak vastzit (wat gebeurt als gevolg van condensatie), verwijder deze dan voorzichtig met een pincet van de rotor. Het wegvegen van het gecondenseerde vocht dat aan de buitenkant van de ultracentrifuge aanwezig is vóór het ultracentrifugeren, voorkomt plakken.
    2. Bewaar het supernatans in een voorgekoelde tube van 50 ml (zie toelichting). Keer de ultracentrifugebuis om op een vers, pluisvrij absorberend papier om sporen van het supernatant te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 600 μL HEPES-bufferoplossing (50 mM HEPES en 150 mM NaCl, pH 7,4; filtreer en steriliseer voor gebruik).
      OPMERKING: Sla het supernatans alleen op als back-up. De inheemse mEV-pellet verschijnt als een geleiachtige vlek met een diameter van 5-7 mm, dof grijsgeel tot doorschijnend. Als er geen pellet zichtbaar is, herhaal dan stap 2.3.1 door de opgeslagen supernatant opnieuw te gebruiken. Als er na herhaling van stap 2.3.1 geen pellet verschijnt, gooi deze dan weg en start opnieuw vanaf stap 1.2. De pellet heeft tijd nodig om te resuspenderen. Het wordt aanbevolen om de HEPES-buffer toe te voegen en deze een nacht bij 4 °C te laten staan om deze gemakkelijk opnieuw te kunnen suspen. Resuspendeer voorzichtig maar met herhaald pipetteren (gebruik P200-tips voor een betere resuspensie) tot een gelijkmatige resuspuur.
  4. Dag 6
    1. Onderwerpt de geresuspendeerde pellet aan een centrifugatie op basis van dichtheidsgradiënt op basis van 'jodixanol'.
      1. Leg de geresuspendeerde pellet op de bodem van de 13 ml schone, gewassen (met ddw) en voorgekoelde ultraheldere polypropyleen ultracentrifugebuis en meng voorzichtig (gebruik een pipet van 1 ml) met ~4 ml inerte dichtheidsgradiënt 'jodixanol'-oplossing (in de handel verkrijgbaar als een ~60% w/v-oplossing). Na het aanbrengen van de geresuspendeerde pellet op de bodem van de buis (tot een maximum van 5 ml), bedek vervolgens met 1 ml (w/v) elk van 40%, 30%, 20% en 10% subvoorraden 'jodixanol' in de respectievelijke volgorde (bereid subvoorraden (met HEPES-buffer) uit 60% voorraad). Voeg vervolgens 4 ml 6% subvoorraad (bereid uit 60% bouillon met HEPES-buffer) toe aan de bovenkant om de buis te vullen.
        NOTITIE: Bereid het verloop vlak voor gebruik voor; Nooit bewaren en gebruiken.
      2. Weeg de buis voorzichtig (zonder te schudden) in een glazen bekerglas en breng deze voorzichtig over in de rotor van de zwenkbare emmer.
        OPMERKING: Wegen is noodzakelijk om te balanceren met een dummy-buis (ook gewogen).
      3. Dompel het gedurende 16 uur bij 4 °C bloot aan ultracentrifugatie bij 141.000 × g.
  5. Dag 7
    1. Verwijder voorzichtig het buisje (zie opmerking bij stap 2.3.1) en vang fracties van 1 ml op in vers geautoclaveerde microcentrifugebuisjes; let op de 4etot 6efracties , die meestal de Msm-mEV's bevatten.
      OPMERKING: De mEV's van deze fracties fractioneren normaal gesproken in drie of vier mEV-banden (één is de hoofdband) die dof wit van kleur zijn. De R-mEV's die mCherry bevatten, fractioneren in de 5e tot 7efractie en zien er donkerpaarstot magenta uit. De Mtb EV's fractioneren meestal in de 5etot 7efractie. De scheiding van de mEV's in de gradiënt hangt af van de gebruikte gradiëntconcentratie en hoe goed de gradiënt gelaagd is. Als mEV's gedeeltelijk scheuren, kunnen ze in eerdere fracties uiteenvallen. Als de na stap 2.3.2 verkregen pellet niet goed wordt geresuspendeerd, vormen de blaasjes ook dichte micropellets die als latere fracties uiteenvallen. We raden aan om de fracties alleen nauwkeurig te verzamelen als de gebruiker wil evalueren welke van de fracties van 1 ml de mEV's bevatten. Gebruikers kunnen op basis van hun gemak in kleinere of grotere fracties aliquoteren. Wanneer we ze voor bepaalde toepassingen gebruiken, bijvoorbeeld door ze te testen als een potentiële subeenheidvaccinbooster voor BCG, beperken we onze verzameling van de mEV's tot minder dan 250 μL van de fracties (waar mEV's fractioneren), zodat we specifiek alleen de mEV-banden kunnen verzamelen en verwerken zoals aangegeven in 2.7.5. Dit helpt om alle sporen van jodixanol die onze stroomafwaartse experimenten kunnen verstoren, effectiever te verwijderen.
  6. Dag 8
    1. Pool de mEVs-bevattende fracties, verdun met HEPES-buffer tot 38 ml en herhaal de ultracentrifugatie bij 4 °C gedurende 16 uur bij 100.000 × g. Resuspendeer de pellet (zoals in stap 2.3.2 met dezelfde waarschuwingen) in HEPES-buffer of in een buffer die stroomafwaartse experimenten (hier niet beschreven) zoals eiwitschatting, nano-tracking-analyses, negatieve kleuring, transmissie-elektronenmicroscopie, western blotting en immuun-goudetikettering vereisen.
      NOTITIE: Voor een betere resuspensie sonificeert u de mEV-bevattende buis gedurende 10 minuten met behulp van een ultrasone waterbadsonicator. Langer sunicen kan leiden tot scheuren en verlies van intacte mEV's. Indien goed opgehangen, is sonicatie niet nodig. Alle stappen van 2,1 tot 2,6 zijn identiek, terwijl ze door Mtb gegenereerde EV's verrijken.

