的RNA分离方法的改进火炬松（ P。火炬松 L）和其他针叶树种
Summary
许多植物组织中，包括从火炬松的韧皮部及木质部（<em>火炬松</em> L），含有酚和干扰RNA纯化的多糖高的水平。此演示文稿讨论的收获种植现场组织和隔离的芯片和其他基因组分析的RNA质量足够技术。
Abstract
针叶树种，特别是那些属于松科家族，如火炬松，从组织中分离（<em>火炬松</em> L），含有高浓度的酚类化合物和多糖干扰RNA纯化。从这些品种的高品质的RNA分离需要严格的组织程序，收集多个有机提取步骤以孤立的芯片和其他基因组分析的质量足够的RNA组成的RNA分离协议的领域和就业。从现场收集的火炬松样本可以是具有挑战性的，但标准组织和RNA分离程序的若干修改，大大提高结果的高品质的RNA隔离。如果样品不正确收集和从外地运输，特别是在大型的收成，一般RNA降解程度增加。总RNA产量显着增加，粉碎样品在液氮冷冻轧机前RNA分离，尤其是当从木本植物组织样本。这主要是由于氧化剂的存在，如酚类化合物，多糖，都是在目前大多数针叶树种木本植物组织中提取的高层次，。如果不除去，这些污染物可以开展对领导的问题，如RNA降解，导致产量低和质量差的RNA样品。结转酚类化合物，以及多糖，还可以减少甚至完全消除cDNA合成常用的逆转录酶或其他聚合酶的活性。特别是，RNA的注定用于cDNA文库的产生双链cDNA合成，单链PCR或定量PCR的基因合成，或合成芯片的目标材料的模板必须是最高质量，如果研究人员期望以获得最佳的结果。常用于许多其他植物物种的RNA分离技术往往不足以从针叶样品中删除这些污染物的能力，因此不产生总RNA样品，适合于下游操作。在这个视频中，我们展示了针叶树组织进行实地收集的方法，一个四十二岁树砍伐，收获的韧皮部，次生木质部，反应木材木质部开始。我们还证明，一直随后酶操作带来了高品质的RNA的RNA分离协议。
Protocol
Discussion
从针叶树种获得高质量的RNA可以是一个艰巨的任务，鉴于木本植物组织中发现的酚类和多糖化合物的高水平。开始与张等人开发的协议。 （1），我们已经发现，更严格的提取和清理步骤导致各种木本和非木本组织从多种针叶树种采样的质量非常高的总RNA的一致隔离。该视频已证明不仅是我们修改后的RNA分离协议，而且在实地收集和火炬松用于RNA分离前处理技术而采取的步骤。这些收获和准备步?…
Acknowledgements
我们要感谢以下人士没有他们的帮助不会有可能收集的松树组织：乔奈恩博士，马特布里曼，迈克尔波尔多，Ujwal Bagal，靳慧哲，阿曼达Bouffier。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
