مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts
Summary
ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تسهل علاج<em> thaliana Arabidopsis</em> الشتلات قبل الفرز الخلية.
Abstract
عالية الدقة ، الخلية نوع معين من تحليل التعبير الجيني يحسن إلى حد كبير فهم التنظيم التنموية والاستجابة للمؤثرات البيئية في أي كائن متعدد الخلايا. التهجين في الموضع والتصور مراسل الجين يمكن إلى حد محدود يمكن استخدامها لهذه الغاية ولكن لارتفاع القرار الكمي RT – PCR أو الإنتاجية العالية transcriptome على نطاق التحليل عزل الحمض النووي الريبي من أنواع الخلايا معين هو المطلوب. تفكك النسيج الخلوي معربا عن علامة بروتين فلوري في نوع من الخلايا المحددة واللاحقة الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS) يجعل من الممكن لجمع كميات كافية من المواد اللازمة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، [كدنا] توليف / ميكروأري التضخيم والتحليل.
مجموعة واسعة من الخلايا نوع محدد خطوط مراسل الفلورسنت يتوفر لمحطة المجتمع البحثي. في هذه الحالة ، يتم استخدام خطوط علامة اثنين من الجذر thaliana Arabidopsis : P SCR : : GFP (endodermis ومركز هادئة) و ف WOX5 : GFP (وسط هادئة). تزرع بأعداد كبيرة (آلاف) من الشتلات hydroponically أو على لوحات أجار وحصادها للحصول على ما يكفي من المواد الجذرية لمزيد من التحليل. ويتحقق الخلوية تفارق من المواد النباتية التي الهضم الأنزيمية للجدار الخلية. هذا الإجراء يجعل من استخدام الأسمولية انفكاك الجبلة التي يسببها ارتفاع والسليلوزات المتاحة تجاريا ، وpectinases hemicellulases للافراج عن protoplasts الى حل.
FACS من GFP إيجابية الخلايا يستفيد من التصور الأخضر مقابل الانبعاثات الأطياف الحمراء protoplasts ولع ليزر 488 نانومتر. ويمكن تمييز ايجابي GFP protoplasts التي زادت نسبتهم من الأخضر إلى الأحمر الانبعاثات. عادة يتم فرز Protoplasts مباشرة في استخراج الحمض النووي الريبي العازلة وتخزينها لمزيد من المعالجة في وقت لاحق.
وكشفت هذه التقنية لتكون واضحة وقابلة للتنفيذ. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن استخدامه دون صعوبة لعزل أعداد كافية من الخلايا لتحليل transcriptome ، حتى بالنسبة لأنواع الخلايا نادرة جدا (مثل خلايا مركز هادئة). وأخيرا ، أظهرت الإعداد لنمو الشتلات Arabidopsis المعاملة غير معقدة تمكن من النباتات قبل الفرز الخلية (على سبيل المثال لنوع محدد من الخلايا تحليل استجابات التوتر الحيوية أو غير الحيوية). تكميلي محتمل يستخدم لمراقبة الأصول الميدانية من محطة protoplasts تمت مناقشتها.
Protocol
Discussion
يمكن Protoplasts من حيث المبدأ ، يمكن أن تستمد من مجموعة متنوعة من الأنسجة النباتية ، وتحسين الظروف المواتية سوف يعزز كثيرا نوعية وكمية الحمض النووي الريبي. سيكون كل من حل protoplasting وحضانة الانتخابية العازلة المستخدمة تؤثر على هذا الجانب.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt…Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (منحة رقم 0519984 DBI) ، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة لا. 5R01GM078279)..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