3. Bouw en verrijking van recombinante mEV's.

OPMERKING: Een van de 10 meest voorkomende eiwitten (geïdentificeerd door massaspectrometrie) van Msm EV's is Cfp-2930. Gezien zijn kleine formaat (29 kDa), eenvoudige secundaire structuur 40, lokalisatie naar het membraan 41 en de neiging om te worden uitgescheiden in gebruikte media in axenische culturen (bijv. als een kweekfiltraateiwit; uitgescheiden door zowel Msm als Mtb42,43, is het hier gebruikt om een rode fluorescerende reporter en een interessant eiwit (EsxAMtb) in mEV's af te leveren. Om dit te bereiken,

  1. Gebruik geschikte voorwaartse en achterwaartse primers (tabel 1; compatibel om direct te worden gekloond in een shuttlevector zoals pMV261) voor het amplificeren van cfp-29 van Msm. Met behulp van ~50 ng Msm-genoom-DNA met een hoog molecuulgewicht (~>20 kb) als sjabloon, PCR-amplificeert u het cfp-29-genfragment met een high-fidelity proeflees-DNA-polymerase (zoals Phusion of Q5). Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor PCR.
    OPMERKING: Ontwerp de nodige beperkingsplaatsen in primers voor eenvoudig klonen in elke alternatieve shuttlevector van belang. De PCR-omstandigheden en het volume zijn afhankelijk van het type en merk DNA-polymerase dat wordt gebruikt. Het volume van het reactiemengsel zal variëren afhankelijk van de hoeveelheid DNA-sjabloon en de hoeveelheid proeflezen van DNA-polymerase. Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor PCR-omstandigheden, succes van amplificatie en eliminatie van niet-specifiek gloeien van primers.
  2. PCR zuivert het geëlueerde amplicon met een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit en verifieert de lengte van het amplicon door middel van standaard agarosegelelektroforese. Verteer het gezuiverde amplicon.
    1. Schat de hoeveelheid gezuiverd amplicon op een spectrofotometer. Gebruik ten minste 2 μg cfp-29 amplicon voor de spijsvertering.
    2. Eerst verteren met BstB1 bij 65 °C gedurende 1 uur (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant), de reactietemperatuur verlagen tot RT en vervolgens verteren met HindIII gedurende 1 uur bij 37 °C (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
    3. PCR zuivert en elueert het verteerde amplicon in 50 μL geautoclaveerde nucleasevrije ddw.
    4. Schat de concentratie en opbrengst van het verteerde amplicon met behulp van een spectrofotometer. Bewaren bij -20 °C tot het afbinden. OPMERKING: Controleer na PCR de ampliconlengte (~798 + 50 bp) en de opbrengst door 10 μL van het PCR-reactiemengsel te elektroforeseren op een agarosegel van 1%. Hoewel dubbele vertering niet mogelijk is met deze combinatie van enzymen, voorkomt een compatibele buffer herhaalde PCR-zuivering en het daaropvolgende verlies van verteerd amplicon. De concentratie van verteerde amplicon varieert met de kit die wordt gebruikt voor PCR-zuivering. Het varieert ook met de lengte (in bp) van eventuele alternatieve vectoren naar keuze.
  3. Gebruik de voorwaartse en achterwaartse primers (tabel 1), een proeflezen van DNA-polymerase en ~ 50 ng Mtb-genoom-DNA, PCR-amplificatie esxA- of esxA-3X FLAG-tag-specifiek amplicon. Gebruik ~5 ng van geschikt plasmide-DNA om mCherry te PCR-amplificeren. Plasmide en sequentiedetails staan in aanvullend bestand 1.
    OPMERKING: Gebruik een Glycine, Glycine, Glycine, Glycine, Serine 44,45(G4S) linker tussen cfp-29 en mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; voor de start van mCherry helpt de G4S-linker mCherry om geen valse niet-functionele vouwen te ondergaan (inclusief die aangedreven door Cfp-29). Raadpleeg cfp-29, hsp60 promotor, mCherry en esxA-sequenties in aanvullend bestand 1. Plasmiden die als sjablonen voor mCherry dienen, zijn verkrijgbaar bij verschillende plasmide-opslagplaatsen/banken. Er zijn verschillende versies (licht gewijzigde sequenties) van mCherry beschikbaar die gewijzigde voorwaartse en achterwaartse primersequenties vereisen. De primers (tabel 1) helpen bij het versterken van de in aanvullend bestand 1 genoemde mCherry. Fusie van de N-terminus van mCherry/esxA/esxA::3XFLAG naar het C-terminale uiteinde van Cfp-29 werkt goed.
  4. Verteer 1 μg DNA van de mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons en zuiver verteerd DNA.
    1. Vermaal elke amplicon dubbel met HindIII en HpaI gedurende 1 uur bij 37 °C (of volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
