Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen
Summary
Veel planten-weefsels, waaronder floëem en xyleem van loblolly den (<em> Pinus taeda</em> L.), bevatten een hoog niveau van fenolen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Deze presentatie behandelt technieken voor de oogst van het veld geteelde weefsels en isolatie van RNA van voldoende kwaliteit zijn voor microarrays en andere genomische analyses.
Abstract
Weefsels geïsoleerd van naaldbomen, in het bijzonder die welke behoren tot de Pinaceae familie, zoals loblolly den (<em> Pinus taeda</em> L.), bevatten hoge concentraties van fenolische verbindingen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Isolatie van hoge kwaliteit RNA van deze soorten vergt rigoureuze weefsel verzameling procedures op het gebied en de inzet van een RNA-isolatie protocol bestaat uit meerdere organische extractie stappen om RNA van voldoende kwaliteit te isoleren voor microarray en andere genomische analyses. De isolatie van hoge kwaliteit RNA uit het veld verzameld loblolly pine monsters kan lastig zijn, maar een aantal aanpassingen aan standaard-weefsel en RNA-isolatie procedures sterk verbeteren resultaten. De omvang van het algemeen RNA degradatie verhoogt, indien monsters die niet goed zijn verzameld en vervoerd van het veld, met name tijdens grootschalige oogsten. Totaal RNA opbrengst kan aanzienlijk worden verhoogd door verpulveren monsters in een vloeibare stikstof vriezer molen voorafgaand aan de isolatie RNA, vooral wanneer monsters komen uit houtachtige weefsels. Dit is vooral te danken aan de aanwezigheid van oxiderende stoffen, zoals fenolische verbindingen, en polysacchariden die zowel aanwezig zijn op een hoog niveau in uittreksels uit de houtachtige weefsels van de meeste naaldbomen. Indien niet verwijderd, kan deze verontreinigingen overdracht leidt tot problemen, zoals RNA degradatie, die resulteren in lage opbrengsten en een slechte kwaliteit RNA monster. Overdracht van fenolische verbindingen, evenals polysacchariden, kan ook verminderen of zelfs volledig te elimineren de werking van reverse transcriptase of andere polymerasen gebruikt voor cDNA synthese. In het bijzonder RNA bestemd om te worden gebruikt als sjabloon voor double-stranded cDNA synthese in het genereren van cDNA-bibliotheken, enkelstrengs cDNA synthese voor PCR of qPCR, of voor de synthese van microarray doel materialen moeten van de hoogste kwaliteit als onderzoekers verwachten beste resultaten te verkrijgen. RNA-isolatie technieken die gewoonlijk gebruikt voor vele andere plantensoorten zijn vaak onvoldoende in hun vermogen om deze verontreinigingen te verwijderen van de coniferen monsters en dus geen opbrengst totaal RNA monsters geschikt zijn voor downstream-manipulaties. In deze video tonen we methoden voor het gebied collectie coniferen weefsels, te beginnen met het kappen van een veertig jaar oude boom, op het verzamelen van floëem, secundaire xyleem, en reactie hout xyleem. We tonen ook aan een RNA-isolatie protocol dat consequent heeft opgeleverd van hoge kwaliteit RNA voor latere enzymatische manipulaties.
Protocol
Discussion
Het verkrijgen van hoge kwaliteit RNA uit naaldbomen, kan een moeilijke taak, gezien de hoge niveaus van fenol-en polysaccharide verbindingen aangetroffen in bosrijke weefsels. Te beginnen met het protocol ontwikkeld door Chang et al.. (1), hebben we ontdekt dat een strengere extractie en clean-up treden leiden naar de consistente isolatie van zeer hoge kwaliteit totaal RNA uit diverse houtige en niet-houtige weefsels bemonsterd uit een breed scala van naaldbomen. Deze video heeft aangetoond dat niet alleen onze gewijzi…
Acknowledgements
We willen graag de volgende personen, zonder wiens hulp het verzamelen van dennen weefsels zou niet mogelijk zijn geweest bedanken: Dr Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, en Amanda Bouffier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
