식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기 설립<em> Arabidopsis thaliana</em셀 정렬하기 전에> 모종.
Abstract
높은 해상도, 유전자 발현의 세포 유형의 특정 분석은 크게 발달 규제 및 모든 다세포 생물 환경 자극에 반응의 이해를 향상시킵니다. 원위치 하이브리드화와 리포터 유전자의 시각화에서 양적이를 데 사용 제한 범위 수 있지만 높은 해상도 RT – PCR 또는 특정 세포 유형에서 높은 처리량 transcriptome – 다양한 분석 RNA의 격리가 필요한 것입니다. 특정 세포 유형과 후속 형광 활성 세포 정렬 (외과)에 형광 단백질 마커를 표현하는 조직의 세포 분리는 가능한 RNA 추출, cDNA 합성 / 증폭 및 microarray 분석을위한 자료의 충분한 양을를 수집합니다.
셀 유형 – 특정 형광 기자 라인의 광범위한 집합은 식물 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 경우, Arabidopsis thaliana 루트 두 마커 라인이 사용됩니다 : P SCR : GFP (endodermis 및 정지 센터)와 P WOX5 : GFP를 (정지 센터). 모종 많은 (수천) hydroponically 또는 한천 플레이트에 성장하고 추가 분석을 위해 충분한 루트 자료를 얻기 위해 수확하고 있습니다. 식물의 세포 분열은 세포 벽 소화 효소에 의해 이루어진다. 이 절차는 높은 osmolarity – 유도 plasmolysis 및 상용 cellulases을 사용하게, pectinases 및 hemicellulases이 솔루션에 protoplasts을 해제합니다.
GFP 양성 세포 외과는 488 nm의 레이저에 의해 흥분 protoplasts의 붉은 방출 스펙트럼 대 녹색의 시각화을 사용합니다. GFP 양성 protoplasts은 빨간색으로 방출하는 녹색들의 증가 비율로 구분할 수 있습니다. Protoplasts는 일반적으로 RNA 추출 버퍼에 직접 정렬하고 나중에 추가 처리를 위해 저장됩니다.
이 기술은 간단하고 실용적인 것으로 드러났습니다. 또한, 그것은 심지어 매우 부족한 세포 유형 (예 : 정지 중심 세포)에 대한, 그것이 transcriptome 분석을 위해 세포의 충분한 숫자를 분리하는 어려움없이 사용할 수 표시됩니다. 마지막으로, Arabidopsis 모종의 성장 설정은 그 (셀 타입 – 특정 biotic 또는 비생물적 스트레스 응답의 분석 예) 셀 정렬하기 전에 식물의 단순한 치료를 가능하게 증명합니다. 잠재적인 보조는 식물 protoplasts의 외과에 대해 설명합니다.
Protocol
식물 1) 준비 Protoplasts는 효소를 소화 세포 벽의 오른쪽 혼합이 1을 사용된다는 가정하에 다양한 식물 종 및 조직에서 얻을 수 있습니다. 본격적인 실험이 수행되기 전에, 소재의 작은 규모의 소화는 조직의 protoplasting 효율성, 효소 등을 평가하고 셀 정렬에 대한 %로 긍정적인 세포를 추정하기 위해 좋습니다. 여기, 셀 타입 – 구체적으로 표현하는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하는 <…
Discussion
Protoplasts는 원칙적으로 유리한 조건을 최적화하는 것은 크게 RNA의 품질과 수량을 향상시키는, 식물 조직의 다양한에서 파생된 수 있습니다. protoplasting 솔루션 및 사용 선택 부화 버퍼 모두이 부분에 영향을 미칠 것이다.
여러 가지 형광 단백질을 사용 외과의 기능에 따라 사용할 수 있습니다, 예를 들어 GFP, RFP, YFP, CFP하거나 많은 변종 및 파생 상품. 마커의 표현이 여기…
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (부여 안돼. DBI 0,519,984)과 국립 보건원 (부여 안돼. 5R01GM078279)에 의해 지원되었다 …