    2. Gebruik een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit en de aanbevelingen van de fabrikant voor het zuiveren van het verteerde amplicon. Elute het verteerde amplicon in 50 μL geautoclaveerd nucleasevrij ddw.
    3. Schat de concentratie en opbrengst van het verteerde amplicon met behulp van een spectrofotometer. Bewaren bij -20 °C tot het afbinden.
  5. Verteer 2 μg pMV261-KanR (aanvullend bestand 1) of een geschikte kloonvector met het (de) enzym(en) naar keuze.
    1. Eerst verteren met BstB1 bij 65 °C gedurende 1 uur (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant), de reactietemperatuur verlagen tot RT en vervolgens verteren met HindIII gedurende 1 uur bij 37 °C (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
    2. Gel zuiveren en elueren in 50 μL geautoclaveerde nucleasevrije ddw.
    3. Schat de concentratie en opbrengst van de verteerde vector met behulp van een spectrofotometer. Bewaren bij -20 °C tot het afbinden.
      OPMERKING: Klonen in één stap met twee fragmenten is mogelijk met de bovenstaande primers voor pMV261. Elke alternatieve shuttle-vector die overleeft als een episoom zal werken. Integratieve plasmiden zullen ook werken, maar de opbrengst van recombinante eiwitten zal relatief lager zijn per celbasis.
  6. Ligate en transformeren in een compatibele stam van E. coli.
    1. Gebruik voor ligatie 125 ng van de vector. Gebruik op de juiste manier verteerde mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-amplicons in een molaire verhouding van 1:3. Ligatie 's nachts met T4 DNA-ligase (hoeveelheid volgens de aanbevelingen van de fabrikant) bij 16 °C in een gekoeld circulatiewaterbad.
      OPMERKING: Gebruik geschikte controles, zoals alleen vector, met en zonder T4-DNA-ligase om de efficiëntie van de spijsvertering te evalueren en de efficiëntie van het kloonsucces te voorspellen.
    2. Transformatie
      1. Ontdooi NEB5α chemisch competente cellen aliquots (~100 μL per transformatie) op ijs gedurende 15 minuten. Meng twee keer voorzichtig met een steriele pipetpunt. Voeg ligatiemix (tot 20 μL) toe aan de koude competente cellen.
      2. Meng voorzichtig pipetcellen + geligeerd DNA. Incubeer het mengsel nog eens 30 minuten op ijs.
      3. Zorg voor een hitteschok bij 42 °C (in een circulerend waterbad) gedurende 60 s en breng onmiddellijk terug naar ijs gedurende nog eens 15 minuten.
      4. Herstel de getransformeerde cellen door 1 ml SOC-bouillon toe te voegen (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 en 20 mM glucose) en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur bij 200 tpm.
      5. Centrifugeer de teruggewonnen bacteriën in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (3000 × g, RT en 10 min), gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 200 μL steriele, voorverwarmde, vers bereide LB-media en verdeel de suspensie op vers gegoten LB Miller-agarplaten met de vereiste antibiotica in de juiste concentraties.
      6. Incubeer de petrischaaltjes in een bordenincubator die vooraf is ingesteld op 37 °C.
  7. Screenen (hier niet gedetailleerd) op mogelijke klonen, verifiëren (door middel van kolonie-PCR-/restrictie-enzymen-gebaseerd)46 en sequentie (Sanger-sequencing) om fusie te bevestigen.
  8. Extraheer plasmide-DNA (~200 ng/1-2 μL; elke in de handel verkrijgbare kit) van de bevestigde kloon (E. coli-achtergrond ) en transformeer deze in vers gemaakte elektrocompetente cellen van Msm.
  9. Bereiding van Msm elektrocompetente cellen
    1. Vers gekweekte Msm (zoals in de stappen 1.2.1 en 1.2.2). Was de vers gekweekte Msm zoals in stap 1.3.3 en 1.3.4 (behalve 7H9 + ADC + Tween-80 (rijk) in plaats van Sauton's).
    2. Voeg een aliquot van de gewassen Msm-cellen toe aan een uiteindelijke OD 600 van ~0,05 in een steriele erlenmeyer van500 ml met 150 ml rijke media.
    3. Incubeer in de incubatorschudder bij 200 tpm en 37 °C tot de kweek OD600 ~0,8 tot 1,0 (~12-14 uur) bereikt.
    4. Breng de cultuur over in een voorgekoelde centrifugefles van 400 ml en incubeer gedurende 60-90 minuten op ijs. Pelleteer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij 4.000 × g bij 4 °C.
    5. Was de cellen twee keer (elke wasbeurt met 150 ml, bij 4.000 × g, 4 °C en 15 min) met ijskoud, steriel (geautoclaveerd) 10% glycerol.
