RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler
Summary
Loblolly çam ksilem ve floem de dahil olmak üzere birçok bitki dokularında, (<em> Pinus taeda</em> L.), fenolik ve RNA arıtma müdahale polisakkaritler yüksek düzeyde içerir. Bu sunum alanında yetişen doku ve mikroarray'ler ve diğer genomik analizler için yeterli kalitede RNA izolasyonu hasat teknikleri tartışır.
Abstract
Dokular özellikle Loblolly çam gibi kozalaklı türler, Pinaceae ailesine mensup olanlar, (den izole<em> Pinus taeda</em> L.), yüksek konsantrasyonlarda RNA arıtma ile müdahale fenolik bileşikler ve polisakkaritler içerir. Bu türlerin yüksek kaliteli RNA izolasyonu mikroarray ve diğer genomik analizler için yeterli kalitede RNA izole etmek için birden fazla organik çıkarma adımları oluşan bir RNA izolasyonu protokolü ve istihdam alanında titiz doku toplama yöntemleri gerektirir. Alan toplanan Loblolly çam örnekleri zor olabilir, ama büyük ölçüde standart doku ve RNA izolasyonu işlemleri için çeşitli değişiklikler sonuçlarını iyileştirmek yüksek kaliteli RNA izolasyonu. Örnekleri, özellikle büyük ölçekli hasat sırasında, düzgün toplanan ve alandan taşınan eğer genel RNA bozulması ölçüde artırır. Toplam RNA verim örnekleri odunsu dokulara gelen özellikle, izolasyon RNA önce sıvı azot dondurucu değirmen ezerek örnekleri ile önemli ölçüde artış olabilir. Bu öncelikle, fenolik bileşikler, ve her ikisi de, en kozalaklı türlerin odunsu dokular alıntılar yüksek düzeyde mevcut polisakkaritler gibi oksitleyici ajanların varlığı nedeniyle. Kaldırılmaz, bu kirleticiler, RNA bozulması, bu sonucu düşük verim ve düşük kaliteli bir RNA örnek olarak sorunları, önde gelen üzerinde taşıyabilir. Bulaşma, fenolik bileşikler, polisakkaritler, yanı sıra da azaltmak veya cDNA sentezi için yaygın olarak kullanılan ters transkriptaz veya diğer polimerazları aktivite hatta tamamen ortadan kaldırabilir. Araştırmacılar bekliyoruz eğer Özellikle, RNA, cDNA kütüphaneleri nesil çift iplikli cDNA sentezi PCR veya qPCR Kullanıcı için tek iplikli cDNA sentezi, veya mikroarray hedef malzeme sentezi için Şablonu olarak kullanılmak üzere kaderinde en yüksek kalitede olması gerekir optimum sonuçlar elde etmek için. Diğer birçok bitki türünün yaygın istihdam RNA izolasyon teknikleri kozalaklı örneklerinden bu kirleri çıkarmak ve böylece aşağı manipülasyonlar için uygun toplam RNA örnekleri verim yok yeteneklerini genellikle yetersizdir. Bu videoda, floem hasadı, ikincil ksilem ve reaksiyon ahşap ksilem, kırk yaşındaki ağacın kesilmesi ile başlayan kozalaklı dokuların alan koleksiyon için yöntemler göstermektedir. Ayrıca, tutarlı bir sonraki enzimatik manipülasyonlar için yüksek kaliteli bir RNA vermiştir RNA izolasyonu protokol göstermektedir.
Protocol
Discussion
Kozalaklı ağaç türlerinin yüksek kaliteli bir RNA Alınması odunsu dokularında bulunan fenolik ve polisakkarit bileşiklerin yüksek düzeyde verilen zor bir görev olabilir. Chang ve arkadaşları tarafından geliştirilen protokol ile başlayarak. (1), biz daha titiz çıkarma bulundu ve tutarlı kozalaklı türlerin geniş bir yelpazede örneklenmiş çeşitli odunsu ve odunsu olmayan dokular çok yüksek kalitede toplam RNA izolasyonu yol adımları temizlemek gerekir. Bu video modifiye RNA izolasyon protokol…
Acknowledgements
Dr. Joe Naim, Matt Bryman Michael Bordo Ujwal Bagal, Huizhe Jin, ve Amanda Bouffier: Biz, yardım toplama çam dokuların mümkün olmazdı olmadan aşağıdaki kişilere teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
