Per studiare i processi di sviluppo delle ascospore in Gibberella zeae, una procedura per la raccolta in condizioni di sterilità è girato in modo da generare il massimo livello di informazioni per la descrizione del protocollo. Ciò dovrebbe facilitare la riproducibilità dell'esperimento, un aspetto cruciale quando è piena genoma test profilo di espressione attuazione.
Abstract
Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) è un patogeno per le piante che causano la malattia crosta di grano e orzo, che riduce la qualità e la resa delle colture di grano. F. graminearum causa anche marcisce stelo e spiga di mais ed è un produttore di micotossine, quali i tricoteceni che contaminano cereali e sono nocivi per gli esseri umani e animali (Goswami e Kistler, 2004). Il fungo produce due tipi di spore. Ascospore, i propaguli che derivi dalla riproduzione sessuale, sono la principale fonte di infezione primaria. Queste spore sono forzatamente dimessi periteci maturi e disperse dal vento (Francl et al 1999). Infezioni secondarie sono principalmente causati da macroconidia che sono prodotte per mezzo asessuata sulla superficie della pianta. Per studiare i processi di sviluppo di ascospore in questo fungo, una procedura per la loro raccolta in grande quantità in condizioni di sterilità è stato richiesto. Il nostro protocollo è stato filmato in modo da generare il massimo livello di informazione per la comprensione e la riproducibilità; aspetti cruciali quando è piena genoma profili di espressione genica sono generati e interpretati. In particolare, la variabilità di germinazione ascospore e l'attività biologica dipendono dalla prima manipolazione del materiale. L'uso del video per documentare ogni fase di produzione ascospore viene proposto al fine di aumentare la standardizzazione, conformi ai requisiti sempre più stringenti per l'analisi microarray. La procedura richiede solo equipaggiamento standard di laboratorio. Passaggi sono illustrati per impedire la contaminazione e tempo di sincronizzazione favore di ascospore.
Protocol
Agar carota (Klittich e Leslie, 1988) è stato preparato in piatti di diametro 9 cm di Petri. Un cubo 2 mm di agar contenente micelio freschi coltivati su agar patata destrosio è stato applicato al centro di ogni piatto di Petri. Le culture sono state coltivate a 25 ° C e una 12-ore fotoperiodo di 96 ore. Un ml di soluzione acquosa 2,5% Tween 60 è stata applicata sulla superficie della cultura (Trail e Common, 2000) e diffuse in tutta la cultura con una bacchetta di plastica, premendo delicatament…
Discussion
Il protocollo qui presentata si basa su precedenti procedure utilizzate per la produzione di perithecial per Fusarium spp. (Klittich e Leslie, 1988; Trail e Common, 2000). Standardizzazione della procedura con la quale sono state generate grandi quantità di ascospore (sufficiente per l'analisi microarray) è stato essenziale per la riproducibilità dell'esperimento. E 'stato riportato che le differenze i fattori ambientali, età e substrato può cambiare il carattere biologico delle ascospore (Beyer e Verreet, 2005). Pertanto l…
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Karen Hilburn per un eccellente supporto tecnico. Questo progetto è stato sostenuto dal National Research Initiative dello Stato USDA cooperativa ricerca, istruzione e servizi di estensione (Premio # 2004-35604-14327). Matias Pasquali è supportato da Branco Weiss Fellowship. Il grano statunitense e Scab Iniziativa L'orzo è anche riconosciuto per il continuo sostegno della ricerca.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Petri dish 9 cm Diameter
Tool
Tween 60 (20%)
Reagent
Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar)
Beyer, M., Verreet, J. A., Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J., Goswami, R. S., Kistler, H. C., Klittich, C. J. R., Leslie, J. F., Trail, F., Common, R., Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E., Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors.遗传学. 118, 417-2013 (2005).
Pasquali, M., Kistler, C. Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.. J. Vis. Exp. (1), e115, doi:10.3791/115 (2006).