      LET OP: Bij elke wasbeurt komt de pellet los. Wees voorzichtig bij het weggooien van het hele supernatans (na elke wasbeurt). Anders gaat het grootste deel van de cellen verloren in het afgedankte supernatant.
    6. Was de cellen nog een keer met 75 ml ijskoude, steriele 10% glycerol met 0,005% Tween-80.
    7. Resuspendeer de celpellet in 7,5 ml 10% glycerol met 0,005% Tween-80 en aliquot in aliquots van 400 μl.
      OPMERKING: Hoewel Msm-elektrocompetente cellen minimaal 4 maanden competent zijn, geven vers bereide elektrocompetente cellen de beste resultaten. Bij gebruik van oude competente cellen verschijnen een paar niet-roze kolonies (blanken) als valse transformanten. Hoe ouder de competente cellen, hoe meer de witte kolonies.
  10. Transformatie van Msm
    1. Ontdooi de Msm-competente cellen aliquot op ijs.
      OPMERKING: Ontdooien bij RT en het transformeren van dergelijke cellen levert minder efficiëntie op.
    2. Voeg 1-2 μL plasmide-DNA (~200 ng totaal) toe aan de koude competente cellen, meng voorzichtig met een steriele pipetpunt van 1 ml en breng over in een voorgekoelde steriele elektroporatiecuvet van 2 mm.
    3. Breng de gesloten cuvette met Msm-competente cellen + plasmide-DNA-mix over in de muis van de elctroporator, sluit het deksel voorzichtig en pas een puls (exponentieel vervaltype) toe op 2,5 kV (spanning), 25 μF (capaciteit) en 1000 Ω (weerstand).
    4. Voeg onmiddellijk 1 ml voorverwarmd steriel rijk (7H9 + ADC + Tween-80) medium toe aan de cuvette, meng voorzichtig met een steriele pipetpunt van 1 ml en breng de volledige inhoud over in een steriele buis van 10 ml.
    5. Incubeer de inhoud gedurende 3 uur in een incubatorschudder ingesteld op 37 °C en 200 tpm. Draai de inhoud in een microcentrifugebuis (4.000 × g, RT en 10 min), gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 200 μL steriel voorverwarmd rijk medium en verdeel de suspensie op vers gegoten 7H11-agarplaten met ADC, Tween-80 en de vereiste antibiotica in de juiste concentraties.
      OPMERKING: Gebruik voor Msm, indien nodig, hygromycine, kanamycine en aprramycine in de eindconcentraties van respectievelijk 50 μg/ml, 25 μg/ml en 50 μg/ml. Msm per se is NIET resistent tegen deze antibiotica. Gebruik deze antibiotica alleen bij gebruik van plasmiden met de juiste resistente genen voor de selectie/groei van transformanten/recombinante Msm-kolonies.
    6. Incubeer de petrischaaltjes in een bordenincubator die vooraf is ingesteld op 37 °C. Meestal verschijnen transformanten tussen 3-5 dagen.
      OPMERKING: Als een eiwit van belang giftig is voor Msm, kunnen de transformanten later opduiken of niet opduiken. Kloon in dergelijke gevallen afgekapte versies van de volledige lengte.
    7. Maak glycerolvoorraden van de opkomende Msm-kolonies na verificatie op positieve klonen (zelfde als stap 3.7)
  11. Om R-mEV's te verrijken die mCherry- of EsxA-eiwitten bevatten, kweekt u eerst R-Msm die mCherry of exsA of esxA::3X FLAG tot expressie brengt door de stappen 1.2.1 tot en met 1.2.3 te volgen en vervolgens de stappen 2.1 tot en met 2.6 te volgen. om R-mEV's te verrijken. De R-mEV's elueren in de 4e-7efracties na de spin van de dichtheidsgradiënt (stap 2.5). De R-mEV's pelleteren na de eerste ultracentrifugatiestap (2.3.1). Nadat u identiek bent aan stap 2.3.1, controleert u of de R-mEV's zichtbaar zijn als een donkerpaarse tot magenta pellet met een diameter van 5-7 mm onderaan in het midden van de ultracentrifuge.
  12. Voer westerse analyses47 uit (hier niet gedetailleerd) om eiwit(en) van belang te detecteren binnen de verrijkte R-mEV's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruiken M. smegmatis (Msm) als model mycobacterium om de verrijking van zowel native als recombinante mEV's (R-mEV's) aan te tonen. Dit schematisch samengevatte mEV's verrijkingsprotocol (Figuur 1) werkt ook voor de verrijking van R-mEV's van Msm en native EV's van Mtb (met kleine aanpassingen zoals in protocolnotities van 1.2). Voor de visualisatie van de verrijkte mEV's moeten ze negatief worden gekleurd onder een transmissie-elektronenmicroscoop36 (Figuur 2A). Doorgaans scheiden Msm-specifieke EV's zich af in de 4e-6e fractiesvan 1 ml van de 13 ml6-60% dichtheidsgradiënt (Figuur 2B). Ongeveer 80-100 μg eiwitequivalent van EV's wordt routinematig verkregen uit 2 L mid-logaritmische axenische culturen van Msm. Hun diameters variëren doorgaans tussen 20 nm en 250 nm (figuur 2C).

