식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬
Summary
식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기 설립<em> Arabidopsis thaliana</em셀 정렬하기 전에> 모종.
Abstract
높은 해상도, 유전자 발현의 세포 유형의 특정 분석은 크게 발달 규제 및 모든 다세포 생물 환경 자극에 반응의 이해를 향상시킵니다. 원위치 하이브리드화와 리포터 유전자의 시각화에서 양적이를 데 사용 제한 범위 수 있지만 높은 해상도 RT – PCR 또는 특정 세포 유형에서 높은 처리량 transcriptome – 다양한 분석 RNA의 격리가 필요한 것입니다. 특정 세포 유형과 후속 형광 활성 세포 정렬 (외과)에 형광 단백질 마커를 표현하는 조직의 세포 분리는 가능한 RNA 추출, cDNA 합성 / 증폭 및 microarray 분석을위한 자료의 충분한 양을를 수집합니다.
셀 유형 – 특정 형광 기자 라인의 광범위한 집합은 식물 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 경우, Arabidopsis thaliana 루트 두 마커 라인이 사용됩니다 : P SCR : GFP (endodermis 및 정지 센터)와 P WOX5 : GFP를 (정지 센터). 모종 많은 (수천) hydroponically 또는 한천 플레이트에 성장하고 추가 분석을 위해 충분한 루트 자료를 얻기 위해 수확하고 있습니다. 식물의 세포 분열은 세포 벽 소화 효소에 의해 이루어진다. 이 절차는 높은 osmolarity – 유도 plasmolysis 및 상용 cellulases을 사용하게, pectinases 및 hemicellulases이 솔루션에 protoplasts을 해제합니다.
GFP 양성 세포 외과는 488 nm의 레이저에 의해 흥분 protoplasts의 붉은 방출 스펙트럼 대 녹색의 시각화을 사용합니다. GFP 양성 protoplasts은 빨간색으로 방출하는 녹색들의 증가 비율로 구분할 수 있습니다. Protoplasts는 일반적으로 RNA 추출 버퍼에 직접 정렬하고 나중에 추가 처리를 위해 저장됩니다.
이 기술은 간단하고 실용적인 것으로 드러났습니다. 또한, 그것은 심지어 매우 부족한 세포 유형 (예 : 정지 중심 세포)에 대한, 그것이 transcriptome 분석을 위해 세포의 충분한 숫자를 분리하는 어려움없이 사용할 수 표시됩니다. 마지막으로, Arabidopsis 모종의 성장 설정은 그 (셀 타입 – 특정 biotic 또는 비생물적 스트레스 응답의 분석 예) 셀 정렬하기 전에 식물의 단순한 치료를 가능하게 증명합니다. 잠재적인 보조는 식물 protoplasts의 외과에 대해 설명합니다.
Protocol
Discussion
Protoplasts는 원칙적으로 유리한 조건을 최적화하는 것은 크게 RNA의 품질과 수량을 향상시키는, 식물 조직의 다양한에서 파생된 수 있습니다. protoplasting 솔루션 및 사용 선택 부화 버퍼 모두이 부분에 영향을 미칠 것이다.
여러 가지 형광 단백질을 사용 외과의 기능에 따라 사용할 수 있습니다, 예를 들어 GFP, RFP, YFP, CFP하거나 많은 변종 및 파생 상품. 마커의 표현이 여기…
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (부여 안돼. DBI 0,519,984)과 국립 보건원 (부여 안돼. 5R01GM078279)에 의해 지원되었다 …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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