Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo
Summary
Neurale inductie is de eerste stap in de vorming van de hersenen. Het is een mechanisme waarmee Hensen's node (organisator), instrueert aangrenzend weefsel aan te nemen een neurale lot, dat wil zeggen om aanleiding te geven aan het zenuwstelsel. Deze video toont een test voor neurale inductie bij kippenembryo.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideale tool voor het bestuderen van de vorming en de eerste patroonvorming van het zenuwstelsel. Deze video laat zien hoe om te enten organisator weefsel in een gastheer, een methode waarmee Hensen s node (de organisator in het kippenembryo) is geënt op een host bevoegde ectoderm. De organisator transplantaat instrueert bovenliggende na weefsel hebben om een lot te nemen via neuraal neurale inducerende signalen. Dit mechanisme wordt aangeduid als neurale inductie, en vormt de eerste stap in de vorming van de hersenen en het ruggenmerg in amnioten. Deze methode wordt hoofdzakelijk gebruikt voor het karakteriseren van vermeende neurale induceren van moleculen in chick. Deze video toont de verschillende stappen in de test voor neurale inductie, Ten eerste is de donnor embryo is geëxplanteerd en gespeld op een schotel. Dan is de gastheer embryo voorbereid op nieuwe cultuur. De ent is uitgesneden en getransplanteerd naar de host gebied pellucida marge. De gastheer is gekweekt voor 18-22 uur. De montage is vast en verwerkt voor verdere toepassingen (zoals in situ hybridisatie). Deze methode is oorspronkelijk bedacht door Waddington<sup> 1,2</sup> En Gallera<sup> 3,4</sup>.
Protocol
Discussion
Deze video toont de verschillende stappen bij het uitvoeren van een test voor neurale inductie, Deze test wordt hoofdzakelijk gebruikt voor het karakteriseren van vermeende neurale induceren van moleculen in chick, en kan dus worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, variërend van embryologische micromanipulations 1-4; 6 tot en met het ontrafelen van nieuwe signaleringscascades 7,8, alle gericht op het begrip van de eerste stap in de vorming van de hersenen en de resterende zenu…
Acknowledgements
DP is ontvanger van Ruth Kirschstein Award 1F32-01A1 DA021977 van het National Institute on Drug Abuse. Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma | A5177-5EA | |
| Microelectrode puller | Equipment | Sutter Instruments | Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