Een langetermijndoel van ons laboratorium is om te evalueren of mEV's van verschillende mycobacteriën mogelijk kunnen fungeren als een subunit-booster voor het bestaande vaccin, BCG. Aangezien het verrijken van mEV's gegenereerd door pathogene bacteriën tijdrovend, riskant en duur is, kan het benutten van inheemse en recombinante EV's van avirulente mycobacteriën als een geschikt alternatief werken. Daarom streven we ernaar om niet alleen het protocol te standaardiseren om de mEV's van Msm te verrijken, maar ook om de R-mEV's te bouwen en te verrijken.

Om R-mEV's te construeren, selecteerden we eerst de top 10 van overvloedige eiwitten van Msm EV's (Tabel 1; we identificeerden ze aan de hand van gedetailleerde massaspectrometrie-analyses van de Msm EV's)30. We veronderstelden dat als een vreemd eiwit van belang translationeel wordt gefuseerd met een van hen, het in staat zou moeten zijn om te lokaliseren in mEV's. Vervolgens hebben we Cfp-29 op de shortlist gezet van de 10 omdat het de kleinste onder hen is (~29 kDa), membraangelokaliseerd is en een kweekfiltraateiwit is met een relatief eenvoudige secundaire structuur40,41,42,43. We hebben het N-terminale uiteinde van mCherry (fluorescerend eiwit) translationeel gefuseerd met het C-terminale uiteinde van Cfp-29 en het laden/afleveren ervan in mEV's geëvalueerd. Een deel van de verrijkte mEV's van Msm werd roze (Figuur 3), wat wijst op het vermogen van Cfp-29 om een vreemd eiwit van belang in Msm EV's te vervoeren.

