Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma
Summary
Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada kuruldu<em> Arabidopsis thaliana</em> Hücre sıralama önce fide.
Abstract
Yüksek çözünürlüklü, gen ekspresyonu hücre tipi özel analiz gelişim düzenleme ve herhangi bir çok hücreli bir canlının çevresel uyaranlara verilen yanıtlar anlayışı büyük ölçüde artırır. In situ hibridizasyon ve raportör gen görselleştirme kantitatif sınırlı bir ölçüde bu amaçla kullanılabilir ama yüksek çözünürlüklü RT-PCR veya özel hücre tiplerinden yüksek verim transcriptome çapında analiz RNA izolasyonu şarttır. Belirli bir hücre tipi ve sonraki Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) floresan proteini işareti ifade doku Hücresel disosiyasyon mümkün RNA ekstraksiyon, cDNA sentezi / amplifikasyon ve mikroarray analizi için yeterli miktarda malzeme toplamak için yapar.
Hücre tipi özel floresan muhabiri hatlarının geniş bir bitki araştırma topluluk için kullanılabilir. Bu durumda, Arabidopsis thaliana kök iki belirteç hatları kullanılır: P SCR: GFP (endodermis ve latent merkezi) ve P WOX5: GFP (latent merkezi). Fideler çok sayıda (binlerce) hydroponically veya agar plaklarına büyüdü ve daha fazla analiz için yeterli kök malzeme elde etmek için hasat edilir. Hücresel disosiyasyon bitki materyali hücre duvarının enzimatik sindirimi ile elde edilir. Bu prosedür yüksek ozmolarite indüklenen plasmolysis ve piyasada mevcut sellülazlar yapar, pectinases ve hemicellulases çözüm protoplast serbest bırakmak için.
GFP pozitif hücreler FACS 488 nm lazer tarafından heyecan protoplast kırmızı emisyon spektrumları karşı yeşil görselleştirme yapar. GFP pozitif protoplast yeşil kırmızı salma artan oranı ile ayırt edilebilir. Protoplast genellikle doğrudan RNA ekstraksiyon tamponu içine sıralanır ve daha sonraki bir zamanda daha fazla işlem için saklanır.
Bu teknik, basit ve uygulanabilir olduğu ortaya. Ayrıca, çok kıt hücre tipleri (örneğin latent merkezi hücreleri) için bile, transcriptome analizi için yeterli sayıda hücre izole etmek için zorluk olmadan kullanılabilir olması gösterilmiştir. Son olarak, Arabidopsis fide için bir büyüme kurulum (örneğin hücre tipi özel biyotik veya abiyotik stres tepkileri analiz için) hücre sıralama önce bitkilerin komplikasyonsuz bir tedavi sağlar gösterilmiştir . Potansiyel ek bitki protoplast FACS tartışılmıştır kullanır.
Protocol
Discussion
Protoplast, prensip olarak, elverişli koşulları optimize RNA kalitesi ve miktarı büyük ölçüde artıracak, çeşitli bitki dokularında elde edilebilir. Protoplasting çözüm ve seçmeli inkübasyon tampon kullanılan her ikisi de bu yönünü etkileyecektir.
Birçok farklı floresan proteinleri kullanılan FACS yeteneklerine bağlı olarak, kullanılabilir, örneğin, GFP, RFP, YFP, CFP ya da birçok varyantları ve türevleri . Belirteçlerin ifade buradaki gibi sadece h?…
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (hibe yok. DBI 0.519.984) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe yok. 5R01GM078279) tarafından desteklenen ..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