Gezien dit vermogen van Cfp-29 (Figuur 3), evalueerden we vervolgens de afgifte van EsxA (Esat-6), een belangrijk immunogeen eiwit37,38,39 in Msm EV's. Nogmaals, we genereerden twee onafhankelijke translationele fusies naar de C-terminus van Cfp-29-only EsxA en EsxA + 3X FLAG-tag (3X FLAG gefuseerd met de C-terminus van EsxA. Zoals verwacht hebben we Mtb's EsxA waargenomen in Msm EV's (rijstroken 5, 6 en 10, figuur 4A,B), zij het in kleine hoeveelheden. Interessant is dat Cfp-29::EsxA::3XFLAG veel stabieler was (banen 3 en 4 plus 8 en 9; Figuur 4A) en geaccumuleerd op hogere niveaus in mEV's (banen 3 en 4 plus 8 en 9; Figuur 4B). Samenvattend demonstreren we het ontwerp, de constructie en de verrijking van R-mEV's die een vreemd eiwit van belang bevatten (Figuur 3 en Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van mycobacteriële extracellulaire blaasjesverrijking. 'Dagen' (in rood lettertype, bovenaan de figuur) verwijst naar de dagen die nodig zijn om de mEV's uit Msm te verrijken (specifiek voor protocolstap 1 en 2). "Stappen" (in zwart lettertype, onderaan de afbeelding) verwijst naar de protocolstappen zoals beschreven in de protocolsectie. Voor het verrijken van mEV's van Mtb, hoewel alle stappen vergelijkbaar zijn, duurt het minstens 10 dagen voor de verschillende stappen van culturing (stap 1) tot de eerste stap van centrifugeren (stap 2). De volgende stappen vereisen dezelfde duur (zoals aangegeven in rood lettertype). Vóór de dichtheidsgradiënt zien de mEV's-pellet + extracellulaire complexen er kleurloos uit bij het verrijken van zowel native mEV's als R-mEV's. Het lijkt echter roze tot blauw (zie figuur 3) bij het verrijken van mEV's die mCherry bevatten. Na de dichtheidsgradiënt zouden de mEV's wit (native en R-mEV's) of roze (als ze mCherry bevatten) in de dichtheidsgradiëntbuis verschijnen. De kleuren van mEV's in de afbeelding zijn alleen bedoeld om de duidelijkheid aan te geven en vertegenwoordigen niet de exacte kleuren. Zie figuur 3 voor meer duidelijkheid. Afkortingen: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. tuberculosis; 0,45 en 0,22 μm = poriegrootte van afvoerfiltereenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Mycobacteriële EV's zijn cirkelvormig, concentreren zich met dichtheidsgradiënten en variëren in afmetingen . (A) Een representatief beeld van Msm EV's bij hun visualisatie met negatieve kleuring en weergave onder een transmissie-elektronenmicroscoop. Schaalbalk = 200 nm. (B) Een representatief beeld van hoe mEV's in de ultracentrifugebuis verschijnen bij het uitvoeren van een dichtheidsgradiënt van 6-60%. Als de gradiënt van 6-60% niet nauwkeurig gelaagd is, kan de positionering van de grote (bovenste open pijl) en kleine (onderste open pijl) banden van mEV's aanzienlijk veranderen, waardoor het fractiegetal van 1 ml verandert. (C) Een representatief beeld bij nanotracking-analyse van verrijkte mEV's van Msm. Nanotracking-analyses onthullen de verhoudingen en concentraties van mEV's van verschillende grootte en het totale aantal mEV's in het preparaat. Gemiddeld, met het hier beschreven protocol, worden ~1-3 × 1010 EV's verrijkt met 2 L Msm en Mtb. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Verschillende stappen die wijzen op de verrijking van mEV's die mCherry tot expressie brengen. (A) Representatief beeld van de axenische cultuur van Msm die Cfp-29::mCherry tot expressie brengt. (B) Representatief beeld van de bacteriële pellet na centrifugatie van de axenische Msm-cultuur die Cfp-29::mCherry tot expressie brengt. (C) Representatief beeld van kweekfiltraatconcentraat verkregen na concentratie van de gebruikte media van Msm-axenische cultuur die Cfp-29::mCherry tot expressie brengt via centriconconcentratoren. (D) Representatief beeld van mEV's + extracellulaire complexen pellet na ultracentrifugatie van kweekfiltraatconcentraat verkregen uit Msm axenische cultuur die Cfp-29::mCherry tot expressie brengt. De pellet zou echter kleurloos blijven als de mEV's inheems of recombinant zouden zijn (na fusie tot Cfp-29) voor een of meer vreemde eiwitten behalve mCherry. (E) Representatieve afbeeldingen van mCherry die mEV's bevatten. Merk op dat niet alle mEV's roze zijn, wat aangeeft dat niet alle mEV's Cfp-29 bevatten. Goed: Een representatief beeld met verschillende banden van mEV's die doorgaans worden verkregen na verrijking voor Cfp-29::mCherry EV's. Omdat mCherry-bevattende EV's dichter zijn, scheiden ze zich in latere fracties. Slecht: Een representatief beeld dat wijst op een slechte scheiding (de witte mEV's scheiden zich af in de eerste/tweede fractie en de mCherry-bevattende mEV's scheiden zich af in de 10efractie (mogelijk vanwege slechte resuspensie van mEV's-pellet, d.w.z. protocolstap 2.3.2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Recombinante mEV's die EsxA (ESAT-6) bevatten, een Mtb-gecodeerd immunogeen in Msm totaal cellysaat en Msm-gegenereerde EV's. (A) Beelden van Coomassie-gel en (B) westerse analyse (gedetecteerd met ESAT6-specifiek polyklonaal antilichaam) die de accumulatie van gefuseerde ExsA tonen in zowel Msm totaal cellysaat als mEV's die cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, banen 3 en 4 (totaal lysaat) en banen 8 en 9 (mEV's)) of cfp-29 tot expressie brengen: esxA (- 3XFLAG, rijstroken 5 en 6 (totaal lysaat) en rijstrook 10 (mEV's)). Open en gevulde pijlen geven respectievelijk geaccumuleerd Cfp-29::ExsA::3XFLAG en Cfp-29::ExsA aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Inleidingen:
Sl # Gen Abc Sequentie (5' tot 3') Bron Om in te klonen
1 GVB-29 Voorwaarts CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC Msm genoom-DNA pMV261
Omkeren GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG Msm genoom-DNA pMV261
2 mKers Voorwaarts GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG Lab collectie pMV261
Omkeren TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC Lab collectie pMV261
3 esxA Voorwaarts GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S-linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genoom-DNA pMV261
Omkeren TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 Mtb genoom-DNA pMV261
4 exsA-3X VLAG Voorwaarts GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S-linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genoom-DNA pMV261
Omkeren TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 Mtb genoom-DNA pMV261

Tabel 1: Primer sequenties. Voorwaartse en achterwaartse primers voor het versterken van cfp-29, mCherry, esxA en esxA : :3X FLAG en klonen in shuttlevector pMV261 worden vermeld.

Aanvullend bestand 1: A: pMV261 , de cirkelvormige kaart, de belangrijkste kenmerken en de volledige nucleotidesequentie. Gele highlight-hsp60 promotor nucleotidesequentie; Groene en cyaan highlight-restrictieve sites waarin mCherry, esxA en esxA::3X FLAG-amplicons werden gekloond. B, C en D: nucleotidesequenties van respectievelijk cfp-29, mCherry en esxA . Groen highlight-stop codon van cfp-29, mCherry en esxA. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aangezien het ontwikkelen van een nieuw tbc-vaccin dat superieur is aan BCG en het kan vervangen, een formidabele uitdaging blijft, streven verschillende groepen als alternatief naar de ontdekking van verschillende subeenheid tbc-vaccins die de potentie van BCG kunnen vergroten en de beschermende duur kunnen verlengen48,49. Gezien de toenemende aandacht voor bacteriële EV's (bEV's) als potentiële subeenheden en als natuurlijke hulpstoffen50,51, is consistente verrijking van voldoende hoeveelheden mEV's voor hun downstream testen/analyse een belangrijke stap geworden. Het is met het oog op deze onderzoeksvragen dat dit protocol mEV's uit axenische culturen en hun recombinante versies wil verrijken.

Tijdens gedetailleerde massaspectrometrische proteoomanalyses van Msm EV's identificeerden Prados-Rosales et al. de 10 meest voorkomende eiwitten30. We veronderstelden verder dat bij voldoende moleculaire engineering, één van hen voldoende zou moeten zijn om een vreemd eiwit van belang in mEV's te vervoeren. Interessant is dat Cfp-29 opviel als de best mogelijke optie vanwege de verschillende functies 39,40,41,42. Onze gegevens tonen inderdaad aan dat het voldoende is om mCherry en EsxA te vervoeren (hoewel EsxA een kleine tag nodig had op zijn C-terminus om stabieler te zijn) en ze te accumuleren in de mEV's. Onlangs, in 2021, toonden Tang et al. aan dat Cfp-29 een encapsulin is met het vermogen om kleurstof-ontkleurende peroxidase (DyP)-type peroxidasen40 te vervoeren. Misschien kan Cfp-29 ook andere vreemde eiwitten bevatten.

We hebben EsxA onderzocht omdat het een prominent Mtb-immunogeen 37,38,39 is, beschermend kan zijn als een subeenheidvaccin in diermodel37,38,39, klein van formaat is; en de ortholoog (MSMEG_0066) is interessant afwezig in Msm EV's. Hoewel we dit hier niet bespreken, hebben we met succes R-mEV's gegenereerd voor een paar andere Mtb-eiwitten (uniek aanwezig in Mtb en niet gecodeerd door Msm), waaronder Antigeen 85B (Rv 1886c). Tegelijkertijd, interessant genoeg, slaagden we er ook niet in om R-mEV's te genereren voor een paar andere, waaronder Rv2660c en Rv0288 van volledige lengte, mogelijk omdat de eiwitten giftig zijn voor Msm. We concluderen van wel omdat, ondanks het klonen van de juiste nucleotidesequenties en het uitvoeren van herhaalde transformaties, er geen transformanten van Msm naar voren kwamen. Omdat EsxA een 3XFLAG-tag aan het C-terminus-uiteinde nodig had voor een betere accumulatie in mEV's, voegden we een 3XFLAG-tag toe aan alle andere Mtb-gecodeerde eiwitten die we evalueerden. Ondanks de tag overleefde Msm het niet, wat aangeeft dat sommige Mtb-eiwitten ondanks de tagfusie giftig blijven. We speculeren dat in deze gevallen het klonen van alleen de voorspelde epitoopregio's of het samenvoegen van verschillende epitopen zijn vruchten kan afwerpen (momenteel geëvalueerd in ons laboratorium). We gebruikten een kleine linker van vijf aminozuren (vier Glycine en één Serine) tussen Cfp-29 en mCherry/EsxA om de negatieve invloed op de vouwing van het eiwit van belang te minimaliseren44,45. We voorspellen dat zonder deze linker het vouwen van het eiwit van belang sterk zou worden beïnvloed door Cfp-29-vouwing.

Dit verrijkingsprotocol is eenvoudig uit te breiden naar de verrijking van Mtb-gegenereerde EV's. We speculeren ook dat het verrijken van mEV's uit mycobacteriën uit de omgeving ook haalbaar zou moeten zijn met dit protocol. Ondanks dat het protocol eenvoudig en duidelijk is, duurt het nog steeds 7-8 dagen om Msm-gegenereerde EV's en R-mEV's te verrijken. Daarentegen duurt het 15-20 dagen voor de verrijking van door Mtb gegenereerde EV's. Het concentreren van EV's op een kleiner volume is tijdrovend en duur en we onderzoeken momenteel tangentiële stroomfiltratie en andere benaderingen om het 'tijd'-probleem op te lossen.

Ten slotte gebruiken we Sauton's en niet 7H9 om mEV's te verrijken, omdat het 'ADC'-supplement grote hoeveelheden runderserumalbumine bevat die het stroomafwaartse gebruik van mEV's kunnen verstoren. Dit protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid naar andere specifieke media (bijv. media met een laag ijzergehalte) die moeten worden gebruikt om de samenstelling van de mEV's te evalueren. Als alternatief kan men voor bepaalde toepassingen in de laatste stap (d.w.z. protocolstap 2.7.5) in plaats van HEPES-buffer steriele zoutoplossing gebruiken bij het injecteren van dezelfde in muizen of cavia's voor verschillende in vivo gebaseerde analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs verklaren dat dit onderzoekswerk is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties/belangen die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

De auteurs danken Prof. Sarah M. Fortune oprecht voor het vriendelijk delen van M. smegmatis mc2155 voorraad. Ze erkennen ook Servier Medical Art (smart.servier.com) voor het leveren van enkele basiselementen voor figuur 1. Ze erkennen oprecht de steun van de rest van de laboratoriumleden voor hun patiëntaanpassingen tijdens het lange gebruik van de couveuseschudders, centrifuges en ultracentrifuges voor mEV-verrijking. Ze erkennen ook de heer Surjeet Yadav, de laboratoriumassistent, omdat hij er altijd voor zorgde dat het benodigde glaswerk en verbruiksartikelen altijd beschikbaar en handig waren. Ten slotte erkennen ze de administratieve, aankoop- en financiële teams van THSTI voor hun constante ondersteuning en hulp bij de naadloze uitvoering van het project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Tags

Immunologie en infectie Extracellulaire blaasjes recombinante blaasjes Esat-6 mycobacteriën ExsA mCherry Cfp-29 bacteriën

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter